不同微生物菌落特征篇1
关键词：亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌；形态特征；生理生化特征；氧气含量
亚硫酸还原梭状芽孢杆菌是一类能将亚硫酸盐还原为硫化物的梭状芽孢杆菌，而不是一个专门的生物学分类单位，亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的代表性菌株是致黑梭状芽孢杆菌，其他较为常见的还有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌和破伤风梭菌。这类细菌有很强的抵抗力，可以在自然环境中存活很长时间，即使在经适当加工处理后其芽孢仍会存活，条件适宜时又会生长繁殖[1]。其大量存在于人和动物肠道中，由粪便污染土壤，经伤口感染引起疾病。
亚硫酸还原梭状芽孢杆菌是羽毛羽绒检测中主要微生物指标之一，也是引起产品不合格的主要污染菌[2]。而国内关于羽绒亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的特性分析报告很鲜见。本文通过选择性培养基从羽绒中分离出一株厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌，然后研究其菌落特征，菌体显微特征、生理生化特征以及在不同氧气含量下的平板生长特性，以期为羽毛羽绒中准确检测厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌奠定基础，同时为国家标准的修订及规范企业提供实验室依据。
1材料与方法
1.1试剂与材料
菌种来源：亚硫酸还原梭状芽孢杆菌，本实验室分离；大肠杆菌，atCC11229。
革兰氏染色试剂盒、芽孢染色液、微量生化鉴定管系列、亚硫酸铁琼脂培养基、厌氧液体培养基、庖肉培养基基础等均购自北京陆桥技术有限责任公司。厌氧培养袋，厌氧产气袋、微需氧产气袋、厌氧指示条均购自日本三菱瓦斯化学株式会社公司。
1.2仪器
RJ-tGL-16G离心机（无锡瑞江分析仪器有限公司）；aL204电子天平（mettLeRtoLeDo）；YXQ-LS-75Sii立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；BCn-1360生物洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；Gnp-9160隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；2.5L密封培养罐/7.0L密封培养罐（三菱瓦斯化学株式会社）；CX41显微镜（oLYmpUS）。
1.3方法
1.3.1菌种的分离与纯化
亚硫酸还原梭状芽孢杆菌分离参照中国国家标准GB/t10288―2003《羽绒羽毛检验方法》[3]、FZ/t80001―2002《水洗羽毛羽绒试验方法》[4]以及Sn/t1071―2002《进出口食品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验方法》[5]进行。将羽绒置于无菌0.1%蛋白胨水中，置于75℃的水浴锅中水浴20min以后取出，用亚硫酸铁琼脂培养基对得到的溶液进行严格厌氧的平板培养。将平板于37℃下培养过夜。从亚硫酸铁琼脂培养基上挑取其中典型黑色的圆形菌落，将其接种于具塞的装有250mL厌氧液体培养基的锥形瓶中，在37℃厌氧培养箱中进行液体培养24h，得到一代种子菌液。
1.3.2亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的液体培养
取1mL种子接种到装有250mL厌氧液体培养基的具塞锥形瓶中，在37℃厌氧培养箱中进行液体培养过夜。
1.3.3染色
革兰氏染色、芽孢染色均参照《微生物学实验手册》[6]及《食品卫生微生物学标准鉴定图谱》[7]中进行。
1.3.4显微观察
染色样品在目镜wHB10×、物镜100×/1.25oilph3下进行观察，拍照。
1.3.5生理生化鉴定
用微量生化鉴定管系列分别对鉴定项目为甘露醇、西蒙式枸橼酸盐、动力-硝酸盐、mR-Vp、葡萄糖和木糖-明胶6项进行试验。取培养好的3mL菌液以5000r/min的转速离心3min，弃上清后加入灭菌的蒸馏水，使其与产品配套的比浊管的浊度一致，然后将菌液加入6个生理生化鉴定管里，厌氧37℃环境下培养24h（木糖-明胶需培养48h），加入指示试剂并观察结果，判断其特性。
1.3.6不同厌氧环境对菌体生长的影响
取培养好的菌液0.2mL接入250mL亚硫酸铁琼脂培养基中，用磁力搅拌器混匀，然后铺到平板上。利用厌氧产气袋和微需氧产气袋将平板均分放置在严格厌氧和微需氧两种不同的厌氧环境下，以及空气中好氧环境中，在37℃恒温培养，24h后观察菌落生长情况。
2结果与分析
2.1厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的分离和菌落特征
按照1.3.1对亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌进行平板分离。由于这类菌在厌氧条件下生长能产生硫化氢，硫化氢与培养基中的亚硫酸铁反应生成黑色硫化铁，因此在培养基上呈现黑色菌落的就是分离的亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌。随机选择三个大小不同的黑色菌落，分别液体培养后进行镜检，结果显示，所有的菌的形态都一样，因此随机选择了其中的一个菌落，编号S1。如图1所示。
观察可见，菌落正面圆形，侧面为低凸面；边缘整齐；菌落表面干燥粗糙；颜色为黑色，正反面无明显差异；不透明。单个菌落的菌体之间结合紧密，很难分开。
2.2分离菌S1的显微形态特征
2.2.1革兰氏染色
分离菌S1的革兰氏染色形态图见图2。由图可知，分离菌S1在革兰氏染色后是紫色，是革兰氏阳性菌。菌为两端钝圆，直杆状，无鞭毛，产芽孢。图中透明、边缘紫色、较菌体小的梭状是该菌的芽孢。
2.2.2芽孢染色
分离菌S1的芽孢染色见图3，图中红色的两端钝圆直杆状的为分离菌S1的菌体，绿色的较菌体稍小的梭状的是其芽孢。
2.3分离菌S1的生理生化反应
用微量生化鉴定管系列分别对鉴定项目为甘露醇、西蒙式枸橼酸盐、动力-硝酸盐、mR-Vp、葡萄糖和木糖-明胶6项进行试验。液体培养后按照1.3.5方法进行生理生化反应，结果见表1。
由表1可见，分离菌S1的西蒙式枸橼酸盐、mR-Vp、甘露醇和葡萄糖反应均为阴性；动力为不扩散生长；硝酸盐培养基为阴性；木糖-明胶4℃呈液态，显色阳性。
2.4不同氧环境对菌生长的影响
分离菌S1分别经严格厌氧、微需氧和空气好氧培养24h后，观察菌落生长情况，如图4所示。
亚硫酸盐还原菌是生态系统中土著微生物类群，是一类形态各异、营养类型多样、能利用硫酸盐或者其他氧化态硫化物来异化有机物质的微生物，在其生长繁殖代谢活动中，除Co2和水外，还产生高浓度的H2S为呼吸终产物。由于培养基中含有亚硫酸铁，该菌生长繁殖过程中将亚硫酸铁还原成为硫化铁，因而形成黑色菌落。菌落越大，由一个菌长成的菌越多，细菌繁殖快，说明细菌适合该条件。
由图4可以明显看出，在空气中，分离菌S1不生长；在含有微量氧气的环境下，菌落可以形成，但是生长不好，形成的菌落小；在无氧、严格厌氧条件下，该菌生长良好，菌落形成数量多而大，是S1最适宜的生长环境。由此可见亚硫酸还原梭状芽孢杆菌是严格厌氧菌，在羽毛羽绒检测过程中要严格控制厌氧条件，以免漏检，造成假阴性。
3结论与建议
分离菌株S1在亚硫酸铁琼脂培养基上，37℃厌氧生长后的菌落形态为：菌落正面圆形，侧面为低凸面；边缘整齐；菌落表面干燥粗糙；颜色为黑色，正反面无明显差异；不透明。单个菌落的菌体之间结合紧密，很难分开。染色后显微观察到菌体两端钝圆，直杆状，无鞭毛，革兰氏阳性菌，产芽孢；观察到菌体两端钝圆，直杆状，无鞭毛，革兰氏阳性菌，产芽孢；在生理生化反应中，分离菌S1的西蒙式枸橼酸盐、mR-Vp、甘露醇和葡萄糖反应均为阴性，动力为不扩散生长、硝酸盐培养基为阴性，木糖-明胶4℃呈液态，显色阳性。该菌是严格厌氧菌，在微需氧环境中生长不良，形成菌落很小，因此在羽毛羽绒检测过程中要严格控制厌氧条件，以免漏检，造成假阴性。
通过了解该菌的特性，我们可以控制羽毛羽绒检测中的关键点，提高羽毛羽绒中亚硫酸还原梭状芽孢杆菌等微生物检测能力。
参考文献：
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不同微生物菌落特征篇2
关键词：微生物数量；城市绿地；植被覆盖率；群落结构
中图分类号：S731.2文献标识号：a文章编号：1001-4942（2017）02-0099-06
城市绿地是由各类G地相互作用和联系形成的有机整体[1]，可以有效降低噪声污染，吸收工业和汽车发动机排放的有毒气体，吸附空气中的细微颗粒物。土壤是城市绿地植物的载体，是影响城市绿地植物生长的重要环境因子，是城市生态环境系统中不可缺少的组成部分，对城市的建设和发展有着不可取代的作用[2]。土壤微生物是土壤物质循环和养分转化的动力，是土壤速效养分、有效养分和有机质的储备库，对于土壤有效养分的变化十分敏感[3，4]。土壤为微生物生长和增殖提供了良好的化学营养和物理结构，是微生物的“天然栖息地”[5]。微生物可参与土壤生化过程，分解转化有机质固定养分，又可使母岩、母质分解释放速效矿质养分，供给植物吸收和利用，还可以形成根际微生物、菌根等，参与植物的生命活动，对土壤肥力、植物多样性和生态系统功能都有重大影响[6，7]。
国内对于城市绿地土壤微生物的活性和数量也有研究。蒋炳伸[8]对不同植被类型覆盖的城市绿地土壤微生物特征分析结果表明：从三大类群微生物总数的平均状况来看，花卉绿地>人工草灌地>人工林地>人工草地>人工灌木地>分车带绿地>行道绿地，花卉绿地比行道绿地土壤微生物数量多269×105cfu・g-1干土，且不同绿地土壤微生物生物量碳、氮的含量变化较大，其变化趋势与土壤有机质含量的变化趋势一致。孙福军等[9]认为，随着城市化水平的提高，土壤中微生物数量表现为明显的减少趋势，其中变化较大的是细菌，而真菌和放线菌的变化不明显。宋博等[10]的研究表明：土壤动物的多样性指数与土壤污染程度具有显著的负相关性，可以利用多样性指数指示土壤综合污染程度。侯颖等[11]对河南省商丘市的城区、郊区和农田的研究表明：城区和郊区土壤中的微生物明显少于农田，城市化改造对自然土的扰动导致土壤质量发生变化，从而使土壤微生物减少，而且真菌、细菌和放线菌的数量比例在城区、郊区和农田里也有显著不同。
城市功能区是整个城市职能的载体，可以集中反映城市所具特性，越发达的城市其功能区也就越多。不同功能区中绿地土壤的微生物群落结构可能会有很大差别，不同的绿地配置也会使土壤微生物群落结构受到影响。泰安市是旅游城市，道路众多而且繁杂，道路区和居民区绿地面积较多。由此，以泰安市的道路区和居民区的绿化带土壤为研究对象，探究泰安市主要绿地类型土壤中微生物的数量特征和不同绿地配置对土壤微生物数量的影响，为泰安市科学合理的园林规划和高效改善绿地土壤情况提供理论依据。
1材料与方法
1.1研究区域概况
泰安市位于山东省中部的泰山南麓，地理坐标在东经116°20′～117°59′、北纬35°38′～36°28′，属于温带大陆性半湿润季风气候区，四季分明，寒暑适宜，光温同步，雨热同季。春季干燥多风，夏季炎热多雨，秋季晴和气爽，冬季寒冷少雪。年平均气温13℃，7月份气温最高，平均26.4℃，1月份最低，平均-2.6℃。年平均降水量697mm。泰安地处鲁中山区，整个地势自东北向西南倾斜，境内拥有多种地貌类型，山地、丘陵、平原、洼地、湖泊兼而有之。
具体研究区域位于泰山区、岱岳区龙潭路和温泉路两侧，区域内地势由东北向西南逐渐降低，以山地、平原为主。南北约跨越0.103个纬度，东西约跨越0.045个经度。
1.2样地设计及土样收集
于交通区道路林和居民区绿化林两个功能区，选取10个样地，其中a、B、C、D、e位于居民区，F、G、H、i、J位于交通区。具体样地信息如表1所示。
采样时，先去除地表凋落物，用铁铲挖开地下土层，在每个样地0～10cm深度取土样，装入自封袋带回实验室，置于-4℃冰箱保存，供室内土壤微生物数量测定。
1.3土壤微生物的培养与测定
细菌、放线菌和真菌数量的测定采用稀释平板测数法，其中，细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用高氏1号培养基，放线菌采用孟加拉红培养基。分别接种后置于无菌培养室进行培养，其中，细菌37℃下培养2～3天，真菌28℃下培养3～5天，放线菌28℃下培养2～4天。然后，记录每种菌的数量，并根据稀释倍数进行换算。每克土壤微生物数量=菌落数×稀释倍数/取样体积。
1.4分析方法
所有数据的处理和分析均由microsoftexcel软件和SpSS19.0软件完成。不同功能区水平间的数据用t检验对比分析其差异显著性（p
2结果与分析
2.1土壤微生物群落数量特征
不同种类微生物具有不同的生物学性状，10个取样点的土壤微生物数量分布主要特征如表2，可以看出，样地土壤微生物菌落总数为798.210×104cfu・g-1干土，其中细菌菌落总数为383.755×104cfu・g-1干土，放线菌菌落总数396.125×104cfu・g-1干土，真菌菌落总数为18.330×104cfu・g-1干土，总体微生物数量组成模式为放线菌>细菌>真菌，细菌和放线菌数量相当且远远大于真菌数量。
从不同样地来看，样地a、D和i的微生物组成模式为细菌放线菌真菌，B、C、e、F、G、H、J的微生物组成模式为放线菌细菌真菌。样地H的微生物数量明显少于其它9个样地，为6.165×104cfu・g-1干土，少了有一个数量级之多。样地F的微生物数量最多且明显高于其它样地，为179.890×104cfu・g-1干土。从各个样地三种微生物比例来看，样地C、e、H、J中放线菌所占比例最大，远远高于细菌和真菌比例，样地D、i细菌所占比例最大，远远高于放线菌和真菌比例，其余4个样地中细菌和放线菌比例相当且远远高于真菌比例。
表2三类微生物的数量分布样地
从图1可以看出，三种类型微生物均显示出相同变化规律，即道路^土壤微生物数量显著大于居民区（p
2.3植被覆盖率对土壤微生物数量的影响
根据植被覆盖率将样地分为3组。一组植物覆盖率
由图2可知，二组微生物菌落总数显著低于一组和三组（p0.05）；对于细菌来说，一组、二组、三组间
图1不同功能区各类微生物数量的比较
均没有显著差异（p>0.05），细菌数量与植被覆盖率无明显相关关系；对于放线菌来说，二组显著低于一组和三组（p0.05），说明中等水平的植被覆盖率能显著降低土壤放线菌数量；对于真菌来说，其数量大体上随着植被覆盖率的增加而减少，一组真菌数量显著高于二组和三组（p0.05）。
2.4植被类型对土壤微生物数量的影响
为探讨植被类型对土壤微生物数量的影响，将调查样地分为3组：Ⅰ组包括样地a、B、D、F、i，植被类型以灌木为主；Ⅱ组包括样地C、G、J，植被类型以乔木为主；Ⅲ组包括样地e、H，植被类型以草本为主。
由图3可知，三种植被类型的土壤微生物总数之间差异显著（p以乔木为主的植被类型>以草本为主的植被类型；对于土壤细菌数量而言，Ⅰ组显著高于Ⅱ组和Ⅲ组（p0.05），说明以灌木为主的植物配置类型中土壤细菌数量最多；对于土壤放线菌数量而言，Ⅱ组和Ⅲ组之间差异显著（p
Ⅰ组和Ⅱ组、Ⅰ组和Ⅲ组之间差异不显著（p>0.05），说明以乔木和灌木为主的植物配置类型中土壤放线菌数量较多；对于土壤真菌数量来说，Ⅱ组显著高于Ⅰ组和Ⅲ组（p0.05），说明以乔木为主的植被配置类型中土壤真菌数量最多。3讨论
微生物数量是衡量微生物生长的重要指标，能直接显示某一地区土壤肥力、土壤健康状态和是否有人类活动的胁迫效应[12]。姚晶晶[13]认为土壤微生物是恢复环境的最先锋，微生物的各项生理活动可以显著增强土壤生态系统的缓冲能力。土壤中微生物的种类和数量是土壤具有生物活性的决定者，土壤肥力状况与微生物关系非常密切，微生物数量愈大，土壤微生物活性越高，肥力亦增大。本研究结果表明，土壤微生物总数为798.210×104cfu・g-1干土，其中放线菌数量最多，为396.125×104cfu・g-1干土，占微生物总菌落数的49.63%；细菌数量次之，为383.755×104cfu・g-1干土，占微生物总菌落数的48.07%；真菌数量最少，只有18.330×104cfu・g-1干土，占微生物总菌落数的2.3%。aibalch等[14]的研究认为在肥力好的土壤中，细菌所占比例较高；而在难分解物质较多的土壤中，土壤微生物细菌所占比率相对较低，真菌和放线菌比率相对较高。宋敏等[15]对中亚热带喀斯特峰丛洼地坡耕地、草丛、人工林、灌丛、次生林5个不同生态系统土壤微生物的数量研究表明，其土壤微生物总数量为4.27×104～3.14×106cfu・g-1，其中人工林和次生林则为细菌>放线菌>真菌，坡耕地、草丛、灌丛土壤三大菌类的组成为放线菌>细菌>真菌。本研究区域与北亚热带喀斯特地貌相比，温度较低，降雨量少，土壤微生物数量较少，三大菌类的组成与其研究结果一致，多为放线菌>细菌>真菌，表明不同绿化植被和水热条件对土壤微生物数量、分布存在重要影响。
城镇化也是影响土壤微生物数量的一个重要原因，随着城市化的加深，土壤微生物数量会整体减少[16]。本研究样地主要集中在道路区域和居民区域，道路两旁绿化带土壤每天会吸收道路上车辆排出的有毒气体和细小颗粒物，还会遭到践踏、车压等人为扰动[17]。在长期净化过程中，有的微生物形成了以有机污染物作为唯一碳源的代谢特点，从降解污染物中获得能量进行生长增殖[18，19]，有的微生物还通过共代谢和共氧化降解有机污染物[20]。居民区绿地土壤更多的是遭受翻动、回填、客土等人为扰动。本研究发现，细菌、放线菌和真菌数量均是道路区>居民区，可能由于泰安是旅游城市，道路绿化带每天浇水，从而增加了道路绿化带土壤水分含量，使道路土壤微生物大量增殖。
本研究中，样地植被覆盖率差距较大，植被覆盖率最大可达95%左右，最小只有40%左右。结果表明，最大植被覆盖率条件下，土壤微生物数量最多，原因一方面可能由于高植被覆盖率可以避免土壤直接被阳光暴晒，有效减少土壤吸收紫外线，起到保护微生物的作用，另一方面植被覆盖率越大的地方人为干预越小，从而避免土壤被人为破坏和踩踏。此外，高覆盖率区域凋落物多，有效增加了土壤有机质含量，促进土壤微生物生长繁殖。
各类微生物对于生长环境的要求也不同，一般认为，细菌在湿润的环境下更易增殖，能耐受低氧水平；真菌耐旱但是氧含量水平过低会导致大量减少；放线菌具有喜热且耐旱的特性，但是生长增殖慢，在土壤中主要参与难分解物质的分解，只有当土壤中各类微生物竞争压力减少时才会大量出现[12]。本试验采样点分为三种类型：灌木为主、乔木为主和草本为主。不同植被类型组成导致其土壤中微生物生存的微环境不同。从土壤微生物总数来看灌木为主类型>乔木为主类型>草本为主类型。以灌木为主的植被类型更适合细菌生长繁殖，以乔木为主的植被类型更适合放线菌和真菌生长繁殖，以草本为主的植被类型中，细菌、真菌和放线菌的数量都很小，说明草本为主的植被类型不适合微生物生长繁殖。这与孙其远[21]研究的灌木类绿地>草坪类绿地>乔木类绿地有所不同。出现本研究结果的原因可能是：灌木为主的植被类型生长旺盛，为土壤微生物提供了良好的湿热条件，同时生长旺盛的灌木凋落物较多，为土壤提供了较多的有机质；乔木植物的根多在土壤深处，而且受人为破坏严重，有机质含量偏少就造成了微生物数量减少；草地虽然根系发达，但人为踩踏严重，土壤压实，抑制了土壤微生物的呼吸作用，导致土壤微生物数量较少。
4结论
通过对泰安市道路区域绿化带土壤和居民区绿地土壤微生物群落的研究及植被类型和植被覆盖率对其影响的探讨，可以得出以下结论：一，泰安市道路林和小区绿化林的土壤微生物数量模式除a取样点（山东农业大学本部）、D取样点（丰园小区居民区）和i取样点（天外村）为细菌>放线菌>真菌外，其它均表现为放线菌>细菌>真菌，这三个点绿化较好，水肥管理也比较得当，而且植被类型均是灌木为主。二，泰安市道路区微生物数量>居民区微生物数量，这可能由于泰安市旅游城市道路区有专人负责浇水，保证了土壤中良好的湿热条件。三，植被覆盖率对土壤微生物数量有一定影响，中等植被覆盖率对土壤中放线菌数量影响最大，植被覆盖率大的区域和植被覆盖率小的区域土壤微生物数量均大于中等植被覆盖率。四，植被类型对土壤中微生物数量影响很大，泰安市表现为灌木为主>乔木为主>草本为主。
总之，泰安市在以后的园林规划中，应该选用土质较好的土壤，加强管理，定期松土、施肥，保持土壤微生物生存需要。另外，在规划中，要采用草本、灌木、乔木结合的方式，可以上部是乔木，下部是灌木。在绿化过程中，要加强道路林建设，同时提高人民素质，减少对绿化带人为扰动现象。
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收稿日期：2016-07-15
基金项目：四川省草公司重点科技攻关项目（SCGY201401）
不同微生物菌落特征篇3
关键词：黏细菌；分离；纯化；新菌株
中图分类号：Q939文献标识码：a文章编号：1672-979X(2007)03-0038-03
apreliminaryStudyonScreeningandidentificationofmyxobacteria
LiUBing-hua1,2,LiXiao-hong1,BianGuo-ning1,XionGShi-juan1,LiHong-xia1,YURong1*
(1.westChinaSchoolofpharmacy,SichuanUniversity,Chengdu610041，China；2.Schoolofnursing,ChengduUniversity,Chengdu610015，China)
abstract：objectivetoscreenandidentifymyxobacteria.methodsDuringthescreeningofmyxobacteria,carbendazolwasusedtoinhibittheproductionoffungusandheatingtreatmentwasusedtoinhibittheproductionofheat-labilehybridbacteriaandfreezingtreatmentwasusedtoinhibitthegrowthofvermesandtheproductionofbacteriathatcouldnotbearthefreeze-thawingagainandagain.inordertoidentifymyxobacteria,VY/4culturemedium,celluloseculturemedium,wCXculturemediumwereused.Resultsthreestrainswerepreliminarilyclassifiedasangiococcusaccordingtomorphologiccharacteristics,suchasfruitingbodies,colony,myxosporesandvegetativecells.Conclusionthreenewmyxobacteriastrainscanbeobtained.
Keywords：myxobacteria；isolation；purification；newstrains
黏细菌是一种具有复杂多细胞行为的革兰阴性菌[1]。在研究细胞分化、发育和生物进化中占有重要地位。黏细菌能产生丰富的次级代谢产物，迄今已发现几百种结构不同的化合物，许多是以前未发现过的[2]。一株黏细菌可产生许多具有相同基本结构的衍生物，且同种的不同菌株产生的生物活性物质差异较大。因此，黏细菌是极具研究及开发价值的微生物类群。目前，黏细菌的分离纯化和培养耗时制约着黏细菌的应用，因此，研究简单而特异的黏细菌分离筛选方法具有重要的意义。
1材料和仪器
1.1材料
纯喂草家兔粪便，采自四川成都文家场盐井村，风干后立即使用。
1.2仪器
JSm-5900LV型扫描电子显微镜（日本电子公司）；XSp-16a光学显微镜（江南仪器厂）；Sw-CJ-1F洁净工作台（苏净集团安泰公司）；HH・B11电热恒温培养箱（上海市跃进医疗器械厂）；tHZ-C恒温振荡器（太仓市实验设备厂）。
1.3培养基
（1）安琪酵母水培养基：安琪酵母0.2％，琼脂粉1.5%，pH7.2；（2）VY/4培养基：安琪酵母0.25%，CaCl2・2H2o0.1%，维生素B120.5μg/mL，琼脂粉1.5%，pH7.2；（3）纤维素培养基：纤维素粉1.5%，琼脂粉1.5%，pH7.2；（4）wCX培养基：CaCl2・2H2o0.1%，琼脂粉1.5%，pH7.2；（5）LB液体培养基：胰蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，pH7.0。
2方法
2.1黏细菌的初步分离
取兔粪适量，分别用30mg/L的多菌灵，60mg/L的灰黄霉素，60mg/L的克霉唑溶液浸泡6h。分别接种于安琪酵母水培养基中（为减少霉菌等真菌的污染，在培养基中分别加入浸泡时所用抗真菌药，混匀后倒入平板），置30℃孵箱恒温保湿培养，并及时挑取疑似黏细菌的菌落，转接于含VY/4培养基的平板，继续于30℃恒温保湿培养。
2.2黏细菌的进一步分离纯化
2.2.1平板稀释及时挑取疑似菌落边缘的细菌，反复转接于含VY/4培养基的平板，30℃恒温保湿培养。
2.2.2低温反复冻融处理将初步分离纯化的单菌落接种于VY/4斜面培养基，置－80℃冰箱冷冻48h，取出放至室温后即转接于VY/4培养基，30℃恒温保湿培养，反复3次，除去可能存在的蠕虫以及不耐反复冻融的细菌。
2.2.3加热处理将生长在VY/4培养基上的疑似菌落连同斜面一起置于58℃的孵箱恒温保湿培养，然后放至室温，转接于VY/4培养基上，30℃孵箱培养，以除去不耐热的杂菌如大肠杆菌等。
2.2.4筛选噬细菌群黏细菌用酵母菌和大肠杆菌（活菌或死菌）在wCX培养基上划交叉线，将VY/4培养基上的疑似菌落转接于划线处，30℃恒温保湿培养。除筛选噬细菌群黏细菌外，此方法也有鉴定噬纤维素群黏细菌的作用。
2.3黏细菌的纯度检验
2.3.1VY/4培养基检验将分离所得到黏细菌涂布在VY/4平板上，观察有无杂菌生长。
2.3.2LB液体培养基检验挑取经多次纯化的菌落接种于LB液体培养基中，30℃恒温震荡培养48h，观察培养液是否混浊[3]。黏细菌在LB液体培养基中不生长。
2.4黏细菌的鉴定分类
2.4.1VY/4培养基鉴定将分离所得黏细菌涂布在VY/4平板上，观察菌落是否滑动、产生黏液以及菌落的形状、子实体的颜色等。
2.4.2纤维素培养基鉴定将疑似黏细菌的单菌落接种于纤维素培养基上，30℃恒温保湿培养。
2.4.3wCX培养基鉴定分别用活酵母菌、死酵母菌及活大肠杆菌在wCX培养基上划交叉线，然后将疑似黏细菌的单菌落接种于划有交叉线的wCX培养基上，30℃恒温保湿培养。
2.4.4菌株分类将所得菌株进行革兰染色，在光学显微镜及电子显微镜下观察细胞形态。根据Bergey’smanualofdeterminativebacteriology（《伯杰鉴定细菌手册》）第9版（1994年）[1]的黏细菌分类标准，主要以形态特征确定菌株归属。
3结果
3.1抗真菌药物抑菌效果
本实验结果表明，30mg/L多菌灵在分离初期抑制霉菌、丝状真菌等的效果优于灰黄霉素和克霉唑，对正常菌落影响较小。
3.2菌株筛选及鉴定
经过大量、多次筛选，最终得到3株菌株，其形态特征及生理生化特性见表1。
表13株细菌的形态及生理生化特征
由表1可见，分离到的3株菌株均符合黏细菌的特征，由于3株菌株子实体的颜色不同，次级代谢物的颜色及气味也不同，所以它们属于不同的黏细菌菌株。
筛选所得的3株菌株在不同培养基上的生长情况见表2。根据噬细菌群黏细菌可以分解活或死的细菌、真菌，不能分解纤维素的特征，由表2可见，我们分离到的3株菌株均符合噬细菌群黏细菌的特征。
表2筛选所得到3株菌在不同培养基上的生长情况
对筛选得到的3株菌的子实体进行了电镜扫描，结果见图1、图2和图3。
图11号黏细菌子实体的扫描电镜图
（线条=5μm）
图22号黏细菌子实体的扫描电镜图
（线条=1μm）
图33号黏细菌子实体的扫描电镜图
（线条=5μm）
电子显微镜下1号菌为杆状、两端略细，菌宽0.75～0.8μm，菌长3.7～5.4μm；子实体复杂，1个黏杆上顶有1个或多个黏孢子，且子实体上有些黏孢子呈曲折链状排列，黏孢子呈球形，直径1.3～1.6μm。2号菌为船形，两端略细，菌宽0.6～0.7μm，菌长4～8μm；子实体复杂，成簇状，有分支，大小不等。黏孢子呈球形，直径0.9～1.1μm。3号菌为杆状，两端略细，菌宽0.4～0.6μm，菌长3.7～5.4μm。子实体大小不等，1个黏杆上有2个至多个黏孢子，子实体上有些黏孢子曲折链状排列；黏孢子呈球形，直径0.9～1.6μm。根据文献[1]的描述，这3株菌株均属嗜细菌群黏细菌的囊球黏细菌属（angiococcus）。
4讨论
多菌灵为农业用药，毒性低、价格低廉而且易得。本实验表明，多菌灵能较好地抑制霉菌等真菌的生长。比文献报道的抗真菌药放线菌酮（剧毒，约700元/g）适用，值得推广[4]。实验还表明，样品存放太久会直接影响黏细菌的分离。
目前，黏细菌的分类鉴定仍主要停留在形态特征上，其原因一是对黏细菌的研究起步较晚，其生理特征的描述只限于个别种属；再是黏细菌形态的复杂性意味着形态分类比其它细菌可靠。虽然依照营养细胞、黏孢子形态和菌落特征黏细菌可分为纲、亚纲，甚至可鉴定到属，但确切的鉴定仍需有特征性的子实体的形成[4，5]。我们重点研究了1号菌，发现其胞内物可抗革兰阴性菌，胞外物既可抗革兰阴性菌又可抗革兰阳性菌，并且对革兰阳性菌的抗性很强，这对黏细菌资源及抗生素的有效开发具有意义。
（本课题受到四川大学药学院杨继虞教授的热心帮助，在此表示衷心的感谢。）
参考文献
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不同微生物菌落特征篇4
关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术马尔尼菲篮状菌鉴定
StudyontheoptimizedpretreatmentconditionsforidentificationoftalaromycesmarneffeibymaLDi-toFmS
LiUYuguHeYingFUJunfangLonGJunXionGJunJianGLingxiaowanGYanfang
microbiomemedicineCenter,DepartmentofLaboratorymedicine,ZhujiangHospital,SouthernmedicalUniversity;
abstract：objectivetoconstructthedatabaseoftalaromycesmarneffeiformatrixassistedLaserDesorption/ionizationtimeofFlightmassSpectrometry(maLDi-toFmS)identification,andtoexplorethebestcultureconditionsandpretreatmentmethodformaLDi-toFmSidentificationoftalaromycesmarneffei.methodsaself-builtmassspectrometrydatabasewasconstructedbyusing8strainsoftalaromycesmarneffei.theeffectsofdifferentculturemedia[SabouraudDextroseagar(SDa),SabouraudDextroseBroth(SDB)],culturetemperature(28,35℃),culturedayandpretreatmentmethods(formicacidacetonitrilemethodanddirectcoatingmethod)onthequalityofspectrumandtheaccuracyofidentificationwerecompared.ResultsinViteKmSresearchuseonlymode(RUomode),theself-builtmassspectrometrydatabaseoftalaromycesmarneffeiwassuccessfullyconstructed.SDawasmoresuitableformaLDi-toFmSidentificationoftalaromycesmarneffeithanSDB,andthelatterhadmoreinterferencepeaksintheacquisitionspectrum.thecharacteristicpeaksofthespectracollectedatthetwotemperaturesweresimilar,buttheidentificationaccuracyofcoloniesat35℃wasslightlyhigher.theaccuracyrateofcolonyidentificationwashigherthan71.4%whenculturedfor3-5days,andthehighestratecouldreach100.0%whenculturedfor5days.theextractioneffectofformicacidacetonitrilemethodwasbetterthanthatofdirectcoatingmethod.ConclusionthebestidentificationaccuracycouldbeobtainedbyculturingtalaromycesmarneffeionSDaat35℃for3-5daysandpretreatedwithformicacidacetonitrilemethod.thisisalsoapplicabletothetalaromycesmarneffeiwithatypicalmorphology.
Keyword：matrixassistedLaserDesorption/ionizationtimeofFlightmassSpectrometry;talaromycesmarneffei;identification;
马尔尼菲篮状菌(tm)是一种双相真菌，流行于东南亚地区及我国南方地区，可致播散性感染，多发于免疫缺陷患者，其病情凶险、预后差，因此早期准确鉴定尤为重要[1-3]。目前，tm的鉴定以其典型菌落特征(温度双相性和红色素)为主，但对于形态不典型菌株，单一温度培养时检验人员易出现判断错误的情况，从而延误患者的诊治。分子生物学方法虽是“金标准”,但目前尚不适用于临床检验科的常规鉴定。近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(maLDi-toFmS)在微生物鉴定领域发展迅速，因其具有快速准确的优点被称为最有前景的鉴定方法[4-5]。目前maLDi-toFmS应用较广泛的有BrukerBiotyper及ViteKmS系统，但其对于双相真菌的应用研究较为滞后[6]。本研究拟在ViteKmS科研模式(RUo模式)中构建tm的参考数据库，并通过比较不同培养条件及样品前处理方法，探索用于tm质谱鉴定的最佳培养条件和前处理方法。现报道如下。
1材料与方法
1.1材料来源
南方医科大学珠江医院检验科分离的tm8株，菌株编号分别为ZJ01、ZJ02、ZJ2360、ZJ399、ZJ18919110、ZJ110307、ZD180201、ZJLin,以上菌株均经形态学及itS测序鉴定。以大肠埃希菌atCC8739作为校准和内质控菌株。
1.2仪器与试剂
maLDi-toFmS仪(法国生物梅里埃股份有限公司，数据库版本V3.0,RUo模式);隔水式电热恒温箱(28、35℃),高速冰冻离心机，大型落地摇床(美国themoFisher科技有限公司);电子天平；沙保弱葡萄糖琼脂培养基(SDa,广州市迪景微生物科技公司);ViteKmS-CHCa基质液(主要成分为α-氰基-4羟基肉桂酸)、ViteKmS-Fa(主要成分为甲酸，酵母菌前处理液)、ViteKmS-DS靶板(法国生物梅里埃股份有限公司);葡萄糖，蛋白胨[生工生物工程(上海)股份有限公司];70%乙醇，甲酸，乙腈(天津市化学试剂供销公司),蒸馏水等。
1.3方法
1.3.1分生孢子悬液制备
于SDa平板接种上述8株tm,28℃培养5d,用含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液收集菌液，并经12层无菌纱布过滤得到孢子悬液，计数并调节孢子浓度为2×107个/毫升。
1.3.2菌株培养
取上述tm菌株约2×106个孢子接种于SDa、沙氏葡萄糖肉汤培养基(SDB)中，于28、35℃进行培养，分别在第3、5、7、9天取菌落前处理进行质谱鉴定。以编号ZD180201菌株的质谱数据建立tm质谱参考库。其余7株tm用于验证参考库及构建tm超级谱图库。
1.3.3菌落前处理方法
酵母相菌落(35℃)分别采用甲酸乙腈法或者直涂法处理，菌丝相菌落(28℃)生长过程的孢子与菌丝不够丰富，且部分生长呈现“咬琼脂”现象，难取样，因此未采用直涂法，按照ViteKmS推荐的丝状真菌前处理方法即甲酸乙腈法处理，具体步骤如下。甲酸乙腈法：按照ViteKmS丝状真菌前处理方法进行处理，即生物安全柜内挑SDa或SDB中菌落分别于900μL70%乙醇静置10min,14000r/min离心2min,弃上清液；沉淀中加入70%甲酸和乙腈各40μL振荡混匀，14000r/min离心2min。取1μL上清液及质控菌株加于靶板点位上，干燥后覆盖1μLCHCa基质液，室温下干燥上机，自动采集质谱谱图。直涂法：生物安全柜内直接取酵母相菌落适量涂靶板，待干后加入0.5μLViteKmS-Fa,干燥后覆盖1μLCHCa基质液，同上采集质谱谱图。
1.3.4构建参考库
以其中1株(编号ZD180201)在不同培养基(SDa、SDB),培养温度(28、35℃),培养天数(3、5、7、9d),前处理方法(甲酸乙腈法、直涂法)的高质量谱图，即背景噪音低、基峰分辨率高、主次峰分布错落有致、一致性好、主峰信号强度强、基线稳定及出峰数为80～250个的谱图，构建tm参考库，加入ViteKSaRami数据库中。
1.3.5结果判读
专用分析软件对鉴定结果进行判读，版本为V3.0。靶板点位通过点位颜色变化来提示结果的可信度，通常有绿、黄、红3种颜色。绿色提示只有一个鉴定结果，概率为60.0%～99.9%,结果可信度水平高。黄色提示仪器对标本分辨率较低，需要进一步采用试验进行区别。红色提示与数据库中任何质谱不匹配。
1.3.6验证并创建超级谱图库
利用其余7株tm验证tm参考库，并汇总高质量质谱谱图，创建超级谱图库，保留39～41个特征性峰，特征性峰权重之和≤1400。
1.4统计学处理
计数资料以频数或百分率表示，比较不同培养天数、培养温度、前处理方法时的tm质谱鉴定正确率。正确率=正确鉴定菌株数/总数×100%。因样本量小，未进行统计分析。
2结果
2.1不同培养天数、培养温度及前处理条件对tm质谱谱图的影响
tm质谱谱图的离子峰以位于质荷比m/z7848.00、6113.00、6668.00、3335.00附近的特征峰为主，见图1。不同培养温度时，特征峰信号基本相似但略有不同，28℃培养特征峰主要以m/z6113.00附近为主峰，见图1a、B,而35℃培养以m/z7848.00附近为主峰，见图1C、D。
相比于SDB,SDa培养的tm更易采集到较多的特征离子峰信号且强度明显的高质量质谱谱图，见图1a、B。tm在SDB35℃培养的菌落采集的高质量谱图数量较少，谱图主要表现为干扰峰多，特征峰信号强度不明显，未纳入参考库。且未使用SDB继续对其他7株临床分离菌株进行培养。
不同培养时长对特征峰的数量与强度影响较为明显，培养3～5d时采集的质谱谱图质量更佳，可获得较多数量且信号强度明显的特征峰，信噪比较高，见图1a、B、C、D,而培养第9天时特征峰的数量明显减少且信号强度减弱，甚至消失，见图1e、F。
甲酸乙腈法与直涂法前处理方法进行比较后发现，在特征峰最佳的第3天培养时，甲酸乙腈法较直涂法可获得更多数量、信号强度更明显的特征峰，且信噪比更高，质谱谱图与参考库中的特征性质谱谱图匹配效果更好，提示蛋白提取效果更佳，见图1C、D。
2.2maLDi-toFmS对不同培养温度、培养天数的tm的鉴定正确率比较
不同培养温度下的tm鉴定结果显示，在相同培养天数时，35℃培养菌落鉴定正确率均高于28℃培养菌落，其中35℃培养3～7d内鉴定正确率均超过70.0%,培养5d时鉴定正确率可达100.0%。而28℃培养菌落则需要在培养3～5d内行maLDi-toFmS鉴定，正确率可超过70.0%,见表1。
不同培养天数下的tm鉴定结果显示，培养第5天鉴定正确率最高(28℃培养时鉴定正确率为85.7%,35℃培养时鉴定正确率为100.0%),而培养第9天时鉴定正确率最低，均不足50.0%,见表1。
2.3maLDi-toFmS对不同前处理方法培养的tm的鉴定正确率比较
利用甲酸乙腈法、直涂法对35℃,SDa培养的tm进行前处理，结果显示，经甲酸乙腈法提取蛋白进行鉴定的正确率略高于直涂法，见表2。另外，甲酸乙腈法及直涂法对tm的鉴定效果均表现为培养第3～5天鉴定正确率最高，随着培养时间延长，鉴定正确率降低，见表2。
2.4maLDi-toFmS在不典型tm鉴定中的价值
2.4.1不典型tm的形态学特征
本研究中的不典型tm菌株分离自南方医科大学珠江医院患者肺泡灌洗液和痰液，形态学表现为温度双相型，但是红色素产生极缓慢，28℃培养7～9d局部开始分泌红色素，经itS测序证实为tm(100%),见图2。
2.4.2tm自建数据库在不典型菌株鉴定中的应用
对于28℃培养7d未分泌红色素的不典型tm菌株(编号ZJLin),生长速度较典型tm慢，但培养3～5d时可被tm自建数据库正确鉴定，而培养第7～9天均无法经tm自建数据库正确鉴定。不同温度和前处理方法对鉴定结果均无差异。见表3。
3讨论
近年来，随着免疫抑制人群数量的增加，tm感染发病率也随之上升。目前临床微生物实验室对tm的鉴定，主要依赖其温度双相的菌落特征(35℃培养为酵母样，28℃培养为霉菌样)及典型红色素来判断，但形态学鉴定主要依赖于检验人员的经验。分子生物学鉴定则需要获取足够数量的菌体。对于生长缓慢的菌落，其鉴定耗时长。这限制了tm感染的早期诊断和及时治疗。同时，形态不典型菌株的出现，向微生物实验室对tm的快速准确鉴定提出挑战。
maLDi-toFmS是微生物鉴定领域的一项极具前景的新技术，有成本低、耗时短、准确、高效等优点，可实现菌株的快速鉴定，目前在国内检验科被广泛推广。但国内外常用的BrukeBiotyper及ViteKmS系统均无tm鉴定参考库，且适合用于tm质谱鉴定的菌落培养条件及前处理方案鲜有报道。
质谱鉴定的准确性受许多因素影响，如培养基种类、培养条件、培养时间、蛋白提取方法等[7]。本研究比较了两种温度(28、35℃)、两种培养基(SDa、SDB)培养3～9d的质谱鉴定正确率。其中从SDB35℃培养菌落采集的质谱谱图数量少，干扰峰较多且特征峰信号强度不明显，考虑为液体培养基摇菌时菌量不足及洗涤不充分所致。因此，操作时应尽可能将菌落沉淀洗涤干净。另外，从28℃SDa及SDB中培养菌落采集到的质谱谱图无明显差异。液体培养基培养操作较复杂，培养液等营养成分会干扰质谱分析，且菌落培养耗时更长，因此固体培养基更适合临床微生物室的快速鉴定。LaU等[8]发现，补充构建数据库后，maLDi-toFmS能准确鉴定tm,其菌丝相和酵母相质谱谱图类似。本研究发现tm菌丝相及酵母相的特征峰相似，且与文献报道的主峰一致，但在35℃培养时鉴定正确率略高。
不同真菌培养时间下质谱谱图的特征峰数量和强度存在明显差异[9-11]。本研究发现，tm培养3～5d时进行质谱鉴定的正确率高，且第5天最佳，可达100.0%。这主要与此时质谱谱图质量佳、信噪比高及鉴定结果稳定有关。随着培养时间的延长，特征峰信号强度减弱，甚至消失，从而出现错误鉴定或无鉴定结果，这可能与真菌细胞壁较厚且坚韧难破壁、色素产生干扰等有关。
tm于28℃时呈菌丝相，35℃呈酵母相生长。法国梅里埃公司推荐对丝状真菌采取甲酸乙腈法，对酵母菌采用直涂法进行前处理。直涂法用于酵母菌鉴定效果好，且适用于多种商业化maLDi-toFmS系统[12-15]。而甲酸乙腈法是利用甲酸及乙腈对菌体进行蛋白提取来获得高质量质谱谱图，不仅适用于酵母菌鉴定[16],也适用于曲霉、皮肤癣菌等丝状真菌鉴定[17-20]。本研究比较两种前处理方法对tm酵母相菌落的鉴定发现，对培养3～5d的菌落，甲酸乙腈法的鉴定正确率略优于直涂法(100.0%、100.0%vs.71.4%、85.7%)。这与甲酸乙腈法蛋白提取更充分有关。
综上所述，本研究发现经SDa培养3～5d的酵母相(35℃)菌落，经甲酸乙腈法处理后，可获得良好的质谱谱图，鉴定正确率高。此条件也同样适用于形态不典型的tm,为tm的快速、准确鉴定提供了辅助手段。但本研究仅纳入8株tm的质谱谱图，还需要更多菌株进一步完善数据库并验证。maLDi-toFmS提高了真菌鉴定的准确性，但在鉴定中仍需努力解决如生物安全问题、少见菌株数据库问题及样本处理标准化等问题。
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不同微生物菌落特征篇5
关键词：微生物镉筛选鉴定
中图分类号：X825文献标识码：a文章编号：1672-3791（2013）07（b）-0137-02
随着工农业的发展，采矿、冶炼、电镀等行业向环境中排放了大量的重金属离子，引起环境和生态恶化，其中镉是污染程度最严重的重金属之一。据统计，在过去半个世纪里，全球排放到环境中的镉达到22000[1]。中国受到镉污染的耕地分布在11个省市的25个地区，约为1.3万hm2。每年约有1200万t粮食因污染而损失，其中镉米就达到5万t以上，蔬菜镉超标率为11.6%[2]。重金属污染严重危害着我国粮食生产和食品安全。
重金属污染治理的方法中，传统的物理化学方法具有成本高、易产生二次污染等特点，生物法不仅可以降低处理的成本，还具有较好的经济、环境效益，以成为目前的研究热点。自然界中耐重金属微生物大量存在，往往可从受重金属污染的环境中筛选出优势菌种。
1材料与设计
1.1样品
样品1：采自内江市某电镀厂边缘的土壤。
样品2：采自某生活污水处理厂的活性污泥。
1.2主要仪器
主要仪器：Bt224S型电子分析天平；LRH-150F型生化培养箱；YXQ-LS-50SLL立式压力蒸汽灭菌器；Sw-CJ型超净工作台；摇床。
1.3培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏0.5g、蛋白胨1.0g、0.5gnaCl、琼脂15g、去离子水定容至100ml，调节pH为7.2～7.4。
豆芽汁葡萄糖培养基：黄豆芽10g、葡萄糖5g、琼脂1.5～2.0g，去离子水定容至100ml，自然pH。
1.4方法
（1）选择最适培养浓度。
称取5g土壤鲜样加到15ml灭菌水中，置于摇床振荡10min。吸取悬浮液0.1ml、无菌水0.9ml加入无菌试管中，此时菌悬液浓度为10-1。以浓度为10-1菌悬液为基准液，采用逐步稀释法，配制浓度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液；吸取不同浓度的菌悬液各0.1ml于相应的培养基中，涂布均匀，置于培养箱中28℃培养48h后，观察培养基中微生物的生长状况，选取生长单菌落数量合适的相应浓度作为最适培养浓度。
按上述方法制备污泥悬浮液，并选取最适培养浓度[3]。
（2）菌株的分离。
取最适培养浓度悬浮液涂布于Cd（Ⅱ）浓度为43.8mg/L的牛肉蛋白胨培养基上，至于恒温培养箱中培养，48h后观察平板上的菌落，挑取单个菌落进行划线培养，重复三次以上，直到在显微镜下观察为纯菌[4]。
（3）菌株的驯化。
将纯化后长势最好的单菌落转接到Cd（Ⅱ）浓度为43.8mg/L、87.6mg/L、219mg/L的牛肉蛋白胨培养基上，培养3d后，选取在219mg/L中长势最好的单菌落继续转接到Cd（Ⅱ）浓度为328.5mg/L、438mg/L、547.5mg/L的牛肉蛋白胨培养基上，培养3d。
（4）抗性菌株的鉴定。
①个体形态特征：采用革兰氏染色法染色，镜检观察其个体形态特征。
②群体形态特征：将菌株接种于牛肉蛋白胨固体培养基，28℃培养2d，观察单菌落特征。
2结果与分析
2.1菌株的分离
土壤及污泥悬浮液经浓度梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6平板培养分析后，均选取浓度为10-5的悬浮液为最适培养浓度。在该浓度下培养微生物并纯化培养，从土壤中分离出抗性菌3株，编号a1、a2、a3，从活性污泥中分离出抗性菌两株，编号B1、B2。
2.2菌株的驯化
当培养基中Cd（Ⅱ）浓度为43.8mg/L、87.6mg/L时，菌株a1、a2、a3均生长良好，Cd（Ⅱ）浓度继续增大，a2、a3相继被淘汰，a1表现出明显优势，仍然生长良好。Cd（Ⅱ）浓度为547.5mg/L时，a1生长受到抑制，Cd（Ⅱ）浓度继续增大，a无法正常生长。B1、B2的驯化过程中，Cd（Ⅱ）浓度增加至219mg/L时，B2无法正常生长，加大Cd（Ⅱ）浓度，得B1最高耐Cd（Ⅱ）浓度为438mg/L。
2.3菌株的鉴定
a1、B1经试验鉴定如表1所示。
由表1鉴定操作初步推断a1为革兰氏阴性短杆菌，B2为黄杆菌。
3结论
采用微生物分离纯化技术，从受重金属污染土壤及活性污泥中各分离出对Cd（Ⅱ）具有高抗性的菌株a1、B1，a1最高耐Cd（Ⅱ）浓度在547.5mg/L左右、B1最高耐Cd（Ⅱ）浓度在438mg/L左右，a1菌株的耐性要高于B1菌株。经初步鉴定，a1为革兰氏阴性短杆菌，B1为黄杆菌。
通过对菌株a1、B1的形态学的观察，为菌株a1、B1的分类鉴定奠定了基础。
参考文献
[1]孙铁珩，李培军，周启星.土壤污染形成机理与修复技术[m].北京：科学出版社，2005.
[2]胡振琪.重金属污染土壤的粘土矿物与菌根稳定化修复技术[m].北京：地质出版社，2006.
[3]刘彧.污泥中耐镉微生物的筛选与鉴定[D].西南大学硕士学位论文，2007
不同微生物菌落特征篇6
1、微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察,直观地了解细菌在形态结构上特性,根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落(colony)。不同微生物在某种培养基中生长繁殖,所形成的菌落特征有很大差异,而同一种的细菌在一定条件下,培养特征却有一定稳定性。,以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此,微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。
1)细菌的培养特征包括以下内容:在固体培养基上,观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况
2)霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体,在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似,只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似,有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在条件适宜的培养基里,菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色,因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如青霉菌:孢子青绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
二、生理生化试验
微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物,生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。
微生物检验中常用的生化反应有:
1、糖酵解试验
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异,或能利用或不能利用,能利用者,或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。
试验方法:以无菌操作,用接种针或环移取纯培养物少许,接种于发酵液体培养基管,若为半固体培养基,则用接种针作穿刺接种。接种后,置36±1.0°C培养,每天观察结果,检视培养基颜色有无改变(产酸),小倒管中有无气泡,微小气泡亦为产气阳性,若为半固体培养基,则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡,有时还可看出接种菌有无动力,若有动力、培养物可呈弥散生长。
本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力,从而进行各种细菌的鉴别,因而每次试验,常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫,溴百里蓝和an-drade指示剂。
2、淀粉水解试验
某些细菌可以产生分解淀粉的酶,把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再变蓝色。
试验方法:以18~24h的纯培养物,涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板(一个平板可分区接种,试验数种培养物)或直接移种于淀粉肉汤中,于36±1°C培养24~48h,或于20°培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面,若为液体培养物,则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果,阳性反应(淀粉被分解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。
淀粉水解系逐步进行的过程,因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间,培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性,以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱,因而以临用时制备为妥。
3、V-p试验
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中氧氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称V-p(+)反应。
试验方法:
1)o’meara氏法:将试验菌接种于通用培养基,于36±1°C培养48h,培养液1ml加o’meara试剂(加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液)1ml,摇动试管1~2min,静置于室温或36±1°C恒温箱,若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。亦有主张在48~50°C水浴放置2h后判定结果者。
2)Barritt氏法:将试验菌接种于通用培养基,于36±1°C培养4天、培养液2.5ml先加入5°Cα萘酚(2-na-phthol)纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml,摇动2~5min,阳性菌常立即呈现红色,若无红色出现,静置于室温或36±1°C恒温箱,如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。
3)快速法:将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环,乳化接种于其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氢氧化钠水溶液2滴,振动后放置5min,判定结果。不产酸的培养物不能使用。
本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时,通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生,故应省去或以氯化钠代替。
4、甲基红(methylRed)试验
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖,在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸,进一步分解中,由于糖代谢的途径不同,可产生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物,可使培养基pH值下降至pH4.5以下,使甲基红指示剂变红。
试验方法:挑取新的待试纯培养物少许,接种于通用培养基,培养于36±1°C或30°C(以30°C较好)3~5天,从第二天起,每日取培养液1ml,加甲基红指示剂1~2滴,阳性呈鲜红色,弱阳性呈淡红色,阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。
甲基红为酸性指示剂,pH范围为4.4~6.0,其pK值为5.0。故在pH5.0以下,随酸度而增强黄色,在pH5.0以上,则随碱度而增强黄色,在pH5.0或上下接近时,可能变色不够明显,此时应延长培养时间,重复试验。
5、靛基质(imdole)试验
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合,形成玫瑰吲哚,为红色化合物。
试验方法:将待试纯培养物小量接种于试验培养基管,于36±1C培养24h时后,取约2ml培养液,加入Kovacs氏试剂2~3滴,轻摇试管,呈红色为阳性,或先加少量禁药或二甲苯,摇动试管以提取和浓缩靛基质,待其浮于培养液表面后,再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴,在接触面呈红色,即为阳性。
实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应,若先用二甲苯或禁药等进行提取,再加试剂,则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色,因而结果更为可靠。
6、硝酸盐(nitrate)还原试验
有些细菌具有还原硝酸盐的能力,可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。
试验方法:临试前将试剂的a(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面,立即或于10min内呈现红色即为试验阳性,若无红色出现则为阴性。
用α-萘胺进行试验时,阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。
7、明胶(Gelatin)液化试验
有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶),能将明胶先水解为多肽,又进一步水解为氨基酸,失去凝胶性质而液化。
试验方法:挑取18~24h待试菌培养物,以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天
观察结果,若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化,如确被液化,即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂,若为阳性,10~20min后,菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。8、尿素酶(Urease)试验
有些细菌能产生尿素酶,将尿素分解、产生2个分子的氨,使培养基变为碱性,酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶,因为不论底物尿素是否存在,细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。
试验方法:挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中,摇均,于36±1℃培养10,60和120min,分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面,不要到达底部,留底部作变色对照。培养2,4和24h分别观察结果,如阴性应继续培养至4天,作最终判定,变为粉红色为阳性。
9、氧化酶(oxidase)试验
氧化酶亦即细胞色素氧化酶,为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶,氧化酶先使细胞色素C氧化,然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化,产生颜色反应。
试验方法:在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴,阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色,ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。
10、硫化氢(H2S)试验
有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物,而产生硫化氢气体,硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。
试验方法:在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中,沿管壁穿刺接种,于36±1℃培养24~28h,培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋酸铅纸条法:将待试菌接种于一般营养肉汤,再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空,以不会被溅湿为适度;用管塞压住置36±1℃培养1~6天。纸条变黑为阳性。
11、三糖铁(tSi)琼脂试验
试验方法:以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物,穿刺接种并涂布于斜面,置36±1℃培养18~24h,观察结果。
本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气(变黄);产生硫化氢(变黑)。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄,但因量少,生成的少量酸,因接触空气而氧化,加之细菌利用培养基中含氮物质,生成碱性产物,故使斜面后来又变红,底部由于是在厌氧状态下,酸类不被氧化,所以仍保持黄色。
12、硫化氢-靛基质-动力(Sim)琼脂试验
试验方法:以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度,置36±1℃培养18~24h,观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性,混浊或沿穿刺线向外生长为有动力,然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面,静置10min,若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部,可作为对照。
本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选,与三糖铁琼脂等联合使用可显着提高筛选功效。
三、血清学试验
血清学反应是指:相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用,可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中,常用血清学反应来鉴定分离到的细菌,以最终确认检测结果。
血清学反应的一般特点:
1)抗原体的结合具有特异性,当有共同抗原体存在时,会出现交叉反应。
2)抗原体的结合是分子表面的结合,这种结合虽相当稳定,但是可逆的。
3)抗原体的结合是按一定比例进行的,只有比例适当时,才能出现可见反应。
4)血清学反应大体分为两个阶段进行,但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段,反应速度很快,只需几秒至几分钟反应即可完毕,但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段,表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢,需几分、几十分以至更长时间。而且,在第二阶段反应中,电解质、pH、温度等环境因素的变化,都直接影响血清学反应的结果。
习惯上将经典的血清学反应分三种类别:凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。
1、凝集反应
颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合,在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象,称为凝集反应(agglutinationreaction)。其中的抗原称为凝集原,抗体称为凝集素。在该反应中,因为单位体积抗体量大,做定量实验时,应稀释抗体。
1)直接凝集反应
颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的反应,称为直接凝集反应(Directagglutionreaction)。
a.玻片凝集法。是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴,在玻片上混匀,数分种后若出现肉眼可见的凝集块,即阳性反应,证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便,但不能进行定量测定。
b.试管凝集法。是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试管凝集试验。因为要测定抗体的含量,故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度,然后加入等量抗原,37℃或56℃,2~4小时观察,血清最高稀释度仍有明显凝集现象的,为该抗血清的凝集效价。
2)间接凝集反应
将可溶性抗原(抗体)先吸附在一种与免疫无关的,颗粒状微球表面,然后与相应抗体(抗原)作用,在有电解质存在的条件下,即可发生凝集,称为间接凝集反应(indirectagglutination)。由于载体增大了可溶性抗原的反应面积。当载体上有少量抗原与抗体结合。就出现肉眼可见的反应,敏感性很高。
2、沉淀反应
可溶性抗原与相应抗体结合,在有适量电解质存在下,经过一定时间,形成肉眼可见的沉淀物,称为沉淀反应(precipitation)。反应中的抗原称为沉淀原,抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大,为了不使抗原过剩,故应稀释抗原,并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。
1)环状沉淀反应:是一种定性试验方法,可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中,然后沿管壁徐徐加入等量抗原,如抗原与抗体对应,则在两液界面出现白色的沉淀圆环。
2)絮状沉淀反应:将已知抗原与抗体在试管(如凹玻片)内混匀,如抗原抗体对应,而又二者比例适当时,会出现肉眼可见的絮状沉淀,此为阳性反应。
3)琼脂扩散试验:利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散,若抗原抗体对应,且二者比例合适,在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体,就可分别形成几条沉淀线。琼脂扩散可分为单向扩散和双向扩散两种类型。单向扩散是一种定量试验。可用于免疫蛋白含量的测定。而双向扩散多用于定性试验。由于方法简便易行,常用于测定分析和鉴定复杂的抗原成分。>
不同微生物菌落特征篇7
1肠道微生物概述
人体正常的肠道微生物群落主要由细菌、古菌和真核生物等构成，其中99%都是不能通过传统方法培养的。这些微生物平均重量约1.5kg，相当于肝脏的重量，数目达1012~1014个，是人体自身细胞数目的10倍。我国华大基因公司针对欧洲人群的肠道微生物宏基因组测序证实，人类肠道微生物基因数目是人类基因的150倍，其中超过99%的基因来自细菌，共发现1000-1150种常见细菌，其中78%是新发现的。人类肠道微生物宏基因组分为以拟杆菌属、普里沃菌属和瘤胃球菌属为代表的3个肠型。该研究认为肠型和血型一样，与年龄、性别、种族、体重指数以及地域环境无相关性。
肠道微生物构成具有时间和空间特异性。新生儿在出生后几小时内即有产道来源的细菌在肠道定植，顺产婴儿早期肠道微生物构成与母亲阴道内微生物构成具有相似性，而剖宫产婴儿则不同[5]。1岁左右婴儿的肠道微生物即可达健康成人水平。人体肠道内的微生物绝大部分定植于结肠，数目达1012cfu/ml，空肠、回肠及十二指肠含量依次降低，分别为107、104、103cfu/ml，并且各部位富含的微生物种类也存在差异。另外，肠道黏膜和粪便相关微生物的构成也不尽相同。
2肠道微生物与消化系统疾病
2.1炎症性肠病（iBD)iBD是一种病因尚不明确的慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（UC)和克罗恩病（CD)。该病通常反复发作、迁延不愈，目前临床上仍无特效的治疗手段。近年研究认为肠道微生物及其代谢产物、宿主基因易感性以及宿主肠道黏膜天然性或者获得性免疫应答失衡等3个方面共同参与了iBD的发病机制。
基于动物模型的研究证实了肠道在无菌环境下不会出现炎症，但如重新恢复肠道正常菌群状态，则可出现肠道炎症，提示肠道菌群成分的存在对iBD发病是不可或缺的。有研究证实，回肠黏膜上皮黏膜侵袭性大肠埃希菌、副结核分枝杆菌与CD关系密切；沙门菌属、空肠弯曲菌属等相关致病菌感染可能增加iBD发生或复发的风险[11]。肠道微生物代谢产物在iBD中也发挥着重要作用。例如：丁酸不仅是肠道上皮细胞能量的主要来源，也可阻止促炎症细胞因子表达的信号传递途径；产丁酸菌能改善大鼠模型肠道炎症和坏死情况，给予大鼠产丁酸菌的培养上清液可改善肠道炎症反应。有研究证实iBD患者肠道内柔嫩梭菌、球形梭菌等产丁酸菌含量减少，同时对丁酸的利用率降低。
目前，诸多研究已经证实iBD患者与健康个体的肠道微生物种类和丰度存在差异，iBD患者肠道微生物多样性较健康人群显著降低。Frank等利用基于宏基因组学策略的16SrDna测序技术分析了CD和UC患者肠道各部位的菌群构成，证实CD和UC患者存在肠道菌群构成改变，主要表现为拟杆菌门和硬壁菌门含量降低。ott等对iBD急性期患者结肠各部位的活检标本菌群构成进行了基于16SrDna的单链构型多态性检测，发现CD患者肠道微生物多样性降低至50%，UC患者降低至30%，肠道正常厌氧菌如拟杆菌属、真细菌属、乳杆菌属等减少。manichanh等对恢复期⑶患者粪便菌群构成进行了16SrDna测序分析，结果发现⑶患者硬壁菌门多样性显著降低，特别是柔内梭菌、球形梭菌丰度较低，而拟杆菌门变化不大。由我国华大基因研究院负责的对欧洲124个成人个体进行的肠道宏基因组测序工作已经完成，该研究证实iBD患者与健康个体间的细菌丰度存在差异，非冗余的细菌基因在iBD患者与健康个体中亦存在差异。
抗生素对部分iBD的有效性证明了肠道微生物在iBD发病机制中的作用，但益生菌制剂治疗iBD的效果不一，总体来看，益生菌治疗UC可能有效，但对于CD的治疗效果并不明显，关于益生菌制剂治疗iBD的效果则有待进一步观察和验证。
虽然已经证实iBD患者肠道微生物构成发生了改变，但究竟是哪种细菌或者微生物群落构成导致iBD的发生发展仍不清楚。另外，肠道微生物构成改变与iBD之间的因果关系目前仍无定论。iBD疾病本身及其治疗方式，以及饮食环境等因素均可影响肠道微生物构成，明确肠道微生物在iBD发病机制中的作用尚需时日。
2.2结直肠肿瘤肠道微生物在人类宿主中的致癌作用越来越受到重视。目前认为导致结直肠肿瘤发生发展的机制主要有以下3个方面:①肠道微生物使肠道黏膜促炎症反应信号传导机制异常，导致肠道黏膜上皮损伤修复加剧，最终出现瘤形成和恶变；②某些微生物种属对肠道黏膜上皮细胞具有直接的细胞毒性作用，或者通过旁观者效应发挥毒性作用；③某些肠道微生物在参与营养物质代谢过程中的产物对肠道上皮细胞具有毒性作用，受损肠道黏膜上皮的不完全修复可导致其致瘤性转化。
目前已知的可能与结直肠肿瘤有关的肠道微生物主要有牛链球菌、拟杆菌属的某些种（如脆弱拟杆菌）、败血梭菌、大肠埃希菌的某些种，其他链球菌属如唾液链球菌、血链球菌和粪肠球菌等，相关病毒主要有人乳头状瘤病毒、多瘤病毒属、eB病毒和巨细胞病毒等。肠道微生物代谢产物如丁酸、甲烷等可能在结直肠肿瘤中发挥有益作用。丁酸是肠道上皮细胞用以维持细胞稳定性和正常细胞表型的重要能量来源，可通过组蛋白超乙酰化抑制肿瘤生长和激活细胞凋亡研究发现结直肠肿瘤高危人群肠道内短链脂肪酸和丁酸盐含量显著降低。另外，肠道内产甲烷菌可产生无细胞毒性的甲烷，有研究发现结直肠肿瘤低风险人群肠道内甲烷含量增多。肠道微生物代谢产生的硫化氢和氢气等则作为有害产物发挥作用。
诸多研究证实结直肠肿瘤人群与健康人肠道微生物构成存在差异。采用16SrDna变性梯度凝胶电泳和核糖体内源性间隔段分析方法对结直肠癌和腺瘤性息肉病患者肠道微生物构成进行分析，结果发现结直肠癌及腺瘤性息肉病患者肠道内微生物多样性和优势菌群降低，但柔嫩梭菌和球形梭菌的多样性显著增加。Sobhani对6例结直肠癌患者和6例健康人进行了基于焦磷酸高通量测序技术的16SrDna测序分析，结果发现结直肠癌人群中肠道拟杆菌门/普里沃菌属较健康对照组增多。
有研究提出通过分子生物学方法检测肠道微生物分布可以对结直肠肿瘤的发生风险程度进行早期预警[23]，提示通过大样本的人群流行病学研究，有可能找到结直肠肿瘤人群的肠道微生物构成和代谢特征，为结直肠肿瘤的早期发现及预防带来全新的思路和方法。
2.3肠易激综合征（iBS)既往公认的观点认为iBS是一种功能性胃肠道疾病，但是越来越多的证据表明iBS是一种免疫-炎症模式的胃肠道疾病，微生物导致的肠道局部持续性、低级别的炎症反应状态是其病理生理学基础。目前，流行病学和临床资料均表明肠道微生物与iBS的关系密切，表现在以下几个方面：①基于动物模型的研究已经证实肠道微生物失衡可导致胃肌轻瘫、小肠转运时间延迟、结肠扩张等胃肠道功能紊乱；②iBS人群肠道微生物构成和数量与健康人群存在差异；③iBS人群肠道微生物代谢产物含量异常；④部分iBS与早期罹患急性胃肠炎即感染后iBS有关；⑤iBS可能伴随小肠内细菌过度生长，且两者症状相似；⑥益生菌制剂可调节iBS患者肠道菌群，缓解iBS相关症状；⑦抗生素临床试验性治疗iBS可能有效。
基于传统培养、16SrDna文库分析、实时定量pCR以及Dna微列阵等技术的研究证实，iBS人群肠道微生物的构成和数量均发生了改变，目前较为一致的结论有：①肠道中优势菌群含量显著降低；②肠道微生物多样性和稳定性普遍降低；③肠道乳杆菌和双歧杆菌等益生菌种含量降低；④腹泻型iBS较便秘型iBS患者肠道微生物构成和数量变化更明显；⑤黏膜相关微生物对人体宿主的作用更直接，而粪便样本微生物决定了肠道微生物的代谢产物，两者的微生物构成和数量无显著差别；⑥腹泻型iBS、炎症性肠病及其他腹泻性胃肠道疾病患者肠道微生物的构成和数量改变具有相似性。
最近开展的几项采用高通量测序技术对iBS患者粪便菌群进行分析的研究值得我们注意。Jeffery对37例iBS患者和20名健康人的粪便菌群进行了基于宏基因组学策略的16SrDnaV4区域焦磷酸测序，并未发现iBS特异性的相关菌群变化，仅部分iBS亚型患者粪便菌群变化与临床表型相关，iBS患者粪便中硬壁菌门和拟杆菌门的比例增加。采用16SrDna焦磷酸测序和基因微列阵方法对22例iBS儿童进行了粪便菌群分析，发现iBS儿童Y-蛋白菌含量较健康对照组显著增高，类瘤胃球菌属的某些菌种与iBS关系密切，来自alistipes种属的细菌丰度高低与疼痛发作频率呈正相关。虽然上述两项研究结论不一，但宏基因组学研究的兴起和高通量测序技术的不断发展，使全面深入了解iBS相关肠道菌群变化成为可能，并有助于揭示肠道菌群在iBS中的作用机制及其潜在的诊断和治疗价值。
2.4乳糜泻乳糜泻是一种因遗传易感宿主对麦胶不耐受而引起的小肠黏膜慢性炎症反应性疾病，属于自身免疫性疾病范畴，任何年龄均可发病，以儿童多见。小肠内微生物作为重要的环境因素，在乳糜泻发病机制中的作用正逐渐受到重视，肠道致病微生物感染或构成失衡均可触发肠道持续性的炎症反应，使肠道免疫学稳态受损。^1&40等[28]基于十二指肠黏膜活检样本的研究证实，接受麦胶饮食和不含麦胶饮食的乳糜泻患儿小肠内拟杆菌属和肉嫩梭菌属丰度较健康对照组高，且接受麦胶饮食的患儿肠道内大肠埃希菌和葡萄球菌属含量显著增高，而双歧杆菌含量降低。De卩&1咖等[29]基于粪便样本的研究发现乳糜泻患儿肠道内拟杆菌属含量升高，而双歧杆菌、溶组织梭菌、象牙海岸梭菌等含量降低。上述小肠微生物构成的改变可能参与了乳糜泻的病理生理过程。
2.5肝硬化肝硬化是慢性肝脏疾病的病理学终末期表现，肠道微生物、肠通透性增加、细菌易位、内毒素血症和炎症细胞因子释放等因素均可影响肝硬化及其并发症的发生发展。早期基于传统培养方法的研究发现，肝硬化患者肠道内双歧杆菌等有益菌种含量降低。采用基于宏基因组学策略的16SrDna焦磷酸测序技术对肝硬化患者的粪便菌群进行了分析，发现肝硬化患者粪便内拟杆菌门含量较健康对照组显著降低，蛋白菌和梭杆菌门含量增加，在科(Familia)水平上表现为肠杆菌科、韦荣球菌科和链球菌显著高于健康对照组，但毛螺菌科显著降低。该研究还认为肝硬化患者肠道内肠杆菌科和链球菌科等潜在致病菌含量增多，毛螺菌科等有益菌种含量降低，影响着肝硬化患者的预后。
2.6非酒精性脂肪性肝病（naFLD)naFLD是最常见的导致慢性肝损伤的原因之一，遵循脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌的疾病发展过程。naFLD常常是代谢综合征的肝脏表现。
naFLD的发病机制可能与胰岛素抵抗、痩素抵抗、脂质过氧化、炎症反应等因素相关，目前有诸多证据表明肠道微生物参与了naFLD的发生发展过程。8&5&技等证实与健康人群相比，naFLD患者小肠细菌过度生长发生率明显增高，且与脂肪肝严重程度相关。小肠细菌过度生长可促发胰岛素抵抗和胆碱缺乏等情况。肠道微生物通过脂多糖(LpS)而诱发肥胖相关的机体炎症反应和胰岛素抵抗；高脂饮食促使LpS从肠道转运至门静脉系统，并引起肠道微生物的构成和数量改变，增加肠道通透性，提高血浆内毒素水平。最近，Henao-mejia等研究证实，nLRp6和nLRp3炎性体及效应蛋白iL-18可通过肠道微生物抑制naFLD的发展，由于炎性体缺失而引起的肠道菌群变化与naFLD的严重程度相关，这种关联是通过tLR4和tLR9激动剂进入门脉循环，导致tnF-a表达水平升高而实现的。益生菌制剂可调节肠道菌群，产生抗菌物质，提高肠上皮屏障功能及降低肠道炎症反应，因此可能对naFLD的治疗有效。
目前有关肠道微生物在肥胖、糖尿病和代谢综合征等疾病中的作用研究比较多，虽然naFLD与上述疾病有所重叠，但作为一个单独的疾病，了解naFLD时肠道微生态的特征性改变非常有必要，不仅可以深化对其病因、发病机制等的认识，也可为进一步临床干预提出新的策略。
2.7胆石症胆固醇和胆汁酸的代谢及分泌异常是胆石形成的主要原因，肠道微生物引起肠道运动功能障碍和慢性炎症反应同样在胆石形成过程中发挥着重要作用。胆石形成过程中常存在胆汁受到肠道细菌污染的问题，传统培养方法证实污染胆汁的细菌以肠杆菌科为主，链球菌属也较为常见;胆道梗阻时肠通透性增加、细菌易位是胆汁中出现细菌、炎症反应增强和结石形成的原因之一;同时细菌污染可导致胆汁淤积，同样可促进结石形成。2.8急性胰腺炎急性胰腺炎时肠道微生物构成失衡，致病菌过度繁殖，肠屏障功能破坏以及细菌或内毒素易位是导致继发感染和死亡的主要因素。证实急性坏死性胰腺炎伴有消化间期移行运动复合波延长和小肠细菌过度生长，并且胰腺炎严重程度与十二指肠细菌过度生长之间呈正相关。mifkovic等认为肠道细菌易位是胰腺脓肿形成的主要原因。De发现20%的急性胰腺炎患者血清内革兰阴性菌Dna阳性，证实肠道微生物及细菌易位在急性胰腺炎的发病中发挥作用。
目前诸多抗生素预防胰腺炎相关并发症的临床实验研究结论不一，说明肠道微生物及其易位在急性胰腺炎的发生发展中发挥一定作用，但消除其影响并不能有效逆转或阻止急性胰腺炎的进程，肠道微生物在急性胰腺炎中的作用还需深入研究。
3肠道微生物与内分泌系统疾病
有关肥胖、糖尿病、代谢综合征的病因学观点普遍集中在遗传易感性、不良饮食习惯和体力活动减少等方面，在遗传背景及能量摄入相同的条件下，高热量摄入诱导的体重增加和血糖升高表现并不相同，提示存在着与人类基因不相关的其他因素影响着肥胖和胰岛素抵抗的易感性。近年来的研究证实肠道微生物参与了肥胖及胰岛素抵抗的发生。关于肠道微生物在肥胖、糖尿病和代谢综合征中的作用逐渐成为研究热点。
3.1肥胖随着肥胖人数的不断增加，肥胖及相关代谢疾病已成为现阶段对公共健康的极大挑战。学者们普遍认为肥胖是一个复杂的多种遗传背景和环境因素相互作用的结果。肠道微生物是除遗传因素和饮食影响以外导致体重增加和脂肪积聚的独立危险因素。无菌动物需要更多的能量摄取才能维持与普通动物相同的体重，说明肠道微生物可以增加摄入食物的能量利用率。肠道微生物一方面可从人体摄入的不消化寡糖类中摄取能量，另一方面可通过调节肠道上皮细胞营养吸收功能而促进营养物质的吸收和利用。
美国Gordon实验室在肠道微生物和肥胖关系研究方面做了大量工作，他们证实肠道微生物直接参与了宿主能量的摄取、利用和储存。饮食等因素相同的条件下，与同窝出生的消痩小鼠（ob/+和+/+)相比，脂联素敲除的遗传性肥胖小鼠（ob/ob)肠道拟杆菌门丰度降低了50%，而硬壁菌门丰度升高。为了验证肠道微生物构成改变是导致肥胖的原因，如^匕&叫匕等[47]将肥胖和消痩小鼠肠道菌群移植到无菌小鼠肠道内，2周后，接受肥胖小鼠肠道菌群的无菌小鼠能从饮食中摄取更多的能量，体重明显增加，同时肥胖小鼠粪便内残余能量较少，提示肠道内肥胖相关微生物从食物中摄取能量的能力较强。
部分基于人体的研究也证实肥胖者肠道微生物构成发生改变，可能是导致肥胖的原因。Ley等[48]比较了12例肥胖者和12例非肥胖者肠道微生物构成的差异，证实肥胖人群肠道拟杆菌门丰度降低，而硬壁菌门丰度升高，与动物模型中的变化趋势一致。另外，肥胖者减轻体重1年后，肠道菌群构成与非肥胖者相似。turnbaugh等[49]对成年肥胖、消痩双胞胎女性及其母亲（包括31对单卵双生女性双胞胎、23对双卵双生女性双胞胎和46位母亲）的粪便相关微生物群落进行基于宏基因组学策略的16SrDna测序分析，发现肥胖者肠道微生物多样性显著降低，拟杆菌门比例降低，而放线菌纲比例升高；同时该研究证实肠道微生物群落具有家族成员聚集现象，但个体间仍具有细菌种属的差异。
3.21型糖尿病1型糖尿病是一种主要由t细胞参与的自身免疫性疾病，通过t细胞破坏胰岛p细胞，使之无法产生胰岛素而造成血糖升高，其发病机制至今没有阐明。近年来的观点认为1型糖尿病与肠道微生物和肠道免疫的关系密切。
61叫=30等[5()]采用FiSH技术对1型糖尿病大鼠(BB-Dp)肠道微生物构成进行分析，发现与未出现糖尿病的大鼠相比，最终罹患1型糖尿病的BB-Dp大鼠肠道内拟杆菌门数量增加，且这种肠道微生物构成改变在发病前就已长期存在；同时该研究证实BB-Dp大鼠接受标准饮食和抗生素后，1型糖尿病发病率降低50%，而接受高酪蛋白饮食和抗生素治疗组未出现1型糖尿病。Calcinaro等[51]给予非肥胖糖尿病小鼠（noD)益生菌VSL#3(乳酸杆菌、链球菌和双歧杆菌的混合制剂）治疗，发现益生菌制剂可使局部和全身抗炎症细胞因子iL-10含量增加，减轻noD小鼠胰岛和p细胞的破坏，进而预防1型糖尿病的发生。16=等[52]研究发现，myD88敲除的SpF级noD小鼠不会发展为1型糖尿病，而myD88敲除的GF级noD小鼠会出现1型糖尿病，但GF级n0D小鼠肠道内出现特定菌群定植时，可以阻止糖尿病的发生。另外该研究还发现myD88敲除的noD小鼠肠道微生物构成发生显著改变，因此认为肠道微生物及其与宿主先天性免疫系统的相互作用是发生1型糖尿病的重要影响因素。上述研究提示，以肠道微生物为靶点，从肠道微生物与天然免疫系统的相互作用这个角度进行研究，可能是进行1型糖尿病和其他自身免疫性疾病发病机制研究及治疗的新途径。
3.32型糖尿病近年有观点认为2型糖尿病是以持续性、低级别炎症反应为特征的代谢性疾病，肠道微生物在其中发挥着重要作用。肥胖、代谢综合征和非酒精性脂肪性肝病等其他代谢相关性疾病可能都具有上述特征。小鼠在接受高脂饮食后易出现内毒素血症，罹患2型糖尿病的风险也增高，而且肠道内双歧杆菌的含量较正常饮食小鼠降低。在另外一项研究中给予高脂饮食小鼠益生元治疗后，肠道双歧杆菌数量恢复，机体内毒素血症、炎症水平、葡萄糖耐量和胰岛素分泌等均得到改善。
有研究证实肠道微生物参与了胰岛素抵抗的发生过程。8化他64等[55]将普通大鼠的肠道菌群移植到裸鼠肠道内，发现裸鼠在2周内即出现了胰岛素抵抗，其机制考虑与肠道内葡萄糖的吸收增加有关，其过程是肠道菌群对食物中不能被消化的营养物质进行酵解，例如短链脂肪酸经肠道菌群酵解为葡萄糖后经肠道吸收，伴随高血糖和高胰岛素血症，这两个因素又促进脂肪形成。001^3等[56]认为肠道微生物通过调节胆碱代谢而影响胰岛素抵抗，胆碱至三甲胺的代谢途径主要受肠道微生物调节，该研究推测胰岛素抵抗加剧与肠道微生物介导的胆碱至三甲胺的代谢水平升高有关。
3.4代谢综合征代谢综合征主要表现为与肥胖和胰岛素抵抗相关的代谢异常，能增加个体罹患2型糖尿病和心血管疾病的风险，其发病与遗传、饮食和环境等多种因素有关。近年来的研究认为肠道微生物及宿主肠道先天性免疫系统可能参与了代谢综合征的发生发展过程。Vijay-Kumar等[57]发现toll样受体5敲除小鼠表现出摄食过度并出现代谢综合征相关症状，如高血脂、胰岛素抵抗、高血压和肥胖，将toll样受体5敲除小鼠的肠道微生物移植到无菌小鼠肠道内，后者也会出现代谢综合征的表现，提示肠道微生物可通过先天性免疫系统诱发代谢综合征。
4肠道微生物与心血管系统疾病
20年前即有研究认为肠道和口腔内的微生物与心血管疾病具有相关性。动脉粥样硬化与巨细胞病毒、幽门螺杆菌以及衣原体等致病微生物的关系已有报道，但抗生素治疗改善心血管疾病的效果并不明显，同时有研究发现无菌小鼠感染致病微生物后，粥样硬化斑块发展程度无明显改变。目前有观点认为动脉粥样硬化是一种炎症性疾病，高脂饮食及其伴随的内毒素血症和血管内免疫是重要的始动和影响因素，肠道微生物可能通过激活受体信号传导通路来影响动脉粥样硬化的发生和发展。受体基因多态性的个体，其罹患动脉粥样硬化的危险性降低。myD88敲除小鼠可通过减少巨噬细胞浸润和泡沫细胞形成而延缓动脉粥样硬化的发展。胆固醇血症患者益生菌治疗后，其低密度脂蛋白和纤维蛋白原水平显著降低。1&=8等[64]指出，食物磷脂类或胆碱物质在肠道微生物作用下生成代谢产物胆碱、氧化三甲胺和甜菜碱，上述代谢产物能够促进动脉粥样硬化的发生发展，其血浆内含量与心血管疾病的发病风险成正相关，可通过测定血浆中上述代谢产物的含量来预测心血管疾病的发病风险。
5肠道微生物与获得性免疫缺陷综合征(aiDS)
aiDS是由人类免疫缺陷病毒（HiV)引起的致命性慢性传染病，HiV主要侵犯⑶4+t淋巴细胞，导致其数量呈进行性减少。有研究证实aiDS病程中的CD4+t淋巴细胞破坏大部分发生在胃肠道黏膜淋巴组织，HiV感染早期即可出现肠道黏膜⑶4+t淋巴细胞的大量消耗，进而影响肠道内环境稳态[65.]。Brenchley等[67]发现HiV长期感染患者血浆脂多糖水平显著升高，指出肠道微生物易位是慢性HiV感染系统免疫激活的原因之一。。。^等―指出HiV感染早期即出现以铜绿假单胞菌和白色念珠菌含量显著升高、双歧杆菌和乳酸菌含量降低为特征的肠道微生物构成改变，同时伴有肠道免疫指标的升高。其后续研究又证实寡糖类益生元能显著增加HiV感染人群肠道有益菌种的含量，减少致病菌的定植，同时能有效改善aiDS患者的相关免疫学指标[69]。
总之，肠道微生物可能是参与aiDS发病机制的关键因素，从人类宿主肠道和肠道微生物角度进
行研究，有望加深我们对aiDS发病机制的理解，改进和完善aiDS的治疗措施。
6肠道微生物与特应性疾病
Strachan[?]提出的卫生学假说认为家庭成员、卫生措施、胎次、抗生素应用、饮食及生活方式改变等是影响个体微生物暴露程度的主要因素，也是目前湿疹、花粉症和哮喘等特应性疾病流行的主要原因。妊娠期母亲暴露于各种环境特别是微生物环境的刺激下，对婴儿出生后免疫功能的构建，以及后续特应性疾病的发生发展具有重要作用。Schaub等证实在怀孕期间暴露于农场和耕作动物的母亲，其孩子发生哮喘和其他特应性疾病的概率降低，主要与调节性t淋巴细胞参与的天然性免疫功能构建有关。noverr等提出了特应性疾病的肠道微生物假说，认为肠道微生物构成异常能增强免疫系统对常见过敏原的反应，增加哮喘和其他特应性疾病的发病风险。等证实婴儿肠道内大肠埃希菌丰度增加可导致湿疹的发生率升高，艰难梭菌数量增多可增加罹患哮喘、湿疹及其他特异性皮炎的风险。
7肠道微生物与精神性疾病
肠道微生物可影响行为和中枢神经系统功能。有研究证实致病微生物感染与自闭症和精神分裂症等常见神经发育障碍之间的关系密切[74]。8&^16〖等[75]指出胃肠道功能异常在自闭症起始前已经存在，给予万古霉素治疗可改善自闭症症状，但停药后即可复发。自闭症患儿肠道中梭菌的某些种，如产神经毒素的破伤风梭菌含量显著高于健康对照组]。动物模型也证实围产期暴露于致病微生物后可引起焦虑行为和认知功能受损[77_78]。Heijtz等[79]指出肠道正常微生物作为重要的环境因素影响着大脑的发育和功能。在大鼠模型上证实属于肠道正常微生物的婴儿双歧杆菌可调节色氨酸的代谢，可能具有潜在的抗抑郁作用。此外，肠易激综合征作为功能性肠道疾病，常伴有焦虑、抑郁等精神症状[，同时可出现肠道微生物构成的变化，说明肠道微生物与神经系统存在相互作用的通路。
8肠道微生物与类风湿性关节炎
类风湿性关节炎是一种病因未明的，以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病，其发病不但与人类主要组织相容性复合物和白细胞抗原等遗传因素有关，与环境因素也存在密切关系。早期有关反应性关节炎的研究已经证实滑膜组织内可出现耶尔森菌、沙门菌、志贺菌和弯曲杆菌等致病菌的降解产物，从而引起局部的炎症反应。人类肠道内正常微生物同样可引起易感宿主关节滑膜组织的炎症反应，外周白细胞和关节组织内均可见正常菌群细胞壁的降解产物;肠道正常微生物中某些细菌种属的细胞壁降解产物在动物模型上也具有致关节炎作用。Vaahtovuo等证实类风湿性关节炎早期患者肠道中双歧杆菌、拟杆菌属-紫单胞菌属-普里沃菌属、脆弱拟杆菌属某些亚型和直肠真细菌-球形梭菌属等含量显著降低，与健康人群存在较大差异。同时有研究认为类风湿性关节炎患者肠道微生物的变化趋势与炎症性肠病相似。上述内容均证实肠道微生物作为重要的环境因素可能在类风湿性关节炎的发病机制中发挥着重要作用。
不同微生物菌落特征篇8
目前普遍的看法是：城市污水系统主要是由污水收集系统（排水管网）和污水处理系统（污水厂）两部分组成，而且它们各自的功能划分十分明确，下水道管网的主要功能是收集与输送污水，而污水厂的主要功能则是净化污水。
实际上，城市污水系统对污水的净化并不是在污水到达污水处理厂时才开始的，从污水进入污水管网的那一刻起，污水系统对污水的净化就已经开始了，污水管网对于污水处理厂来说，其作用不仅仅只是一个“供应站”，它同时也扮演了一个巨大的中间反应器的角色，对一些排水管道内壁生物膜的大量测试表明：原污水中和下水道管内壁已存在着大量高活性的微生物，管道中的生物不断发生着细菌增殖、适应及选择等生物过程，从而在污水输运过程中诱导出活性很强的微生物群落。
大量研究表明：排水管渠内表面已存在着大量微生物，其生物群落组成类似于超高负荷曝气池中的生物群落。特别是在有氧条件下，污水在管道内流行过程中，污水中的微生物几乎能够附着到所有与污水接触的固体表面，这些附生微生物往往包埋在浓稠的细胞外化合物基质中，构成一个结构和功能的整体，称之为下水道生物膜。这层生物膜不仅能够有效的降低污水中的有机物质，而且具有较高的生物活性。
2.下水道生物膜的形成演化
下水道生物膜的出现与时间密切相关，不同水质的下水道中生物膜微生物的种类和数量及其表现出来的群落特征相差很大。据此，将下水道生物膜的形成演化划分为以下五个连续的阶段。
①附生介质（生物膜载体）表面性质的改变
不同材料的污水管道与原污水接触后，水中各种物质，如各种细菌微生物、蛋白质、聚多糖等可能通过疏水作用、表面化合反应等作用吸附到下水道管网内壁，吸附速率取决于水中有机物质的含量、水流特征等。
发生吸附的有机物对管壁的表面粗糙度影响不大，但它们改变了管道的表面电荷和疏水性等表面特征，同时提供了细菌等微生物生长所需的营养物质，为它们发生粘附创造了有利条件。
②微生物的可逆性粘附
在下水道内流动的污水中含有各种各样的微生物和有机质，受范德华力、静电力的相互作用，在氢键、偶极矩、色散力等理化作用力的控制下，部分个体与管壁接触，进而发生粘附。但这些粘附个体仍作布朗运动，在水流冲击下很容易解除粘附，处于一种不稳定的可逆粘附状态。发生可逆性粘附的微生物和有机质都来源于污水中的悬浮性物质，因而水中微生物的种类和数量及其生理状态决定可逆性粘附的发生速度和发生程度。
③微生物不可逆粘附
发生可逆性粘附后，有些粘附个体分泌大量具有粘合作用的细胞外化合物，它们将微生物、有机质和下水道管壁紧密联系在一起，从而使粘附具有不可逆性。微生物发生不可逆粘附是附生生物膜发育过程中的关键阶段。这些经受住下水道内较高流速水力冲刷的微生物逐渐形成为结构复杂的生物膜。
④表面微群落、生物膜的形成
在下水道生物膜形成初期，下水道附生微生物斑块状散布在管道内壁上。由于数量少，加上流动水体源源不断的“运送”各种营养物质，微生物间不存在对营养物质和空间上的竞争，因而分裂增生速度快，形成的菌落或细胞群体连接成片，相对均匀地覆盖在管道内壁。随着细菌微生物的继续粘附及粘附个体的不断增生，下水道内管壁生物群落逐渐复杂化。物种组成上，粘附生物种类增加，甚至在水中有机质降低到一定程度时，原生动物也出现在膜表层；在结构上，管壁生物群落逐渐向外伸展，由突出的二维平面变为垂直的三维立体，发育良好时还出现明显的分层现象。
⑤生物膜的脱落和扩散
在膜的增长期内，当微生物的粘附速度超过微生物的降解速度时，粘附管壁生物量就不断增加。但当膜生长到一定厚度后，由于较大的阻力而阻止了基质，尤其是溶解氧向其纵深的扩散传递，当生物膜超过一定厚度后，其内部将出现厌氧区。结果膜深处的出现缺氧状况，厌氧区的出现容易造成nH4+、CH4、H2S及有机酸的积累，若这些物质不能够及时向外传递，将逐渐影响生物膜的活性和在载体表面的附着程度，甚至导致生物膜的异常脱落。从而引起膜大块脱落，这种现象在营养丰富的环境中非常普遍。
水力冲刷也是引起生物膜脱落的重要原因。生物膜外层结构较为疏松，在向外伸展的过程中，水流不断地将其冲走，这同样使得下水道生物膜不能无限制地增厚。细菌和微生物在粘附后发生各种各样的生理变化，尤其分泌的细胞外化合物的性质和数量发生变化以及细胞外酶的积累会破坏生物膜的稳定性。
3.下水道生物膜的物理特征
下水道生物膜是一个复杂的微生物系统。受生长时间和环境条件的影响，其结构和组成处在不断的变化之中，所表现出来的生物和物理特征也随之改变。
近年来，一些学者用共焦激光扫描显微镜（CSLm）下水道生物膜的三维结构，取得较好效果。
下水道生物膜的厚度及表面平整状况与水流强度有关。①在坡度较大、水流流速大的下水道管段，生物膜结构致密且均匀性好，生物膜的厚度不大，表面平整；②在坡度较小、水流平缓的下水道管段，下水道生物膜结构疏松且较大程度地向外垂直伸展，表面凹凸不平，表现出极强的异质性。这主要是各类丝状微生物伸入水流中获得营养物质和氧气而充分生长的结果。
下水道生物膜的密度随水流速度增加而增大，这可能与强水流对附生物种的选择以及膜内水分被水流挤压出来等因素有关。Hoehn和Ray发现，在膜生长期生物膜的密度较大，到达临界厚度后相对稳定在一个低值。此外，不同深度处的膜的密度也不一样，充分反映出生物膜空间结构的复杂性。
下水道生物膜的生物活性
对下水道生物膜的细菌进行种群密度和酶活性测定，是一种描述下水道生物群落活性的有效而实用方法，据此可以用生物学方法有效证明下水道内污水水处理过程和效果。
形成下水道生物膜的细菌微生物分泌细胞外聚合物的能力很强，细菌细胞常被厚厚的粘质外鞘包裹。在由这些细菌微生物形成的生物膜中，细菌占一小部分，而以各种细胞外化合物构成为主体。大量研究表明：下水道生物膜的生物量呈“S”形增长，即在生长初期，生物膜的生物量很小，随着时间延长，生物量逐渐积累并维持在一个相对稳定的水平。一些学者通过测定下水道生物膜的atp、蛋白质和脂肪含量、电子传递、氧在生物膜内的分布、同位素示踪、同化营养基质的能力，结果发现：附生在下水道生物膜内的微生物通常表现出比悬浮个体更高的代谢和酶活性，生长繁殖速度和呼吸速率等都呈增强趋势。生物膜内部，藻类、细菌和真菌等自养和异养微生物在空间上紧邻，彼此相互交换代谢产物，尤其藻类分泌的可溶性有机物为异养细菌等利用，引起微生物增生。
下水道生物膜是固定形式的膜系统，经对下水道生物膜的种群密度和生物活性的研究，发现其表现出来的性质与超高负荷活性污泥系统中的细菌活性相近，例如酪酶、m-和p-葡萄糖昔酶以及磷酸酶在基质转化方面，各种酶活性表现出相似的趋势。然而，L-丙氨酸-氨肤酶在高负荷活性污泥中却显示出极高的基质转化率。但是下水道生物膜细菌种群密度却比在二级废水处理厂高负异养菌数目高出一个数量级。下水道生物膜中有发达的真核生物机体存在，例如粘土霉菌、各种原生动物和后生动物。多年来，人们广泛应用这种生物膜系统去除碳和氮。Lemmer发现下水道生物膜所显示的种群密度和生物活性都是高活性的生物群落，它们的异养活性可与高负荷活性污泥相比甚至超出它们。并且与悬浮性微生物有机体相比，那些附着在生物膜上的微生物能够更好地抵抗如重金属之类的毒性物质。
4.利用下水道空间处理污水的展望
由于城市污水管道的管径大，管道长，污水在其中有相当长的滞留时间，而下水道中污染物质降解主要是通过管壁上附着的下水道生物膜来完成。
如果能够通过采用适当的技术措施增加管道内的微生物量和溶解氧的浓度，将使直接利用下水道管渠空间处理污水成为可能。
例如在我国的广大山地城镇地区，生活污水水量小、分布面广，污水排放零散，不利于污水的集中处理，而目前对这些污水进行处理所需的技术和资金都很缺乏，可以通过大力开发下水道管渠处理城市污水的简易、高效、低能耗工艺，以较少的投资削减较大量的污染负荷。另一方面，对于地形复杂和污染源分散的广大经济尚不发达的农村地区，如果利用下水道管渠空间处理污水，将有利于在有限的经济条件下有效地控制水环境污染。
参考文献
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不同微生物菌落特征篇9
人体内细菌种类繁多，数量巨大，已分离鉴定的细菌就达数百种，此外还有各种不同的亚种和菌株，同时还受到同样复杂、繁多的体内、体外因素的影响，因而人体微生态系统是一个非常复杂的系统，也可以说复杂性是人体菌群或人体微生态系统最基本的特征。那么，复杂的人体菌群在分布、演变及相互作用等等诸方面究竟遵循什么样的规律?菌群的复杂性后面是否隐藏有一定的“秩序”?菌群演变与人体的生理、病理过程有什么联系?如何进行诊断、处理，使菌群向有利于人体的方向演变?这些问题临床上每天都可碰到，常常令临床医师们十分困惑，难于入手，也一直是微生态学者十分关注的问题。
本文作者以微生态学基本理论为指导，对临床上各种微生态异常与菌群失调进行了大量的实际观察、分析，得出了一些带有普遍性的论点，可能有助于我们认识在菌群的复杂性后面隐藏的“秩序”，也有助于临床上对菌群失调进行诊断、处理。谨在此抛砖引玉，供同道们参考。
1 描述菌群的指标
要全面、准确地观察人体菌群的演变过程，首先就需要确定合适的观察指标。本文提出4个描述菌群的指标。总体上看，这4个指标能比较准确地反映出一个菌群的整体特征或整体性质以及相应微生境的特征；这几个指标的变化，还能在一定程度上反映出人体生理机能的变化与体内菌群演变的因果关系，因而与临床联系紧密，非常实用。这几个指标为：菌群密集度、菌群多样性、优势菌和机体反应性。具体检测方法有直接涂片染色观察、半定量培养与菌落计数这三种方法。
1.1 菌群的密集度(populationDensity)
指标本(微生境)中细菌分布、排列的密集程度，结合标本来源的微生境容积大小，可以反映出某微生态区域中菌群总生物量的大小。密集度是一个量的概念，菌群分析得出的每克或每毫升标本中的菌落数，实质上就是细菌的密集度。
一般来讲，菌群的密集度主要受两方面因素的影响，一是细菌的生长繁殖，其二是机体对体内菌群持续不断的机械性清除作用，如人体肠内容物的排空、尿液对尿道的冲刷、粘液的分泌流动、粘膜上皮细胞与皮肤角质层的不断脱落、纤毛运动等等，机体正常生理机能不断清出相应部位的细菌。细菌的生长繁殖产生一个增长速率μ，机体的清除作用则产生一个清除速率D，细菌量m与μ、D之间的关系可用下述公式来描述：
当菌群的增长速率大于清除速率D时，细菌密集度将增加，而当清除速率D大于增长速率μ时，菌群的密集度将逐渐降低。如新生儿口腔、肠道的细菌密集度在出生后迅速增加，但腹泻时肠内容物排泻加快、细菌密集度降低，等等。当菌群的增长速率μ与机体对其的清除速率D相等时二者相互抵消，细菌密集度将保持不变，正常人体结肠菌群在相当长的时期内保持稳定，说明各种细菌的生长繁殖速率都相同，都等同于结肠内容物的排泻速率。
菌群中不同细菌的增长速率即使只有细微的差异，在经过足够长的时间后，都会导致菌群内不同细菌比例的改变，最终导致菌群演替；机体对菌群清除速率的改变，同样会导致菌群的改变，这种改变往往更为迅速、更为严重、在临床上也更为常见，很多人体菌群异常，即与此有关。
新侵入人体的细菌在生长增殖前对人体微生境有一个适应期，适应期的长短与可利用营养物的丰富程度有关，可利用营养物越丰富，适应期就越短，表现为菌群增长前的延滞期短，菌群能迅速进入快速生长繁殖期，这时细菌在人体内定植下来的机率大；如果可利用营养物不足，细菌的适应期就将延长，当延滞期太长时，细菌来不及繁殖就会被清除出人体。进入成年人结肠的细菌即便存活下来，但因受到原籍菌群激烈的营养竞争而使生长前的适应期延长，以至于很少有机会生长繁殖就被排除出人体，因而外源性细菌在结肠内定植下来的机率极小；而有的新生儿出生后仅10余个小时，其口腔菌群就接近成人类型，表明菌群增长前的延滞期短，细菌很快就进入了生长繁殖期。转贴于
一般来说，细菌密集度可通过光镜下观察涂片染色标本中的细菌分布、排列来直接进行判断、分级，可满足临床诊断的需要，同时还可判断不同细菌种群间的大致比例。我们将细菌的密集度分为四级：
Ⅰ级(记为“+”)：油镜(放大倍数15×1000)观察每视野平均细菌数1个～9个，经换算标本中的细菌数约为105～6个/ml(G)。
Ⅱ级(记为“++”)：油镜(放大倍数15×1000)观察每视野平均细菌数10个～99个，经换算标本中的细菌数约107～8个/ml(G)。
Ⅲ级(记为“+++”)：油镜下每视野平均细菌数在100个以上光镜下观察细菌满视野，经换算此时标本中的细菌数约为109～10个/ml(G)。
Ⅳ级(记为“++++”)：光镜下观察细菌聚集成团、或密集覆盖粘膜上皮细胞，标本中细菌数在1010个/ml(G)以上。
也可采用菌落计数的方法来检查细菌的密集度，但在得结论时要小心，因为菌群的自然分布排列复杂多样，可以是单个或数个散在排列也可能是以微菌落的方式或菌膜(Biofilm)的方式密集排列，所以平板上的单个菌落既可以自单个细菌生长而来，也可以是由数十、数百甚至上千个细菌组成的微菌落生长而来。有动力的革兰阴性杆菌和无动力的阳性球菌比较，即使细菌个体的绝对数相同，因前者有动力细菌分布较为分散、CFU值高，而后者常积聚生长且很难人为使其分散，故CFU值会相差很远。另外细菌的生长还受培养基营养条件、培养时的气体条件等等的影响，涂片观察到的优势菌因培养条件的限制而不生长的情况就比较常见。基于上述原因，在检查细菌密集度时涂片直接观察是基础，有着细菌培养不能替代的独特价值。
1.2 菌群多样性(populationDiversity)
指某一菌群中所有细菌种类的多少，这也是一个非常重要的指标，但以前一直未受到重视。影响菌群多样性的因素也主要有两方面，一是菌群自身自胎儿出生开始的，从简单到复杂、由低级向高级的逐渐演变过程，导致菌群复杂性和多样性增加；二是微生境参数对菌群的选择压力或限制性微生境参数的作用使菌群多样性增加受到限制。从总体上看，菌群多样性主要反映了菌群所处微生境选择压力的大小。
机体对菌群的机械性清除作用，是最重要的决定菌群多样性的微生境参数之一，清除速率高，将使菌群演化停留在早期较为简单的阶段，不能进一步演进成为复杂的菌群，因而菌群多样性低如上、中段小肠菌群；酸度也是人体某些微生境重要限制性参数，如胃的低酸对胃和上段小肠的菌群都有重要的限制作用，阴道的酸性环境则对维持阴道菌群正常至关重要。机体内限制性微生境参数的改变，将不可避免地导致菌群的改变，这在很多菌群失调或微生态疾病的病理生理机制中都扮演着关键的角色。
一般来说，菌群多样性高、复杂的菌群，生活的微生境选择压力小，不同细菌之间关联度高，细菌间的相互作用在维持菌群稳定方面起着决定性的作用，使菌群具有较强的自身稳定性，能在一定程度上抵抗微环境参数的变化，对外源性细菌也有很强的抗定植作用；菌群多样性低、简单的菌群，一般生活在选择压力大的微生境，菌群内不同细菌之间的相互作用弱、菌群稳定性低，易随某些微环境参数的周期变化而发生周期性的激烈变化，如口腔菌群晨起时的量可比餐后高100倍～1000倍。决定这些部位微生境抗外源性细菌定植的首要因素是机体的防御能力，正常菌群的作用居次要地位甚至没有重要意义。
自然状态下的菌群其细菌密集度与多样性有很强的相关性，密集度高多样性通常也高；抗菌治疗下可以出现由耐药菌组成的密集度高而多样性低的菌群。光镜观察能比较准确地观察到
标本中的优势细菌，可籍此对菌群的多样性进行分级。细菌培养的方法检测菌群多样性的准确性和价值取决于培养方法和培养技术，其中选择性培养的方法对非优势菌也能查出来，但太繁琐、消耗太大，除非有特殊需要，否则意义不大。转贴于
根据光镜下观察细菌的形态，我们将菌群的多样性分为四级：
Ⅰ级(记为“+”)：能辨别1～3种细菌；
Ⅱ级(记为“++”)：能辨别4～6种细菌；
Ⅲ级(记为“+++”)：能辨别7～10种细菌；
Ⅳ级(记为“++++”)：能辨别11种以上细菌。
可按照以下方式记录细菌的形态：
以“G”表示革兰染色方法，在G的右上角以小写英文字母表示光镜下观察到的细菌染色和形态，具体为：革兰阳性小球菌，G+c(s)；革兰阳性大球菌，G+c(L)；革兰阳性小杆菌，G+b(s)；革兰阳性大杆菌，G+b(L)；芽孢杆菌，G+sp；革兰阴性短杆菌，G-b(s)；革兰阴性长杆菌，G-b(L)；革兰阴性弧形菌，G-v；革兰阴性梭形菌，G-f；酵母样真菌，G+Y。
再在G的右下角以阿拉伯数字表示同一大类但形态不同的细菌，如两种阴性球菌则分别记为G+c1、G+c2，等等。
非选择性细菌培养，通常只能检查出比较优势的细菌，选择性培养方法则只能检查出目标细菌，总的说来，培养的方法检查菌群多样性不如涂片染色镜检来得便捷而可靠。
1.3 优势菌(predominatingpopulation)
指菌群中生物量或种群密集度大的细菌，在很大程度上影响着整个菌群的功能及其对宿主的生理病理意义。
优势菌也与微生境的特征密切相关，以厌氧菌为优势菌的菌群，一般生存在清除速率较低的微生境，且菌群密集度、多样性也高；而以兼性/需氧菌为优势菌的菌群，一般生活在清除速率高的微生境，其菌群密集度较低、菌群多样性较低。由于菌群密集度低，这样的细菌有时很难称得上是“优势菌”；在酸性微生境中，耐酸、产酸的细菌成为优势菌。微生境的改变，可使优势菌发生替换，如便秘时大便优势菌群主要是革兰阴性厌氧菌，慢性腹泻时常见革兰阳性杆菌为优势菌，而在严重急性腹泻时大便中的优势菌为致病性细菌或某些兼性/需氧菌群。
抗菌药物是除机体内环境因素以外最常见、对人体菌群影响最大的作用因子，它直接抑制、杀灭敏感细菌，造成菌群的彻底破坏，或使菌群中的优势菌发生转换。康白教授等曾根据人体菌群在抗生素作用下发生异常的严重程度与自我恢复能力，将人体菌群失调分为三度，分别为可逆性的、无临床症状的i度菌群失调，不可逆的、有慢性临床症状的Ⅱ度菌群失调，和严重的、以急性临床病症为主的Ⅲ度菌群失调，可较好地衡量、评价抗生素对人体菌群的破坏程度。
正常生理微生境里的密集度高的优势菌与非优势菌比较，一般而言，前者具有较为重要的生理作用，而后者则具有较为重要的病理意义，如医院感染通常因人体微生态失调、体内非优势菌过度生长引起，了解、掌握优势菌与非优势菌转化的条件，对于感染的防治具有重要的现实意义。
优势菌可通过光镜观察与细菌培养的方法来进行检测，因光镜观察的方法不能准确鉴定细菌种类，所以这是细菌培养方法最能发挥作用的地方；其中，采用的培养条件和技术要确保标本中所有的细菌都能生长良好，这是关键。比较好的方法是选用两种或多种非选择性培养基平皿，每种平皿定量或半定量接种三个，分别在有氧、厌氧和微需氧的条件下培养；观察菌落生长最多的平皿，并从最末一个划线区倒向计数最末十个菌落，观察这十个菌落的特征并做涂片染色观察，与标本的涂片观察结果比较，即可准确诊断标本中的优势菌，临床上通常只需分纯、鉴定其中最多的2株～3株菌即可。
用选择性培养基培养出来的细菌种类，很多不是真正的优势菌。因此除非有特殊目的和要求，如分离致病性细菌等，我们不愿采用连续稀释、接种选择性培养基平皿培养、菌落计数的方法来做“菌群分析”，这种结果并不准确。
1.4 机体反应性
局部有无炎症，观察指标有无白细胞、脓细胞渗出，以及有无吞噬现象等，可在一定程度上反映出菌群的致病性。
上述前三个指标通常就可反映出某一菌群及其微生境的总体特征，第四个指标主要反映菌群的致病性或机体对菌群的炎性反应。描述任何一个菌群，至少都应包括上述四个指标，在这四个指标的基础上，根据菌群的特征性细菌(包括致病性细菌)、微生境特征、生理代谢特点、在人体内的分布、对人体生命活动的影响等等，可进一步对特定菌群进行界定、分型。
2 人体菌群分类
根据密集度、多样性、优势菌及机体反应性四个指标，可将人体内所有菌群分为四大类：
2.1 前驱性菌群(pioneerbacterialcommunity)
指进入(或侵入)无菌微生境的菌群，其中的细菌称为前驱菌。有两类重要前驱性菌群，一类是胎儿出生后最先在其体内定植的菌群，如新生儿出生后48小时的肠道菌群，由大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌等组成，其中大肠杆菌是优势菌；另一类是感染性菌群，如侵入粘膜下层、血液等无菌组织或器官的致病菌、条件致病菌等。
前驱性菌群的细菌密集度低于“++”，菌群多样性也在“++”以下，优势菌不定，机体反应性不定。
前驱性菌群通常是过渡性菌群，在演替过程中将被其它菌群取代，如新生儿一周后双歧杆菌数量大量增加，取代大肠杆菌成为新的优势菌，大肠菌演替成为厌氧发酵型菌群；侵入人体无菌部位的肠道杆菌、葡萄球菌、肠球菌等兼性需氧菌可在人体的无菌组织内形成微小感染灶，随之可继发厌氧菌侵入，并形成以厌氧菌为主的混合菌群，导致脓性感染灶形成。
若人体菌群因抗生素而严重破坏，停药后甚或用药过程中也有一个菌群的演替过程，这时的细菌相当于前驱菌，通常都是一些耐药性较强的条件致病性细菌，且很可能引起二重感染，这在院内感染的发生发展中有很重要的临床意义。
2.2 边际性菌群(marginalbacterialcommunity)
指主要由兼性细菌或需氧细菌组成的菌群，因这种菌群通常处于人体菌群演替的过渡性阶段，故称其为边际性菌群，也可叫做兼性——需氧性菌群。它具有以下特征：(1)总生物量较低(106～8CFU/ml)，细菌密集度+～++；细菌种类较少、多样性+～++；优势菌主要为需氧/兼性菌；(2)稳定性较低，其生物量、多样性和细菌种类等易受到机体内外因素的影响而发生剧烈变化。如口咽部菌群的生物量晨起时最高、餐后最低，二者可相差100倍，随人正常生活节奏呈周期性改变。(3)边际性菌群通常定植于人体机械性清除作用强、物质流动速率高的部位、包括小肠、口咽部、前尿道等。
边际性菌群的形成与维持，主要与人体正常生理机能如上皮细胞的脱落、粘液的分泌与流动、空腔脏器内容物的流动等所产生的、对菌群较高的机械性清除速率相关。清除速率的变化对菌群的生物量、菌群多样性等等具有重大影响；而不同细菌间的相互作用和关联强度相对较弱，原籍菌群对外来细菌的拮抗作用不如结肠菌群那么重要、突出。
人体最重要的边际性菌群有下面两个：
口咽部菌群：由甲型链球菌、奈瑟菌、口腔粘球菌、棒状杆菌、葡萄球菌、嗜血杆菌等组成。其中甲型链球菌的定植部位是粘膜上皮细胞、牙齿等，而其它细菌的定植部位尚不完全清楚。在口咽部菌群中，甲型链球菌被公认为是最重要的代表性种群和主要的拮抗致病菌、条件致病菌的细菌。
小肠腔内菌群：以大肠埃希菌、肠球菌为主，加上更少量的其它肠杆菌科细菌和来自唾液的口腔菌群等。
2.3 顶极性菌群(Climaxbacterialcommunity)
顶极性菌群是人体内最重要的菌群之一，主要由厌氧菌组成，在人体菌群演替过程中处于晚期“顶峰”阶段，故称为顶极性菌群，也可以叫做厌氧性菌群。它具有以下特点：(1)菌群生物量大，细菌密集度在或以上，可接近其微生境的容量极限，达1012～13CFU／g；菌群多样性高、在以上，优势细菌为专性厌氧菌。(2)顶极性菌群定植的微生境流动性低、机械性清除速率低，因而菌群有充足的演替时间，最终形成以厌氧菌为主的菌群。(3)顶极性菌群对人体宿主生理影响大，很多已知的人体微生物相关特征(maC)主要与顶极性菌群，尤其是结肠菌群有关，后者是最为典型的顶极性菌群。
在顶极性菌群中，细菌间相互关系、相互作用极为密切，使菌群具有较强的抗御外界干扰、包括拮抗外源性细菌定植的能力(定抗能力)，这是顶极性菌群自稳定机制之一。常见顶极性菌群有：
结肠菌群：由数十种、数百种细菌组成，其中最优势的细菌有十余种，均为专性厌氧菌，包括双歧杆菌、优杆菌、类杆菌、消化球菌、韦荣球菌等等。兼性需氧菌的生物量较少，仅为厌氧菌的1/100左右，但对维持整个菌群的稳定却是必不可少的。
牙周袋菌群：也是比较重要的顶极性菌群，以类杆菌等厌氧菌为主。
正常人体菌群绝大多数是第二和第三种，根据其特征性细菌、微生境特征、生理代谢特点、在人体内的分布、对人体生命活动的影响等等，各自又可进一步细分为不同类型，其中比较特殊而又很重要的有阴道菌群与胃内菌群。
2.4 特殊环境菌群
阴道菌群：正常阴道菌群从其生物量和种群多样性来看，属于边际型菌群。其生活环境是一个很特殊的微生境，一是流动性较低，二是阴道上皮细胞含有丰富的糖原，因而在阴道最终形成了以乳酸杆菌为优势菌的产酸、耐酸菌群。
胃内菌群：胃腔是一个极端微生境，胃粘膜壁细胞分泌酸，使胃内酸度极高，空腹时胃液pH仅为1～2，这样的微环境里细菌不但不能生长繁殖，而且绝大多数对酸耐受程度低的细菌均被杀死，但有少数耐酸的细菌和真菌可存活、定植。胃内低酸环境对保持小肠的“清洁”、使小肠菌群维持在边际性菌群的状态也具有重要意义。
3 人体菌群的演变
3.1 人体菌群演变的基本动力学过程
一般来讲，人体内各粘膜、皮肤的菌群自胎儿出生，即开始了从无到有、从低级到高级的演化进程，先是前驱性菌群定植，然后逐渐演替为边际性菌群，再进一步演替为顶极性菌群，这是人体内菌群总的自然演替方向。
另一方面，人体的正常生理机能对粘膜、皮肤部位的菌群持续不断的机械性清除作用和人体内环境保持稳定，对菌群的自然演替过程均产生对抗作用，尤其是前者使人体微生态系统具有连续流动培养系统的本质特点，清除速率的高低不同，就决定了菌群的演替是停滞在边际性菌群的阶段，或能进一步发展为顶极性菌群。因而人体各粘膜、皮肤部位菌群的演替过程和细菌种类、数量的变化，均显著地受到清除速率的制约。
上述两方面因素相互对抗、相互作用，就构成了人体菌群演变的基本动力学过程。
当人体生命过程处于正常状态时，各种人体内微环境参数，包括机械性清除速率在内，稳定在正常范围内，与此相对应，人体内正常菌群也保持稳定并维持相应的菌群类型；一旦机械性清除速率或其它微生境参数的变化超出正常范围，就将立即导致菌群发生相应演变。
3.2 人体菌群异常演变类型
当体内、外各种因素的影响超出了一定限度时，就会使人体菌群发生演变，一般来讲主要有以下几种主要类型或演变方向。
3.2.1 菌群过度生长
主要发生于边际性菌群，当机体清除速率降低时菌群过度生长并向顶极性菌群方向演化，因过度生长和程度不同可形成多种异常菌群；主要见于口咽部菌群、小肠菌群与阴道菌群，具有重要临床意义，与院内下呼吸道感染、肠源性感染等等密切相关，也是多种多微生物病(polymicrobialDiseases)的特征。顶极性菌群不会发生这种异常，因它本身的生物量已接近其微生境空间的极限容量。
3.2.2 菌群减弱
主要发生于顶极性菌群及边际性菌群，当机体清除速率加快时菌群排出增加使菌群向边际性菌群、前驱性菌群方向演化，如绝经后妇女阴道菌群生长不良较为常见，原有的乳酸杆菌以及其它细菌均极少，甚至缺乏，某些急慢性上呼吸道感染病人口咽部粘膜菌群减少甚至缺乏，以及严重腹泻时结肠厌氧菌显著减少等等。
抗生素抑制敏感细菌生长使菌群增长速率减缓甚至为零，也导致菌群减弱，严重时可继发耐药菌定植与危及生命的二重感染，这种类型的菌群异常相当于康白教授等提出的Ⅲ度菌群失调；但长时间接触抗菌物质菌群会获得耐药性并可能恢复原始的菌群类型。转贴于
3.2.3 优势细菌转换
当机体的清除速率基本保持在正常范围时，菌群的密集度和多样性可维持原有水平，此时菌群的异常主要表现为菌群中优势细菌转换，可见于一些慢性微生态失调，如上呼吸道、沁尿生殖道等慢性炎症和某些慢性腹泻。
抗生素是使菌群优势细菌转换最重要的外源性因素，菌群优势细菌转换，相当于康白教授等提出的Ⅰ度和Ⅱ度菌群失调。
3.2.4 附加菌群
因人体生理、解剖异常而形成病理性微生境，出现相应菌群生长，可称之为附加菌群，如支气管扩张时的感染菌群。
3.2.5 抗生素相关性菌群
抗生素对细菌有强大的抑制或杀灭作用，在消灭病原体的同时，也对人体正常菌群产生作用。因抗生素种类繁多，其抗菌谱、抗菌活性、在人体内的分布、给药途径等各不相同，因而人体菌群在各种抗生素作用下的具体变化非常复杂。
在广谱、活性强的抗生素作用下，菌群总的演变趋势是菌群多样性降低、总生物量减少，菌群向边际性菌群或前驱性菌群演变，同时伴有耐药细菌、真菌生长成为优势细菌。而因机体清除速率加快导致的菌群减弱不伴有真菌增长，这是二者的重要区别之一。在极端情况下，广谱、高效抗生素治疗使体内某一局部菌群(局部用药)或人体所有菌群(全身用药)遭受毁灭性破坏，绝大多数细菌均灭绝、消亡，人体“无菌化”。这种状态对耐药性病菌的抵抗力极低，对耐药菌感染高度易感。
而窄谱抗生素对菌群整体影响程度有限，多导致优势细菌转换，形成Ⅰ度或Ⅱ度菌群失调。
4 临床常见菌群失调
4.1 口咽部(口腔粘膜)菌群失调
口咽部菌群属边际性菌群，如前述。其异常改变主要有两种类型：
4.1.1 口咽部(口腔)细菌过度生长
病因：口咽部(口腔)菌群的清除速率因唾液分泌减少、衰老的粘膜上皮细胞脱落清除减缓等等而降低。主要见于昏迷、气管插管、禁食禁饮、口腔干燥综合征等患者。
菌群特点：由正常时的边际性菌群向顶极性菌群方向演化，菌群的总生物量和多样性增加；除常居菌如甲型链球菌、奈瑟菌、葡萄球菌等增长外，革兰阴性杆菌也定植并大量增长；唾液pH下降，可低于6.0甚至更低；严重时厌氧菌、真菌也大量增殖。
在临床上，上述菌群演化常因受到抗生素的作用而变得很复杂，其中耐药性强的革兰阴性杆菌和真菌的定植、过度生长通常会更加突出。
意义：口咽部革兰阴性杆菌定植，因被公认为医院内下呼吸道感染的主要来源而受到高度重视，然而更为本质的问题其实是口咽部(口腔)细菌过度生长。
对口咽部(口腔)细菌过度生长的处理，一是强化口腔清洁护理，以部分替代丧失了的机体清除机能；其二口腔、口咽部脱污染或选择性脱污染，即口腔、口咽部粘膜局部用抗菌药物，抑制细菌尤其是革兰阴性杆菌、真菌的生长。
4.1.2 口咽部(口腔)菌群减弱
病因：一是抗菌治疗，以β-内酰氨酶类抗生素、大环内酯类抗生素作用最强，而胺基糖甙类抗生素作用较弱；二是炎症，如急慢性咽炎时我们观察到上皮细胞脱落增加(清除速率增加)。
菌群特点：细菌总量减少，尤其是粘膜上皮细胞表面的革兰阳性球菌(多为甲型链球菌)微菌落减少或消失，易于观察；细菌培养可见口咽部常居细菌种类减少(多样性减少)，有时可培养出革兰阴性杆菌，但其量一般不会很多，与口咽部细菌过度生长时的情况不一样。
意义：无论何种原因导致口咽部正常菌群减少，对人体来讲都意味着相应功能的缺陷。其后果之一，是β-链球菌等咽部、扁桃腺感染菌有较多的机会定植下来，形成反复发作的慢性感染。
对口咽部细菌减少的处理，是恢复其正常菌群，美国、瑞典都有使用α-链球菌活菌制品来预防、控制呼吸道感染的报导。
4.2 胃内菌群过度生长
胃内细菌数很低，其异常变化就是增多，而不会有细菌减弱。转贴于
病因：一是胃内酸度降低，正常空腹时胃液pH1～2，是一个极端酸性的微生境，当这种酸度降低，胃液pH升高至4.0左右时，胃内细菌数可增加102～104倍，常见于胃大部切除、萎缩性胃炎和服用抗酸药的病人；其二是因幽门梗阻而导致胃排空障碍、胃内容物滞留。
菌群特点：细菌数增长102～104倍，因酸度降低造成的胃内细菌过度生长主要是唾液菌群(口咽部菌群)；幽门梗阻时则耐酸的乳酸菌、真菌等增多更为显著。
意义：胃内细菌可逆行至口咽部，并成为院内肺炎感染菌的重要来源，见于为预防消化道应激性溃疡和出血而接受抗酸药物的重症患者、以及萎缩性胃炎患者和高龄患者；胃内细菌数增高还使进入小肠的细菌增多，导致小肠的细菌生长过度并产生相应疾病。
对胃内细菌过度生长，应尽量去除其病因，再配合适当抗菌药物治疗。
4.3 小肠细菌过度生长
小肠的菌群异常也主要是生长过度。
病因：一是胃内细菌生长过度，如前述；其二是小肠运动排空障碍，对菌群的清除速率降低，见于各种原因造成的小肠梗阻、肠麻痹患者。
菌群特点：细菌数增长102～104倍，有两种类型，即咽菌群型和结肠菌群型，后者过度生长的程度更严重、危害更大。
意义：小肠细菌生长过度的后果一是破坏消化酶和分解胆汁酸，造成消化不良；二是产生大量有害代谢产物，吸收后引起机体出现慢性毒性反应；第三，肠原性内毒素在重肝、急性坏死性胰腺炎等疾病的病理生理过程中有重要意义。
对小肠细菌生长过度的处理，主要是在尽量去除病因的基础上，采取三个办法：一是用抗菌药物抑制细菌生长；其二是促进肠内容排空，如华西医大对重症胰腺炎合并的急性肠麻痹用中药大承气汤灌胃、排空肠道，能显著降低血内毒素水平，阻断胰腺坏死的病理生理过程，取得良好临床疗效；三是使用乳酸杆菌类活菌制品如“丽珠肠乐”等，拮抗不良菌群的生长。
4.4 结肠菌群失调
结肠的菌群是顶极性菌群，失调时与小肠相反，主要是在不利因素作用下菌群减弱向边际性菌群转化，以及发生“菌群飘移”，但不会有过度生长的问题。
4.4.1 结肠细菌减弱
病因：主要是急性腹泻性疾病、热带斯普鲁和抗菌治疗。
菌群特点：共同特点是总菌量减少和多样性减低。严重的急性腹泻菌群以兼性菌为多，有的涂片看起来象纯培养；热带斯普鲁慢性腹泻的大便菌群也以兼性需氧为主；如果大便检查有真菌存在、增多，提示菌群减弱的原因是抗菌治疗，腹泻引起的菌群生长不良一般不会有真菌的生长；大便有白细胞或脓球则提示致病性强的细菌感染。
意义：抗生素引起的菌群减弱常常同时伴有耐药菌生长过度，如艰难梭菌、真菌、葡萄球菌等条件致病菌可生长过度并产毒素，引起抗生素相关性腹泻、伪膜性肠炎及其它临床病症。
无论大便有无白细胞、脓球，均可用乳酸杆菌、双歧杆菌等活菌制剂来调整菌群，但一般来讲，有炎症时应先用敏感的抗生素进行治疗。
4.4.2 结肠发酵型菌群
病因：一是对食物中的碳水化合物吸收不良，见于肝胆胰和肠道本身的疾病、小肠细菌生长过度等；其二是肠蠕动过快没有足够时间消化食物，如肠道慢性炎症、肠易激综合征。
菌群特点：总菌量无减少，但多样性降低，菌群以革兰阳性杆菌为主，可合并有真菌，大便pH在6以下，化学染色可观察到大量脂肪球或淀粉颗粒。若查见白细胞，提示有炎症反应。
意义：至少1/3以上的慢性腹泻病人其大便菌群为发酵型菌群，有的可同时有炎症存在。
给予“多酶片”、“丽珠肠乐”常可显著改善大便性状，使病情得到满意控制；必要时还可给予普鲁苯辛等药物减缓肠蠕动。
4.4.3 结肠腐败型菌群
病因：主要见于蛋白质消化不良和便秘者。
菌群特点：总菌量无减少，但菌群以革兰阴性厌氧菌为主。
意义：腐败型菌群对人体的危害较发酵型菌群更甚，可引起所谓慢性结肠中毒综合症，以及使肠道中致癌物质的产生、激活增加等。
调整饮食和给予乳酸杆菌、双歧杆菌等活菌制品以及促进肠蠕动的药物可有效改善菌群。
4.5 阴道菌群失调
阴道正常菌群是以乳酸杆菌为优势种群的边际性菌群，其异常变化主要是因细菌过度生长而向顶极性菌群方向演化。
4.5.1 阴道细菌过度生长
病因：比较复杂，主要与性激素水平、性生活过度、安宫内节育器以及抗菌治疗扰乱阴道正常菌群等有关。
菌群特点：总菌量增加102～104倍，细菌种类增加、复杂，以厌氧菌为主，优势菌因病情的轻重不同而不同，轻者以阳性球菌、阴性球菌(韦荣球菌)为主，重者见大量阴性杆菌、阴性动弯杆菌；阴道酸度减弱，pH升至4.6至5.4甚至更高；阴道分泌物中可有白细胞(阴道炎)，或无白细胞(细菌性阴道病)。
意义：阴道细菌生长过度在临床上有很重要的意义，除了本身就引起一系列临床病征以外，还与产科异常包括流产、早产、胎儿宫内发育迟缓、产褥感染等有密切关系，也是盆腔感染、尿路感染的感染菌来源之一。
对阴道细菌生长过度，目前国际上用得最多的治疗方法和药物是阴道局部给灭滴灵制剂和氯林可霉素制剂；但新的治疗方法如用乳酸杆菌制剂等可望在以后成为首选治疗方法。
4.5.2 阴道菌群减弱
病因：主要见于阴道冲洗、使用抗生素的病人与绝经后妇女。
菌群特点：细菌量减少，多样性减低；阴道pH升高；优势菌则因病人不同而不同。
停止冲洗与抗菌治疗后多数病人可恢复正常，必要时给予乳酸杆菌制剂治疗；绝经后妇女可使用雌激素替代治疗。
5 微生态诊断
5.1 临床微生物诊断新观念
随着60、70年代感染症面貌的变迁而变迁。
5.1.1 传染病(CommunicableDiseases)：
由病原菌感染引起，分离、检定出病原菌即确诊；
5.1.2 感染症(infectionsDiseases)：
条件致病菌感染为主，细菌学诊断；
5.1.3 多微生物疾病(polymicrobialDiseases)：
细菌过度生长，菌群诊断。
5.2 细菌学诊断
临床上经常需要判断分离到的条件致病菌株的致病意义。
5.2.1 涂片观察有无炎症反应：
a.有无炎症细胞；
B.炎症细胞有无吞噬细菌。
5.2.2 涂片观察细菌种类、有无荚膜。
5.2.3 细菌培养：
a.是否为优势菌；
B.细菌密集度；
C.是否持续存在。
5.2.4 涂片、培养结果与临床表现的关系：
a.是否与临床转归一致；
B.是否与抗生素有关。
5.3 微生态学诊断：菌群检测
5.3.1 目标:
a.确定菌群类型；
B.确定菌群中的优势菌；
C.特殊细菌(如病原菌)的检验。
5.3.2 方法：
5.3.2.1 涂片、染色或不染色、镜检：
a.了解细菌密集度(菌群生物量)、多样性、优势的种类；
B.观察自然状态下细菌间的空间关系、与粘膜上皮细胞间的关系；
C.是否有宿主炎性反应、有无吞噬现象、是否为感染的原因菌。
5.3.2.2 培养：
a.致病菌分离、检定：使用选择性培养基平皿。
B.优势菌的检定：所有细菌都能生长良好的培养条件和技术，是关键。使用非选择性培养基平皿、划线接种；厌氧培养、二氧化碳培养、需氧培养。
5.3.2.3 功能检测：
测定细菌的酶、代谢产物等，对菌群及其功能状态进行诊断、评价。
5.2.2.4 微生境参数测定：如pH、营养物浓度等。
6 微生态防治
6.1 感染症防治的发展方向
6.1.1 “无菌人技术”：
a.用抗生素与其它抗菌药物杀灭人体内一切微生物；
B.用隔离罩、层流室等“无菌饲养”技术维持人体的“无菌”状态。
6.1.2 “无有害细菌技术”：用抗生素进行“选择性脱污染”或“选择性微生物调节”，抑制、消灭人体内有害细菌，同时配合环境控制阻断有害菌再感染。
6.1.3 微生态防治途径：通过维护和建立生理性菌群，来对人体内有害细菌进行控制。
上述途径相辅相成，共同发挥作用。
6.2 微生态防治技术发展前景
由于无菌化技术已登峰造极，因而微生态防治技术将是今后感染防治的重点方向，且将超越感染症的范畴，在多微生物疾病等疾病的治疗、控制中发挥主导作用。
此外，当“无菌人”或“无有害细菌人”脱离无菌环境时，对生理性菌群的需要是显而易见的。
6.3 微生态防治技术要点
微生态防治是指采用综合性手段，通过促进生理性菌群的恢复、建立和稳定，来实现对有害细菌的控制。具体包括以下方法和途径：
6.3.1 微生境调控控制菌群演变方向
a.保持和/或改变机械作用；
B.化学因子调节；
C.改变细菌的能量和营养来源；
D.其它。
6.3.2 微生态制品
a.补充、恢复生理性细菌减少和消灭“空白”生态位；
不同微生物菌落特征篇10
关键词：盐碱湖；兼性嗜碱菌；培养特征
中图分类号：Q93-335文献标识码：a文章编号：0439-8114（2013）10-2295-04
嗜碱菌是一类最适生长于pH大于或等于9的环境中的微生物，根据它们在pH7条件下生长与否可分为专性嗜碱菌和兼性嗜碱菌两大类[1，2]。对于嗜碱菌新菌株的分离、碱性蛋白酶的基因克隆和应用、极端环境适应机制、结构新颖的活性产物的分离都是当今极端环境微生物研究的热点[3-6]。嗜碱菌已广泛应用于发酵工业、石油化工、农作物生长改良和环境污染物的生物修复等多个领域[7，8]。目前，对嗜碱菌的嗜碱机理研究又有了新的重要突破[9]。
内蒙古有广阔的盐碱湖分布，蕴藏着丰富的微生物资源，其中嗜碱微生物呈现较高的生物多样性[10，11]。嗜碱菌有很高的经济价值和生产应用潜力，对其进行深入研究和开发利用，将成为我国战略生物资源的平台之一，有利于发挥生物技术创新的支撑作用。因此，对分离于浑善达克盐碱湖的一株嗜碱菌的基本特征进行了分析，以期为进一步认识和开发内蒙古地区的极端环境微生物资源奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1盐碱湖杆菌菌株盐碱湖杆菌菌株mim18由内蒙古农业大学生命科学学院应用与环境微生物研究所从内蒙古浑善达克盐碱湖中分离获得。
1.1.2培养基
1）液体培养基。酵母粉2g/L，蛋白胨2g/L，K2Hpo40.2g/L，mgSo4·7H2o0.1g/L，naCl10g/L，微量元素1mL/L，微生素100μL/L，pH9～10。
2）固体培养基。在液体培养基中加入琼脂15g/L制成。
3）半固体培养基。在液体培养基中加入琼脂4g/L制成。
4）微量元素溶液配方（g/L）。FeCl30.05，mnSo4·H2o0.02，H3Bo30.01，CuSo4·5H2o0.01，（nH4）6mo7o24·4H2o0.02，ZnSo40.01g，eDta0.5，CaCl2·2H2o0.2。
5）微生素溶液配方（g/L）。生物素0.02，VB10.02，VB120.001，硫辛酸0.05。
1.2方法
1.2.1形态特征和生长曲线的绘制通过革兰氏染色和平皿划线培养的方法来观察mim18的基本形态特征。将mim18菌种接种于含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，置33℃、200r/min水浴摇床光照培养。隔时取样于600nm处测定吸光度。以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制生长曲线。
1.2.2耐盐试验调整培养基中盐浓度分别为0、10、20、30、40、50、55、60g/L。固体培养基平皿划线光照培养测定mim18的耐盐程度；液体培养基（装液量为100mL/（250mL），接种量2%）33℃、200r/min水浴摇床培养3d后于600nm处测定吸光度，每个梯度3个平行[12，13]。
1.2.3pH对生长的影响调整培养基的pH分别为5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、11.5、12.0，培养测定方法同1.2.2。
1.2.4温度对生长的影响采用含naCl的培养基，分别置于0、24、27、30、33、36、40、42℃的条件下培养，培养测定方法同1.2.2。
1.2.5氧气对生长的影响半固体培养基穿刺培养，每12h观察一次。观察菌体的生长情况及位置。液体静置和摇床培养，观察菌体在液体中的分布。
1.2.6光照对产色素的影响划线接种固体培养皿3个，两个平皿用锡箔纸包住避光培养，24h后将锡箔纸中的一个平皿光照培养，另一个仍避光培养，第三个平皿一直光照培养。
1.2.7产酶种类和抗生素敏感性分析产酶种类测定参考《常见细菌系统鉴定手册》[14]和文献[15]中的方法进行。抗生素敏感性试验采用药敏纸片检测法[16]进行。
2结果与分析
2.1mim18的生长曲线
通过7d的恒温摇床培养和吸光度测定，绘制出mim18的生长曲线（图1）。从图1可以清晰看到0～12h为延滞期，12～72h为指数生长期，72～120h为稳定期，120h后进入衰亡期。
2.2盐浓度对mim18生长的影响
经过培养，mim18可在盐浓度0～55g/L范围内生长。对比各盐浓度的生长状况发现，在盐浓度0～40g/L时均能较好地生长。盐浓度为0g/L时，菌落的颜色明显淡于盐浓度10～40g/L时的菌落颜色（图2、图3）。盐浓度为50g/L时，有少数菌落生长，盐浓度为55g/L时只有5个左右的小菌落，盐浓度≥60g/L时几乎不生长。说明低盐有利于mim18的生长，过高的盐浓度将会抑制其生长。通过不同盐浓度培养后测定吸光度比较发现（图4），mim18在盐浓度0～10g/L范围内随着盐浓度升高有利于mim18的生长，在盐浓度为10g/L时生长情况最好；在盐浓度10～40g/L时抑制mim18的生长，但抑制效果不明显，当盐浓度为40g/L以上时mim18的生长明显受到抑制。
2.3pH对mim18生长的影响
经平板培养可知，mim18适应pH变化能力较强，能在pH6.0～11.0环境下生长。当pH≤5.5或≥11.5时该菌株不生长。当pH6.0、7.0和11.0时该菌株生长比较缓慢；pH8.5～10.0时mim18生长随pH的增大逐渐加快，pH9.5时最适生长，生长最快，也最先达到稳定期，之后生长量随pH增大而减小（图5）。
2.4温度对mim18生长的影响
经平板培养可知，mim18的生长温度范围为24～40℃，大于40℃时不再生长。从图6可以看出，33～36℃为mim18生长的适宜温度范围。
2.5氧气对mim18生长的影响
半固体培养基穿刺光照培养24h后，穿刺孔上部有生长迹象，之后半固体斜面生长迹象加强，穿刺孔中生长迹象逐渐减弱直至消失；液体培养时，只在液面处生长，说明氧气是mim18生长的必要条件，mim18不具有运动性。摇床振荡培养与静置培养对比结果表明摇床培养条件下mim18的生长状况明显优于静置培养，说明摇床培养提供的氧气对mim18生长有重要作用。
2.6光照对mim18产色素的影响
如图7所示，3种光照处理方式下mim18生长状况、菌落形态基本一致，说明光照对mim18的色素合成乃至生长无影响。
2.7mim18的产酶种类和抗生素敏感性
经测定，该菌株在生长中产生接触酶（过氧化氢酶）、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶，不产生脲酶、苯丙氨酸脱氨酶、酯酶；甲基红和硫化氢试验为阳性；它对常见的抗生素（青霉素-G、红霉素、氯霉素、四环素、庆大霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、罗红霉素、多粘菌素、卡那霉素、妥布霉素、利福平、杆菌肽）均表现为高度敏感。
3结论与讨论
mim18在盐浓度0～40g/L范围内都能较好生长，适应能力较强，甚至在无盐条件下也能生长，在盐浓度10g/L时就能达到最适盐浓度，说明其生长对盐量要求不大，当盐浓度超过40g/L时生长明显受到了抑制，因此mim18不是嗜盐菌[10]；mim18不仅能在强碱条件下生长而且能在pH7下生长，因此是兼性嗜碱菌[11]。另外，mim18在温度方面要求也不十分严格，30～36℃生长差异不是很大。mim18对pH和周围环境的氧气量变化很敏感，氧气是其生长的必要条件，光照对其色素合成乃至生长没有影响。
嗜碱菌是盐碱湖中数量大、分布广的极端微生物。由于其独特的环境适应模式，特殊的生理机制，独特的基因类型，并有多种代谢产物可以利用，因而不仅成为了生命科学理论研究的理想材料，而且成为一类具有很大开发潜力的生物资源[17]。近年来，嗜碱微生物的研究发展迅速，已应用于诸如清洁剂生产[18]、生物表面活性剂[19]、农作物生长促进剂[20]和天然产物的生物转化、环境污染物降解[8，21，22]等多个方面。对盐碱湖菌的深入研究，不仅可以开发新的微生物基因资源，而且将大大促进微生物在人类健康、环境保护和生物技术等领域的利用。
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