细胞研究篇1
nKt细胞(CD1ddependentnaturalkillerliketcells)作为一类新型的免疫调节细胞，其主要特征为t细胞受体(tCR)基因表达的恒定性、CD1d的限制性以及细胞因子产生的迅速、高水平性。nKt细胞既能增强免疫反应又能抑制免疫反应，从而在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中发挥重要的作用。现就近年来有关nKt细胞的研究进展综述如下。
1nKt细胞的命名
于1987年在小鼠中首次发现nKt细胞之后，nKt细胞定义为既表达tCR又表达nK1.1（nKRp1c或CD161c）的一类淋巴细胞，而命名为nK1.1+t细胞(naturalkillertcells)。随着研究的逐渐深入，发现此命名并不准确，因为在人类并不是所有表达CD161的t细胞都是nKt细胞，也并不是nKt细胞均表达CD161。在小鼠中除C57BL/6小鼠外其他小鼠并不表达nK1.1，一些其他的t细胞（包括传统的病毒特异性的CD8+t细胞）能诱导表达nK1.1。而且nKt细胞虽然能表达穿孔素、FasL及其他受体（例如nKG2D），但自然杀伤的细胞毒活性并不是nKt细胞的主要效应机制，因此更为准确的命名为CD1d依赖的自然杀伤样的t细胞(CD1ddependentnaturalkillerliketcells)[1]。
2nKt细胞的发生及发育
nKt细胞产生于围产期的胸腺，由CD4+CD8+双阳性细胞偏离于主流的t细胞分化途径而分化产生[2]。nKt细胞在胸腺经历了复制周期，因此这部分数目非常少的经历随机tCR重排形成恒定的tCRα链的细胞在出生3周后增殖至有意义的水平。其阳性选择是由表达CD1d的骨髓衍生的细胞而不是胸腺皮质上皮细胞介导，这是nKt细胞的特殊性。在骨髓衍生的表达CD1d的细胞中胸腺细胞已基本被认定为阳性选择至关重要的细胞。在成熟晚期阶段nKt细胞表达几种分子，包括iL7R、CD24、DX5、nK1.1和Ly49家族nKR。nK1.1表达的诱导可以发生在胸腺，但大部分从胸腺移出的细胞nK1.1为阴性，表明nKt细胞的最终成熟阶段也可发生在外周血。
3nKt细胞的分型
目前所指的nKt细胞均为CD1d限制性，根据tCR(小鼠Vα14Jα18，人类Vα24Jα18)的表达与否，而将nKt细胞分为Vα14Jα18+Ⅰ型nKt细胞和Vα14Jα18ⅡnKt细胞，通常所说的nKt细胞即为Ⅰ型nKt细胞[1]。
根据nK1.1的表达与否将nKt细胞分为如下2型:(1)nK1.1+nKt细胞:根据CD4、CD8的表达与否，小鼠的此类nKt细胞分为CD4+和(CD4-CD8-)Dn2个亚群。人类的nKt细胞分为CD4+、CD8+和(CD4-CD8-)Dn3个亚群。(2)nK1.1-nKt细胞:此类细胞大多表达CD4。目前研究认为:在胸腺nK1.1-nKt细胞是nK1.1+nKt细胞的前体，有可能在外周血继续成熟[2]。然而在体外实验中观察到nK1.1+nKt细胞在αGalCer刺激后出现nK1.1的表达下调，而表现为nK1.1-，所以nK1.1-nKt细胞又可能为体内接受刺激后的细胞。基于上述研究，目前认为nK1.1的表达与否与下列因素有关:遗传背景、nKt细胞是否成熟、是否被刺激及其组织定位。
各不同物种、不同器官中nKt细胞亚群的比例、功能及所分泌的细胞因子均不同[3]。Hammond等的研究表明:小鼠的CD4+和(CD4-CD8-)DnnKt细胞各以不同的比例存在于不同的组织中，并且有着不同的效应功能。在体外实验中antiCD3刺激下CD4+nKt细胞产生大量的iL4。Baev等[4]的研究表明，在人类CD4+nKt细胞产生th0样的细胞因子iL4和iL13以及iFnγ，而CD4-CD8-nKt和CD8+nKt细胞产生th1样的细胞因子iFnγ。并且各亚群细胞在趋化因子受体(如CCR5或CCR6)、nK细胞受体(如CD94或nKG2D)，介导细胞毒分子(如FasL、tnF、穿孔素)的表达模式方面也有所不同，并影响了各自的功能。Rossignol等对CD4+nKt和CD4-CD8-nKt细胞在促th2活性方面（通过其促自身的B细胞分泌免疫球蛋白的能力）进行了比较，结果显示，CD4+nKt细胞促进B细胞分泌igG和ige（不包括igm），即发挥了促th2样活性，而CD4-CD8-nKt细胞却不能。CD4+nKt细胞主要表达CD127(iL7受体)，而CD4-nKt细胞主要表达CD122(iL2/iL15受体共用β链)，因此CD4+nKt细胞主要对iL7起反应，而CD4-nKt细胞主要对iL15起反应。同一亚群的nKt细胞由于所在的器官不同行使不同的功能，如肝脏中的(CD4-CD8-)DnnKt细胞主要表现为抗肿瘤的活性;而胸腺中的(CD4-CD8-)DnnKt细胞主要表现为免疫调节的活性。
4nKt细胞的分布
在传统t细胞所分布的各组织中都有nKt细胞的分布，但其主要分布于肝、骨髓、胸腺、脾及外周血中，此外脐血中也含有一定数量的nKt细胞。各器官所含有的nKt细胞的比例、分型及激活后的表型亦不同。其中肝脏中nKt细胞占总t细胞的30%～50%，骨髓中可占总t细胞的20%～30%，在成熟胸腺细胞中则占到10%～20%，在脾细胞中占到0.5%～1%，而在外周血中仅占0.1%～0.5%。CD4+nKt细胞在胸腺及脐血nKt细胞中所占的比例为90%，而外周血中只占40%。
5nKt细胞的免疫活化
nKt细胞的抗原识别与传统的t细胞不同，不能识别由经典的mHCⅠ、Ⅱ类分子提呈的抗原肽，而只识别由细胞表面CD1d分子提呈的脂类、蛋白质抗原[5]，在这些抗原的刺激下nKt细胞被激活，并迅速的产生iL4、iFnγ、iL10、iL13等细胞因子，从而在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植免疫中发挥重要的作用。
5.1nKt细胞的自身配体及合成的配体最早，人们从海绵提取物中发现αGalCer（α半乳糖神经酰胺），其能特异性的激活nKt细胞。之后于1993年由日本的KirinBrewery公司首次合成并命名为aGLs，并相继出现其类似物aGL582，命名为KRn7000，以及其衍生物βGalCer、oCH、αCGalCer、C20∶2。此期间发现nKt细胞的蛋白质抗原SeB（金黄色葡萄球菌肠毒素B）及天然抗原[5]，如寄生虫的糖基磷脂酰肌醇、分枝杆菌胞壁的磷脂酰肌醇甘露糖等。于2004年Zhou等发iGb3(isoglobotrihexosylceramide)为nKt细胞的天然配体，在nKt细胞从主流t细胞前体池的成熟过程中的阳性选择中起到重要的作用[6]。于2007年porubsky等对iGb3进一步研究，结果表明，其作为天然配体在nKt细胞的阳性选择中确实起到作用，但在其缺失时可被其他的抗原代替，而不影响nKt细胞的阳性选择[7]。
5.2nKt细胞的免疫活化nKt细胞的表面表达近期激活或记忆t细胞的特征标志CD44hiCD62LCD69+，在αGalCer等抗原的刺激下，其与CD1d、tCR形成三联体激活nKt细胞，nKt细胞数目增加，并同时迅速的产生大量的iL4、iFnγ、iL10、iL13等细胞因子，并或者通过细胞间直接接触的作用方式，而作用于nK细胞、B细胞、DC细胞和t细胞，从而影响了整个免疫网络。
nKt细胞在接受刺激后所分泌的细胞因子受下列因素影响:(1)不同的nKt细胞亚群所分泌的细胞因子不同。CD4+nKt细胞在丝裂原的刺激下同时分泌th1和th2细胞因子，而CD4-CD8-和CD8+nKt细胞主要产生th1样的细胞因子，例如iFnγ和tnFα。在小鼠nKt细胞中CD4的表达与否与th2细胞因子的表达增加与否相关。但细胞内细胞因子染色实验显示，大部分nKt细胞均组成性的同时表达iL4及iFnγmRna，因此nKt细胞对th1和th2细胞因子的调节部分可能发生于转录后时相[8]，然而nKt细胞这种细胞因子调节的模式尚不清楚。同时CD4+和CD4-nKt细胞亚群所表达的趋化因子受体也明显不同，表明它们各自的转移和归巢的特性亦不同[9，10]。(2)nKt细胞接受的刺激的不同，CD1d/配体与tCR结合的亲和力的不同均可导致分泌的细胞因子的不同。如KRn7000促使nKt细胞同时分泌th1和th2细胞因子，而oCH偏向分泌th2细胞因子;自身CD1d/配体与tCR的亲和力较低，刺激nKt细胞后使其持续的偏向分泌th2细胞因子而在内环境的稳定的情况下维持对自身的耐受。(3)nKt细胞接受刺激时所处的微环境对其受刺激后所分泌的细胞因子有着重要的影响，其中微环境中的细胞因子及抗原提呈细胞（apC）的性质是2个重要因素。如iL12、iL15促进th1型细胞因子的分泌，iL7促进th2型细胞因子的分泌;非专职apC(如胃肠道上皮细胞、皮肤角质细胞、肝细胞)促进th2型细胞因子的分泌[11]。
激活的nKt细胞几乎对所有的血细胞，包括nK细胞、DC细胞、B细胞及t细胞均有所作用。在αGalCer合成抗原的刺激下，nKt细胞促使DC细胞的成熟，在应用αGalCer24h后DC细胞的成熟标志mHCii类分子、CD40、CD80和CD86表达上调，但多次注射αGalCer后上述DC细胞的表面标志下调至未刺激时水平[12]。通过CD40LCD40的相互作用，刺激DC细胞释放iL12;促进nK细胞的增殖，并增加nK细胞的iFnγ的分泌及其细胞毒活性;同时能促进B细胞的增殖及产生免疫球蛋白，在mHCⅡ-/-的小鼠模型中显示nKt细胞能代替传统的CD4+t细胞辅助B细胞分泌免疫球蛋白，并且可见到在缺乏nKt细胞的老鼠中循环抗体的衰退要加。nKt细胞分泌的iL4上调外周血B细胞的激活标志CD69，并能影响CD4+t细胞的细胞因子的分泌，扩大CD8+t细胞对蛋白抗原的反应。nKt细胞还可以以细胞间直接接触的方式促进调节性细胞(tregcells)的增殖[13]。
6nKt细胞与疾病
nKt细胞既有增强免疫反应又有抑制免疫反应的双向免疫调节功能，因此与多种疾病如肿瘤、自身免疫性疾病及移植耐受等密切相关。目前研究发现nKt细胞在某些肿瘤患者（如前列腺癌、多发性骨髓瘤等）及自身免疫性疾病患者（如糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血等）中数目减少，并且在肿瘤患者中nKt细胞分泌iFnγ的能力降低[14]。在小鼠肿瘤模型中nKt细胞的抗肿瘤作用已非常明确。David等在肿瘤患者体内扩增nKt细胞的研究，以及ishikawa等在晚期肺癌患者的Ⅰ期临床试验表明患者体内应用αGalCer后nKt细胞数目明显增加，从而起到抗肿瘤的作用[15，16]。现认为nKt细胞抗肿瘤作用的主要机制为:nKt细胞在自身配体及合成配体的刺激下，其表面的iL12R活化，刺激DC细胞分泌大量的iL12，并促使未成熟DC细胞的分化及成熟，而其本身迅速、大量的分泌iFnγ，同时iFnγ作用于nK细胞促使nK细胞亦分泌大量的iFnγ，DC细胞分泌的iL12作用于初始CD4+t细胞，使其向th1极化，上述因素共同作用而介导了抗肿瘤作用[17]。在小鼠的自身免疫性疾病模型（如Ⅰ型糖尿病、实验性自身脑脊髓膜炎等）中已表明nKt细胞在疾病的发生及治疗中起到了重要的作用，通过应用αGalCer刺激nKt细胞，使其数目增加的同时，极化分泌iL4、iL10等th2细胞因子而起到治疗自身免疫性疾病的作用。nKt细胞在移植耐受中的作用亦不容忽视。在小鼠的肝移植、心脏移植、胰岛移植及aCaiD（前房相关免疫偏离）模型中均证实了nKt细胞在移植耐受中的重要作用[18]。同时在小鼠GVHD模型研究中表明:来源于供鼠骨髓中的nKt细胞能抑制外周血干细胞移植后所发生的GVHD[19]，将供鼠的nKt细胞体外扩增后输注给受体鼠，进一步减轻了GVHD并维持了长期的混合嵌合体[20]，另外应用αGalCer刺激受体鼠的nKt细胞，使其数目增加的同时，诱导iL4、iL10的产生，从而通过细胞因子介导或细胞间直接接触的方式而抑制GVHD。
7结语
nKt细胞以双刃剑的方式调节着免疫系统，越来越引起人们的关注，对nKt细胞的免疫活化及与疾病的关联的进一步研究将为人们在抗肿瘤、抗自身免疫性疾病及移植耐受中提供一新的有效的治疗手段，具有广泛的应用前景。
参考文献
[1]GodfreyDi，macdonaldHR，Kronenbergm，etal.nKtcells:what’sinaname?[J].natRevimmunol，2004，4(3):231-237.
[2]Kronenbergm，engeli.ontheroad:progressinfindingtheuniquepathwayofinvariantnKtcelldifferentiation[J].Curropinimmunol，2007，19(2):186-193.
[3]Kronenbergm，GapinL.theunconventionallifestyleofnKtcells[J].natRevimmunol，2002，2(8):557-568.
[4]BaevDV，pengXH，SongL，etal.DistincthomeostaticrequirementsofCD4+andCD4-subsetsofVα24invariantnaturalkillertcellsinhumans[J].Blood，2004，104(13):4150-4156.
[5]RaginmJ，Sahun，augusta.DifferentialregulationofcytokineproductionbyCD1drestrictednKtcellsinresponsetosuperantigenstaphylococcalenterotoxinBexposure[J].infectimmun，2006，74(1):282-288.
[6]ZhouD，mattnerJ，CantuC，etal.LysosomalglycosphingolipidrecognitionbynKtcells[J].Science，2004，306(5702):1786-1799.
[7]porubskyS，Speakao，LuckowB，etal.normaldevelopmentandfunctionofinvariantnaturalkillertcellsinmicewithisoglobotrihexosylceramide(iGb3)deficiency[J].procnatlacadSciUSa，2007，104(14):5977-5982.
[8]wangZY，KusamS，munugalavadlaV，etal.Regulationofth2cytokineexpressioninnKtcells:unconventionaluseofStat6，Gata3，andnFat21[J].Jimmunol，2006，176(2):880-888.
[9]Leept，BenlaghaK，teytonL，etal.DistinctfunctionallineagesofhumanVα24naturalkillertcells[J].Jexpmed，2002，195(5):637-641.
[10]thomasSY，HouR，BoysonJe，etal.CD1drestrictednKtcellsexpressachemokinereceptorprofileindicativeofth1typeinflammatoryhomingcells[J].Jimmunol，2003，171(5):2571-2580.
[11]YuKo，porcelliSa.thepersefunctionsofCD1drestrictednKtcellsandtheirpotentialforimmunotherapy[J].immunolLett，2005，100(1):42-55.
[12]KojoS，SeinoK，Haradam，etal.inductionofregulatorypropertiesindendriticcellsbyVα14nKtcells[J].Jimmunol，2005，175(6):3648-3655.
[13]Kronenbergm.towardanunderstandingofnKtcellbiology:progressandparadoxes[J].annuRevimmunol，2005，23(1):877-890.
[14]YonedaaK，moriiat，niedabm，etal.theperipheralbloodVα24+nKtcellnumbersdecreaseinpatientswithhaematopoieticmalignancy[J].LeukemiaRes，2005，29(2):147-152.
[15]ishikawaa，motohashiS，ishikawae，etal.aphaseistudyofalphaGalactosylceramide(KRn7000)pulseddendriticcellsinpatientswithadvancedandrecurrentnonsmallcelllungcancer[J].ClinCancerRes，2005，11(5):1910-1917.
[16]ChangD，osmanK，ConnollyJ，etal.SustainedexpansionofnKtcellsandantigenspecifictcellsafterinjectionofalphagalactosylceramideloadedmaturedendriticcellsincancerpatients[J].Jexpmed，2005，201(9):1503-1517.
[17]FujiiS，ShimizuK，HemmiH，etal.GlycolipidαCgalactosylceramideisadistinctinducerofdendriticcellfunctionduringinnateandadaptiveimmuneresponsesofmice[J].procnatlacadSciUSa，2005，103(30):11252-11257.
[18]陈钰，毛远丽.一种新的淋巴细胞类型——nKt细胞[J].细胞与分子免疫学杂志，2001，17（4）:301-303.
细胞研究篇2
【关键词】干细胞进展克隆
干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。根据个体发育过程中出现的先后次序，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。eSC具有发育的全能性，在一定条件下可以向内、中、外三个胚层的细胞和组织分化，已可成功分离并建系，然而，由于不同个体间的免疫屏障和伦理学问题存在广泛争议，其应用仍停留在动物实验阶段。而源于成体组织的aSC由于完全是自身遗传背景，避免了伦理问题和免疫屏障，同时来源丰富、容易获得、体外诱导条件相对成熟，在血液病、心脑血管疾病、恶性肿瘤等疾病的治疗和组织损伤修复方面有广阔的应用前景，已成为生命科学研究的一个新热点。
一、干细胞生物学研究进展
在干细胞生物学研究中，人们发现某些成体组织细胞不但能再生，而且在一定条件下可跨系统、跨胚层分化成其他组织细胞，称为aSC的可塑性，其机制尚未阐明，且存在广泛争议。中国医学科学院血研所赵春华等在人多种胚胎组织如胰腺、骨髓、肝脏、皮肤、骨骼肌和肺等中分离出具有多系分化潜能的原始干细胞，在适当条件下可向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、肝脏样上皮细胞、神经细胞及造血细胞分化；将其输入接受超致死剂量射线照射的受体小鼠，可重建受体小鼠的造血功能；并可在小肠、肝、肺、皮肤及造血等多种组织中分化和再生；分离获得的Flk1+CD31-CD34-细胞具有高度的分化潜能，在体内不仅参与造血重建及微血管损伤的修复，而且还能分化为气管、肺、消化道上皮细胞以及肝细胞等。
研究表明，来自多种组织的aSC移植可治疗多种疾病。然而，人们对aSC分子生物学特性了解尚少，阻碍了aSC的体外培养和体内组织再生研究和应用。进一步研究发现，CKi介导的细胞周期调控也存在于神经干细胞中，提示CKi在其他组织干细胞周期调控中也扮演着至关重要的角色。这些研究为干/祖细胞特异性细胞周期调控提供了新的靶向，也为体外干细胞的诱导、分化提供了新的线索。
军事医学科学院干细胞生物学研究室岳文等进行了干细胞分化调控新基因的筛选及其功能研究。他们利用抑制性消减杂交技术构建了Lin-CD34-和Lin-CD34+细胞的差异表达基因的cDna文库，发现了Humanin基因，该基因对神经细胞的凋亡具有保护作用，在髓系造血祖细胞K562中具有延缓凋亡和抑制分化的作用，在Lin-CD34-细胞中的高表达提示该基因可能参与造血干细胞自我更新能力的维持。目前，他们正对人10号染色体长臂上的两个新基因——n-Rap和moB进行克隆与功能研究。这些研究可以使人们获得越来越多的与干细胞增殖与分化过程相关的新的功能基因，对这些基因的深入研究将有助于阐明干细胞增殖与分化的调控机制。
二、干细胞与克隆人
按分化潜能的大小，干细胞基本上可分为三种类型：一类是全能干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。胚胎干细胞就属于此类，它具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，从而可以进一步形成机体的任何组织或器官。第二类是多能干细胞，它具有分化出多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。第三类称为专能干细胞，只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。
利用多能或专能干细胞培育人体细胞和组织的研究已经取得了一定成果，但利用前景更广阔的，还是分化能力最强的全能干细胞。目前全能干细胞只能通过胚胎获取。受精卵在分裂期的早期、尚未植入子宫之前，会形成一个称为囊胚的结构，它由大约140个左右的细胞组成。如果能将它们取出，做成细胞悬液，在体外进行培养，就可以通过改变体外培养条件来探索胚胎干细胞向不同组织细胞分化的规律，对揭开人体的个体发育之谜具有极其重要的理论意义。
在体细胞克隆技术出现之前，科学家只能通过流产、死产或人工授精的人类胚胎获取干细胞进行研究。医生可以从病人身上取下体细胞进行克隆，使形成的囊胚发育6至7天，然后从中提取干细胞，培育出遗传特征与病人完全吻合的细胞、组织或器官，如果向提供细胞的病人移植这些组织器官，这就是所谓“治疗性克隆”。如果治疗性克隆研究取得成功，病人将可以轻易地获得与自己完全合适的移植器官，不会产生排异反应。届时，血细胞、脑细胞、骨骼和内脏都将可以更换，这给患白血病、帕金森氏症、心脏病和癌症等疾病的患者带来生的希望。
三、展望
当前，干细胞和再生医学的研究已成为自然科学中最为引人注目的领域，其理论的日臻完善和技术的迅猛发展必将在疾病治疗和生物医药等领域产生划时代的成果，是对传统医疗手段和医疗观念的一场重大革命。aSC移植的总体目标是建立aSC增殖和诱导分化的技术平台，获得大量多能或组织干细胞，用于相关病人的移植治疗，相信随着研究的不断深入，干细胞移植治疗多种疾病将不再是一个梦想。
参考文献：
[1]周作民.人胚胎干细胞研究进展[J].生殖与避孕，2004，（5）.
[2]王春雨，贾占生.核移植胚胎干细胞的研究及其应用前景[J].生物化学与生物物理进展，2005，（3）.
细胞研究篇3
1DpSCs的发现和生物学特性
牙髓是结缔组织,位于牙齿髓室和根管内，有一定修复再生的能力。由于成牙本质细胞是一种终末细胞,一旦分化后就不再分裂，因此普遍认为在成牙本质细胞遭受损伤后，牙髓内存在的未分化前体细胞可分化为成牙本质细胞，并分泌细胞基质。但直到2000年，Gronthos等[1]才首次正式提出DpSCs的概念,把具有克隆形成能力的高增殖率的牙髓细胞命名为DpSCs，在试验中应用酶消化法对成人第三磨牙牙髓细胞进行体外培养，并与骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BmSCs)进行比较,结果表明,这两种细胞具有相似的免疫表型，但DpSCs具有更高的克隆形成率和增生率,经体外诱导后能形成分散而高密度的钙化小结，当将DpSCs与Ha/tCp支架共同培养后回植到小鼠背侧皮下，能观察到类似牙本-牙髓复合体样的结构。miura等[2]发现人脱落乳牙(stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth,SHeD)的牙髓中含有多能干细胞,具有高度增殖和克隆形成的特性，当将体外扩增的DpSCs和SHeD与羟磷灰石/磷酸三钙(hydroxyapatite/tricalciumphosphate,Ha/tCp)联合植入免疫缺陷小鼠的皮下时可形成牙本质-牙髓样结构。Young等[3]分离猪第三磨牙牙胚，制备单细胞悬液，并接种到可降解的聚合物支架上，植入大鼠肠系膜内生长20～30周，可成功地构建出牙齿结构，包括含成熟牙釉质的釉器官、牙本质、成牙本质细胞、髓室、上皮根鞘和成牙骨质细胞，证实了在猪第三磨牙有上皮和间充质干细胞的存在。
DpSCs在形态上类似人骨髓成纤维细胞集落形成单位（colonyformingunitfibroblast,CFU-F）[1]，大多数细胞呈长梭形，体积较小。透射电镜下，DpSCs的核呈卵圆形，约占胞体体积的80%～90%，核仁大而明显，常染色质居中，异染色质少，分布于核周。胞浆很少，核浆比例大。细胞器较少，核糖体丰富,这些形态特征也体现了DpSCs的未分化或低分化状态。自我更新是干细胞的重要特性，Gronthos等[4]从3个月的原代DpSCs移植物中分离出基质样细胞,在体外培养扩增后植于小鼠皮下,结果形成牙本质-牙髓复合体样结构。对形成的牙本质样结构进行免疫组化检测,发现其牙本质涎蛋白(dentinsialoprotein,DSp)表达阳性,证实DpSCs具有自我更新能力。多向分化能力也是干细胞的特征之一，在不同的微环境下，DpSCs可分化为多种细胞，矿化诱导培养基中，DpSCs能够形成与前期牙本质相似的球状矿化基质并表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白（dentinsialophosphoprotein，DSpp）[5]；在脂肪诱导培养基中，DpSCs培养物中出现油红“o”阳性的脂滴，并伴随脂肪细胞特异性的pparγ2和lpl基因表达上调；此外，DpSCs还在mRna和蛋白水平表达神经前体细胞和神经胶质细胞的标志：神经巢蛋白（nestin）和神经胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidprotein，GFap），这说明体外培养的DpSCs有向神经样细胞分化的潜能[5]。其他学者也成功地诱导了DpSCs向成牙本质细胞、肌管样细胞以及脂肪细胞的分化[6-7]。
2DpSCs的定位、分离和鉴定
Gronthos等[1]推测DpSCs可能来源于血管周围的微环境(perivascularniche)。Shi等[8]研究发现，DpSCs和BmSCs存在于它们起源组织的微血管周围。tecles等[6]选取拔除的根尖孔未形成的第三磨牙分为三组：一组制备累及牙本质的浅洞，一组制备暴露牙髓的深洞，一组不做处理，分别观察牙髓内干细胞的活化和迁移，结果表明血管周围存在干细胞。干细胞表面的分子标记是鉴定和研究干细胞功能的重要手段，目前发现明确的干细胞标记不多，对DpSCs的标记物研究也不够深入。Gronthos等[1]应用免疫组化技术研究DpSCs的表面分子标记，并与BmSCs比较。结果表明，均表达与内皮细胞(血管细胞粘附分子1、CD146)、平滑肌细胞(α2平滑肌肌动蛋白)、骨细胞(碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨连接素、骨桥素、骨钙素)和成纤维细胞(Ⅲ型胶原、成纤维细胞生长因子2)有关的分子标记。DpSCs不表达骨基质蛋白、骨涎蛋白，而在BmSCs为低水平表达。用northernblotting方法研究发现DpSCs不表达成牙本质细胞的特异性标记物牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSpp)，说明DpSCs处于未分化状态,尚未分化为成熟的成牙本质细胞。为进一步比较DpSCs和BmSCs的性质，Shi等[7]应用基因芯片技术研究DpSCs和BmSCs的基因表达情况,发现两者在人类将近4400个基因表达水平上是一致的，包括表达细胞外基质成分、细胞粘附分子、生长因子、转录调节因子等的基因。但同时发现，DpSCs较高表达ⅩⅤⅢα1型胶原、胰岛素样生长因子2、盘状结构域酪氨酸激酶、naD(p)H2维生素K3氧化还原酶、周期素依赖性蛋白激酶6等；BmSCs较高表达胰岛素样生长因子连接蛋白27和Ⅰα2型胶原。Liu等[9]研究发现,DpSCs分化时，初始Runx2、tGFβ相关基因、胶原代谢相关基因上调、碱性磷酸酶活性上升，后均下降；而细胞外基质磷糖蛋白(matrixextracellularphosphoglycoprotein,mepe)是DpSCs分化过程中唯一下降的标记物，作者认为mepe是矿化的抑制剂,在DpSCs分化时下调，可作为DpSCs分化时的检测指标。最近mokry等[10]研究表明，牙髓干细胞表达StRo-1、vimentin、CD29、CD44、CD73、CD90、CD166等间充质干细胞的细胞标志物，同时表达Sox2,nestin及nucleostemin干细胞标志物。
3DpSCs的多向分化能力与相关因素的调控
牙髓干细胞是来源于神经嵴和间充质的多潜能干细胞[11]，研究发现其细胞群主要是来源于神经嵴细胞群，细胞标志物为lowaffinitynervegrowthfactorreceptor(LanGFR)和间叶细胞群，标志物为1-integrinreceptorsubunit。这两个细胞群都具有多向分化的功能。牙髓干细胞的多项分化能力即可塑性(plasticity)在国内外的很多实验中得到验证。Yu等[12]认为牙髓干细胞的分化方向取决于局部的微环境，他们在试验中发现利用猪牙胚细胞条件培养基能诱导牙髓干细胞形成更加合理组织学结构的牙本质-牙髓复合体。iohara等[13]研究发现，Bmp2能够刺激牙髓细胞分化为表达牙本质涎磷蛋白DSpp的成牙本质细胞。Saito等[14]也发现,Bmp2能促进牛和人单层培养和三维胶丸培养的牙髓细胞分化为成牙本质细胞。Keklikoglu等[15]认为转化因子ap21家族的成员FosB在成牙本质细胞和牙髓未分化间充质细胞的分化和增生方面有重要作用。moioli等[16]的研究,tGF2β能诱导DpSCs向成牙本质细胞分化。Liu等[17]研究表明牙本质素是mepe的一个肽片段,它能下调p16，促进DpSCs的增生，在牙髓修复中扮演重要角色。Gronthos等[1]发现DpSCs在含有L2抗坏血酸22磷酸、地塞米松、无机磷酸盐的矿化诱导液培养基中培养5～6周后,经染色表明有钙结节形成。Yamada等[18]的研究表明，人DpSCs高表达Dmp1，而Dmp1在未分化间充质细胞分化和牙本质矿化中起重要作用。arthur等[19]体内和体外实验中，分别加入了各种生长因子如eGF及FGF等，均发现牙髓干细胞可以分化为具有功能活性的神经元。Francescapaino等[20]认为黑素细胞和牙髓细胞均源于神经嵴细胞群，在试验中DpSCs在没有外加定向诱导因素下，表达tRp-2、tRp-1、gp100/pmelandmaRt-1抗原，且能自主分化为完全成熟的黑素细胞。Demarco等[21]最近研究把三维多聚乳酸支架置于拔除的第三磨牙髓室内，用晶体盐或胶体做成孔剂辅料，把牙髓干细胞接种于其内，发现与牙本质相关的形态发生因子在诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化中起着重要的作用，且DpSCs的微环境对细胞的行为和分化也有重要的影响。JingwanG等[22]用纳米纤维多聚乳酸支架进行DpSCs体内体外定向分化研究，发现Bmp-7和DXm复合因子及纳米纤维多聚乳酸支架可大大提高DpSCs向牙髓牙本质复合体的定向分化能力。Gronthos等[23]实验成功对DpSCs进行了脂肪诱导，而norsat等[24]证明DpSCs具有神经分化分化能力。
4DpSCs向ipSCs的重组转化
诱导多潜能性干细胞（inducedpluripotentstemcells，ipSCs）是通过在分化的体细胞中表达特定的转录因子，以诱导体细胞的重编程而获得的可不断自我更新且具有多向分化潜能的细胞。由于ipSCs既避免免疫排斥，又不涉及伦理道德问题，因此具有广泛且重要的临床应用价值。在2006年日本学者takahashi和Yamanaka[25]研究小组采用体外基因转染技术,从24个因子中筛选出oct4、Sox2、c-myc、Klf4等4个转录因子,通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞,在小鼠eS细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系,该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠eS细胞非常相似,而在基因表达谱、Dna甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠eS细胞,故将其命名为ipSCs，从那开始全世界众多实验室开始了ipSCs研究[26-28]，相继从狗、猪、猴和人等哺乳动物的皮肤细胞、肝细胞、羊水细胞、CD34血细胞、骨髓干细胞及牙齿干细胞等成体细胞成功获得了ipSCs。其中牙髓组织在临床上易于获得，不牵涉伦理问题而得到广泛关注。tamaoki[29]和XingYan等[30]研究小组利用病毒载体把c-myc、Klf4、oct4、Sox2和Lin28、nanog、oct4、Sox2因子导入牙髓干细胞中，成功获得了ipSCs。
迄今为止，关于DpSCs的研究，国内外学者做了大量的工作，取得了很大的进展。但是DpSCs的研究仍面临许多问题,如DpSCs有无特异性细胞标志物?DpSCs的鉴定标准?DSpCs的潜在分化能力和如何定向诱导DpSCs的分化?telomere在DpSCs体外培养和体内增殖过程中的作用机制？DpSCs向ipSCs的成功转化载体和重组因子的优化？这些问题说明DpSCs应用于临床还有很长的路要走,需要相关学者更多的基础和临床研究。
[参考文献]
[1]GronthosS,mankanim,BrahimJ,etal.postnatalhumandentalpulpstemcells(DpSCs)invitroandvivo[J].procnatlacadSciUSa,2000,97(35):13625-13630.
[2]miuram,GronthosS,Zhaom,etal.SHeD:stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth[J].procnatlacadSciUSa,2003,100(10):5807-5812.
[3]YoungCS,teradaS,VacantiJp,etal.tissueengineeringofcomplextoothstructuresonbiodegradablepolymerscaffolds[J].JDentRes,2002,81(10):695-700.
[4]GronthosS,BrahimJ,Liw,etal.Stemcellpropertiesofhumandentalpulpstemcells[J].JDentRes,2002,81(8):531-535.
[5]HaradaH,Kettunenp,JungHS,etal.LocalizationofputativestemcellsindentalepitheliumandtheirassociationwithnotchandFGFsignaling[J].JCellBiol,1999,147(1):105-120.
[6]tecleso,Laurentp,ZygouritsasS,etal.activationofhumandentalpulpprogenitor/stemcellsinresponsetoodontoblastinjury[J].archoralBiol,2005,50(2):103-108.
[7]ShiS,RobeypG,GronthosparisonofhumandentalpulpandbonemarrowstromalstemcellsbycDnamicroarrayanalysis[J].Bone,2001,29(6):532-539.
[8]ShiS,GronthosS.perivascularnicheforpostnatalmesenchymalstemcellsinhumanbonemarrowanddentalpulp[J].JBoneminerRes,2003,18(4):696-704.
[9]LiuH,Liw,ShiS,etal.mepeisdownregulatedasdentalpulpstemcellsdifferentiate[J].archoralBiol,2005,50(11):923-928.
[10]mokryJ,Soukupt,micudaS,etal.telomereattritionoccursduringexvivoexpansionofhumandentalpulpstemcells[J].JBiomedBiotechnol,2010:1-11.
[11]HuangaH,YKChen,LmLin,etal.isolationandcharacterizationofdentalpulpstemcellsfromasupernumerarytooth[J].Joralpatholmed,2008,37(9):571-574.
[12]YuJ,DengZ,ShiJ,etal.Differentiationofdentalpulpstemcellsintoregularregular-shapeddentin-pulpcomplexinducedbytoothgermcellconditionedmedium[J].tissueeng,2006,12(11):3097-3105.
[13]ioharaK,nakashimam,itom,etal.Dentinregenerationbydentalpulpstemcelltherapywithrecombinanthumanbonemorphogeneticprotein2[J].JDentRes,2004,83:590-595.
[14]Saitot,ogawam,HataY,etal.accelerationeffectofhumanrecombinantbonemorphogeneticprotein-2ondifferentiationofhumanpulpcellsintoodontoblast[J].Jendod,2004,30:205-208.
[15]Keklikoglun.thelocalizationofFosB,amemberoftranscriptionfactorap-1family,inratodontoblastsandpulpalundifferentiatedectomesenchymalcells[J].FoliaHistochemCytobiol,2004,42(3):191-193.
[16]moiolieK,Clarkpa,XinX,etal.matricesandscaffoldsfordrugdeliveryindental,oralandcraniofacialtissueengineering[J].advDrugDelivRev,2007,59:308-324.
[17]LiuH,Liw,GaoC,etal.Dentonin,afragmentofmepe,enhanceddentalpulpstemcellproliferation[J].JDentRes,2004,83(6):496-499.
[18]YamadaY,Fujimotoa,itoa,etal.Clusteranalysisandgeneexpressionprofiles:acDnamicroarraysystem-basedcomparisonbetweenhumandentalpulpstemcells(hDpSCs)andhumanmesenchymalstemcells(hmSCs)fortissueengineeringcelltherapy[J].Biomaterials,2006,27(20):3766-3781
[19]arthura,RychkovG,ShiS,etal.adulthumandentalpulpstemcellsdifferentiatetowardfunctionallyactiveneuronsunderappropriateenvironmentalcues[J].Stemcells,2008,26(7):1787-1795.
[20]painoF,RicciG,DeRosaa,etal.ecto-mesenchymalstemcellsfromdentalpulparecommittedtodifferentiateintoactivemelanocytes[J].eurcellmater,2010,20:295-305.
[21]DemarcoFF,CasagrandeL,ZhangZ,etal.effectsofmorphogenandscaffoldporogenonthedifferentiationofdentalpulpstemcells[J].Jendod,2010,36:1805-1811.
[22]wangJ,LiuX,JinX,etal.theodontogenicdifferentiationofhumandentalpulpstemcellsonnanofibrouspoly(L-lacticacid)scaffoldsinvitroandinvivo[J].actaBiomater,2010,6(10):3856-3863.
[23]CoublemL,FargesJC,BleicherF,etal.odontoblastdifferentiationofhumandentalpulpcellsinexplantcultures[J].Calciftissueint,2000,66(2):129-138.
[24]nosratiV,SmithCa,mullallyp,etal.Dentalpulpcellsprovideneurotrophicsupportfordopaminergicneuronsanddifferentiateintoneuronsinvitro:implicationsfortissueengineeringandrepairinthenervoussystem[J].eurJneuroSci,2004,19(9):2388-2398.
[25]takahashiK,YamanakaS.inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandfibroblastculturesbydefinedfactors[J].Cell,2006,126(4):663-676.
[26]takahashiK,tanabeK,ohnukim,etal.inductionofpluripotentstemcellsfromhumanfibroblastsbydefinedfactors,2007,Cell,131(5):861-872.
[27]aoit,YaeK,nakagawam,etal.Generationofpluripotentstemcellsfrommouseliverandstomachcells[J].Science,2008,321(5889):699-702.
[28]woltjenK,michaelip,mohsenip,etal.piggyBactranspositionreprogramsfibroblaststoinducedpluripotentstemcells[J].nature,2009,458(7239):766-770.
[29]YanX,QinH,QuC,etal.ipScellsreprogrammedfromhumanmesenchymal-likestem/progenitorcellsofdentaltissueorigin[J].StemCellsDevel,2010,19(4):469-480.
细胞研究篇4
体内糖平衡主要由胰岛素(inS)控制，胰岛β细胞可释放inS调节餐后的血糖，也可通过β细胞的增长适应长期的inS需求，如果其中任一环节发生障碍，引起绝对或相对inS缺乏，则可引发糖尿病。有关inS的生物合成和释放调节已进行了广泛的研究，但对于β细胞再生研究直到近年方引起重视。
非inS依赖型糖尿病(niDDm)发病机理并不十分清楚。但有证据表明：对葡萄糖的刺激反应inS分泌减少和β细胞增长不足易患此病〔1〕，而老年人存在胰岛再生能力低下，可能与糖尿病患病率高有关。Ⅰ型糖尿病是自身免疫引起β细胞损伤，致失代偿，此病初发时常有inS的短期恢复，说明缺损的胰岛细胞竭力满足体内inS的需求。研究β细胞增长的调节将有助于了解糖尿病发病机理，对糖尿病的治疗也将有重要的意义。本文对β细胞增长的难度，如何增长，调节因素等问题的研究做一简要综述。
1 β细胞生长能力与糖尿病
目前常用C57BL/6J小鼠作为研究niDDm的遗传性糖尿病动物模型，该种系1988年由美国Duke大学培育成功，为单糖尿病遗传基因病鼠。此鼠在正常饲料喂养下不发病，在高脂肪(33%)，高单糖(38%)，低纤维素(＜3%)饲料诱导下，经过4w(由4周龄开始至8周龄)发病。它与C57BL/KSJ鼠种的胰岛再生能力不同，即用葡萄糖刺激C57BL/6J小鼠胰岛，可增殖的细胞比率较C57BL/KSJ的多一倍。当发病时，C57BL/6J小鼠出现中度糖尿病、inS抵抗、肥胖和胰岛过度增生，C57BL/KSJ的早期症状与前者相似，但随后出现重度糖尿病，体重下降，β细胞破坏及死亡，这些观察表明胰岛素细胞再生能力决定了糖尿病的表现形式，支持人类Ⅱ型糖尿病是多因素致病的遗传观点。
另有证据表明，niDDm患者的β细胞总量比相应对照组(体重匹配)少〔1〕。有人提出一种假设，认为肥胖者由于外周inS抵抗，β细胞总量应适应性地增加，假如β细胞没有增长，inS产生将不足，便会引发糖尿病。由于胰岛有生产inS的较大贮备，β细胞的适度减少不会引发糖尿病，然而长期持续增加功能负载，致β细胞总量减少，inS释放会逐渐减少。另外，胰岛也存在质的异常，如niDDm患者血中inS原/inS比值增高，是否通过β细胞的增殖可遮掩质的异常也是今后寄望的研究课题。由此可见，除了inS分泌、抵抗外，还应研究β细胞的生长能力。
β细胞增长能力与Ⅰ型糖尿病的发病关系不大，它主要因自身免疫损伤胰岛，发病初期经历了inS的合成由增多到减少的变化过程，表明胰岛为满足机体对inS的需求进行了再生的努力，因不能充分代偿，必然引发糖尿病。如及时用免疫抑制剂中止β细胞损害，可不致于发生严重的糖尿病症状。由于β细胞可再生的部分有限，此种治疗需在自身免疫损伤β细胞的初期进行。
2 胰岛β细胞的生长
人到成年以后，有些细胞仍然进行着细胞分型，如表皮细胞、血细胞，有的不再进行分裂增殖，如神经细胞，即损伤后不能通过增殖来修复；有些细胞正常时并不进行分裂增殖，但当损伤后，细胞可旺盛地进行分裂，达到修复目的，如肝细胞。胰岛细胞平时也是处于相对静止期，并不分裂，但当损伤后需修复时只有很少一部分细胞可以进行分裂，且随年龄增长，可增殖细胞的部分也逐步减少。
β细胞增殖周期分裂过程同其它细胞相似，由G1期、S期、G2期和m期组成，整个细胞周期时间为14.9h，平时处于相对稳定的G0期。分析葡萄糖对β细胞增殖的作用，见细胞周期各时期变化与葡萄糖无关，说明葡萄糖是调节部分细胞进入“可增殖部分proliferativecompart,pC)”，使之进入细胞循环进行增殖。这与一般的调节机制相同，即进入细胞周期后是由与启始刺激因子不同的一系列调节物调节。用不同刺激条件观察细胞周期，可估计最大pC，即能够再生的部分细胞，胎鼠的胰岛约为10%，到成年时减到不足3%，而剩余大部分胰岛处于不可逆的G0期，不能进行细胞增殖〔5〕。以上研究说明胰岛再生能力受能够再生细胞的存有量和刺激因子的双方约束。
3 β细胞的增长方式〔2，3〕
β细胞的增长包括三方面：由β细胞前体衍变，即增生或化生；β细胞体积增大——肥大，β细胞数目增多——再生。
给正常成年大鼠注射链脲佐菌素(StZ)破坏胰岛，可造成永久性糖尿病模型，而给刚出生的大鼠注射StZ14d后血糖恢复正常，此时可见管状上皮存在，含有inS的细胞，另外胰岛随胰管的生长而增长，表明胰岛细胞可增生。虽然缺乏β细胞前体的形态标志物，不能直接测定前体，但间接证据表明存在在此过程。
关于β细胞肥大的研究较少，它主要由营养素刺激，适应inS增加的需求，致β细胞体积增大，inS产生增多，但在β细胞生长方面此种方式有限，只是部分质(inS分泌增多)上的修复。
4 β细胞生长的调节因子
4.1 营养素调节 胎儿和新生儿胰岛发育变化较大，尤其是出生后受营养素的刺激，在妊娠20d前的胎鼠胰岛主要由混合必需氨基酸刺激再生，葡萄糖不起作用，而妊娠末期为对葡萄糖敏感，氨基酸降到次要地位。此种转变似乎是为出生后作准备，何种因子调节此变化尚不清楚。氨基酸的促进作用，可持续到成年，但不再起主导作用〔4〕。
D-葡萄糖、D-甘露糖或混合必需氨基酸由β细胞代谢刺激再生，用甘露庚酮糖抑制葡萄糖代谢，刺激作用消失。不能代谢的糖类，如L-葡萄糖、3-0-甲基葡萄糖或果糖不能促进再生。这些研究表明，β细胞再生与inS合成和释放一样，与刺激物的代谢相关。也有报道游离脂肪酸可促进再生。
4.2 生长因子的调节 现已知体内含有一组多肽生长因子，其结构与激素相似，通过特异性膜受体传递生物学信息，称之为生长因子。根据生长因子产生细胞和支配细胞间的关系，主要有下列三种模式：(1)内分泌型：产生生长因子的细胞分泌出来的生长因子，通过血液携带作用于远处的细胞；(2)旁分泌型：产生生长因子的细胞分泌出来的生长因子作用于邻近的细胞；(3)自分泌型：产生生长因子的细胞所分泌的生长因子作用于细胞本身，其本身有相应的受体〔6〕。
生长调节素或inS样生长因子(iGFs)由生长激素刺激生产和释放，它通过自分泌或旁分泌机制促进局部细胞增殖。鼠胰岛可释放iGFⅠ和iGFⅡ，外源性iGFⅠ和iGFⅡ的加入促进胰岛细胞再生，另外用iGFⅠ抗体可抵消部分生长激素(GH)，促进增殖作用。这些研究表明，iGFs中介了GH促生长作用，inS可与Ⅰ型iGF受体作用促进胰岛再生。
血小板衍生长因子(pDGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)对某些细胞的作用，可称为“支配”因子，因它们本身并不进入细胞循环，而是通过其后的“执行”因子，如inS、iGFs或表皮生长因子(eGF)使细胞再生。
4.3 激素的调节 已知生长素(GH)对β细胞再生和inS的合成有促进作用，与此密切相关的催乳素和胎盘催乳素也促进再生，鼠β细胞有催乳素受体，在许多组织GH是通过刺激iGFs的产生和释放而起到促进细胞增殖效应的〔7〕。
胃肠(Gi)肽类激素除调节消化器官本身的活动外，还具有促激素和促生长等生理机能。Gi肽类中的胃泌素、缩胆囊素、促胰液素和抑胃肽均刺激inS释放。有报道促胰液素和缩胆囊素可促进胰岛素细胞再生，但此方面的研究较少，需进一步证实。
类固醇激素对胰岛作用的研究，体内与体外的实验结果不一致。体内给予糖皮质激素促进β细胞肥大、增殖、血中inS浓度升高；而体外实验为糖皮质激素抑制inS释放和细胞再生，也有报道不抑制，但未证实其促进作用。
4.4 基因的调控 为提高胰岛细胞再生能力，许多学者从基因调控方面进行了探索。大鼠经90%去胰岛术在数周内发生糖尿病，再用Dna修复酶多聚(aDp-核糖)合成酶抑制剂尼克酰胺治疗可诱导胰岛细胞再生，减低糖尿病的发病率。已鉴定其作用是由一种仅在增生的胰岛表达，而正常胰岛不表达的特异再生基因(regeneratinggene,Reggene)所致〔8，9〕，由此生产的Reg蛋白参与β细胞的再生增殖〔10〕。人类Reg基因也已鉴定，其结构同大鼠的相似。另外正常的胰腺泡细胞也可产生Reg蛋白，以前由人体胰石和胰液分离的胰石蛋白(pancreaticstoneprotein,pSp)以及由人胰腺分离出的胰线蛋白(pancreaticthreadprotein，ptp)均为由Reg基因产生的同一种蛋白〔11，12〕。Reg蛋白的作用可以看作为胰岛β细胞的自分泌型生长因子，最近有人观察到用不同营养因素和激素作用培养的大鼠胰岛细胞，可见β细胞的增殖与Reg基因的表达有相关性〔13〕。用Reg蛋白治疗90%去胰岛大鼠，β细胞增加，血糖显著降低〔14〕。另外Reg蛋白促进离体β细胞核中3H-tdR的掺入增多。这些结果表明，Reg蛋白有望开辟治疗糖尿病的一种新途径。
另外许多其它因子，如camp、胰岛素原、糊精、热休克蛋白(Heatshockprotein,HSp)和超氧化物歧化酶均有报道与胰岛的修复相关〔3〕。
参考文献
1 KloppelG，Lohrm，HablichKetal.isletpathologyandpathogenesisoftypeⅠandtypeⅡdiabetesrevisited.SurySynthpathRes，1985；4：10
2 Swennei.pancreaticbeta-cellgrowthanddiabetesmellitus.Diab-
etologia，1992；35：193
3 河津捷二，石井主税，大野富雄etal.胰ヲンダルハンス岛β细胞再生.综合临床，1994；43(2)：255
4 Swennei.Glucose-stimulatedDnareplicationoftheisletsduringdevelpmentofratfetus.effectsgrowthhormoneandtriiodothyronine.Diabetes,1985；34：803
5 pardeeaB.G1eventsandregulationofcellproliferation.Science，1989；246：603
6 陈诗书.医学细胞与分子生物医学.上海：上海医科大学出版社，1995：313～330
7 nielsenJH.effectsofgrowthhormone,prolactinandplacentaloninsulincontentandreleaseanddeoxyribonucleicacidsynthesisincultureedpancreaticislets.endocrinology，1982；110：600
8 terazonoK，YamamotoH,takasawaSetal.anovelgeneactivatedinregeneratingislets.JBiolChem，1988；263：2111
9 eizirikDL，SadlerS,palmerJp.Repairofpancreaticβcells.arelevantphenomenoninearlyiDDm?Diabetes，1993；42：1383
10 ishiiC，KawazuS,tomonoSetal.appearanceofaregenerating(reg)geneproteininpancreaticisletsofremissinonBB/wor/tkyrats.endocrineJ，1993；40：269
11 GrossJ，CarlsonRi,Brauerawetal.isolation，characterizationanddistributionofanunusualpancreatichumansecretoryprotein.JClininvest,1985；76：2115
12 DeCaroa，BoncelJ,Rouimipetpleteaminoacidsequenceofanimmuoreativeformofhumanpancreaticstoneproteinisolatedfrompancreaticjuice.FeBS，1987；188：201
细胞研究篇5
关键词：单核细胞；淋巴管内皮细胞；转分化。
干细胞替代治疗是近些年来医学研究领域的热点。单核细胞参与血管新生一直是近些年来非常活跃的课题。研究发现，单核细胞能受组织环境影响、发生不同方向的分化。单核细胞不仅是巨噬细胞、树突状细胞的前体细胞，还能在特殊环境下分化成内皮祖细胞（endothelialprogenitorcell，epCs）[1]，参与血管新生。然而，单核细胞参与淋巴管新生的研究相对较少。相对于血管内皮标志物，淋巴管内皮特异性标志物发现较晚，在1984年以后才陆续被发现[2]，因此对于淋巴管内皮的研究一直滞后于血管内皮。近年来，随着研究者对于一些淋巴管内皮特异性标志物的发现，关于淋巴管在诸多领域的研究均有所突破。因此，随着单核细胞向血管内皮细胞转分化的研究的深入，单核细胞向淋巴管内皮细胞转分化的研究已经有了初步进展，但至今仍未有定论。目前这方面的研究，只能给单核细胞向淋巴管内皮细胞转分化的可能性提供一些依据。
一、单核细胞向血管内皮细胞的转分化
从胚胎发育学看，淋巴管内皮细胞与血管内皮细胞具有同源性。胚胎主静脉的一部分内皮细胞出芽形成淋巴囊，再由淋巴囊出芽形成成熟的淋巴管网络[3]。所以，单核细胞向血管内皮细胞转分化的研究，能提示单核细胞向淋巴管内皮细胞转分化的可能性。
研究发现，从人类血中分离培养CD34-CD14+单核细胞，表达特异性内皮细胞表面标志物的细胞的比例随时间推移增加，到第4周时，表达vwF、Ve-cadherin和e-noS的细胞比例分别达到94.2%，89.7%和58.8%，在三维基质胶中，这些细胞形成了条索状或管状结构，表明这些细胞聚集可能是参加血管生成的[4]。由于单核细胞数量多，其在治疗缺血性疾病领域的应用前景备受关注。
二、单核细胞的多向性干细胞分化潜能
有研究报道，单核细胞经诱导具有多向性干细胞分化潜能。Zhao等的研究表明，人外周血单核细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（m-CSF）的作用下，能被诱导成多潜能干细胞，后者经过诱导能分化成巨噬细胞、t淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经元细胞、肝细胞[5]。Kuwana等的研究小组发现，人外周血单核细胞在纤维连接蛋白（fibronectin，Fn）、L-Dmem以及外周血CD14―单个核细胞上清（即淋巴细胞上清）的某些细胞因子诱导作用下，能分化成具有成纤维细胞形态并且表达CD34的多潜能细胞，命名为momCs，这种细胞仍然携带单核细胞抗原CD14和白细胞共同抗原CD45，因此来源于单核细胞；他们在momCs的培养体系中分别加入相关的刺激因子，对momCs进行诱导，发现会有不同数量的细胞群向相应的方向分化，如成骨细胞、肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞[6]。在2007年，Kuwana等人又在StemCell上[7]，专门研究了momCs向内皮细胞分化的潜能。培养7d后，发现在蛋白和基因水平，细胞均表达内皮细胞特异性标志物，如CD144、CD34、vwF、VeGFR-2等，且与脐静脉内皮的表达水平相近，Rt-pCR结果显示细胞对于CD14、CD45的表达明显下调。
上述研究中，无论是单核细胞来源的epCs、还是momCs，均只关注了其向血管内皮细胞分化，及其用于血管新生、缺血性疾病治疗的效果，尚未见单核细胞来源的epCs或momCs向淋巴管内皮细胞诱导分化的研究报道。
三、单核细胞参与淋巴管新生
炎症、肿瘤或免疫排斥反应时，局部组织会出现单核-巨噬细胞浸润。研究者发现单核-巨噬细胞浸润与淋巴管新生有关。肿瘤淋巴转移的研究发现，肿瘤周围有巨噬细胞浸润且高表达VeGF-C（称为肿瘤相关巨噬细胞），其数量与周围淋巴管密度及淋巴转移明显相关，甚至发现淋巴管壁有巨噬细胞的掺入[8，9]。肾移植后免疫排斥反应的研究发现，移植肾的淋巴管密度比正常肾增加了约50倍，观察到淋巴管附近出现结节样单个核细胞浸润，淋巴管内含有淋巴细胞[10]。有研究表明，在野生型鼠伤口急性期形成的淋巴管，大部分是由巨噬细胞标志物F4/80和淋巴管标志物LYVe-1和podoplanin共同阳性的细胞构成；在纯合子糖尿病鼠，由于巨噬细胞的数量和活性均降低，角膜伤口愈合中，与对照组杂合子鼠相比，LYVe-1+淋巴管和CD31+血管明显减少[11]。maruyama等通过建立鼠的角膜移植模型，发现CD11b+的巨噬细胞浸润区有淋巴管新生，认为新生的淋巴管来源于巨噬细胞[12]。这些研究提示，单核巨噬细胞有向淋巴管内皮细胞转分化的可能性。体外研究表明，活化的单核-巨噬细胞表达VeGF-C和其受体VeGFR-3[9，13]，VeGF-C是特异性促淋巴管生长因子[14]。maruyama等研究小组将致炎物质硫胶质（thioglycollate）注入小鼠的腹膜腔，收集腹腔渗出的细胞，Rpmi-1640培养24h后，收集粘附的细胞进行流式细胞术测定，结果显示，超过99.67%的腹膜渗出细胞（peCs）CD11b阳性；Rt-pCR结果显示，收集的CD11b+巨噬细胞表达VeGFR-3和VeGF-C，但不表达VeGFR-2；另外，CD11b+巨噬细胞中有30-50%表达LYVe-1，podoplanin或者prox-1；免疫细胞化学分析表明，peCs（培养24h）表达CD11b和prox-1以及podoplanin和LYVe-1蛋白，而未用thioglycollate刺激的腹膜腔巨噬细胞，淋巴管内皮标志物的表达呈弱阳性，提示激活的巨噬细胞而非静止的巨噬细胞表达淋巴管特异性标志物[13]。
四、淋巴管内皮祖细胞
针对前述单核细胞参与淋巴管新生及表达淋巴管特异性标志物的研究结果，有研究者提出外周血中存在淋巴管内皮祖细胞，而非单核细胞直接参与或表达的结果。Salyen等分别从胎儿肝、脐带血和成人外周血单个核细胞中分离出CD34+CD133+VeGFR-3+细胞，认为该群细胞可向血管内皮细胞或淋巴管内皮细胞分化[15]。wang等人从成人外周血和脐带血分离出CD34+CD133+VeGFR-3+的epCs，用VeGF-C诱导能将其转分化为淋巴管内皮细胞[16]。为了与CD34+CD133+VeGFR-2+的血管内皮祖细胞区别开来，故将CD34+CD133+VeGFR-3+细胞命名为淋巴管内皮祖细胞（lymphaticendothelialprogenitorcells，LepCs）。然而人们发现，循环血中无论是epCs抑或LepCs，均含量很少，约占单个核细胞的0.002%[17]，与上述单核-巨噬细胞经诱导刺激高比例的表达淋巴管内皮细胞标志物不符，且分离过程复杂。
五、单核细胞淋巴管内皮细胞转分化
研究表明，取成人新鲜外周血，分离单核细胞，用内皮细胞培养基eCm培养，尽管单核细胞在Fn、tnF-%Z或VeGF-C诱导下能表达淋巴管内皮标志物，但内皮细胞标志物的基因表达为阴性。[18]已有的研究表明，单核细胞可在VeGF等生长因子的诱导下向血管内皮细胞转分化[4，7，19]。上述实验单核细胞未表达内皮细胞共同标志物vwF、enoS、VeGFR-2，可能与培养基中VeGF的剂量不足以及诱导时间较短有关。真正的淋巴管内皮细胞应该既表达内皮细胞标志物，又表达淋巴管内皮特异性标志物。
六、展望
综上所述，前述研究表明，单核细胞能分化成momCs或epCs，而单核-巨噬细胞在活化时易于表达淋巴管特异性标志物。由此我们设想，momCs或epCs有可能更容易被诱导成淋巴管内皮细胞，参与淋巴管新生。前述研究结果虽然表明单核-巨噬细胞在淋巴管新生方面起重要作用，但是，单核细胞是否能真正转化为淋巴管内皮细胞、并能用于淋巴管新生？尚需要体外研究来证实。
淋巴管是淋巴系统重要的组成部分，在维持人体内环境稳定和免疫功能等方面发挥重要作用。临床上，淋巴管发育缺陷、手术创伤等均会导致淋巴引流不畅而致淋巴水肿。淋巴水肿的治疗依然是医学界的难题。众所周知，原发性淋巴水肿不同于炎症等病理过程，主要为细胞间隙蛋白质等大分子物质回流障碍，缺乏刺激炎症细胞和内皮祖细胞浸润的病理生理环境。特别是近些年来，乳腺癌发病率呈上升趋势，乳腺癌根治术由于清扫腋窝淋巴结、切断了大量淋巴管，造成上肢淋巴水肿的并发症约占15%-20%[20]，轻者随着侧支循环的建立而缓解，严重者可导致上肢功能障碍，影响患者的生存质量。长期以来，国内、外主要运用烘绑或间歇加压等保守疗法促进淋巴回流，难以从根本上治愈淋巴水肿。实质上，治疗淋巴水肿的根本问题就是促进淋巴管新生。所以，研究淋巴管新生机制及有效方法对于治疗淋巴水肿及淋巴管相关疾病具有重要意义。
另外，我们认为，乳腺癌患者手术后由于接受化疗或放疗，容易造成免疫细胞损伤，并由此导致局部浸润的单核-巨噬细胞数量减少，间接引发局部淋巴管再生障碍，促进继发性淋巴水肿的产生。人外周血中的单核细胞取材方便，数量相对丰富，如果能作为淋巴管内皮细胞的来源并最终用于临床淋巴水肿的治疗，将有很好的发展前景。
参考文献：
[1]HoenigmR，BianchiC，SellkeFw.Hypoxiainduciblefactor-1%Z，endothelialprogenitorcells，monocytes，cardiovascularrisk，woundhealing，cobaltandhydralazine：aunifyinghypothesis[J].CurrentDrugtargets，2008，9（5）.
[2]JohnstonmG，walkerma.Lymphaticendothelialandsmooth-musclecellsintissueculture[J].inVitro，1984，20（7）.
[3]SabinFR.ontheoriginofthelymphaticsystemfromtheveinsandthedevelopmentofthelymphheartsandthoracicductinthepig[J].amJanat，1902，（1）.
[4]Schmeissera，GarlichsCD，ZhangH，etal.monocytescoexpressendothelialandmacropha-gocyticlineagemarkersandformcord-likestructuresinmatrigelunderangiogenicconditions[J].CardiovascRes，2001，49（3）.
[5]ZhaoY，GlesneD，Hubermane.ahumanperipheralbloodmonocyte-derivedsubsetactsaspluripotentstemcells[J].procnatlacadSciUSa，2003，100（5）.
[6]Kuwanam，okazakiY，KodamaH，etal.HumancirculatingCD14+monocytesasasourceofprogenitorsthatexhibitmesenchymalcelldifferentiation[J].JLeukocBiol，2003，74（5）.
[7]Kuwanam，okazakiY，KodamaH，etal.endothelialdifferentiationpotentialofhumanmonocyte-derivedmultipotentialcells[J].StemCells，2006，24（12）.
[8]SchledzewskiK，Falkowskim，moldenhauerG，etal.Lymphaticendothelium-specifichyaluronanreceptorLYVe-1isexpressedbystabilin-1+，F4/80+，CD11b+macrophagesinmalignanttumoursandwoundhealingtissueinvivoandinbonemarrowculturesinvitro：implicationsfortheassessmentoflymphangiogenesis[J].Jpathol，2006，209（1）.
[9]SchoppmannSF，Birnerp，St？cklJ，etal.tumor-associatedmacrophagesexpresslymphaticendothelialgrowthfactorsandarerelatedtoperitumorallymphangiogenesis[J].amJpathol，2002，161（3）.
[10]KerjaschkiD，RegeleHm，moosbergeri，etal.Lymphaticneoangiogenesisinhumankidneytransplantsisassociatedwithimmunologicallyactivelymphocyticinfiltrates[J].JamSocnephrol，2004，15（3）.
[11]maruyamaK，asaiJ，iim，etal.Decreasedmacrophagenumberandactivationleadtoreducedlymphaticvesselformationandcontributetoimpaireddiabeticwoundhealing[J].amJpathol，2007，170（4）.
[12]maruyamaK，iim，CursiefenC，etal.inflammation-inducedlymphangiogenesisinthecorneaarisesfromCD11b-positivemacrophages[J].JClininvest，2005，115（9）.
[13]Skobem，HambergLm，Hawighorstt，etal.Concurrentinductionoflymphangiogenesis，angiogenesis，andmacrophagerecruitmentbyvascularendothelialgrowthfactor-Cinmelanoma[J].amJpathol，2001，159（3）.
[14]Jeltschm，Kaipainena，JoukovV，etal.HyperplasiaoflymphaticvesselsinVeGF-Ctransgenicmice[J].Science，1997，276（5317）.
[15]Salvenp，mustjokiS，alitaloR，etal.VeGFR-3andCD133identifyapopulationofCD34+lymphatic/vascularendothelialprecursorcells[J].Blood，2003，，101（1）.
[16]wangH，tanY，Zhangm，etal.Vascularendothelialgrowthfactor3induceddifferentiationofCD34+CD133+VeGFR-3+epCstowardslymphaticendothelialcells[J].JpnJLymphol，2005，28（2）.
[17]Hristovm，erlw，weberpC.endothelialprogenitorcells：mobilization，differentiation，andhoming[J].arteriosclerthrombVascBiol，2003，23（7）.
[18]梁艳红，张肇林，田铧，等.单核细胞向淋巴管内皮细胞诱导分化的潜能[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，（10）.
[19]Rohdee，malischnikC，thalerD，etal.Bloodmonocytesmimicendothelialprogenitorcells.StemCells，2006，24（2）.
细胞研究篇6
1资料与方法
1．1方法
1．1．1分离培养hBmSCs在志愿者髂前上棘抽取骨髓10mL。采集的骨髓用生理盐水1∶1稀释，密度为1．077g／L的淋巴细胞分离液2000r／min离心15min，收集白膜层，生理盐水漂洗2次。以含10％FBS的L－Dmem作为完全培养液，以一定密度接种于75mL培养瓶中，置于37℃，5％Co2饱和湿度培养箱内培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每2～3d换液1次，待细胞达80％融合时，用0．25％胰酶＋0．02％eD－ta消化，以1∶3的比例传代培养。
1．1．2流式检测hBmSCs表型hBmSCs用0．25％胰酶＋0．02％eDta消化，1000r／min离心5min，生理盐水洗涤，制备成1×106／mL单细胞悬液，分别加入荧光标记的鼠抗人CD34、CD29、CD105抗体，设置空白对照，避光冰育30min，生理盐水洗涤3次后重悬细胞，上流式细胞仪检测。
1．1．3鉴定hBmSCs多向分化潜能以4×103／cm2密度将第3代hBmSCs接种于6孔板，每孔2mL。（1）成脂诱导及鉴定：细胞达到完全融合后4d，实验组加入脂肪诱导液（H－Dmem，10％FCS，0．5mmol／LiBmX，10μg／mL牛胰岛素，0．2mmol／Lindomethacin，1μmol／L地塞米松）诱导3d，再用脂肪保持液（H－Dmem，10μg／mL牛胰岛素，10％FCS）处理1d，循环3次，再用脂肪保持液处理2d。对照组加入含10％FCS的H－Dmem，每3天换液1次。2周后油红o染色鉴定。（2）成骨诱导及鉴定：细胞达到60％～70％融合后，实验组加入成骨细胞诱导液（oS，含1×10－7mol／L地塞米松，10mmol／L甘油磷酸钠，50g／mL维生素C），对照组加入L－Dmem完全培养液，置培养箱中，每2天换液1次，第21天终止诱导。茜素红S染色鉴定。
1．1．4分组处理hBmSCs采用0．25％胰酶＋0．02％eDta消化hBmSCs，用不同输注液制备单细胞悬液。根据输注液不同分为生理盐水组（9g／L氯化钠注射液）、糖盐组（50g／L葡萄糖氯化钠注射液）、清蛋白组（含5％人血清蛋白的氯化钠注射液）。分别在4℃和25℃温度条件下置于不同时间点（0．5、1．0、2．0、4．0，6．0h）后进行以下检测。（1）取90μL细胞悬液与10μL胎盘蓝混匀，3min内计数活细胞（未染色）和死细胞（染色），测定细胞存活率。（2）另取1×106／mL细胞行流式细胞术检测细胞表型CD34、CD29、CD105。（3）再将不同分组细胞悬液，1000r／min离心5min，采用含10％FBS的L－Dmem作为完全培养液，以1×103／mL密度接种于96孔板，每组设3个复孔，置于37℃，5％Co2饱和湿度培养箱培养7d。采用CCK－8在酶联免疫检测仪上测定450nm各孔波长吸光度（a）值，以时间为横轴，a值为纵轴绘制生长曲线。
1．2统计学处理采用SpSS17．0进行数据分析，结果用x±s表示。采用t检验进行两组均数间比较，采用单因素方差分析进行多组均数间比较，采用LSD最小显著差数法进行均数间两两比较。p＜0．05表示差别有统计学意义。
2结果
2．1hBmSCs形态观察原代hBmSCs贴壁后，呈圆形，散在分布。3d后完全换液，去除未贴壁细胞，可见少量分散短梭形贴壁细胞。第14天时，贴壁细胞融合成单层，细胞排列有明显方向性，呈漩涡状。见图。
2．2hBmSCs的表型流式检测第3代hBmSCs的表型发现，CD105阳性率98．7％，CD29阳性率97．7％，表达率极高；CD34阳性率为2．9％，表达呈阴性。
2．3hBmSCs分化能力鉴定hBmSCs成脂诱导2周后，光学显微镜下可见大量融合成串珠状的圆形脂滴。油红o染色可见被染成橙红色的脂滴，显示分离的hBmSCs可被诱导向脂肪细胞分化。成骨诱导3周，细胞逐渐融合，失去细胞结构，14d左右出现明显钙结节，茜素红S染色后可见散在大量橘红色钙结节，显示培养的hBmSCs可被诱导向成骨细胞分化。
2．4hBmSCs存活率检测在5个时间点（0．5、1．0、2．0、4．0、6．0h）对保存在25℃、4℃的3个实验组的细胞存活率检测，结果见表1～2。结果显示，糖盐组细胞存活率最低，25℃保存4．0h时只有约10％细胞存活；而清蛋白组细胞存活率最高，25℃保存2．0h时清蛋白组细胞存活率仍可达90％，差异有统计学意义（p＜0．05）。25℃和4℃条件下，保存0．5h时，生理盐水组及清蛋白组细胞存活率都超过90％，随着保存时间延长，各组细胞存活率逐渐下降。
2．5不同分组细胞表型检测25℃和4℃条件下，在5个时间点（0．5、1．0、2．0、4．0、6．0h）对3个实验组的细胞表型检测，结果见表3～5。结果表明，不同输注液、保存温度及保存时间对细胞表型影响差异无统计学意义（p＞0．05）。
2．6细胞生长曲线测定将不同分组处理后的细胞，采用L－Dmem完全培养液重新接种培养，检测细胞增殖能力，结果见图2（见《国际检验医学杂志》网站“论文附件”）。50g／L葡萄糖氯化钠注射液组保存的细胞增殖能力最差，保存4h后细胞失去贴壁和生长能力（无细胞贴壁无法完成生长曲线）。5％人血清清蛋白氯化钠注射液组细胞增殖能力比9g／L氯化钠注射液组细胞增殖能力强。同一组细胞4℃条件下不同时间点的增殖能力比25℃条件下强。随着保存时间延长，各组细胞增殖能力逐渐下降。
3讨论
hBmSCs是来源于骨髓的间质干细胞，不仅能分化成肝细胞、胆管上皮细胞［4］、血管内皮细胞［5］、不同类型的皮肤细胞［6］、神经样［7］细胞，还具有免疫调节、炎症趋化等特性，使其在肝脏疾病、血管外科、烧伤整形外科及神经损伤等疾病治疗中发挥越来越重要的作用。干细胞注射液从实验室制备到运送至病房回输给患者具有一定时空距离，特别是随着异地移植病例的增多，如何有效地保存干细胞注射液，对于细胞移植的临床应用非常重要。目前相关研究更多集中于将干细胞冷冻于－80℃或液氮等进行长期保存的探讨［8－9］，有关短时保存条件对干细胞生存和生长影响的研究不多。本实验探讨了几种临床常用注射液在不同温度下短时保存干细胞对细胞存活和增殖能力等状况的影响。形态学观察显示，培养的细胞呈均一长梭形，辐射状生长；流式细胞术检测细胞表型显示CD34表达阴性，CD29、CD105表达阳性；成脂诱导后出现大量脂滴，成骨诱导后出现钙结节，表明该细胞确为hBmSCs。
细胞研究篇7
[摘要]目的探讨激活态雪旺细胞（SCs）对神经干细胞（nSCs）的分化作用。方法取出生24h内的SD乳鼠脊髓nSCs，分离培养并传至4代。取体重（100±5）g的SD大鼠，结扎右侧坐骨神经，1周后取双侧坐骨神经，左侧提取正常坐骨神经分离培养SCs（普通SCs），右侧提取结扎变性的坐骨神经分离培养SCs（激活态SCs），均采用双酶消化加差速贴壁法。将SCs与nSCs应用transwell培养皿联合培养，分为三组：a组为激活态SCs与nSCs；B组为普通SCs与nSCs；C组仅为nSCs。于培养的第2、4、6天检测各组nSCs活性。1周后，westernblot检测各组SCs表皮生长因子（eGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达水平，免疫荧光检测各组nSCs分化比例。结果传至4代的nSCs生长稳定，分离的SCs7d后大量增殖呈旋涡状。联合培养后mtt法检测细胞活性，第2、4天三组细胞的活性差异无统计学意义（p>0.05），第6天C组活细胞比例开始降低，a、B组与C组比较差异有统计学意义（p<0.05），a组与B组比较差异无统计学意义（p>0.05）。westernblot检测a组细胞表皮生长因子（eGF）表达水平（0.486±0.028）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达水平（0.385±0.023）均高于B组，差异有统计学意义（p<0.05）。map-2荧光染色，每高倍视野阳性细胞比例a组[（35.26±2.53）%]高于B组[（27.63±3.45）%]，差异有统计学意义（p<0.05）；GFap荧光染色，每高倍视野阳性细胞比例a组[（62.42±3.78）%]低于B组[（70.18±1.26）%]，差异有统计学意义（p<0.05）。结论激活态SCs能够促进nSCs向神经元的分化进程，提高神经元的分化比例。
[关键词]雪旺细胞；神经干细胞；细胞分化；联合培养；神经元
[中图分类号]R741.02[文献标识码]a[文章编号]1673-7210（2014）03（a）-0019-04
effectofactivatedSchwanncellsininducingdifferentiationofneuralstemcells
ZHanGRuiZHanGJunZHaoChengbin
Departmentoforthopedic，theFourthaffiliatedHospitalofHarbinmedicalUniversity，Heilongjiangprovince，Harbin150086，China
[abstract]objectivetodiscusstheeffectofactivatedSchwanncells（SCs）inthedifferentiationofneuralstemcells（nSCs）.methodsthespinalcordofSDratwastakeninthe24hoursafterbirth.thenSCsfromspinalcordwereseparatedandcultureduntilthefourthpassage.（100±5）gSDratwasusedtoligaturetherightsciaticnerve.afteroneweek，boththerightandleftsciaticnervewereisolatedtocultureSCsbydoubleenzymesdigestionanddifferentialattachment.theSCsfromtherightsciaticnervewerenamedactivatedSCs，andtheonesfromtheleftsidecalledcommonSCs.thentheSCsandnSCswereco-culturebytranswellculturedish，andtheyweredividedintogroupa，groupBandgroupC.groupawasactivatedSCsandnSCs，groupBwascommonSCsandnSCs，andgroupCwasjustnSCsascontrol.thecytoactivewasdetectedatthesecond，fourthandsixthdays.oneweeklater，theeGFandbFGFsecretedbySCsweredetectedinwesternblot，andthedifferentiationratioofnSCswasdetectedbyimmunofluorescence.ResultsthefourthpassagenSCsgrewstably，andtheSCsproliferatedasvortexafter7days.thedifferenceofcytoactivebetweenthesecondandfourthdaywasnotstatisticallysignificant（p>0.05）accordingtothemttdetection.However，thecytoactivebegantoreduceatthesixthdaybymttdetection，andthecytoactiveofgroupaandgroupBweresuperiorthanthoseofgroupC，thedifferenceswerestatisticallysignificant（p<0.05）.thedifferenceofcytoactivebetweengroupaandgroupB，thedifferencewasnotstatisticallysignificant（p>0.05）.theexpressionofeGFandbFGFingroupa[（0.486±0.028），（0.385±0.023）]werebothhigherthanthoseingroupB，thedifferenceswerestatisticallysignificant（p<0.05）.thepositivecellsratioofeachhighpowerfieldofgroupa[（35.26±2.53）%]wassuperiorthanthatofgroupB[（27.63±3.45）%]accordingtothemap-2staining，thedifferencewasstatisticallysignificant（p<0.05）.thepositivecellsratioofeachhighpowerfieldofgroupa[（62.42±3.78）%]waslowerthanthatofgroupB[（70.18±1.26）%]accordingtotheGFapstaining，thedifferencewasstatisticallysignificant（p<0.05）.ConclusiontheactivatedSCscanpromotethenSCsdifferentiateintoneurons，andimprovetheratioofneurons.
[Keywords]Schwanncell；neuralstemcell；Celldifferentiation；Co-culture；neuron
[基金项目]黑龙江省自然科学基金项目（编号D200901）；黑龙江省教育厅科技研究项目（编号11531160）。
[作者简介]张睿（1987.2-），男，哈尔滨医科大学2011级在读硕士研究生；研究方向：神经干细胞应用。
[通讯作者]赵承斌（1958.5-），男，主任医师，教授，硕士研究生导师；研究方向：脊柱外科。
周围神经损伤是骨科常见的疾病之一，虽然周围神经具有一定的再生能力，但对于较大缺损却很难自身修复[1]。随着组织工程学领域研究的深入，神经干细胞（nSCs）已被公认为是对神经损伤修复的有效方法，通过nSCs在神经断端的不断分化，使受损的周围神经重新恢复连接。然而单纯形态学得连接不能保证神经的传导功能，有研究表明，这与nSCs分化过程中分化为胶质细胞和神经元的比例有关[2]，提高神经元的分化比例，降低胶质细胞的表达可有效提高神经的传导速度，因此许多学者通过不同方法促进神经干细胞向神经元的分化[3-5]，均取得了一定进展。本研究通过激活态雪旺细胞（SCs）刺激nSCs的分化，观察其诱导nSCs分化为神经元的能力。
1材料与方法
1.1实验材料
雌性SD大鼠[中国农科院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号：SYXK（黑）2006-032]；Dmem/F12细胞培养基（Hyclone公司，美国）；青-链双抗，胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶（碧云天，中国）；兔抗鼠单克隆抗体nestin，FitC标记的羊抗兔igG，兔抗鼠碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮细胞生长因子（eGF）单克隆抗体，兔抗鼠map-2、GFap单克隆抗体（武汉博士德公司）；transwell培养皿（Corning公司，美国）。
1.2实验方法
1.2.1神经干细胞的分离培养与鉴定取出生24h内的SD大鼠，断髓处死后无菌条件下取出脊髓，显微镜下剥离硬脊膜，剪成5mm3组织块，加入0.25%胰酶消化10min，用吸管反复吹打至单细胞悬液，加入5mLDmem/F12培养基终止消化。1000r/min离心5min，弃上清，加入含20ng/mL的eGF和20ng/mL的Dmem/F12培养液，重悬后移入细胞培养瓶，置于37℃含5%Co2的细胞培养箱中培养。每6～8天传代1次，连续传4代。取第4代神经球，移入含有多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔板内，24h后取出盖玻片，4%多聚甲醛固定，加入兔抗鼠nestin（1∶100）单克隆抗体作为一抗，4℃过夜，加入异硫氰酸荧光素（FitC）标记的羊抗兔二抗，孵育30min，进行观察。
1.2.2雪旺细胞的分离培养取体重（100±5）g的SD大鼠，10%水合氯醛3mL/kg腹腔麻醉后，以右侧臀大肌为中心消毒，铺无菌孔巾，纵行做一长约1.5cm切口，分离暴露坐骨神经，于近端结扎，逐层缝合。1周后，处死大鼠，分离双侧坐骨神经，右侧坐骨神经由于结扎变性，SCs受刺激而发生激活，称激活态SCs；左侧为正常坐骨神经，提取的SCs称为普通SCs。双侧坐骨神经均剪成5mm小段，加入0.1%胰蛋白酶和0.25%的Ⅱ型胶原酶消化1h，反复吹打至单细胞悬液，加入5mLDmem/F12培养基终止消化。采用差速贴壁法，使成纤维细胞贴壁，未贴壁细胞移入含20ng/mLeGF和20ng/mL的Dmem/F12培养液中行原代培养。
1.2.3细胞的分组与联合培养将细胞随机分为3组，a组为激活态SCs与nSCs联合培养，B组为普通SCs与nSCs联合培养，C组nSCs单独培养，作为对照。细胞的联合培养采用0.2μm的6孔transwell培养皿，上室为SCs，下室为nSCs。培养基采用不含任何营养因子的Dmem/F12培养基。于培养的第2、4、6天分别对下室细胞行mtt染色，检测细胞活性。
1.2.4westernblot检测激活态雪旺细胞营养因子的表达水平联合培养1周后，取a、B两组上室细胞，提取总蛋白，进行电泳、转膜、封闭，分别加入兔抗鼠eGF（1∶100）、bFGF（1∶200）单克隆抗体，4℃过夜，加入ap显色液显色。用image-proplus专业图像分析系统测定平均光密度值，并进行统计学分析。
1.2.5神经干细胞分化的免疫荧光检测联合培养1周后，将多聚赖氨酸包被的盖玻片放入下室，24h后取出盖玻片，4%多聚甲醛固定，分别加入兔抗鼠map-2（1∶200）、GFap（1∶200）单克隆抗体作为一抗，4℃过夜，加入FitC标记的羊抗兔igG二抗（1∶200），室温孵育30min。在100倍荧光显微镜下随机选取6个不同视野，计数抗原阳性细胞数与全部细胞数，计算阳性细胞数在全部细胞中的比值，公式为：阳性细胞比值=阳性细胞数/细胞总数×100%。
1.3统计学方法
采用统计软件SpSS18.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1神经干细胞的分离培养与鉴定
nSCs在培养瓶内悬浮生长，呈圆形，核较大，折光性强。于培养第5天开始聚集成团，呈球样生长，第7天左右可见部分神经球出现贴壁，并发出短小突起。传4代后，nSCs形态稳定，未见异型性改变。荧光染色可见聚集成球的nSCs发出绿色荧光，可见因贴壁而发出的短促突起。
2.2激活态雪旺细胞的分离培养
结扎SD大鼠右侧坐骨神经后，大鼠出现右下肢跛行，1周后有足部有溃疡形成。分离双侧坐骨神经，可见结扎远端坐骨神经明显较对侧增粗。细胞经差速贴壁以后可见胞体较大的成纤维细胞得以去除，去除后细胞呈梭形，3d后，胞体增长，发出突起，至7d细胞大量增殖呈旋涡状排列，激活态SCs生长速度较普通SCs的生长速度快。
2.3各组神经干细胞的分化状态
a组nSCs在培养5d后即开始发出较长突起，出现贴壁细胞，细胞形态增长，细胞间借突起形成网状连接。B组细胞在8d后开始出现分化，但细胞发出的突起较a组短小。C组细胞仍呈球形生长，少见贴壁细胞。应用mtt法检测三组细胞的平均光密度值，可见第2、4天三组细胞的活性差异无统计学意义（p>0.05），第6天C组活细胞比例开始降低，a、B组与C组比较差异有统计学意义（p<0.05），a组与B组比较差异无统计学意义（p>0.05）。见图1。
a为激活态SCs作用下的nSCs活性检测；B为普通SCs作用下的nSCs活性检测；C为单独培养的nSCs活性检测
图1mtt法对神经干细胞活性的检测
2.4激活态雪旺细胞营养因子的表达水平
a、B两组上室细胞提取的蛋白经电泳后，条带清晰，两组相同蛋白密度有差异，管家基因GapDH作为内参，电泳条带亮度一致。应用image-proplus专业图像分析系统测定平均光密度值，根据公式：相对量=产物电泳条带密度/GapDH×100%，计算各组蛋白量，可见a组细胞eGF、bFGF的表达水平均高于B组，差异有统计学意义（p<0.05）。见表1。
表1雪旺细胞营养因子表达的平均光密度值（x±s）
注：eGF：表皮生长因子，bFGF：碱性成纤维细胞生长因子
2.5神经干细胞分化的免疫荧光检测
对三组细胞分别进行map-2和GFap染色，计算每高倍视野阳性细胞的比例。a组细胞map-2染色阳性率明显高于B、C组，差异有统计学意义（p<0.05）；B组map-2染色阳性率明显高于C组，差异有统计学意义（p<0.05）。a组GFap阳性率明显低于B组，差异有统计学意义（p<0.05）；C组GFap阳性率明显低于a、B组，差异有统计学意义（p<0.05）。见表2。
表2免疫荧光染色阳性细胞在分化细胞中的比例（%，x±s）
注：与a组比较，*p<0.05；与C组比较，p<0.05
3讨论
各种外伤或病变所致的周围神经损伤一直以来都是显微外科研究的重点内容。虽然周围神经具有自我修复能力，但是如果缺损大于10mm以上则很难使近端神经纤维长入[6]，从而造成永久性的功能丧失。为此有学者研制出干细胞结合导管支架的技术[7-10]，使得周围神经的断端得以重连，然而单纯的形态学重建却难以恢复神经的传导速度。有研究指出nSCs在体内主要分化为胶质细胞，而胶质细胞则会影响神经元的传导速度[11-12]，因此nSCs如何高效分化出神经元就成为研究关键。
周围神经损伤后，损伤远端轴突发生华勒变性，继而坏死溶解，周围的SCs此时会发生增殖，一方面吞噬溶解的轴突，另一方面分泌大量神经营养因子促进近端轴突的长入[13-14]。本研究利用雪旺细胞这一特点，于体外建立SCs，使其持续分泌多种神经营养因子，诱导nSCs的分化。有研究指出，nSCs的生长分化需要多种营养因子的协同作用[15-16]，尽管某一因子的浓度较低，但却是不可或缺的。体外添加营养因子则难以满足干细胞分化的要求[17-18]。本研究运用细胞联合培养的方式，通过细胞间的旁分泌作用，克服这一不足。同时，应用transwell培养皿，借助聚碳酸酯膜的作用使细胞间不发生接触，排除了细胞间的相互干扰。
本研究的结果可以看出，与普通SCs相比，激活态SCs对nSCs的诱导作用存在时间短、神经元分化率高等优点。但是从mtt染色可以看出，由于各组只应用单纯Dmem/F12培养基培养，活细胞比例随时间呈下降趋势，说明单纯在体外依靠雪旺细胞分泌的营养因子难以满足nSCs的生长需求，从而解释了体内移植神经干细胞死亡率高的原因[19-20]。这就需要进一步探索能够保持体内高浓度营养因子的方法，从而维持nSCs的体内生长状态。
由于条件限制，本实验尚存在一些不足之处，对SCs分泌的因子只进行了较为重要的eGF和bFGF的检测，如果能检测出全部营养因子的表达水平，将有助于进一步的详细分析。
综述所述，激活态雪旺细胞能够促进神经干细胞向神经元的分化进程，提高神经元的分化比例。
[参考文献]
[1]ChengLn，DuanXH，ZhongXm，etal.transplantedneuralstemcellspromotenerveregenerationinacuteperipheralnervetractioninjury：assessmentusingmRi[J].aJRamJRoentgenol，2011，196（6）：1381-1387.
[2]ChangDJ，ohSH，Leen，etal.Contralaterallytransplantedhumanembryonicstemcell-derivedneuralprecursorcells（enStem-a）migrateandimprovebrainfunctionsinstroke-damagedrats[J].expmolmed，2013，45：53.
[3]akamaK，Horikoshit，nakayamat，etal.proteomicidentificationofdifferentiallyexpressedgenesduringdifferentiationofcynomolgusmonkey（macacafascicularis）embryonicstemcellstoastrocyteprogenitorcellsinvitro[J].BiochimBiophysacta，2013，1834（2）：601-610.
[4]StringariC，nourseJL，FlanaganLa，etal.phasorfluorescencelifetimemicroscopyoffreeandprotein-boundnaDHrevealsneuralstemcelldifferentiationpotential[J].pLoSone，2012，7（11）：48014.
[5]JhaRm，LiuX，ChrenekR，etal.thepostnatalhumanfilumterminaleisasourceofautologousmultipotentneurospherescapableofgeneratingmotorneurons[J].neurosurgery，2013，72（1）：118-129.
[6]李高山.骨髓基质干细胞与施万细胞联合移植对周围神经缺损的修复作用[J].中国医药导报，2013，10（21）：90-93.
[7]emborgme，LiuY，XiJ，etal.inducedpluripotentstemcell-derivedneuralcellssurviveandmatureinthenonhumanprimatebrain[J].CellRep，2013，3（3）：646-650.
[8]HeermannS，motlikK，HinzU，etal.Gliacellline-derivedneurotrophicfactormediatessurvivalofmurinesympatheticprecursors[J].JneurosciRes，2013，91（6）：780-785.
[9]HeBL，BaYC，wangXY，etal.BDnFexpressionwithfunctionalimprovementintransectedspinalcordtreatedwithneuralstemcellsinrats[J].neuropeptides，2013，47（1）：1-7.
[10]ishiim，ariasaC，LiuL，etal.astablecranialneuralcrestcelllinefrommouse[J].StemCellsDev，2012，21（17）：3069-3080.
[11]ortegaF，GasconS，masserdottiG，etal.oligodendrogliogenicandneurogenicsubependymalzoneneuralstemcellsconstitutedistinctlineagesandexhibitdifferentialresponsivenesstowntsignalling[J].natCellBiol，2013，15（6）：602-613.
[12]BonnerJF，HaasCJ，Fischeri.preparationofneuralstemcellsandprogenitors：neuronalproductionandgraftingapplications[J].methodsmolBiol，2013，1078：65-88.
[13]LamondR，BarnettSC.SchwanncellsbutnotolfactoryensheathingcellsinhibitCnSmyelinationviathesecretionofconnectivetissuegrowthfactor[J].Jneurosci，2013，33（47）：18686-18697.
[14]FaulknerSD，RuffCa，FehlingsmG.thepotentialforstemcellsincerebralpalsy-piecingtogetherthepuzzle[J].Seminpediatrneurol，2013，20（2）：146-153.
[15]nitzane，pfaltzgraffeR，Laboskypa，etal.neuralcrestandSchwanncellprogenitor-derivedmelanocytesaretwospatiallysegregatedpopulationssimilarlyregulatedbyFoxd3[J].procnatlacadSciUSa，2013，110（31）：12709-12714.
[16]RenYJ，ZhangS，miR，etal.enhanceddifferentiationofhumanneuralcreststemcellstowardstheSchwanncelllineagebyalignedelectrospunfibermatrix[J].actaBiomater，2013，9（8）：7727-7736.
[17]GuoX，SpradlingS，Stancescum，etal.Derivationofsensoryneuronsandneuralcreststemcellsfromhumanneuralprogenitorhnp1[J].Biomaterials，2013，34（18）：4418-4427.
[18]XiaL，wanH，HaoSY，etal.Co-transplantationofneuralstemcellsandSchwanncellswithinpoly（L-lactic-co-glycolicacid）scaffoldsfacilitatesaxonalregenerationinhemisectedratspinalcord[J].ChinmedJ（engl），2013，126（5）：909-917.
[19]armatipJ，matheyeK.anupdateonSchwanncellbiology-immunomodulation，neuralregulationandothersurprises[J].JneurolSci，2013，333（1-2）：68-72.
细胞研究篇8
【摘要】J61细胞系是我国建立的第一株人白血病细胞系，是eBV和HHV6双重感染的多克隆细胞系。J61细胞系建系30年来，从J61细胞克隆了许多细胞因子、受体及其他基因，提供了许多有关白血病细胞性质和功能的信息，从而衍生出多项研究课题，而所有这些显示出多克隆细胞系特有的研究价值。本文就30年来J61人白血病细胞系的研究作一评述，包括J61细胞系的异质性和多克隆性，J61细胞群体的生存机制和J61细胞系的异常细胞间通讯及其意义，以及J61细胞系的启示。
【关键词】白血病细胞系
ResearchValueofmulticloneCellLine：aCommentforthe30thanniversaryofJ61HumanLeukemicCellLine——editorial
abstract
J61celllineisthefirstleukemiccelllineestablishedinChina.itisamulticlonecelllineinfectedwithbotheBVandHHV6.manycytokines，receptorsandothergeneswereclonedfromJ61celllinesinceitsestablishment30yearsago.Valuableinformationonleukemiccharacteristicsandfunctionswereobtainedfromthestudiesonthiscellline，whichcouldbecategorizedintoseveralresearchsubjects.theseachievementsimpliedtheuniqueresearchvalueofmulticlonecelllines.thiscommentfocusesattentiononresearchadvanceoftheJ61leukemiccelllinein30years，includingheterogeneityandmulticloningofJ61cells，survivalmechanismofJ61cellpopulations，abnormalintercellalarcommunicationofJ61cellswithitssignificanceandinspirationfromJ61cellline.
Keywords
leukemiccellline;multiclonecellline;herpesvirusinfection;leukemiccellscharacterization
通常都认为细胞系是单克隆的，或者经过单克隆化的，是分析性实验研究和生物工程生产的常用工具。但是，有些细胞系实际上是多克隆的，例如由人类疱疹病毒4型epsteinBarr病毒（eBV）转化正常B淋巴细胞形成的淋巴母细胞样细胞系（lymphoblastoidcellline，LCL）是公认的多克隆细胞系，即由eBV同时转化多个正常的B淋巴细胞而成。LCL作为容易建系和培养的人类细胞模型在20世纪70-80年代的生物学和医学研究中发挥过很大作用，现在已经成为保留人类个体基因组的常规工具。但是作为严格的分析性研究，多克隆细胞系不是适宜的实验模型，近十多年来分子和细胞生物学研究已很少采用多克隆细胞系。J61是我们实验室在1976年建立的我国第一株人类白血病细胞系［1］，为eBV和人类疱疹病毒6型(HHV6)双重感染的多克隆细胞系［2］，30年来J61细胞系提供了大量有关白血病细胞性质和功能的信息，在长期研究中我们体会到多克隆细胞系有其独特的性质，应该继续发挥其研究价值。
J61细胞系的异质性和多克隆性
从J61细胞系建系开始的细胞群体就表现出明显的异质性。培养初期以异型粒系和单核系细胞为主，随着传代次数的增加异型粒系细胞迅速减少，逐渐形成以淋巴样和单核样细胞为主的两大类细胞亚群，并伴有大量双核镜影细胞（ReedSternberg，RS细胞）。培养前患者的骨髓标本，电子显微镜对其观察发现有疱疹病毒样颗粒，结合患者发病时有颈部包块，推测由Hodgkin淋巴瘤发展成急性白血病。从建系后的性质看J61细胞系应该分类为Hodgkin淋巴瘤细胞系［3］，按国际上通用的分类，属人类白血病细胞系。与J61细胞系性质相似的细胞系有德国学者于1986年建立的Crocoii，也是eBV和HHV6双感染的人白血病细胞系，由于Crocoii感染的是eBV1型，所以细胞增殖比感染eBV2型的J61旺盛［2］。
多克隆细胞系的研究价值J61细胞群体的异质性表现在多方面：形态学观察大体上可分为淋巴样细胞、单核样细胞、RS细胞和多核细胞；表面抗原分析显示，几乎所有的J61细胞都有HHV6早期膜抗原的高表达，同时有CD45和CD54以及HLaDR的表达；按照表面抗原标记可以大体上分为两个亚群：高表达CD19+和CD20+的B淋巴样细胞亚群和CD15+的单核样细胞。值得注意的是J61细胞群体中可测出少数其他系列表面抗原的表达，如Glya和CD34。有时甚至能分选出少量CD34+细胞。J61细胞群体的异质性反映出它的多克隆性，与LCL的异质性类似，但是比LCL更复杂，酷似Hodgkin淋巴瘤的状况。
J61细胞群体的多克隆性表型除了表面抗原呈现不同亚群外，用极限稀释法进行单个细胞培养从未成功；用96孔培养盘能够成功增殖繁衍J61细胞群体的最低细胞数是500细胞/孔，提示J61细胞群体中各不同细胞间的相互依赖性。
J61细胞群体的生存机制
J61细胞的生长繁殖除了要求较高的细胞浓度外，最明显的是接触依赖，即成丛生长。对成丛生长的深入研究发现，J61细胞表面高表达膜结合型mCSF及其受体，由此提出了肿瘤和白血病细胞增殖的接触性刺激假设［4，5］，即J61细胞通过膜结合型mCSF及其受体相互刺激，表达多种与细胞增殖相关的细胞因子和癌基因，对这种双向信息转导的机制我们实验室正在研究中。
研究表明，J61细胞的膜结合型mCSF高表达与HHV6感染相关，在白血病患者骨髓单个核细胞中加入HHV6能明显增加HHV6早期膜抗原的表达，不久证明HHV6早期膜抗原就是膜结合型mCSF［6］。后来还从J61细胞克隆出eB病毒功能性巨噬细胞集落刺激因子受体基因BaRF1［7］，提示J61细胞由膜结合型mCSF及其受体介导的接触性调节机制与eBV和HHV6两类疱疹病毒的双重感染有关，并导致了多种细胞因子和癌基因的表达和丰富多彩的表型。
J61细胞系的异常细胞间通讯及其意义
细胞间通讯是细胞生存及功能所必需的，白血病细胞间以及与正常细胞间异常的细胞间通讯在白血病的发生、发展中起十分重要的作用。J61这类多克隆细胞系中存在着复杂的细胞间通讯，与单克隆细胞系比较，更接近白血病细胞在体内的状态，是进行此类研究的良好模型。从J61这个模型入手发现了许多异常的细胞间通讯，为深入研究白血病细胞的异常细胞间通讯提供了有益的线索，深入的研究发现，其中一些异常的细胞间通讯在白血病、肿瘤等恶性疾病中广泛存在的，在白血病、肿瘤的发生、发展中起一定的作用。
J61细胞系表达众多的细胞因子及其受体［8］，有的形成自激机制，如mCSF及其受体；有的是旁分泌，如tnFα和tGFβ。经过对临床病人标本的检测，这些细胞因子和癌基因在白血病患者中都有不同程度的高表达，在白血病发生发展中起重要作用。
我们实验室从J61细胞克隆出mCSF及其受体的cDna［9］；用J61细胞膜分离mCSF及其受体的蛋白，制备出单克隆抗体［10，11］，用这些单克隆抗体为探针检测病人标本发现，异型mCSF及其受体不仅在多种白血病，尤其是髓系白血病和Hodgkin淋巴瘤有高表达［1214］，而且在肝癌和乳腺癌细胞也有高表达，并有预后意义［15］。深入研究表明，异型mCSF及其受体不仅出现在肿瘤细胞表面，而且细胞内尤其是细胞核内的异型mCSF及其受体与肿瘤的恶性程度相关；细胞内的小分子mCSF可以起着细胞内自激因子作用，直接调节基因表达［16-18］。膜结合型mCSF通过调节基质金属蛋白酶的表达影响肿瘤细胞的迁移和浸润能力［19］。从对mCSF及其受体的系统研究，我们体会到生物大分子在分子水平的多样性，是生物多样性的基础，也是疾病和病理变化的基础［20］。针对异型mCSF及其受体的肿瘤相关性，我们实验室研制了以mCSF及其受体为靶标的治疗性Dna疫苗，在实验动物有明显的治疗效果［21，22］。
除了上述刺激细胞增殖的因子外，J61细胞也有多种负调节因子的高表达，如tnFα、tGFβ和LiF等，成为研究负调节因子作用机制的体外模型［8，23-25］；此外，从J61细胞中还分离出对白血病细胞有抑制作用的小分子Rna［26］。
我们实验室从J61细胞系克隆出了新型白细胞介素18（iL18）及其受体［27］，成为研究iL18在白血病细胞中作用机制的适宜模型［28，29］。后来用iL18肿瘤疫苗治疗小鼠L1210白血病取得了十分明显的治疗效果，并有一定的复发预防效应［30］。
多肽抗生素LL37/hCap18是天然免疫的重要成员，除对微生物有杀伤活性外，还有白细胞趋化活性。我们首先从J61细胞入手，克隆出了LL37/hCap18，但发现其蛋白生物活性不高，提示有表达缺陷［31］；然后测定了血液病患者外周血白细胞的LL37/hCap18表达，证实其在白血病患者中的低表达与感染相关，且可能是白血病患者易于感染的机制之一［32］。进一步用LL37/hCap18与maFJ61融合基因制备的肿瘤疫苗可以明显提高抗肿瘤效应，提示LL37/hCap18不仅有天然抗生素作用，而且还是重要的免疫分子佐剂，有免疫增强作用［33］。
核苷酸类物质是新近阐明的细胞间通讯载体，可通过p2X家族嘌呤受体向胞内传递信号，包括J61细胞在内的多数白血病细胞系至少表达一种p2X家族受体，提示核苷酸类物质介导的细胞间通讯广泛存在于白血病细胞中［34］。深入研究p2X7受体发现，其高表达与白血病的治疗相关，J61、LCL等白血病细胞中p2X7受体的功能异常［35］；进一步研究其机制发现，多种机制造成其功能异常，CD39相关的高atp酶活性是LCL细胞p2X7受体功能异常的原因［36］。目前我们已从J61细胞中克隆了p2X7受体［37］，p2X7受体及其功能异常在白血病发病学中的作用和机制正在研究中。
J61细胞系的启示
虽然J61是多克隆细胞系，但是与LCL类似，在若干代数内能保持基本性状恒定，是应用多克隆细胞系进行体外实验研究的基础。
与实体瘤细胞不同，白血病细胞在体内处于高度异质性细胞的微环境中。骨髓微环境是异质性的；外周血中有大量的红细胞、各种白细胞和少数基质细胞，这些细胞对白血病细胞有各种影响。体外培养细胞的原理是模拟体内微环境，要全面模拟白血病患者的微环境是不容易的，现代细胞培养技术只能符合少数白血病细胞的生长条件，所以白血病细胞的建系率低。分析已建立的常用白血病细胞系都是肿瘤性很强的。众所周知，肿瘤性越强自发性突变频率越高，正常细胞突变频率约10-6，通常肿瘤细胞突变频率约10-3至10-4，恶性度高的肿瘤细胞系如HeLa可高达10-2。高突变频率的细胞系在快速传代过程中，在常规培养方法微环境选择压的作用下容易产生亚克隆，如由于培养方法的差异（培养液、血清不同、培养温度和培养器皿不同等）不同实验室传代保存的K562，HL60等人白血病细胞系可以有较大的差别，形成亚系。如有非t非B的K562，也有具有红系特征的K562或粒系特征的K562等。异质性细胞系群体的不定向变异即遗传漂变，有人利用细胞系的遗传漂变筛选某种特定性状的克隆，如耐药细胞株（按照细胞培养的术语，能保持某种性状不变的细胞系称为细胞"株"。如人二倍体细胞株是指保持二倍体性状不变的；耐药细胞株是指保持对某药耐药的）。总之，肿瘤细胞的遗传不稳定性使肿瘤细胞系的单克隆性倍受质疑，随着传代次数的增多实际上成了多克隆细胞系。研究者根据实验要求必要时应该进行亚克隆。
结束语
回顾30年来对J61细胞系的研究，观察到了在eBV和HHV6双重病毒感染下，J61表现出若干人白血病细胞克隆的演变和生物学性质和行为，提供了许多有关白血病细胞的信息。J61细胞系可能更接近于双表型白血病和Hodgkin淋巴瘤的体内状况。
国际通用的人白血病细胞系都来源于分化程度较低、恶性度高的白血病，表达的细胞因子、癌基因较少；J61细胞系在两种疱疹病毒感染下表达更多的细胞因子、癌基因，更接近于前炎症状态［38，39］，这些是多克隆细胞系的优势，适用于相关课题，如病毒病因、发病机制、免疫状态、细胞因子等的体外研究；机体作为高度复杂的细胞社会由不同的细胞群体按照一定的规则组成和运行［40］，多克隆细胞系也可作为研究不同细胞间相互关系的体外模型。
【参考文献】
1吴克复，张一泉，刘宗德等.粒、单型人白血病细胞系的建立及其细胞生物学性质研究.遗传学报，1980；7：136-143
2wuKF，LukaJ，JoshiSS，etal.CharacterizationofaHumanHerpesVirus6(HHV6)andepsteinBarrVirus(eBV)associatedLeukemicCellLine，J61.ChineseJCancerRes，1994；6：157-168
3吴克复，宋玉华.J61细胞系属白血病还是霍奇金病细胞系？：细胞系“生物多样性”初探.中国实验血液学杂志，1997；5：33-36
4wuKF，RaoQ，ZhengGG，etal.enhancementofJ61humanleukemiccellproliferationbycellcellcontact:roleofanmCSFlikemembraneassociatedgrowthfactor.LeukRes，1994；18：843-849
5wuKF，RaoQ，ZhengGG，etal.enhancementofJ61humanleukemiccellproliferationbymembraneboundmCSFthroughacellcellcontactmechanismii.RoleofanmCSFreceptorlikemembraneprotein.LeukRes，1998；22：55-60
6杨文清，吴克复，宋玉华等.人疱疹病毒6型对血液病患者巨噬细胞集落刺激因子表达的影响.中华血液学杂志，1998；19：646-648
7马小彤，宋玉华，吴克复等.由J61细胞克隆eB病毒功能性巨噬细胞集落刺激因子受体基因BaRF1.白血病·淋巴瘤，2001；10：261-264
8吴克复，宋玉华，郑国光等.人白血病细胞系J61基因表达的调控.中华血液学杂志，1993；14：76-79
9LiG，SongYH，wuKF，etal.CloneandexpressionofmutantmCSFanditsreceptorfromhumanleukemiccelllineJ61.LeukRes，2002；26：377-382
10饶青，李长虹，吴克复.人白血病细胞系(J61)相膜相关调节因子（maFJ61）的分离与性质.中国实验血液学杂志，1994；2：257-260
11耿以琪，饶青，孔建等.白血病细胞膜相关因子（maFJ61）单克隆抗体的制备和性质.中华血液学杂志，1994；15：620-622
12wuKF，ZhengGG，RaoQ，etal.Cellularmacrophagecolonystimulatingfactoranditsrole.Haematologica，1999；84：951-952
13ZhengGG，RaoQ，wuKF，etal.membraneboundmacrophagecolonystimulatingfactoranditsreceptorplayadhesionmoleculelikerolesinleukemiccells.LeukRes，2000；24：375-383
14ZhengGG，wuKF，GengYQ，etal.expressionofmembraneassociatedmacrophagecolonystimulatingfactor(mCSF)inHodgkin'sdiseaseandotherhematologicmalignancies.LeukLymphoma，1999；32：339-344
15SongYH，LinYm，wuKF，etal.immunochemicalobservationofmacrophagecolonystimulatingfactoranditsreceptorinbreastcancerandhepatomatissues.ChineseJCancerRes，2001；13：1-4
16tangSS，ZhengGG，wuKF，etal.autocrineandpossibleintracrineregulationofHL60cellproliferationbymacrophagecolonystimulationfactor.LeukRes，2001；25：1107-1114
17CaoZY，wuKF，SongYH，etal.mCSFtargetingintoLCLnucleusbehaviesasamalignancypromotor.ChineseJCancerRes，2003；15：262-268
18CaoZY，ZhangB，RaoQ，etal.effectsofnuclearpresentingmacrophagecolonystimulatingfactorontheprocessofmalignancy.intJHematol，2003；78：87-89
19RaoQ，ZhengGG，LiG，etal.membraneboundmacrophagecolonystimulatingfactormediatedautoJuxtacrinedownregulatesmatrixmetalloproteinase9releaseonJ61leukemiccells.expBiolmed（maywood），2004；229：946-953
20wuKF.onbiopersity，complexityofmCSFanditsreceptor.ChineseSciBulletin，2000；45：1918-1920
21wangY，ZhengGG，wuKF，etal.ConstructionofmacrophagecolonystimulatingfactorreceptorDnavaccine.Haematologica，2001；86：1219-1220
22wangmH，ZhangGG，wuKF，etal.CoimmunizationwithmCSFandmmCSFDnavaccinesisbetterthanmCSFRmmCSFfusionDnavaccine.Haematologica，2002；87：1087-1094
23wuKF，ZhuYm，RaoQ，etal.expressionoftransforminggrowthfactorbeta，tumornecrosisfactoralphaandleukemiainhibitoryfactormRnasinrodentandhumanhematopoieticcells.annnYacadSci，1991；628：151-152
24张晓红，吴克复，郑国光等.tGFβ作为自身负调节因子对J61细胞基因表达的影响.中国实验血液学杂志，1996；4：56-60
25郑国光，吴克复，宋玉华.重组人转化生长因子β1对人白血病细胞系(J61，J62，namalva)增殖的调节.中华血液学杂志，1994；15：292-294
26李牧，吴克复.白血病细胞增殖活性小分子Rna的探讨.中华血液学杂志，1993；14：636-638
27wangY，LiG，ZhangGG，etal.DetectionandsequencinganalysisofiL18expressioninJ61leukemiccells.LeukRes，2001；25：273-274
28ZhangB，wangY，ZhangGG，etal.ClinicalsignificanceofiL18geneoverexpressioninamL.LeukRes，2002；26：887-892
29ZhangB，maXt，ZhengGG，etal.expressionofiL18anditsreceptorinhumanleukemiacells.LeukRes，2003；27：813-822
30ZhangB，wuKF，LinYm，etal.GenetransferofproiL18andiL1betaconvertingenzymecDnainducespotentantitumoreffectsinL1210cells.Leukemia，2004；18：817-825
31YangYH，ZhengGG，LiG，etal.expressionofLL37/hCap18geneinhumanleukemiacells.LeukRes，2003；27：947-950
32anLL，maXt，YangYH，etal.markedreductionofLL37/hCap18，anantimicrobialpeptide，inpatientswithacutemyeloidleukemia.intJHematology，2005；81：45-47
33anLL，YangYH，maXt，etal.LL37enhancesadaptiveantitumorimmuneresponseinamurinemodelwhengeneticallyfusedwithmCSFR（J61）Dnavaccine.LeukRes，2005；29：535-543
34王琳，郑国光，林永敏等．p2X受体在白血病细胞系中的表达．中华血液学杂志，2006；27：4547
35ZhangXJ，ZhengGG，maXt，etal.expressionofp2X7inhumanhematopoieticcelllinesandleukemiapatients.LeukRes，2004；28：1313-1322
36nieK，ZhengGG，ZhangXJ，etal.CD39associatedhighatpaseactivitycontributestothelossofp2X7mediatedcalciumresponseinLCLcells.LeukRes，2005；29：1325-1333
37聂坤，郑国光，林永敏等.J61白血病细胞p2X7受体基因的克隆和功能分析.中华血液学杂志，2006；27：404-407
38吴克复，马小彤.白血病的前炎症状态观.科学通报，2003；48：2295-2298
39吴克复，马小彤，宋玉华.期望肿瘤细胞凋亡还是坏死？中国实验血液学杂志，2005；13：921-923
细胞研究篇9
集落实验和RtpCR实验结果显示：在实验所采用的颗粒浓度范围内，Fe3o4纳米颗粒对HeLa细胞基本没有细胞毒性.对于核苷酸修复通路有缺陷的XpF细胞，Fe3o4纳米颗粒可以抑制该细胞的生长和分裂，表现出一定的细胞毒性.Fe3o4纳米颗粒可以使XpF细胞内CHeK1，Rpa1，Rpa2，Rpa3基因转录比较明显地增加.CHeK1基因转录的增加可以使XpF细胞的细胞周期停止，从而抑制其分裂和生长.而Rpa1，Rpa2，Rpa3基因转录增加暗示了Fe3o4纳米颗粒对XpF细胞产生某种损害.但究竟是何种损害需要进一步研究.本文的研究结果表明：Fe3o4纳米颗粒在肿瘤诊断、治疗上的应用必须谨慎，对有先天核苷酸剪切修复通路突变的肿瘤患者，就不能使用Fe3o4纳米颗粒，否则会对患者造成额外的损害.
参考文献
[1]陈舒怿，古宏晨，吴强，等.超顺磁性铁纳米颗粒标记对视网膜前体细胞体外培养的影响J].国际眼科杂志，2008，8（5）：913-915.
CHenShuyi，GUHongchen.wUQiangwu，etal.effectsofsuperparamagneticironoxidenanoparticleslabelingonabilitytosurviveofretinalstemcellsinvitroJ].intJophthalmol，2008，8（5）：913-915.（inChinese）
2]VoGeLStinB，LaneD，LeVineaJ.Surfingthep53networkJ].nature，2000，408（6810）：307-310.
3]momanDJ，wUHH，DaSGUptaG.mDm2masterregulatorofthep53tumorsuppressorproteinJ].Gene，2000，242（1-2）：15-29.
4]aBBaSt，DUttaa.p21incancer：intricatenetworksandmultipleactivitiesJ].natureReviewsCancer，2009，9（6）：400-414.
5]FoRtina.apaF1isakeytranscriptionaltargetforp53intheregulationofneuronalcelldeathJ].theJournalofCellBiology，2001，155（2）：207-216.
6]moRonimC，HiCKmaneS，DenCHieL，etal.apaf1isatranscriptionaltargetfore2Fandp53J].natureCellBiology，2001，3（6）：552-558.
7]YoSHiDaK，miKiY.RoleofBRCa1andBRCa2asregulatorsofDnarepair，transcription，andcellcycleinresponsetoDnadamageJ].CancerScience，2004，95（11）：866-871.
8]LaZZaRoF，GiannattaSiom，pUDDUF，etal.CheckpointmechanismsattheintersectionbetweenDnadamageandrepairJ].DnaRepair，2009，8（9）：1055-1067.
9]BaRteKJ，LUKaSJ.Chk1andChk2kinasesincheckpointcontrolandcancerJ].CancerCell，2003，3（5）：421-429.
细胞研究篇10
诱导性多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，ipS）是通过基因转染技术(genetransfection)将某些转录因子导入动物或人的体细胞，使体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonicstemcell，eS）细胞样的多潜能细胞。ipS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与eS细胞非常相似，而且在Dna甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与eS细胞几乎完全相同。ipS细胞的研究受到人们广泛的关注，是目前细胞生物学和分子生物学领域的研究热点。ipS细胞技术诞生还不到2年，却为干细胞的基础研究和临床疾病治疗研究带来了前所未有的希望，ipS细胞技术的出现使人们从eS细胞和治疗性克隆等激烈的伦理学争论中解脱出来。但是，目前制备ipS细胞的方法在安全性方面还存在一定问题，因此探索一种高效、安全的ipS细胞的制备方法显得十分必要。
1ipS细胞的制备方法
2006年takahashi等［1］研究小组利用分别携带oct4、Sox2、myc和Klf4转录因子的4种逆转录病毒载体感染小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblasts，meFs)，经过G418药物筛选成功获得第1批ipS细胞。但是这批ipS细胞系中Dna甲基化的方式与自然存在的eS细胞不同，而且这批ipS细胞不能形成畸胎瘤。okita等［2］研究小组报道了第2批ipS细胞的产生。他们采用与制备首批ipS细胞相同的方法，但是采用了不同的筛选基因。第2批ipS细胞系Dna甲基化的方式与自然存在的eS细胞的甲基化方式相同，并且能形成畸胎瘤。2007年末，takahashi和Yu等［3，4］两研究小组分别在细胞和科学杂志上报道关于ipS研究里程碑的实验结果， 他们都成功获得了人的ipS细胞系。Yamanaka采用与诱导小鼠ipS相同的方法，成功将人成纤维细胞诱导成多干细胞。thomson研究小组采用与Yamanaka不同的方法，他们利用慢病毒载体运输oct4、Sox2、nanog和Lin28转录因子转染imR90胚胎成纤维细胞，并且成功地获得了人ipS细胞。2008年1月nakagawa等［5］研究小组报道他们可以利用oct4、Sox2和Klf43种转录因子将小鼠和人的成纤维细胞成功诱导出ipS细胞。aoi等［6］研究小组将小鼠肝细胞和胃上皮细胞成功诱导为ipS。Stadtfeld等［7］实验小组利用oct4、Sox2、cmyc和Klf44种转录因子将胰岛细胞诱导为ipS细胞。
Hanna等［8］研究小组在细胞杂志上报道了他们将小鼠终末分化的B淋巴细胞诱导成ipS细胞的实验结果。他们采用类似于利用成纤维细胞制备ipS细胞的方法，使用4种转录因子（oct4、Sox2、cmyc和Klf4）及CCatt/增强子结合蛋白（C/eBpα），成功地将成熟B淋巴细胞诱导为ipS细胞。
eminli等［9］研究小组利用逆转录病毒载体携带oct4、Klf4和cmyc3个转录因子将神经祖细胞诱导为ipS细胞，之后Kim等［10］研究小组报道利用慢病毒载体携带oct4和cmyc或oct4与Klf4两种转录因子就可以将成人的神经干细胞诱导为ipS细胞。他们检测到在成人神经干细胞中oct4和cmyc的表达量高于胚胎干细胞中oct4和cmyc的表达量，因此考虑利用逆转录病毒载体只携带两种转录因子诱导成人神经干细胞为ipS细胞并获得成功。由此他们推测当被诱导的体细胞中高表达某个或某几个转录因子时，可以减少其他转录因子的使用。
当一系列人正常体细胞被诱导成ipS细胞之后，科学研究者开始研究患者的细胞是否也能诱导成ipS细胞。Dimos等［11］研究小组报道他们将肌萎缩侧索硬化症（amyotrophiclateralsclerosis，aLS）患者的细胞成功诱导成为ipS细胞。随后park等［12］报道他们将腺苷脱氨酶缺陷相关严重的联合免疫缺陷、三型葡萄糖脑苷脂沉积症、帕金森综合征、舞蹈症、青少年i型糖尿病等患者的细胞诱导为ipS细胞。
体细胞可以诱导为ipS细胞，但是获得ipS细胞的几率很低。于是科学研究者们研究能否找到提高ipS细胞产生效率的方法。mali等［13］报道他们将SV40大t抗原和oct4、Sox2、cmyc和Klf4同时诱导成纤维细胞能显著提高ipS细胞产生的效率，而且ipS细胞提前1～2周产生。Huangfu等［14］报道Dna甲基化转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂能显著提高ipS细胞产生的效率。aasen等［15］研究小组报道采用逆转录病毒运输oct4、Sox、Klf4和cmyc诱导人角化细胞产生ipS细胞的效率比诱导人成纤维细胞产生ipS细胞的效率至少提高100倍，而且大大缩短了产生ipS细胞的时间。
maherali等［16］研究小组报道了制备ipS细胞新的研究平台，并指出可从分子、遗传和生化机制上改造细胞程序重排技术。他们开发了一种新的ipS细胞诱导技术，采用doxycycline诱导转录因子的表达，从而可以通过药物来控制ipS细胞的产生，其制备的ipS细胞从结构和功能上都与人类胚胎干细胞很相似。人们研究发现，不同的皮肤细胞类型用于诱导产生ipS细胞的时间也不同［16］。Huangfu等［17］研究小组报道仅利用反转录病毒表达oct4和Sox2两种转录因子，同时借助抑制组蛋白去乙酰基酶活性的小分子化合物丙戊酸（Valproicacid，Vpa）的作用就能将人的成纤维细胞系BJ和nHDF逆转成ipS细胞。
最近，Stadtfeld等［18］报道他们利用腺病毒载体运输oct4、Sox2、Klf4和cmyc4种转录因子成功获得无病毒整合的ipS(adenoipS)细胞。okita等［19］研究小组采用2种质粒分别携带oct4、Sox2和Klf43种转录因子和cmyc转录因子共转染人或小鼠的体细胞并使之诱导成为ipS细胞，经过检测并无质粒整合进入ipS细胞基因组中，即获得了在基因组水平无转录因子整合的ipS细胞。Frank等采用带有loxpCre系统的病毒载体诱导ipS，此系统可将整合到ipS基因组中的4种外源转录因子及病毒基因成分完全剔除，因而所获得了完全没有病毒基因组的来源于parkinson患者成纤维细胞的ipS;而Knut等人使用含有转座子系统的病毒载体也成功获得了完全没有病毒基因组的来源于人胚胎成纤维细胞的ipS。这些无病毒基因组成分的ipS诱导成功为其临床实际应用奠定了基础。ipS细胞产生的方法归纳见表1。表1诱导ipS产生的方法
小鼠胚胎成纤维细胞［13］oct4，Sox2，Klf4小鼠及人成纤维细胞［5］oct4，Klf4，cmyc神经祖细胞［9］oct4，Klf4成人神经干细胞［10］oct4，cmyc成人神经干细胞［10］oct4，Sox2，cmyc，Klf4，nanog人角质细胞［16］oct4，Sox2人成纤维细胞系BJandnHDF［17］
2ipS细胞的应用
ipS细胞技术是一把了解细胞核基因组重序(reprogramming)的钥匙，因为ipS细胞在功能上与胚胎干细胞几乎完全相同。因此，ipS细胞的诱导产生过程将是我们了解基因组重序分子机制和个体特异的疾病发生机制的最理想的模型。Hanna等［20］近期已经进行了ipS细胞应用基础研究的首次尝试，利用人类镰状细胞性贫血的小鼠动物模型，取其尾尖部皮肤的成纤维细胞，通过导入oct4、Sox2、Klf4和cmyc基因，获得自体ipS细胞;进一步采用基因特异性打靶技术对人类镰状血红蛋白等位基因进行纠正后，将体外培养的自体ipS细胞诱导为造血干细胞，移植后可治疗动物模型的镰状细胞性贫血。Dimos等［11］报道将aLS患者的体细胞诱导获得的ipS细胞成功定向分化为运动神经元，而aLS疾病的特征就是患者的运动神经元受到破坏。与此同时，martin研究小组发表将oct4、Sox2、Klf4和cmyc诱导得到的ipS细胞定向分化为有功能的心肌细胞的研究结果。
3ipS的安全性
ipS细胞技术的问世为生命科学的研究和人类疾病的治疗带来巨大的希望，随着研究的深入进行，多种终末分化细胞甚至是患者的细胞都能被诱导成ipS细胞，还有ipS细胞初步应用小鼠疾病模型治疗的成功，这一切似乎预示着ipS细胞距人类疾病的临床治疗不远了。但是，ipS在投入临床疾病治疗之前，必须考虑ipS细胞安全性的问题。目前制备ipS细胞的方法主要是利用逆转录病毒运输系统将几种转录因子导入体细胞，逆转录病毒在染色体上随机插入整合到体细胞基因组内并启动转录因子的表达。逆转录病毒的随机插入存在着潜在的风险，有的转录因子如cmyc和Klf4，它们本身就是一种原癌基因，导入cmyc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20%［2］。由于cmyc基因具有危险性，研究者投入无cmyc基因的ipS研究，但是经过研究发现这些无cmyc基因的ipS细胞依然具有致瘤性。
4展望
ipS细胞技术诞生还不到2年，但却受到极大的关注和广泛的研究，现已成为生命科学研究领域研究和探讨的焦点，为基础研究和临床疾病治疗带来前所未有的希望。人类ipS细胞的建立被公认为2007年最重要的科技进展之一，这项技术不仅可以从体细胞建立个体特异的多能干细胞系，解决了细胞移植治疗中的免疫排斥问题，而且为研究人类细胞的重编程的机理以及研究个体特异的疾病发生机理提供了有力的方法。在干细胞研究领域，ipS细胞技术的出现无疑是具有里程碑意义的突破，多种体细胞经过体外培养和诱导均可转变成为具有多向分化潜能的干细胞，并且证明了几种已知的转录因子可以使已分化的体细胞逆转为未分化的状态，表明细胞的巨大可塑性。但是，ipS细胞在应用于临床之前，还面临许多问题: ①逆转录病毒和慢病毒载体导致肿瘤发生的潜在风险需要加以有效防范;②需要深入研究比较ipS细胞和heS细胞在细胞生物学特性、定向分化机制等方面是否具有显著的差异;③需建立一种新的方法以避免基因转染或基因转导带来的潜在风险，如通过某些化学药物或因子激活体细胞中固有的上述转录因子的方式以替换外源性基因转染的方式，或者用某些因子的短暂性表达代替永久性导入;④提高制备ipS细胞的效率。需指出的是，ipS细胞研究的突破并不意味着eS细胞研究的衰亡，因为ipS细胞所使用的转录因子正是来源于eS细胞长期研究的积累。
参考文献
［1］takahashiK，YamanakaS.inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors［J］.Cell，2006，126(4): 663-676.
［2］okitaK，ichisakat，YamanakaS.Generationofgermlinecompetentinducedpluripotentstemcells［J］.nature，2007，448(7151): 313-317.
［3］takahashiK，tanabeK，ohnukim，etal.inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors［J］.Cell，2007，131(5): 861-872.
［4］YuJ，Vodyanikma，SmugaottoK，etal.inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells［J］.Science，2007，318(5858): 1917-1920.
［5］nakagawam，Koyanagim，tanabeK，etal.Generationofinducedpluripotentstemcellswithoutmycfrommouseandhumanfibroblasts［J］.natBiotechnol，2008，26(1): 101-106.
［6］aoit，YaeK，nakagawam，etal.Generationofpluripotentstemcellsfromadultmouseliverandstomachcells［J］.Science，2008，321(5889): 699-702.
［7］Stadtfeldm，BrennandK，HochedlingerK.Reprogrammingofpancreaticbetacellsintoinducedpluripotentstemcells［J］.CurrBiol，2008，18(12): 890-894.
［8］HannaJ，markoulakiS，Schorderetp，etal.DirectreprogrammingofterminallydifferentiatedmatureBlymphocytestopluripotency［J］.Cell，2008，133(2): 250-264.
［9］eminliS，UtikalJS，arnoldK，etal.ReprogrammingofneuralprogenitorcellsintoipScellsintheabsenceofexogenousSox2expression［J］.StemCells，2008，26(10): 2467-2474.
［10］KimJB，ZaehresH，wuG，etal.pluripotentstemcellsinducedfromadultneuralstemcellsbyreprogrammingwithtwofactors［J］.nature，2008，454(7204): 646-650.
［11］DimosJt，RodolfaKt，niakanKK，etal.inducedpluripotentstemcellsgeneratedfrompatientswithaLScanbedifferentiatedintomotorneurons［J］.Science，2008，321(5893): 1218-1221.
［12］parkiH，aroran，HuoH，etal.Diseasespecificinducedpluripotentstemcells［J］.Cell，2008，134(5): 877-886.
［13］malip，YeZ，HommondHH，etal.improvedefficiencyandpaceofgeneratinginducedpluripotentstemcellsfromhumanadultandfetalfibroblasts［J］.StemCells，2008，26(8): 1998-2005.
［14］HuangfuD，maehrR，Guow，etal.inductionofpluripotentstemcellsbydefinedfactorsisgreatlyimprovedbysmallmoleculecompounds［J］.natBiotechnol，2008，26(7): 795-797.
［15］aasent，Rayaa，BarreromJ，etal.efficientandrapidgenerationofinducedpluripotentstemcellsfromhumankeratinocytes［J］.natBiotechnol，2008，26(11): 1276-1284.
［16］maheralin，ahfeldtt，Rigamontia，etal.ahighefficiencysystemforthegenerationandstudyofhumaninducedpluripotentstemcells［J］.CellStemCell，2008，3(3): 340-345.
［17］HuangfuD，osafuneK，maehrR，etal.inductionofpluripotentstemcellsfromprimaryhumanfibroblastswithonlyoct4andSox2［J］.natBiotechnol，2008，26(11): 1269-1275.