生物多样性的研究方法篇1
关键词：发酵食品；微生物多样性；分子生物科学技术
食品若要发酵就必须要有一个特定的微生物环境，发酵过程中微生物的种类会对发酵食品的口感产生非常大的影响，而加强对发酵食品中微生物多样性的研究可以十分有效的为相关的研究提供更多的理论依据，在研究的过程中，最为基本的两个要素就是物种的丰度和物种的均匀程度。而微生物在生长的过程中也有其自身独到的特点。因为微生物自身的体积小，结构也并不是十分的复杂，所以我国在微生物多样性的研究方面还处于比较缓慢的状态，在很长一段时间里都采用非常陈旧的方法去研究微生物的多样性，而我国有关的技术在不断的发展，所以在微生物研究方面也有了一些新的迹象。
1微生物的培养分离方法
在微生物多样性研究的过程中，培养技术起到了非常关键的作用，直到现在，这种技术都广泛的使用在研究当中，微生物培养主要是按照目标的要求给微生物选择比较适宜的培养基，然后再按照不同的微生物特性来对其进行更加全面和准确的鉴别，但是这种方法在使用的范围上还是有着一定的限制，一般情况下它比较适合使用在小范围的微生物多样性鉴别中。
微生物培养法在实际的应用中需要首先通过人工的方式对培养基进行适当的处理，虽然不同的微生物在生长环境和自身的特性上都存在着较为明显的差异，所以研究的结果会和实验室当中不受任何外界因素影响条件下得出的结果存在着一定的差异，此外，自然界当中，很多种微生物都是没有办法通过人工培养的方式得到的，所以在研究的过程中也会造成生物多样性的流失，这样就使得实验室中所得出的结论不是非常的准确，存在着一定的片面性。
2化学方法
磷脂脂肪酸是生物细胞膜中一个非常重要的成分，而不同的微生物能够通过生活反应形成不同种类的磷脂脂肪酸，这样就可以对不同的微生物进行鉴别和检验，但是在这一过程中尤其需要注意的一点就是不同类型的磷脂脂肪酸或者是不同生物体上的磷脂脂肪酸有可能会出现完全相同的研究和实验结果，所以还需要采用其他的辅助方式对其进行进一步的检验。
3生理方法的鉴定系统
BioLoG微孔平板阀是国外的研究机构在1991年建立起来的一套专门研究土壤微生物多样性的一种方法，这种方法通常就是按照生物对单一碳源不同的反应而实现对不同种类的微生物进行区分的目的，该鉴定系统当中主要有95反应孔的微孔平板和鉴定的软件组成的，反应孔当中还设置了碳源底物和对应的指示剂，而当接种样品溶液的时候，其中的一些营养物质就会被吸收和利用，从而使得孔中的反应物呈现出不同的颜色和状态，因为不同的微生物对95糖的反应和接受程度具备一定的差异按照反应孔当中颜色的转变和吸光度的变化就形成了不同的形式，这样也就使得不同微生物逐渐被判断出来。经过该系统软件的处理和判断，和标准菌种的数据进行详细的对比之后，这种菌的种类也就被准确的判断了出来，这种方法实际上已经进入到了微生物食品微生物多样性的研究当中，但是这种方法在应用的过程中也存在着一定的局限，所以也无法很好的独立使用，其主要的不足有：由于真菌、放线菌的代谢反应不能分解氯化物.此方法只能检测微生物群落细菌中快速生长的那部分微生物信息主要为革兰氏阴性菌：另外由于培养环境的改变可能引起微生物对碳源底物实际利用能力的改变而造成一定的误差目前所具有的标准菌种的数据库还不完善。有些种类还不能被准确进行鉴定即使存在以上不足。但由于其不需经过培养分离繁琐的步骤.仍被用于微生物多样性的研究。
4分子生物学方法
分子生物学技术在微生物多样性研究上的应用主要可以归纳总结为2个方面：一方面是在pCR技术应用前提下所衍生出的一些研究方法.这些方法可以把少部分的Dna进行大量的增加.通过对基因排列顺序的对比和分析来对微生物的多样性进行研究另一方面是在应用分子杂交技术的前提下使用分子标记的方法。
4.1建立在pCR技术的方法
pCR是1985年由mULUS发明的一种聚合酶链式反应技术.主要特点是短时间内在实验室条件下人为控制并特异扩增目的基因或Dn段，以便于对已知Dn断进行分析。pCR技术的发明和不断完善.不仅为分子生物学的发展作出了巨大的贡献.而且在微生物生态学的发展和分析技术的建立提供了有利工具。
4.2基于分子杂交技术的分子标记法
分子杂交技术是基于核酸分子碱基互补配对的原理.用特异性探针与待测样品的Dna或etna形成杂交分子的过程用于微生物多样性研究常用的探针主要有Rna基因探针、抗性探针和编码代谢酶基因探针等。特别是近年来发展起来的荧光原位杂交技术是研究环境中不可培养微生物群落多样性最为常用和有效的手段荧光原位杂交技术是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的Dna序列，以荧光标记的特异寡聚核酸片段作为探针与环境基因组中Dna分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度。操作步骤是将微生物样品固定在载玻片上，用荧光染料标记的基因探针杂交，将未杂交的荧光探针洗去后用普通荧光显微镜进行观察和摄像采用这一技术可以同时对不同类群的细菌在细胞水平上进行原位的定性定量分析和空间位置标示。该方法的特点是可以进行样品的原位杂交，且特意性和灵敏度高，克服了pCR扩增的偏好性，对生态系统样品中的种群结构的测度准确性高发酵食品中微生物多样性研究方法在传统技术的基础上有了很大的发展.主要发展出了4种研究方法四种方法在不同的方面有不同的优缺点，只有根据不同的特点选择不同的研究方法，才能更好地保证研究的准确性，从而促进发酵食品中微生物多样性研究。
结束语
发酵食品越来越多的走入到人们的生活当中，发酵食品中的生物多样性是影响其口感的一个非常重要的因素，而在实际的研究工作中，有很多的研究方法，不同的研究方法尤其自身的优势和使用范围，所以一定要根据实际的需要选择适当的方式，只有这样，才能更加充分的保证发酵食品微生物多样性研究更加的成熟。
参考文献
生物多样性的研究方法篇2
[关键词]大湖流域；综合开发模式；生物多样性保护；鄱阳湖生态经济区
[中图分类号]F127；X176；X321[文献标识码]a[文章编号]1674-6848（2013）06-0062-19
[作者简介]孔凡斌（1967―），男，江西九江人，江西财经大学鄱阳湖生态经济研究院院长、教授，博士研究生导师，博士后合作导师，主要从事生态经济理论与政策、林业经济理论与政策研究；熊凯（1987―），男，江西南昌人，江西财经大学鄱阳湖生态经济研究院人口、资源与环境经济学博士研究生。（江西南昌330032）。
[基金项目]国家社会科学基金重大项目“我国大湖流域综合开发新模式与生物多样性保护研究：以鄱阳湖生态经济区建设为例”（12&ZD213）和江西财经大学鄱阳湖生态经济区发展研究跨学科创新团队资助项目的阶段性成果。
一、引言
大湖流域的开发和保护，是当今世界面临的重大课题。探索我国大湖流域综合开发与生态保护协调发展的新模式是一项紧迫的战略任务。纵观国内外大湖流域的开发历程，既有成功的经验，也有失误的深刻教训。我国大湖流域自然条件好，资源开发潜力大，以湖泊为核心加强流域综合开发，是推动我国经济发展的重要着力点。同时，我国多数湖泊面临着水体富营养化、水质污染、湖泊萎缩与剧减、湖水咸化四大环境问题，以及由此带来的湖泊及流域生态系统功能退化、生物多样性丧失等严峻的生态问题，湖泊流域开发过程中所显现的不可持续态势令人堪忧。《我国国民经济和社会发展十二五规划纲要》明确提出，要以科学发展观为主题，以加快转变经济发展方式为主线，提高发展的全面性、协调性、可持续性，实现经济社会又好又快发展。大湖流域通常是全球生物多样性的关键地区，也是人类活动与全球气候变化的极端敏感地区。对于我国大湖流域发展而言，落实科学发展观的直接体现就是把流域综合开发与生态环境改善紧密结合起来，走出一条流域经济增长与生物多样性保护协调发展的新路子，创造出有利于生物多样性保护的流域资源综合开发新模式。因此，如何协调好流域综合开发与生物多样性保护之间的关系，是关乎未来我国大湖流域地区乃至我国整体社会经济健康发展的重大问题，是我国一项重大的战略任务。
从可持续利用与管理视角看，造成流域开发过程中生物多样性损失的主要原因在于缺乏流域综合开发管理的理念和系统设计。从表面上看，生境破坏、资源过度开发、环境质量恶化和外来物种入侵是造成生物多样性损失的直接原因，但是从可持续利用与管理，以及政府环境保护的公共服务角度来审视的话，造成流域开发过程中生物多样性损失的主要原因在于缺乏流域综合开发管理的理念和系统设计。流域开发模式粗放、流域生态系统功能与开发秩序错乱、土地资源及水资源利用结构不合理、产业结构和产业布局错乱无序、市场经济条件下生态环保机制的制度力度不足、缺乏以生物多样性保护为核心的流域综合开发管理机制体制等问题大大降低了流域综合开发的效益和生态环境保护的成效。
国外流域综合开发的成功经验表明，以流域为单元构建有利于生物多样性保护的流域综合开发新模式是实现资源、环境与经济社会协调发展的重要途径。近些年来，我国有关流域综合开发和生物多样性保护的技术开发、集成和示范取得了显著发展，并在一些地区取得了成效。但从总体上看，有关流域综合开发、生物多样性保护的管理与政策方面的研究则十分零散和薄弱，已成为制约我国大湖流域科学发展理论和政策创新的重要瓶颈。因此，客观上迫切需要提出一套大湖流域综合开发与生物多样性保护的理论框架、内容体系和政策建议，并针对流域综合开发中的主要资源与环境经济问题提出切实可行的解决方案。
鄱阳湖流域是长江中下游流域的重要组成部分，是生物多样性非常丰富的国际重要湿地，被列为全球生物多样性关键地区。在世界大湖流域的开潮中，作为我国第一大淡水湖的鄱阳湖流域在全国乃至世界大湖流域开发中占有十分重要的地位。鄱阳湖流域是由江西省境内的赣江、抚河、信江、饶河、修河等“五河”注入鄱阳湖而形成的一个相对完整、独立的鄱阳湖流域水系。鄱阳湖流域面积16.22万km2，约占长江流域面积的9%，江西省流域面积的97%；其水系年均径流量为1525亿立方米，约占长江流域年均径流量的16.3%。鄱阳湖流域是亚洲最大的候鸟越冬地、洄游鱼类和大型水生哺乳动物迁徙重点区、江河鱼类产卵后幼鱼洄游通道，它对保护全球生物多样性（特别是鸟类和鱼类等重要类群）、确保长江下游地区生态安全以及实现国家水资源合理配置等方面具有举足轻重的作用。近年来，随着鄱阳湖流域社会经济的快速发展，流域生物多样性损失严重，经济发展与生物多样性保护的矛盾格外突出，这在较大程度上威胁着区域和长江流域社会经济的可持续发展。
鄱阳湖生态经济区建设是我国首次系统探索大湖流域综合开发治理新模式的重大发展战略，也是一项具有全国乃至全球意义的国家行动。2009年12月12日，国务院正式批复《鄱阳湖生态经济区规划》，建设鄱阳湖生态经济区上升为国家战略。《鄱阳湖生态经济区规划》对鄱阳湖生态经济区的发展定位是：全国大湖流域综合开发示范区、长江中下游水生态安全保障区、中部崛起重要带动区、国际生态经济合作重要平台。推进鄱阳湖生态经济区建设，标志着我国探索生态与经济协调发展的大湖流域综合开发治理新模式进入全面实施阶段，将为我国乃至世界积累大湖流域综合开发治理的先进经验，意义十分重大。因此，在全面比较和充分吸纳国内外大湖流域综合开发和治理研究优秀成果的基础上，以鄱阳湖生态经济区建设这一伟大实践为生动案例，深入系统地开展“我国大湖流域综合开发新模式与生物多样性保护”这一重大课题研究，具有典型示范意义。
鉴于此，本着“探讨理论基础、评价国外经验、完善总体框架、分析实施难点”的指导思想，采用“定性与定量相结合、案例研究与理论探讨相结合、系统科学和行为科学相结合的综合集成”的研究方法，将土地利用模式、水资源利用模式、产业发展模式等作为建立有利于生物多样性保护的鄱阳湖生态经济区及流域综合开发新模式的关键节点，提出有利于生物多样性保护的鄱阳湖生态经济区及流域综合开发新模式的构建对策；同时对生态补偿机制、公众参与机制等关键性生态环保机制进行系统性分析，最终提出有利于生物多样性保护的流域综合开发新模式和相应的政策保障体系，研究结果对促进我国大湖流域综合开发与生物多样性的协调发展具有重大的现实指导意义。
二、国内外相关研究代表性观点及评述
流域综合开发与生物多样性保护研究具有强烈的学科交叉性，是经济学、环境科学、地理学、生态学、资源科学、管理学、系统科学中的传统研究主题。由于学科传统的不同和研究范式的差异，各项研究在基本概念、研究论域、话语习惯上都存在着区别。环境科学家和生态学家比较注重生物多样性的评价与机理分析，旨在更好地进行生物多样性保护；地理学家比较注重区域，往往从资源利用与生物多样性保护的角度进行研究，目的是协调好地区经济发展和环境保护之间的关系；社会经济学者和管理学者则更多地从社会、经济等角度分析流域综合开发和生物多样性保护的影响因素，提出地区经济发展和环境保护的政策保障机制。这些研究虽然分布在不同的学科，但它们之间却具有逻辑上的一致性。学科交叉是大湖流域综合开发新模式与生物多样性保护重大课题研究的前提条件，现对流域综合开发与生物多样性保护研究领域中的多学科研究内容梳理如下。
（一）流域综合开发过程中生物多样性损失的成因和协调性评价研究
1.流域综合开发过程中生物多样性损失的成因研究
大湖流域综合开发过程中的生物多样性问题是跨越时空的自然演变与社会经济发展共同作用的结果，它伴随着人类长期、持续的社会经济活动而不断以或强或弱的形式在世界各地发生，成为世界各国研究的热点问题。国内外学者普遍认为流域综合开发过程中生物多样性损失的主要原因有以下几个方面：
（1）资源的过度开发。随着城市化和工业化进程的加速，为满足不断增长的人口需求，人类大量开采包括生物资源在内的各种资源，过度放牧、过度捕捞、围海造田、偷猎走私、滥采滥挖等资源的过度开发使生物的栖息地丧失，并形成大量的退化生态系统，从而改变了生态系统中的种类组成、群落或系统结构，导致自然生态破坏和大规模的物种灭绝。据估计，人类的活动使物种灭绝的速度不断加快，当前全球物种灭绝的速度是人类出现以前的100～1000倍。①
（2）生境退化和丧失。这是造成大量动物、植物以至微生物受威胁和大量灭绝的首要原因。②据统计，全球大约90%的已知临近灭绝物种的灾难是由于生境丧失所引起的。③伯克利大学著名的生态经济学家Daily发表在science上的文章，对造成生物多样性减少的人类活动进行了如下排序：过度开发（含直接破坏和环境污染等）占35%、毁林占30%、农业活动占28%、过度收获薪材占6%、生物工业占1%。其中前3项人类活动占93%，而这些破坏最直观的结果是造成了物种生境的破碎化和栖息地环境的岛屿化，从而直接导致生物多样性损失。④
（3）环境污染。环境污染不仅降低了人类的生活质量，而且会通过改变生物原有的进化和适应模式，影响生态系统各个层次的结构、功能和动态，进而导致生态生物多样性在遗传、种群和生态系统三个层次上降低。⑤
（4）外来物种入侵。外来物种入侵不仅导致其侵入生态系统的组成和结构的改变，而且能彻底改变生态系统的基本功能和性质，最终导致本地种的灭绝和群落多样性的降低。⑥有研究表明：生物入侵造成了迄今为止最难以恢复的生态系统变异，这些改变是导致全球生物多样性丧失的主要原因。外来物种入侵对生物多样性的影响仅次于生境破坏，而且其对生物多样性的影响在未来将会更加突出。⑦
以上学者的研究表明：生境破坏、资源过度开发、环境质量恶化和物种入侵是生物多样性损失的“灾害四重奏”，而这些因素都与人类的活动息息相关，是人类为满足自身利益和发展需求而采取的不合理的利用资源方式所致。因此，如何在流域综合开发过程中减少生物多样性损失是我国经济发展中面临的重大问题，而且具有较大的改进空间。
2.流域综合开发和生物多样性保护协调性评价研究
大湖流域综合开发新模式的本质是建立起经济增长与生态环境保护协调发展的新模式，力图达到资源、环境与社会经济三者的统筹协调发展。建立科学、合理的指标体系测度大湖流域综合开发和生物多样性保护的协调性，有利于评价大湖流域开发是否朝着经济增长与生态环境保护协调发展的方向推进，并能通过决策系统反映出的信息来强化适当的决策，建立有利于资源环境保护的流域综合开发新模式。因此，大湖流域的综合开发和生物多样性保护的协调性的测度和评价，成为有利于生物多样性保护的流域综合开发新模式研究中迫切需要解决的问题之一。
国外学者对经济增长与生态环境保护协调性的研究不多。以Brock和taylor为主要代表的经济学家们研究了经济与环境可协调发展条件的问题，他们分别利用新古典增长模型和内生经济增长模型，建立了绿色Solow、强化减排、源头与末端、诱发创新四个模型，分别从经济增长的质量、外部控制以及增长的内在需求角度解释经济与环境协调发展的内在机制和外部控制，从而为如何寻求经济与环境协调发展提供支持；①Bretschger、machiba的研究认为，结构转变、生态创新能够使资源重生，并能保持经济绿色增长，实现资源环境与经济的协调可持续发展；②Hoang和alauddin通过对oeCD30个国家农业生产的经济效益、环境效益和生态效益进行评价后认为，这些国家的环境和经济可持续发展的空间很大，可以通过技术创新或改变投入组合提高环境生态和经济发展的协调性。③
国内学者在这方面的研究比较踊跃，研究主要集中在协调发展的评价以及促进协调发展的对策研究，并且采用了不同的数学模型，如有的采用模糊数学方法、有的采用灰色关联方法、有的采用统计学中的相关分析法等。曾嵘，魏一鸣等建立了北京市人口、资源、环境与经济协调发展的评价指标体系，并通过多目标规划模型求解对北京市若干年后的协调发展进行了规划；④李雪铭、李婉娜利用主成分分析法和模糊数学法，定量分析了1990年以来大连城市人居环境与经济系统的协调发展问题；⑤傅必玲等比较了中国各省区和沿海11个发达省区经济与环境的协调性；⑥黄一绥对2000-2007年福州市的环境与经济协调发展进行了评价；⑦李智国、赵煜、韩桂兰等分别对云南、甘肃、新疆等省区的经济与环境协调发展进行了分析；⑧欧结敏运用耦合协调度模型、熵变方程法和灰色关联度模型，对广州市经济和环境的协调性进行了研究；⑨宋建波、武春友研究了长江三角洲的城市化与生态环境协调发展评价问题；⑩聂春霞等、许宏等研究了新疆、云南的区域城市化与环境、社会协调发展评价问题。①利用数学模型从各种角度对区域的资源环境与经济发展的协调性进行评价，在很大程度上依赖于数学模型构造的合理性和科学性，不同的数学模型可能得到的结果未必一致，这给政策决策者带来了困惑，因此一些学者试图从系统论角度、经济学角度对区域发展的协调路径进行探索，这方面的代表性学者有李鹤、张平宇、王国印、聂强等。②
然而，现有对经济增长与生态环境保护协调性的研究更多关注的是环境保护方面，对生物多样性的关注较少；同时，目前学术界关于协调性的研究大部分集中在概念阐述和应用不同数学模型进行评价研究，对协调性影响因素的研究较少，从而无法切实有力地提出提升经济增长与生态环境保护协调性的政策建议。
（二）土地利用和生物多样性保护研究
经济发展过程中快速城市化、产业结构与布局、制度与政策等人文因素的复杂变化，深刻影响着区域土地利用变化③，并产生了相应的环境负效应④。王建英等的研究指出，土地利用变化对生物多样性的巨大影响超过了其他任何全球变化成分对其的影响，土地利用优化是生物多样性保护的重要预防性措施。⑤现阶段土地利用方面的研究主要可以概括为以下两个方面：
1.土地利用变化的生态环境效应研究
人类活动作用下的土地利用变化会反过来对地球系统环境造成持续的、多层次的影响，这主要体现在土地利用变化对气候、地形等自然条件，水文、土壤等生态环境条件，以及产业、人口等人文因素的影响。土地利用变化通过作用于地表能量流和湿度等因素而影响区域气候条件⑥；从较长时间尺度来看，某些特殊区域土地利用变化还会对地形条件产生一定的影响。土地利用变化对生态环境条件的影响更是当前学术界一大热点议题。研究表明，在澳大利亚昆士兰洲典型流域，近半个世纪的土地利用变化尤其是森林采伐已使该区域地表径流约增加40%；⑦我国太湖流域土地利用变化导致太湖流域产流量平均增加4.11%，而苏锡常地区增加产流量平均增加10.07%；⑧土地利用变化会影响区域地下水和水质；⑨土地利用变化还会深刻影响土壤质量及C、n循环。⑩
近年来，随着生物多样性问题的不断突出，土地利用变化对生物多样性的影响也得到了学者的关注。国内外学者逐步将生物多样性保护理念融入土地利用结构规划中，并从不同的角度对土地利用结构优化中的生物多样性保护问题展开研究。欧盟最先提出将生物多样性保护理念应用于生物多样性丰富地区的土地利用规划，并指出因人类土地利用活动加剧而导致生物多样性急剧减少的行为应该得到正确评估；①Snyder等的研究指出：土地利用特别是城市和农业用地对生物多样性和生境完整性的影响最深刻；②michelsen通过对一个开放的森林系统中影响生物多样性的关键因素的了解，建立了生物多样性变化与土地利用结构规划的趋势模型；③Haines-Young借鉴“驱动力―压力―状态―影响―响应”（DpSiR）模型，系统性地分析了土地数量、土地结构和土地空间分布对生物多样性不同组成部分的影响，并探讨了哪些因素会导致这种影响发生变化，研究指出：土地利用变化和生物多样性之间的关系是理解人类发展和环境保护的基础，到2100年，土地利用因素将超过气候变化、环境污染等因素而成为对生物多样性影响最重要的因素；④Vackár等人使用空间相关分析方法对捷克共和国的土地利用、人口密度和生物多样性之间的关系进行了实证检验，发现土地覆盖和生物多样性之间存在着显著的空间相关性；⑤Geyer等、DeBaan等则提出通过GiS和生命周期评价（LCa）相结合的新方法评估土地利用对生物多样性的影响，并将其应用到加利福尼亚州乙醇生产的土地利用变化对生物多样性影响的评价中，研究指出：GiS和生命周期评价（LCa）相结合的新方法解决了传统生命周期评价中空间位置数据缺失的问题，可以更好地从生命周期的角度评估土地利用的生物多样性效应。⑥
2.土地利用变化模拟与预测研究
随着遥感、GiS和计算机技术的飞速发展，土地利用变化研究已不仅仅局限于揭示其历史变化过程，而是在了解过去和当前变化的基础上，逐渐向探索未来变化趋势的方向转变。早在1980年代末，美国学者就通过建立时空模型开展土地利用变化模拟和预测研究。此后，荷兰瓦赫宁根大学Veldkamp等提出了著名的CLUe模型⑦，并用它模拟构建了未来不同发展时期的土地利用变化情景，该模型当前已被广泛应用于欧洲、南美、非洲、大洋洲和东南亚等国家和地区。此外，Hazen开发了基于平行虚拟机的LUCaS土地利用变化分析系统模型⑧，用于模拟前后100年田纳西州小流域尺度土地利用变化情景；pontius构建了GeomoD2模型①，用于模拟和预测该国土地利用变化情景；Stéphenne和Lambin构建了基于土地投入―产出分析空间综合决策模型②，在苏丹萨赫勒地区模拟了不同土地集约利用水平下的土地利用变化趋势和情景。2000年以后，以美国学者为代表的诸多学者开展了大量的模拟和预测研究，例如基于Logisticregression模型的马萨诸塞州典型流域③、基于CLUe模型的美国中部地区④、基于SLeUtH模型的加亚福尼亚地区⑤、基于多层线性模型的蒙大纳地区⑥、基于FoRe-SCe模型的美国东南部地区⑦等，这些研究为人类在探测自身发展进程中所带来的土地利用变化过程与趋势问题作出了重大贡献。尽管此类研究都是针对不同区域、运用不同方法，但大多数都是以人文因素对土地利用变化的剧烈影响为切入点，探索不同假设条件下的未来变化情景，从而为指导区域土地利用和管理提供决策参考。
为探测区域土地利用变化的趋势与情景，我国学者也积极展开了土地利用变化模拟及预测研究，且研究思路与国外大体类似，即集成GiS、时空模型和计算机技术，对土地利用变化历史过程进行学习和反演，并结合对区域自然条件与人文因素发展趋势的综合判断，构建土地利用变化的未来情景。国内代表性研究有基于markov模型的县级尺度土地利用空间格局变化模拟⑧、基于CLUe-S模型的奈曼旗地区土地利用时空动态变化模拟⑨、基于SD模型的中国北方土地利用变化情景模拟⑩、基于Ca的城市演变知识挖掘及规划情景模拟①等。
纵观国内研究成果，现有对土地利用生态环境效应的研究更多采取定性的研究方法，土地利用对生物多样性的影响机理和定量测度研究相对薄弱，同时目前学术界对土地利用优化配置的研究主要侧重于土地利用数量结构的优化，而忽视了土地利用空间布局的优化，也很少探讨生物多样性约束下的土地利用优化问题。
（三）水资源利用和生物多样性保护研究
自20世纪50年代以来，人为因素对水资源转化的干预作用愈来愈明显，使自然条件下的水资源转化路径、层次和格局发生了深刻变化，水通过循环与自然环境诸要素相互作用、相互影响，其负面效应已严重影响着流域的生态环境安全。②因此，分析水资源利用现状及生态环境效应，制定合理的开发利用措施，维持流域健全的水循环系统，已成为流域水资源可持续利用和生态环境建设的主要科学问题。现阶段水资源利用方面的研究主要可以概括为以下两个方面：
1.水资源开发利用的生态环境效应研究
该类研究可以分为两大类。
第一类研究是综合性地评价水资源开发利用对生态环境系统的某一种或几种关键要素的影响，主要包括水资源开发利用引起的土地利用与土地覆被变化、水系和水域面积变化、动植物生境与多样性变化、地表水和地下水质变化、土壤质量变化、局部气候和空气质量变化等。这类研究起源较早，研究人数较多，研究的时空尺度和研究手段随着观测数据的积累、观测仪器的改进以及RS、GiS等新技术的进步而不断拓展。Dixon早在1892年就分析了澳大利亚干旱区殖民地进行牧场和水资源开发对本土植物种类造成的影响；③Rodríguez-iturbe和porporato对水资源控制下的地区生态系统尤其是土壤湿度和植物动态变化进行了探讨；④Snyder和tartowski则集中分析了不同时间尺度下地区可利用水资源量变化对植被动态变化的影响。⑤这一类型的研究，大多由特定专业领域的生态学者和环境学者完成，内容较微观，研究侧重于自然科学领域。⑥
第二类研究是具体分析不同类型的水资源开发利用活动对生态环境的影响，主要包括修建水库、开采地下水、调水、灌溉、排水、增加城市和工业用水等对生态环境造成的影响。例如，matete和Hassan提出了将环境的可持续发展融入经济发展计划的整体层次框架中，并以跨流域调水的水资源开采作为案例进行了分析，应用并发展了生态经济核算矩阵以评价莱索托高地水利工程的生态经济影响，同时还应用经济成本收益法进行了两个项目的比较分析，其研究成果进一步判定了跨流域调水对生态经济的直接、间接及潜在影响的程度；⑦Hu等和Li等利用环境流体动力学模型（eFDC模型）分析了引江济太调水工程对太湖水动力调控和水质量的影响；①李亦秋等在提出猫跳河流域梯级开发生态效应区域响应概念模型的基础上，比较全面地分析了猫跳河流域河流生态系统中水文情势与水量、水质与水环境、水生生物群落等非生态和生态变量的区域响应，结果表明：猫跳河流域开发在带来流域人口增长、产业集聚和社会发展的同时，也出现了一系列不可逆转的生态环境问题，人地矛盾更加突出；②高永年、高俊峰采用层次分析法测算了南水北调中线工程对汉江中下游流域生态环境影响的综合影响，研究发现：南水北调中线工程的实施对汉江中下游流域生态环境产生了负面影响，各生态环境的影响程度大小排序依次为水质变量、土壤地质变量、社会生产变量、水生生物变量、水资源变量和气候变量；③马芳冰、王总结归纳了国外跨流域调水工程的生态环境影响。④
综合分析以上文献可以发现，国内外按照“发生的问题―产生的机理―调控的标准―过程模拟―情景预测―响应对策”这一逻辑思路，围绕水资源开发利用对生物多样性的影响进行了大量研究，并取得了明显进展。但水资源开发利用对生物多样性的影响机理研究相对薄弱，仍难以精确刻画水资源开发利用与生物多样性之间的定量关系，难以动态模拟和有效预测水资源开发利用对生物多样性的影响，面向生物多样性保护的水资源开发利用对策研究在实践中仍面临着较多障碍。因此，未来应以机理研究为基础，以过程模拟和情景预测为突破口，以综合集成的对策体系建设为落脚点，不断加强水资源开发利用对生物多样性影响的研究。
2.资源环境约束下水资源开发利用的合理阀值研究
该类研究主要集中探讨水资源开发利用的合理标准，即水资源开发利用到何等程度会对生态环境造成胁迫作用、胁迫强度如何，何种程度会对生态环境产生驱动作用、改善程度如何等问题。水资源开发利用合理阈值、生态环境需水或与之类似的概念不断出现，并成为相关研究领域的热点。
生态环境需水量的计算是研究水资源与生态环境之间相互作用与关系的核心。只要计算出流域的生态环境需水，就可以根据流域的水资源总量和已经开发利用的水资源量，来准确判断水资源开发利用对生态环境的影响程度。基于生态保护目标的生态环境需水量是指为解决生态问题及实现环境保护目标所需要的水量。目前，国内外已经从理论、方法与实践等多个层面对生态环境需水进行了大量研究。⑤在国内学者中，汤洁等论述了国内外生态环境需水研究的进展，分析了生态环境需水的内涵、概念、分类和特征，并总结了河流、植被、湖泊、湿地和城市生态系统生态环境需水量计算的理论基础和方法；⑥刘金鹏、费良军将民勤盆地生态功能区和生态环境需水类型需水优先次序进行了划分，并根据盆地实际情况，制定了各生态环境需水类型需水量的需水原则；⑦黎聪等、宋松等结合湿地分类分级计算，分析计算了不同层次生态保护目标下衡水湖湿地生态环境需水量，并在此基础上对研究区最小、最优以及最大几个典型状态下生态环境需水量进行了分析评估。①
应该说国内外生态环境需水在概念界定、分类、计算方法、实证研究及生态系统和水文过程的相互反馈作用研究等方面都取得了大量的成果，但由于不同学者对生态环境需水的概念理解不同，生态环境需水量的计算方法存在显著差异，亟待从机理剖析的角度，结合区域水资源的科学配置与管理实践，从而构建适合的理论框架与技术体系以测算生态环境需水量。
（四）产业发展和生物多样性保护研究
区域产业的发展及其组合类型、强度的变化在显著促进社会经济繁荣的同时，也对生态环境产生重要影响。产业发展和生物多样性保护之间的研究对于建设资源节约和环境友好型社会，实现“效率国土”具有重要意义。现阶段产业发展和生物多样性保护方面的研究主要可以概括为以下两个方面：
1.产业结构和生物多样性保护研究
产业结构是一个“资源配置器”，同时也是资源环境的消耗和污染物产业的质和量的“控制体”。产业结构对生物多样性种类、规模以及形成原因存在直接或间接影响，其组合类型和强度在很大程度上决定了经济效益、资源利用效率和对环境的胁迫程度。目前国内外有关产业结构与资源环境问题的研究分为两类，一类是探讨产业结构演变的资源环境效应，另一类则集中分析资源与环境约束下的产业结构调整及主导产业选择。
（1）产业结构演变的资源环境效应研究。彭建等依据不同产业发展对生态环境影响的定性分析，构建不同产业类型的生态环境影响系数和区域产业结构的总体生态环境影响指数，以丽江为例，证实了重工业等高污染产业比例的下降对生态环境产生了明显的正效应；②赵雪雁分析了甘肃省产业变化轨迹以及不同产业发展对生态环境的影响，利用不同产业的生态环境影响指数，计算了甘肃省产业转型的生态环境效应，结果表明：产业转型轨迹及其引起的生态环境效应轨迹在变化趋势上存在一致性，呈明显波浪形，产业转型对生态环境影响滞后于产业转型；③张海峰等、汤进华、钟儒刚借鉴赵雪雁的思路，利用产业生态环境影响指数，计算了青海省和武汉市产业转型的生态环境效应；④韩峰、李浩运用转移份额分析法与主成分分析法，分别测算了产业结构效应系数和生态环境质量综合指数，进而通过建立动态计量模型，分析了湖南省产业结构对生态环境的作用机制。⑤
（2）资源与环境约束下的产业结构生态化调整研究。此类研究逐步由定性分析向定量与定性结合的方向发展，目前主要的方法有基于投入产出法的计量模型和基于博弈论的产业结构优化模型、多目标规划计量模型、灰色系统分析法、一般均衡法、基于系统动力学理论的计量模型等。⑥陈树良等以经济增长和充分就业为目标，基于投入产出法的线性规划模型对区域产业结构进行了优化设计；①王光净等以合作博弈理论为工具，从宏观和动态的角度来建立三次产业结构优化模型，提出了相关求解算法，并以温州产业为例进行分析，验证了所建模型的可行性和有效性；②代伟等采用多目标规划方法，构建了秦皇岛市水资源约束条件下的产业结构优化模型，提出了秦皇岛市产业结构优化方案；③唐志鹏等利用北京市1987-2007年的投入产出表，在能源消耗总量约束条件下，采用灰色系统分析法，比较了各个历史时期的真实产业结构与优化产业结构的相似程度，提出了北京市产业结构未来调整的方向。④
总体来看，现有关于产业结构与生物多样性的研究主要以特定区域的实证研究为主，机理分析尚未展开。对资源环境约束下产业结构如何调整优化问题研究较少，多数为定性阐述，深度不够，缺乏系统性分析。
2.产业布局和生物多样性保护研究
产业布局是产业与生态环境相互作用的连接点。产业在空间的转移和集聚会引起资源空间配置效率及环境污染空间扩散和转移，从而导致区域环境污染结构的转变，对区域生态环境的可持续发展具有重要影响。目前有关产业布局与资源环境关系的研究主要侧重于产业布局的环境影响与评价、基于资源环境承载力的产业布局适宜性研究两个方面。
（1）产业布局的资源环境效应研究。合理的产业布局和集聚通过发挥规模效应、集聚效应、关联效应和扩散效应，是区域经济发展的重要推动力量；然而一些研究表明，当产业高度集中，超过了该区域的资源环境承载力时，产业布局对环境的不良影响也会累积，例如诱发水环境恶化、大气污染、土壤污染、生物多样性减少等一系列生态环境恶化问题，产业布局所带来的外部不经济性增强。⑤目前国内外学者对产业空间集聚格局的生态环境响应进行了一定的理论和实证研究。研究内容侧重于产业的动态变化对生态环境影响的评价，多将产业集聚作为可持续发展的重要因素来评价环境对产业布局的响应。如Freeman提出产业集聚要研究其与环境外部性的相互作用，并考虑区位、生产等因素与环境污染的作用关系；⑥Rigina对不同发育阶段城市群地区采矿业对大气、土壤、河流等生态环境要素的影响进行了动态评价；⑦Grazi等将产业集聚作为评价可持续发展的一个因子，结合外部性以及社会福利等指标，构建了较为全面的评价城市可持续发展的模型；⑧王树功等的研究认为，产业集聚空间布局不合理是造成长江三角洲地区水资源短缺和环境污染日益严重、生态安全受威胁的主要原因，而合理的工业布局是协调工业发展和水环境污染的重要措施。⑨然而，现有研究多局限于产业集聚与环境污染相互关系的定性识别，产业集聚对环境影响的内在机理缺乏深入研究。
（2）基于资源环境承载力的产业布局适宜性研究。王云等利用区域环境承载力理论对城市工业布局进行探讨，提出工业布局合理度概念，并将其应用于北海市的城市环境规划之中，对其工业布局现状进行评价；①高爽等通过构建污染企业分布密度-CoD排放量的双变量空间自相关模型，以江苏省无锡市作为案例，揭示了制造业产业集聚和水污染的空间关联关系，并提出了环境约束下的制造业产业结构调整方向；②陈诚等以江苏沿江地区为例，在提取生态功能保护区和产业分布空间信息的基础上，运用矩阵分类和空间分析方法研究了生态保护与产业分布的空间匹配特点，总结了生态保护约束下产业空间布局的调整思路；③赵海霞等以产业集聚发达、水网密集但水环境敏感性强的太湖流域为例，通过空间叠加分析，依据水环境容量支撑强度和产业集聚污染压力的对应关系，分别划分了农业、工业集聚空间优化类型区。④上述研究为制定产业布局优化调整以及环境保护方针政策提供了重要依据，然而关于基于生物多样性保护目标的产业布局优化的研究则较少涉及。
（五）流域综合开发过程中的生态环保机制研究
生态补偿机制和公众参与机制是我国建立有利于生物多样性保护的流域综合开发新模式的重要生态环保机制，本部分拟对这两种生态环保机制的国内外文献进行简单回顾。
1.流域综合开发过程中的生态环保机制之一：生态补偿机制
生态补偿机制作为一种新型的生态环境管理创新模式，受到学术界的持久关注。目前国内外对生态补偿的研究主要集中在以下几个方面：
（1）生态补偿标准问题研究。由于生态补偿对象的多样性以及范围的不确定性等原因，目前在学术界并没有形成公认的生态补偿标准的确定方法。比较常用的方法包括生态系统服务功能价值法、机会成本法、意愿调查法、市场法等。以生态服务价值作为补偿定价的依据是国际上的通常做法，在我国则是必然的选择。⑤随着遥感技术和GiS技术的发展，把遥感技术和GiS技术应用于生态系统服务价值评估受到越来越多学者的青睐，国内已有不少学者利用遥感技术和不同的遥感数据源进行了生态系统生物多样功能价值评估，⑥并取得了具有重要价值的研究成果。基于市场法确定生态补偿标准的案例主要集中于水资源交易和碳排放权交易的生态补偿，⑦用市场法确定生态补偿的标准能够兼顾两方面的利益，在双方都能达到满意的条件下开展生态补偿，具有其他方法所不具备的优点。①
目前，尽管生态补偿的理论研究和实践活动越来越多，但学者们对确定生态补偿标准的方法仍处于研究的初始阶段。从文献中看，目前在这个方面研究存在的主要问题有：一是整个研究的系统性不够强，没有形成统一的科学体系；二是现行研究生态补偿标准的方法在获得最终结果的过程中需要大量复杂的数据和计算，而复杂的数据计算容易产生结果的误差；三是按照现行确定生态补偿标准的方法来进行实际的研究，其结果的认可度不高。②尽管如此，基于生态系统服务功能价值确定生态补偿标准是流域生态补偿机制研究的主流方向。
（2）生态补偿的空间对象选择研究。生态补偿对象的空间选择可以理解为一种空间定位技术，指在众多潜在的生态系统服务提供者中，依据其区域或个体条件差异，确定最有效的补偿区域或生态服务供给者。③此前，针对生态补偿对象的空间选择研究多数为定性描述和理论探讨，近几年一些学者开始了定量的讨论和研究。从发展过程来看，国际上对生态补偿对象的空间选择研究经历了由单目标、单准则发展到多目标、多准则的过程。得分函数法、距离函数法和Gap分析法是国外生态补偿控件对象选择的常用方法。近年来逐渐发展和完善起来的探索性空间数据分析（exploratorySpatialDataanalysis，eSDa）技术是一系列空间分析方法和技术的集成，通过对事物或现象空间分布格局的描述与可视化，发现空间集聚和空间异常，解释研究对象之间的空间相互作用机制，eSDa技术已开始应用到区域经济发展问题研究，这为区域生态补偿的空间选择方法提供了新思路。④生态补偿对象的选择方案既要从经济学角度考虑，也要从社会学、生态学角度考虑，既要注重经济效率性，又要注重公平性，更要重视生态效益和社会效益。
生态补偿标准始终是生态补偿机制的核心内容，且至今仍未形成学界和决策层能够普遍接受的方法体系，因此也成为学术研究的重点和难点。当前，需要寻找到适当的函数关系将生态系统服务功能价值转变为生态补偿标准，这是生态补偿标准研究的重要选择。生态补偿空间定位及优化研究至关重要，是影响生态补偿机制有效性的关键内容，但是目前的研究还处于起步阶段。探索并明确影响补偿空间定位的关键因子，确定生态补偿的区域优先序列，是流域生态补偿空间选择研究的必然趋势。同时，现有生态补偿的研究大多立足于宏观和中观层面的分析，缺乏对微观主体行为与选择问题的实证研究，从而严重影响到生态补偿政策的实施绩效和可持续性。
2.流域综合开发过程中的生态环保机制之二：公众参与机制
公众参与机制是指在政策过程中公民与政府之间相互作用的关系，涉及公共政策参与的范围、途径、手段、政府的回应方式等。在民主社会，公众参与机制是公共政策过程的重要组成部分。国际上，公众参与原则作为环境保护的一项基本原则已为国际社会所普遍接受，它是民主思想在环境保护领域的延伸。公众参与是发达国家环境保护事业的基础，是推动环境保护事业发展的重要动力。采用何种模式实现流域开发过程中利益相关者（Stakeholders）的广泛参与，也成为流域综合开发和生物多样性保护研究中理论和实践的热点和前沿，比较有代表性的如当前正在美国的五大湖（Greatlakes）、印度尼西亚的多巴湖（toba）、俄罗斯和爱沙尼亚边界的楚德湖（peipsi）等进行的积极探索。从某种意义上来讲，公众参与程度已经成为一个国家或者地区环境保护事业发达程度和环境管理水平高低的一个重要标志。
文献资料分析表明，我国政府在公众参与环境保护政策这一课题上已经取得了一定的成就，但不容忽视的是，公众在参与生态环境保护的每个环节中都存在一定的问题，主要包括生态环境保护目标无法对公众需求进行确认、公众对环境保护实施过程监督缺位、公众作为评估主体参与环节少发挥作用小以及公众意见被忽视。①相关法律法规文本分析表明，我国的宪法和环境保护法已经对公众参与制度有了一些原则性的规定，其他单行法、部门规章中也有相关规定，《环境影响评价公众参与暂行办法》中公众参与制度的确立对我国环境法治建设有着非同寻常的意义。可以说，我国环境保护公众参与制度已初步建立，但是还不完善。
理论研究文献显示，我国公众参与环境保护的研究直至20世纪90年代才开始兴起，关于这项制度的一些理论、概念和观点被引入我国后，立刻引起了当时学界的广泛关注和研究。②早期的研究成果主要是对国外公众参与环境管理的先进理念和成功案例进行介绍，近期也开始在实证方面作了一些研究，③但是研究缺乏广度和深度，尤其缺少对公众参与环境保护的途径、模式及参与效果等内容的深入研究，④生物多样性保护中公众参与机制的理论研究仍然处于初步阶段，大多研究侧重于公众参与的定性分析，对参与形式、参与程度、参与程度影响因素的定量研究较为缺乏，无法从实证的角度提出促进生物多样性保护中公众广泛参与的有效政策建议。
（六）鄱阳湖生态经济区及流域的相关研究
自从2009年12月鄱阳湖生态经济区建设上升为国家战略以来，鄱阳湖生态经济区综合开发和生态保护问题受到了政府、学术界和产业界的高度关注。黄金国、郭志永分析了鄱阳湖湿地生物多样性现状及其面临的威胁，从控制湿地开发规模、搞好湿地生态环境建设、加大资金投入、提高公众参与度等方面提出了鄱阳湖湿地生物多样性保护及其可持续利用的主要对策；⑤钟业喜、肖加超从国家的退田还湖政策、人口文化素质、农业生产方式等方面分析了鄱阳湖自然保护区生物多样性变化的影响因素，并在此基础上提出了保护鄱阳湖自然保护区生物多样性的对策建议；⑥蔡海生等采用RS与GiS技术计算出了鄱阳湖自然保护区相应年份的生态承载力，并结合生态盈亏情况和生态协调情况，对鄱阳湖自然保护区可持续发展情况进行了评价；①李志强、陈晓玲、廖富强、李松志、游文荪等分别从人口、资源、环境与经济大系统，区域可持续发展、环境脆弱性、水生态安全和县域经济发展水平等方面对鄱阳湖生态区的发展现状进行了评价，为研究鄱阳湖生态经济区的协调发展提供了基础数据；②卢杰借鉴国外大河大湖区域治理经验，提出加强综合规划、综合开发，加大经济与法律手段的运用以及逐步建立合理有效的组织管理体系的鄱阳湖开发利用的指导思想。②
为了保障鄱阳湖生态经济区的经济开发和生物多样性和协调发展，一些学者在生态环保机制方面作了系统的探索。贺思源在分析了鄱阳湖区实施的以命令控制和排污收费为主的传统水污染防治制度存在许多弊端后，从排污权交易制度角度，研究了鄱阳湖水污染物排污权的交易制度，认为鄱阳湖水污染物排污权交易制度构建应关注排污权初始分配、交易市场培育、政府监管以及相关配套措施完善等方面的问题；④董云鹤认为鄱阳湖生态经济区节能减排应处理好企业经济效益与社会效益、保护环境与保障就业、加速发展与持续发展、守法成本高与违法成本低、“硬政策”与“软执行”等五大关系；⑤傅春、周迪从鄱阳湖提供的生态经济价值、保障“长三角”水生态安全及促进江西经济更好更快发展这三个角度，分析了建立鄱阳湖流域生态补偿机制的必要性，提出了建立鄱阳湖流域生态补偿机制的具体财税政策；⑥邱润根、舒小庆认为鄱阳湖生态经济区的建设理应走优先发展现代服务业、重点发展低碳工业、全面发展生态农业的低碳经济之路，并且要以立法的形式来保障鄱阳湖生态经济区的建设；⑦王乔、伍红的研究认为，面对鄱阳湖生态经济区大规模建设和鄱阳湖水质不断下降这一现实，应适时择机出台水污染税，运用环境税收手段，矫正外部不经济，保护自然资本，促进代际间公平，实现经济的可持续发展。⑧
为进一步扩大鄱阳湖生态经济区研究的学术交流平台，江西省社科院还专门创办了《鄱阳湖学刊》杂志，让学者们畅所欲言，为鄱阳湖生态经济区的建设纷纷建言献策，为政府决策提供支持。姬鹏程、孙长学研究了鄱阳湖生态经济区建设的体制机制创新问题，提出了六项体制、八项机制创新的重点建议，以及生态经济区体制机制建设的政策支撑体系和综合配套改革方案；⑨李周从生态产业发展理论透视鄱阳湖生态经济区建设的基本思路，认为建设鄱阳湖生态经济区必须构建有利于环保和可持续发展的生态产业体系；⑩李志萌从理论层面探讨了鄱阳湖流域环境保护与经济发展互动协调的基础及其支持体系建设；①鄢帮有、严玉平研究了新中国成立六十年来鄱阳湖的生态环境变迁，回顾了近三十年来围绕鄱阳湖流域生态环境保护开展的实践和探索工作，提出了当前鄱阳湖生态经济区建设的可持续发展对策。②鄱阳湖生态区的研究正从各个角度、不同层面不断地推进与深化。
总体来看，从2009年鄱阳湖生态经济区建设上升为国家战略以来，鄱阳湖生态经济区的相关研究也如雨后春笋般繁荣起来。这些研究无论是在理论方面还是在实证方面都为未来研究提供了诸多宝贵的资源和探索性的研究成果。但是鲜有研究系统性地探讨鄱阳湖生态经济区综合开发与生物多样性保护问题，这与鄱阳湖生态经济区“全国大湖流域综合开发示范区”的重要性地位极不相称，迫切需要进一步的深入研究。
三、综合述评与研究展望
应该说，近十几年以来，国内外学者对流域综合开发和生物多样性保护方面的重大理论和现实问题进行了卓有成效的艰苦探索，取得了不少有重要价值的研究成果，为后续研究提供了很好的借鉴。然而从力所能及的文献阅读和分析情况来看，流域综合开发和生物多样性保护仍存在较大拓展空间。
第一，从研究视角来看，目前各项研究之间缺乏学科交叉，缺乏有效对接。流域综合开发的研究广泛分布于经济学、社会学、管理学、环境科学、系统科学之中，生物多样性保护的研究则主要分布在生态学、地理学、资源科学之中，各项研究之间缺少交流、缺乏对话，不注重对其他学科成果的借鉴，导致研究既不全面，也缺乏层次感。因此，急需搭建一个跨学科的研究平台，共同探讨流域综合开发和生物多样性保护的研究。
第二，从研究内容来看，目前国内外学者对流域综合开发和生态环境保护的研究更多关注的是环境保护方面，对生物多样性的关注较少；对有利于生物多样性保护的流域综合开发的内涵、模式构建方向以及相应的政策保障体系完善的研究还较为薄弱。因此，客观上迫切需要提出一套大湖流域综合开发与生物多样性保护的理论框架、内容体系和政策建议，并针对流域综合开发中的主要资源与环境经济问题提出切实可行的解决方案。
第三，从研究方法来看，国内流域综合开发与生物多样性保护研究以人文社会科学理论为基础的定性研究为多，流域综合开发与生物多样性保护之间的影响机理研究相对薄弱，仍难以精确刻画流域综合开发与生物多样性之间的定量关系，难以动态模拟和有效预测流域综合开发对生物多样性的影响。
四、鄱阳湖生态经济区及流域综合开发新模式与生物多样性保护研究的总体框架
大湖流域综合开发和生物多样性保护的协调发展是世界性难题。当前我国大湖流域综合开发主要存在着以下三个方面的问题：一是如何协调好流域综合开发和生物多样性保护之间的关系，二是如何设计出有利于生物多样性保护的大湖流域综合开发新模式，三是如何从政策上保证有利于生物多样性保护的大湖流域综合开发新模式的有效运行，
为解决这三个方面的问题，本文认为：首先，需要总结和借鉴典型国家及我国典型地区的可利用经验，并基于经济学、生态学、环境科学、资源科学、地理学、系统科学等多学科的理论，对大湖流域综合开发和生物多样性保护给出统一的解释框架。其次，在此基础上，以鄱阳湖生态经济区建设为具体研究对象，重点从土地利用模式、水资源利用模式、产业发展模式等有利于生物多样性保护的鄱阳湖生态经济区及流域综合开发新模式建立的关键节点出发，提出有利于生物多样性保护的鄱阳湖生态经济区及流域综合开发新模式的构建对策。同时，为保证有利于生物多样性保护的鄱阳湖生态经济区综合开发新模式的有效运行，需要进一步分析生态补偿机制、公众参与机制等关键性生态环保机制的创新政策，最终提出有利于生物多样性保护的鄱阳湖生态经济区及流域综合开发新模式和相应的政策保障体系。
生物多样性的研究方法篇3
关键词：变性梯度凝胶电泳；微生物实验；实验教学改革
中图分类号：G462文献标志码：a文章编号：1674-9324（2013）39-0247-02
微生物学是高等院校生物类专业的一门重要专业基础课，是一门实验性和应用性很强的学科。微生物学实验是微生物学的重要组成部分，是现代生物学技术的重要基础，对于学生加深理论知识的理解，培养创新与实践能力具有非常重要的作用[1]。传统的微生物实验教学内容一般以验证性和演示性为主，注重培养学生的基本实验技能，但对学生综合实验技能和创新能力的培养有待提高。随着国家对创新人才的需求，适当增加综合性和研究性实验内容的比重是微生物实验教学改革的发展方向，对于提高学生的思维能力、动手能力有着积极的作用[1-3]。
本校非常重视实验教学改革工作，鼓励学生在掌握基本实验技能后，积极参加设计性、研究性实验，包括院校两级的大学生科研立项或教师的研究课题，并给予相应的创新学分。通过该项措施进一步激发了学生的学习兴趣，并有效提高了学生的实验技能及分析问题和解决问题的能力。目前微生物实验教学主要包括传统的微生物实验技术，随着分子生物技术的发展，微生物研究技术突破了以往主要依赖纯培养物的局限性，特别是在生态环境样品中的微生物群落结构分析中，基于pCR扩增的分子生物学方法逐渐取代了传统的培养方法，大大拓展了微生物研究的范围[4]。因此，我们在后续的研究性实验中引入了变性梯度凝胶电泳在微生物群落结构分析中的应用等创新型实验项目，使实验教学从基础性向综合性和研究性推进。
一、变性梯度凝胶电泳（DGGe）技术概述
由于自然环境中微生物生存条件的复杂性，大多数微生物以未可培养的形式存在。DGGe是一种不依赖微生物培养技术的研究方法，能快速、准确鉴定环境中微生物种群，在揭示复杂微生物群落演替规律和功能基因多样性方面具有独特的优越性，已被广泛应用于微生物分子生态学研究各领域[5]。DGGe技术的基本原理是在聚丙烯酰胺凝胶的基础上，加入呈梯度分布的变性剂（甲酰胺及尿素），双链Dna分子部分解链导致电泳迁移率降低，而序列不同的Dna分子解链行为不同，在凝胶中的移动速度也就不同，从而使得长度相同而序列不同的Dn段分离。因此，通过测序分析凝胶上不同的谱带，可以检测微生物种群的遗传多样性和动态变化[6]。DGGe技术的工作流程主要包括以下几个步骤：（1）环境样品的采集；（2）样品中微生物基因组Dna的提取；（3）Dn段的pCR扩增；（4）pCR产物的DGGe分析；（5）Dna条带的序列分析。
二、变性梯度凝胶电泳技术在微生物实验教学中的应用
变性梯度凝胶电泳技术是一项综合性较强的实验技术，涉及的知识面较广，要求学生既要有全面扎实的理论知识，又要求较强的实际动手能力。我校的微生物学实验安排在大学二年级的上学期，通过学习使学生掌握微生物学实验的基本原理和操作技术。此外通过后续的生化分析技术和分子生物学实验等课程，学生掌握了聚丙烯酰胺凝胶电泳、基因组提取和pCR扩增等实验技术。因此该项研究性实验项目主要面向大学二年级和三年级的学生，我们为学生提供开放的实验室环境，学生自己组成实验小组，可根据自己的实际情况安排时间。整个实验由学生实验小组开展并完成，同时在实施过程中配备指导教师进行随时指导。根据学生的学习兴趣并结合实验室的科研课题，我们近几年开设了多项DGGe技术在微生物研究中应用的实验，包括《氯嘧磺隆对土壤微生物类群的影响》、《SBR反应器中聚磷菌群的结构分析》、《不同森林土壤中产漆酶细菌群落结构的研究》和《厌氧污泥对偶氮废水的脱色及污泥菌群结构分析》等研究性实验项目。环境样品中Dna的提取是影响微生物多样性的DGGe检测结果的重要因素[7]，学生通过比较不同提取方法对Dna产量和纯度的影响，确定了针对不同的实验样品（土壤或污泥）的最佳提取方法，在这一过程中加深了对Dna提取原理和方法的认识。通过DGGe图谱的分析，学生可以直观地了解到污染胁迫等环境条件下微生物群落结构的改变及优势菌群形成的动态过程，更加深刻地理解富集培养技术在分离特定功能微生物上的应用。学生通过后续的序列比对分析，可以学习到相关环境中常见的微生物优势菌属，特别是一些非培养微生物序列的出现丰富了学生对微生物多样性的认识。通常面向本科生开设的微生物实验主要以好氧微生物为对象，因此学生接受的微生物学知识侧重于好氧微生物，对厌氧微生物的接触和认识较少。我们通过引入厌氧环境中微生物结构分析等实验项目，使学生有机会接触厌氧箱的使用，掌握厌氧微生物的培养方法等实验内容，进一步丰富实验教学内容，深化实验教学改革。
三、小结
分子生物学技术的发展，展示了一个更为丰富的微生物世界。与目前基于高通量测序的微生物多样性分析方法相比，DGGe技术具有快捷、方便、成本低等优点，适合应用于微生物创新实验教学。通过这些研究性实验的开展，使学生完成无法在正常教学时间进行的实验内容，拓展了与其他学科实验技术的综合应用，在激发学生学习兴趣的同时，不仅提升了学生的实验操作技能和团队协作能力，而且增强了综合思考及分析解决问题的能力，为独立完成毕业论文实验及今后从事科研工作打下了坚实的基础[8]。
参考文献：
[1]张萍华，蒋冬花.微生物学创新实验教学体系的构建与实践[J].微生物学杂志，2013，32（3）：107-109.
[2]袁生，徐旭士，戴传超，何伟，张茵，尚广东，戴亦军.微生物学实验课程的改革与实践[J].高等理科教育，2012，（2）：138-140.
[3]贾艳萍，张兰河，马姣.立足学科发展的微生物学实验教学改革研究[J].实验技术与管理，2012，29（12）：26-32.
[4]李晓然，吕毅，宫路路，柳陈坚.微生物分子生态学发展历史及研究现状[J].中国微生态学杂志，2012，24（4）：366-369.
[5]李琬，李景鹏.分子生物学技术在堆肥微生态研究中的应用研究进展[J].中国农学通报，2012，28（18）：20-25.
[6]王洋清，杨红军，李勇.DGGe技术在森林土壤微生物多样性研究中的应用[J].生物技术通报，2011，（5）：75-79.
[7]高慧琴，刘凌.pCR-DGGe技术中不同Dna提取方法综述[J].安徽农业科学，2011，39（1）：52，102.
[8]高健，周建良，蒋本桂，张洁.普通微生物实验教学全面开放理论的建构[J].当代教育理论与实践，2012，4（3）：113-114.
生物多样性的研究方法篇4
关键词：生物资产资产评估评估方法
一、生物资产价值评估的背景
生物是人类赖以生存和经济、社会持续稳定发展的物质基础。地球上多种多样的植物、动物和微生物为人类提供了不可缺少的食物、纤维、木材、药物、工业原料和服务。与此同时，由于人类社会的不断进步，科技的不断发展，对生物资产的需求也越来越多。而且，由于生物资产本身的一些特性，其在人的劳动与自然力的共同作用下生长的，受自然规律和自然环境的影响，另外每种生物资产的生长、发育、成熟、结果都不同，因此，对生物资产的研究不管是从会计角度还是评估角度都是比较重要的。从会计角度看，全球范围内不管是组织、协会还是个人已经认识到生物资产的确认与计量问题，在这方面研究最早的是澳大利亚会计准则委员会(australianac―countingStandardsBoard，简称aaSB)于1998年颁布的1037号(aaS35)会计准则，即自生和再生资产(self-GeneratingandRegener-atingassets简称SGaRas)会计准则，《国际会计准则第41号――农业》(以下简称iaS41)对生物资产的研究从概念的界定、初始确认到后续计量作了详细具体的介绍。我国在借鉴国外会计准则的基础上，2006年颁布《企业会计准则第5号――生物资产》。
但从资产评估的行业讲，对生物资产的价值评估的研究很少。目前具体的生物资产的价值评估准则，这给从事生物资产的企业的经济活动带来了不便，制约了其快速发展。而且也不能很好地向信息使用者传递一些有用可靠的信息，影响了信息使用者的决策。为了保证会计与评估的相互协调与合作，进一步体现评估对会计的补充和完善作用。在当前市场经济不断深入的大潮中，生物资产的租赁、重组、典当、保险、交换等经济行为的不断增多，不能仅依据生物资产的账面价值来反映，还要借助于生物资产价值评估的相关理论与方法，以资产评估结果重新确定其价值。
二、生物资产价值评估的意义
随着经济的快速发展，涉及生物资产的企业与日俱增，探讨生物资产价值的评估问题，对评估行业和企业都有一定的理论意义与现实意义。从理论上讲，首先，为生物资产价值评估做出理论贡献。通过借鉴其他国家对其他行业，尤其是农业资产评估和森林资源资产评估的价值评估理论，可以得出生物资产价值评估的目的、依据和方法。在评估范围越来越细、越来越广的情况下，可以为进一步研究资产评估理论体系和评估方法、模型提供参考，对于推动资产评估理论的发展有重要意义。其次，可以推动会计学相关理论在该领域的应用。从实践上讲，有利于建立全行业统一的评估准则，使评估机构能够很好的按照规范行事，使生物资产的评估更加明朗化；有利于持有生物资产的企业更好地掌握本企业的资产价值情况，促进企业加快生产，提高企业资产价值；有利于不同地区企业持有的生物资产的价值在一定程度上具有可比性；有利于生物资产的信息使用者获得全面、详实、可靠的评估信息；有利于进一步推动和完善评估准则，加快我国评估领域的发展；有利于以财务报告为目的的生物资产价值评估的发展；有利于协调有关评估各方的经济利益。
三、西方国家生物资产价值评估的现状分析
英国《评估指南》(红皮书)1996版指南12――森林与林地资源评估，提到了关于资源类植物价值评估的一些方法。《欧洲资产评估准则》(eVS)2000版指南5
贷款为目的的农业资产评估中将农业资产划分三个大部分来说明：第一部分介绍农业资产包含的内容以及相互之间的区别、评估方法以及市场价值的确定；第二部分介绍了多年生植物的存在形式――正在生长着的、培育中的、收获的和其他形式的，还介绍了一些牲畜；第三部分主要介绍了在评价这些动植物时影响因素和多年生植物的评估方法。《iVS指南10――业资产评估》2005版该指南中指出了生物资产是活的动物和植物，评估中将其划分为附着地的生物资产和非附着地的生物资产，将其区别于农业资产和个人财产进行评估，要求根据农业生物资产的类型和周期性按照市场法对农业资产进行评估。《澳大利亚评估准则与实践》对乡村资产评估进行了介绍，其中包括对生物资产相关不动产的阐述，如果园的建设投资、养殖设备、设施等评估。国外学者进行很多有关生物多样性经济价值评估的理论、方法及其应用的研究，从生物多样性经济价值的类型、评估方法和案例研究等方面进行论述，国外比较流行的是条件价值法。20世纪70年代以后，随着福利经济学对消费者剩余、机会成本、非市场化商品与环境等公共产品价值的思考，生物多样性经济价值的评估研究逐步形成了一套较为完整的理论、方法体系。经济合作与发展组织(简称经合组织，oeCD)将评估方法分为三类，即实际市场价格法(市场分析)、模拟市场法和替代市场法。
从上述国外研究现状来看，虽然国际评估准则和发达国家的评估准则中对农业资产评估的研究有许多可取之处，但相对于其他资产评估研究来讲，起步较晚，而且也不成熟。各评估准则中只是粗略介绍影响生物资产的自然因素，都没有详细说明生物资产具体的评估依据、评估原则和不同生长阶段下的评估方法及一些参数的选取，未将其作为重点进行研究.、随着社会的进步及评估的范围的不断扩大，现有的国外的理论与方法不能满足生物资产发展的需要。
四、我国生物资产价值评估的现状分析
我国的资产评估行业是改革开放和建设社会主义经济的过程中逐渐发展起来的，属于新兴行业。1989年，原国家国有资产管理局下发了《关于国有资产产权变动必须进行资产评估的若干规定》，这是我国首次提及资产评估问题的政府文件。1993年中国资产评估协会成立，随着社会主义市场经济的发展，资产评估项目越来越多、规模越来越大，涉及行业越来越广，技术复杂程度也越来越高。1996年颁布了《森林资源资产评估规范(试行)》，2001年又颁布《资产评估准则――无形资产》具体准则。但目前关于生物资产价值评估的文献很少，而且部分都是从森林资源或者森林生物多样性角度进行的，尚未对生物资产有较全面和系统的研究。本文从生物资产概念、森林资源价值评估、森林生物多样性经济价值评估、作物种质资源价值评估和果园资产评估等方面进行说明。
(一)生物资产的概念2006年以前，一些专家学者们借鉴iaS、《澳大利亚自生和再生资产会计准则》和其他国家的会计准则，对生物资产的界定还没有统一的认识，2006年的《企业会计准则第5号――生物资产》，给出了生物资产的定义：生物资产指有生命的动物和植物。并将其划分为消耗性生物资产、生产性生物资产和公益性生物资产。为了研究方便可将生物资产划分不同种类：按其生物学特性分为动物和植物；按其生长周期长短分为一年生生物和多年生生物；按价值转移方式的小同，分为消耗性生物资产和生产
性生物资产；还可划分为成熟生物资产和未成熟生物资产(何梦圆、马慧，2006)。
另外，我国学者在会计核算基础上总结出生物资产和其他资产相比，具有下列基本特性：一是生物资产形成的特殊性。一般资产完全是依靠人们的生产劳动取得的，而生物资产是通过人的劳动和生物自身的生长、发育过程相互作用形成的。生物资产的价值形成除凝结有人类劳动以外，自然力作用的生长、发育会形成其增值；生物资产的经营受自然规律的制约，遵循自然规律，生物资产就会顺利地生长、发育，不断再生，反之则会消亡，失去其价值。二是生物资产的多样性。生物资产的种类繁多，这使其各自的生长、发育特点差异很大，增加了计价难度。三是生物资产经营周期的既定性。生物资产的投人、生产、经营、回收的周期完全决定于生物的生命周期，不同于工业生产周期以及资产价值转化的周期可人为控制。生物资产的这些特点决定了生物资产会计处理的特殊性和复杂性。
(二)资源类价值评估资源类的价值评估主要包括以下方面：
(1)森林资源价值评估。我国资产评估协会尚未制定有关生物资产价值评估的相关规定，1996由原国家国有资产管理局和林业部制定《森林资源资产评估规范(试行)》(以下简称《规范》)，以适应我国森林资源资产评估事业的发展，规范森林资源资产评估工作，保护森林资源资产所有者、经营者和使用者的合法权益。依据《中华人民共和国森林法》、《国有资产评估管理办法》和《林业部、国有资产评估管理局的通知》等有关文件制定的，具体规定了森林资源资产的评估程序和基本方法，对林木资产评估、林地资产评估、森林景观资产评估及整体林业企事业资产评估作了详细规定，规范了森林资源资产评估行为。按照大范围森林资源包含的经济林也属于生物资产的范畴，此《规范》中指出了森林资源中林木、林地、森林景观及整体林业企事业的评估程序和评估方法。
侯元兆等(2005)第一次比较全面地评估了中国森林资源价值，核算出了生态服务价值，即涵养水源、防风固沙和净化大气的经济价值三项生态服务价值，首次得出了森林的这三项环境价值远大于立木价值的结论.并在此基础上进一步完善了森林资源价值核算的理论。王强(2006)按照森林资源资产的特殊性，以及影响森林资源资产价值因素的复杂性，详尽的介绍了各类森林资源资产的具体评估方法，包括市场成交价比较法、市场价倒算法、年净收益现值法、年金资本化法、收获现值法、重置成本法、序列工数法、历史成本调整法，重点介绍了运用收益现值法时应考虑的折现率问题和质量调整系数。该项研究中还按照不同种类介绍了各评估方法的应用，其中林木资产评估中从用材林、经济林、竹林、防护林和特护林方面，详细介绍了评估方法的应用及评估时涉及的影响因素。何梦圆、马慧(2006)研究指出，按照生物资产的特征，消耗性生物资产采用重置成本法和市场倒摊法进行评估，生产性生物资产按照生长阶段确定评估方法。邹继昌(2006)采用收益现值法对用材林林木资产进行评估，给出了评估参数及评估公式，说明了采用收益现值法的理论依据。谢德新(2006)提出了经济林按照生长阶段产前期、始产期、盛产期和衰产期进行评估，指出成本法主要适合于产前期，市场法理论上适合于任何长阶段，但现阶段因前提条件不具备限制了这一方法在经济林资产评估实践中的实际应用。经济林的收益年限在整个经济林寿命中所占比重最大，故经济林的资产评估主要以收益法为主。
(2)森林生物多样性经济价值评估。北京大学教授张颖开创性地利用市场价格法、机会成本法和支付意愿法，对我国森林生物多样性的价值进行核算，得出了我国森林生物多样性价值的成果。吴火和(2006)研究认为，针对森林生物多样性资产的不同价值需要采用不同的计量评估方法，主要采用市场价格法、替代市场法和模拟市场法(假想市场法)。为提高评估的效率和评估结果的准确性与可信度，在综述了国内外生物多样性信息系统研究和应用进展的基础上，尝试设计了基于专家知识的智能型森林生物多样性资产价值评估专家辅助系统(eSeFBa)。而且文献还列举了龙栖山自然保护区森林生物多样性生物资产类价值评估，从木材生产价值评估和林副产品生产价值评估角度对直接实物资源资产进行评估，其中林副产品采用的是市场价值法。李银霞(2002)以祁连山自然保护区为例，从直接使用价值评估方法和间接使用经济价值评估方法两方面对森林生物多样性经济价值评估进行论述。
(3)作物种质资源价值评估。作物种质资源又称作物遗传资源，是生物多样性的重要组成部分。朱彩梅(2006)在对作物种质资源的价值概念、价值属性、价值特点、价值分类、价值内涵以及价值评估方法系统研究的基础上，系统地探讨了作物种质资源的价值构成分类及其评价方法，提出了作物种质资源价值评估的原则和依据。其中涉及资产评估基本方法――市场法的应用。
(4)果园资产评估。应容枢(1998)在对果园调查研究基础上，根据果园的特征、经营果园面临的行业风险和涉及到的果园时间价值补偿因素，得出果园应采用重置成本法和收益现值法。
从以上对国内的生物资产价值评估研究现状的分析可以看到，对于生物资产的概念界定问题从会计上已基本达成共识。由于研究问题的方式、方法的不同，对生物资产的分类还是还存在争论。我国目前还没有完整的农业资产评估准则，就生物资产的角度，对植物经济价值的评估的文献还是较多的，具体有经济林及林副产品，但没有涉及到其它植物，如蔬菜、经济作物、粮食作物的评估方法及影响因素。并且对动物的评估理论与方法的研究较少。
生物多样性的研究方法篇5
【关键词】语言规划；语言政策；语言生态；语言多样性
0背景
从美国语言学家Haugen1959年第一次提出语言规划（Languageplanning）至今，这个学科的发展也有近50年的历史了。[1]伴随着全球化所带来的种种语言问题，如何在继承语言规划研究者几十年来研究成果的基础上，寻求更适宜的语言规划架构，是摆在研究者面前的一项迫切任务。从一些学者对语言规划的定义可以看出，从20世纪90年代起，语言规划领域的学者对语言生态和语言多样性的关注越来越多，有学者认为所有“语言问题”的共同核心是多样性，因此语言政策的根本使命是多样性的管理。mühlh・usler[2]认为：按照生态学的观点，语言规划已不再是一种流水线式的作业过程，而是一种旨在保持人类交际系统最大多样性的活动。刘海涛[3]总结了20世纪90年代以来人们对语言规划的新的认识，其中的“语言规划是对语言多样性的一种人工调节；语言规划不是要消灭语言的多样性，而是要保护这种多样性；语言规划也应该考虑受众的感受，考虑规划行为对整体语言生态系统的影响”都反映出语言生态的研究已经成为语言规划研究的重点问题。
1生态语言学的发展
从20世纪70年代起，随着全球环境的恶化，人们对环境的关注与日俱增。人口的急剧增长、现代社会和经济的发展、环境的污染、不合理的资源开发导致生态环境遭受到了前所未有的破坏，全球物种灭绝速度加快，生物物种及遗传资源多样性损失严重，许多生物物种濒危。许多语言学领域的学者和专家开始试图从语言学的角度来探讨语言与生态的关系，以语言多样性为核心思想的语言生态观越来越引起语言学家的关注和重视。生态语言学在这种背景下应运而生。
生态语言学（eco-linguistics，简称eL），又称语言生态学（ecologyoflanguage），是语言学和生态学结合而形成的语言研究新兴领域。“语言生态”是指特定语言与所在族群、社会、文化及各种环境相互依存、相互作用的生存发展状态。[4]mühlhaüsler[2]指出，语言环境涉及语言与现实世界和环境问题之间的相互关系，以及语言多样性的重要性等方面；世界上现存的各种语言构成了语言生态。[4]Haugen[5]在《语言生态学》一文中提出要“研究任何特定语言与环境之间的相互作用关系”，他的语言生态隐喻学说奠定了语言生态学研究的主流模式。1990年，m.Halliday在国际应用语言学会议上强调语言学家不可忽视语言在生态问题中的作用，语言研究者对语言和环境的关系问题应当作出新的思考，从此产生了生态语言学的另一研究范式。奥地利生态语言学家Fill[6]认为Haugen[5]与Halliday的论文引出了人们对生态语言学研究的两种方法：一种是把生态学作为一种隐喻来理解，也就是说把生态学理解为环境中的语言，这种方法关注语言与生物多样性的研究，着力于调查、记录及拯救地球上濒危的语言；另一种是从生物的角度来看待生态学，认为语言在环境发展与环境恶化问题上的作用和影响是不难发现的，而对环境问题进行语言研究是一种可行的办法。在随后数年中，又有不少学者、专著探讨此方面的问题，如，生态语言学读本：语言、生态和环境（Fill&mühlh・usler）[7]；语言规划与语言生态：语言规划的当前问题（Liddicoat&Bryant）；语言进化的生态学（mufwene）；语言生态（palmer）；语言规划与语言生态（mühlh・usler）[8]；生态语言学研究发展状况及未来的展望（Fill，1996）；对语篇的生态批评分析（Jung，2001；Gerbig，1993；mühlh・usler，1996）等等。在诸多论著中，1997年，Kaplan和Baldauf的《语言规划：从实践到理论》[9]一书是对语言生态的研究贡献最大的著作之一。该书在考察现有各种语言规划理论和实践的基础上，提出了语言规划的生态观。本书当中的诸多变量是描述语言状况时应该考虑的关键因素，如，“语言消亡”、“语言变化和语言扩散”、“语言融合”、“语言接触”等。最后作者还提出了语言规划的生态模型，并且用生态理论分析了澳大利亚、马来西亚等多个国家的语言生态系统，这对于其他国家语言生态系统的描述，有较大的借鉴意义。这两位作者2003年所著的《太平洋地区语言和语言教育规划》[10]一书的第12章对语言生态的模型又进行了充分的描述。国内方面，许多学者对语言生态也给予了很大的关注。
2基于生态思想的语言规划研究
从20世纪90年代起，语言规划领域的学者对语言生态和语言多样性的关注越来越多，从生态学的视角研究语言规划成为一种新的研究思路。在语言生态思想的视角下，语言规划被看作是与自然生态因素和文化生态因素息息相关的一个过程，它关注的是如何确定这些维持语言多样性的生态因素和保持语言多样性最大化的问题。因此，语言多样性被看作是保持文化多样性和生态多样性的前提。基于生态思想的语言规划，简称生态语言规划（ecologicallanguageplanning）的重要任务是调查语言和其他参数之间的生态链接以减少语言问题的发生。因此，生态语言规划的最终目标是加强对特定生态环境中的语言多样性和这些语言之间链接的系统和环境的支持，达到一种生态的平衡而不再需要任何管理。
基于生态思想的语言规划和以往的语言规划研究是不同的。生态语言规划与传统语言规划的不同主要体现在两点，第一，规划的目标，多样性而非仅仅标准化；第二，规划的方式，集体参与胜过于专家管理。传统的地位规划关注的是个体语言的等级地位，生态地位规划（ecologicalstatusplanning）的目标在于达到不同语言地位之间的最大平衡；传统的本体规划更重视个别语言系统的标准和规范问题，而生态本体规划（ecologicalcorpusplanning）关心的不仅仅是语言的标准化问题。[11]生态视角下的语言规划还具备以下一些特点：不仅仅考虑系统内部的因素，更重视外部环境；对单一文化主义危险的认识；对自然和人力资源限制的认识；长远的眼光；对促进健康生态的因素的认识。
作为应用语言学的一个分支学科，语言规划研究时常受现代语言学中结构和生成学派假设的约束，生态语言学的出现为语言规划的发展提供了新的视角和机会，学者可以从生态学的视角重新审视以往语言规划的实践，同时针对语言问题提供了更全面更丰富的解决办法。
然而，在研究过程中，我们发现以往的语言生态研究常常出现定量不足的情况，没有形成真正的生态模型，大部分的研究都属于定性研究，仅仅借用生态的说法，而没有借助统计的研究方法。abramdeSwaan在《世界上的语言-全球语言系统》[12]中介绍了语言的Q值理论，描写了一种语言获得核心地位的过程，Q值恰当地标示出了一种语言在整个语群中的地位，可以简便地显示语言大致的交际价值。以往语言学习者对于语言的取舍仅仅依靠的是印象、直觉或第三方建议，而不是建立在充分的数据分析的基础之上。目前，关于语言技能分布的统计数据还不够充分和精确，几乎所有国家的语言技能数据都很匮乏，无法进行更细致的计算。根据现有数据计算出来的Q值在很大程度上是有说服力的。abramdeSwaan不仅提出了决定Q值的两个因素，即语言的流行度和中心度，还给出了计算一种语言交际价值的公式。这套Q值理论告诉我们，人们很可能会选择学习最能提高他们言语库Q值的语言，从而导致某些语言（如英语）的地位越来越高，而另外一些语言的地位越来越低，直至最终被使用者弃用。与此同时，人们也应该注意到，要想使自己的语言成为具有高交际价值的语言，当务之急就是要提高该语言的Q值。williamJ.Sutherland在nature上发表的文章parallelextinctionriskandglobaldistributionoflanguagesandspecies[13]中利用相关数据和函数关系分析了语言多样性和生物多样性（以鸟类和哺乳动物类为例）与人口规模、地域面积、所处纬度、森林面积、海拔高度等因素的比例关系。语言、鸟类和哺乳动物类在人口规模大、地域面积大、森林面积大、海拔高度高、所处纬度低、多山等情况下显示出更强的多样性。通过对鸟类和语言的威胁的对比，Sutherland得出的结论是，当前语言面临的威胁远远严重于鸟类。有记录的濒危语言已经非常多，在世界上的357种语言的使用者已分别不到50人。Sutherland利用数据分析出语言使用的下降率和人口规模成反比，使用频率和交际地位较低的语言将会越来越不被重视，直至消亡，因为当语言成为稀有语言时，就不再具有吸引语言学习者学习的能力，使用和学习这种语言的人将会越来越少。最后，他还指出尽管语言濒危的国家或地区伴随有更大的生物濒危的可能性，而且语言多样性和生物多样性的模式几近相同，但造成二者威胁的原因却是有所差异的。
通过对该方面研究情况的梳理，可以看出，该研究在理论研究，即定性研究方面已经取得了一定的进展，但在定量研究和采用统计研究方法方面还存在很大不足。以上两位学者新颖的研究模式值得借鉴。
3结语
综上，生态语言学已成为语言学界尤其是语言规划领域研究的重点。目前，众多学者们对生态语言学的研究多集中在濒危语言的研究方面，语言多样性与生物多样性的关系方面，以及语言人权问题等方面。生态语言学是一门新兴学科，也是一门应用型学科，它关系到人类的长远发展，它的发展越来越清楚地表明这是一个值得探索的研究领域。
结合语言规划的相关理论和语言规划的生态学框架，本文从语言生态思想的起源、发展、影响等多个角度，阐述这个学科的发展进程，作者认为从生态学视角研究语言规划、解决语言问题是一种行之有效的研究方法。针对定量研究和采用统计研究方法方面存在不足的情况，abramdeSwaan和williamJ.Sutherland的著述给我们展示了研究语言生态的新视角和重要方法，告诉我们应该借助统计的方法和实际数据来分析语言的发展和变化，如针对某种语言建立跟踪观察记录的机制，随时间的发展和统计的数据来分析该语言在不同时期和不同语群中所受到的（或给予别的语言的，或相互之间的）影响和威胁。最终通过对多种语言的综合分析，形成一套集实施、评估和修订于一体的语言生态分析框架和研究方法。这样，我们就可以更好地理解各种因素对于语言规划行为的影响，以及对被规划语言发展的影响等。这些是当前研究语言生态问题所急需的。
【参考文献】
[1]刘海涛.语言规划的生态观――兼评《语言规划：从实践到理论》[m].北华大学学报，2007：51.
[2]mühlhusler，p.Languageofenvironment，environmentofLanguage：aCourseinecolinguistics[m].London&newYork：paul&CopubConsortium，2003.
[3]刘海涛.语言规划和语言政策：从定义变迁看学科发展[m]//陈章太，主编.语言规划的理论与实践.北京：语文出版社，2006：55-60.
[4]范俊军.生态语言学研究述评[J].外语教学与研究，2005：110-115.
[5]Haugen，e.theecologyoflanguage[C]//inFill&mühlhusler（eds.），2001.
[6]Fill，a.ecolinguistics―Stateoftheart1998[C]//a.Fill&p.mühlhusler（eds.），2001.
[7]Fill，a.&p.mühlhusler.theecolinguisticsReader：Language，ecologyandenvironment[m].LondonandnewYork：Continuum，2001.
[8]mühlhusler，p.LanguageplanningandLanguageecology[C]//CurrentissuesinLanguageplanning，2000，1（3）.
[9]Kaplan，R.B.&Baldauf，R.B.Jr..Languageplanning：Frompracticetotheory[m].philadelphia：multilingualmatters，1997.
[10]Kaplan，R.B.&Baldauf，R.B.Jr..LanguageandLanguage-in-educationplanninginthepacificBasin[m].Dordrecht：Kluweracademic，2003.
[11]mühlhusler，p.Linguisticecology：Languagechangeandlinguisticimperialisminthepacificregion[m].London：Routledge，1996.
生物多样性的研究方法篇6
关键词海洋生物技术发展展望
近10年来，由于海洋在沿海国家可持续发展中的战略地位日益突出，以及人类对海洋环境特殊性和海洋生物多样性特征的认识不断深入，海洋生物资源多层面的开发利用极大地促进了海洋生物技术研究与应用的迅速发展。1989年首届国际海洋生物技术大会（以下简称mps大会）在日本召开时仅有几十人参加，而1997年第四届imbc大会在意大利召开时参加入数达1000多人。现在imbc会议已成为全球海洋生物技术发展的重要标志，出现了火红的局面。《imbc2000》在澳大利亚刚刚开过，《imbc2003》的筹备工作在日本已经开始，以色列为了举办们《imbc2006》早早作了宣传，并争到了举办权。每3年一届的imbc不仅吸引了众多高水平的专家学者前往展示与交流研究成果，探讨新的研究发展方向，同时也极大地推动了区域海洋生物技术研究的发展进程。在各大洲，先后成立了区域性学术交流组织，如亚太海洋生物技术学会、欧洲海洋生物技术学会和泛美海洋生物技术协会等。各国还组建了一批研究中心，其中比较著名的为美国马里兰大学海洋生物技术中心、加州大学圣地亚哥分校海洋生物技术和环境中心，康州大学海洋生物技术中心，挪威贝尔根大学海洋分子生物学国际研究中心和日本海洋生物技术研究所等。这些学术组织或研究中心不断举办各种专题研讨会或工作组会议研究讨论富有区域特色的海洋生物技术问题。1998年在欧洲海洋生物技术学会、日本海洋生物技术学会和泛美海洋生物技术协会的支持下，原《海洋生物技术杂志》与《分子海洋生物学和生物技术》合刊为《海洋生物技术》学报（以下简称mbt），现在它已成为一份具有权威性的国际刊物。海洋生物技术作为一个新的学科领域已明确被定义为“海洋生命的分子生物学如细胞生物学及其它的技术应用”。
为了适应这种快速发展的形势，美国、日本、澳大利亚等发达国家先后制定了国家发展计划，把海洋生物技术研究确定为21世纪优先发展领域。1996年，
表1近期imbc大会研讨的主要内容
表2近期imbc大会和《marinebiotechnology》学报论文统计表
1.3保证海洋环境可持续利用是海洋生物技术研究应用的另一个重要方面
利用生物技术保护海洋环境、治理污染，使海洋生态系统生物生产过程更加有效是一个相对比较新的应用发展领域，因此，无论是从技术开发，还是产业发展的角度看，它都有巨大的潜力有待挖掘出来。目前已涉及到的研究主要包括生物修复（如生物降解和富集、固定有毒物质技术等）、防生物附着、生态毒理、环境适应和共生等。有关国家把“生物修复”作为海洋生态环境保护及其产业可持续发展的重要生物工程手段，美国和加拿大联合制定了海洋环境生物修复计划，推动该技术的应用与发展。
1.4与海洋生物技术发展有关的海洋政策始终是公众关注的问题
其中海洋生物技术的发展策略、海洋生物技术的专利保护、海洋生物技术对水产养殖发展的重要性、转基因种类的安全性及控制问题、海洋生物技术与生物多样性关系以及海洋环境保护等方面的政策、法规的制定与实施倍受关注。
2.重点发展领域
当前，国际海洋生物技术的重点研究发展领域主要包括如下几个方面：
2.1发育与生殖生物学基础
弄清海洋生物胚胎发育、变态、成熟及繁殖各个环节的生理过程及其分子调控机理，不仅对于阐明海洋生物生长、发育与生殖的分子调控规律具有重要科学意义，而且对于应用生物技术手段，促进某种生物的生长发育及调控其生殖活动，提高水产养殖的质量和产量具有重要应用价值。因此，这方面的研究是近年来海洋生物技术领域的研究重点之一。主要包括：生长激素、生长因子、甲状腺激素受体、促性腺激素、促性腺激素释放激素、生长一催乳激素、渗透压调节激素、生殖抑制因子、卵母细胞最后成熟诱导因子、性别决定因子和性别特异基因等激素和调节因子的基因鉴定、克隆及表达分析，以及鱼类胚胎于细胞培养及定向分化等。
2.2基因组学与基因转移
随着全球性基因组计划尤其是人类基因组计划的实施，各种生物的结构基因组和功能基因组研究成为生命科学的重点研究内容，海洋生物的基因组研究，特别是功能基因组学研究自然成为海洋生物学工作者研究的新热点。目前的研究重点是对有代表性的海洋生物（包括鱼、虾、贝及病原微生物和病毒）基因组进行全序列测定，同时进行特定功能基因，如药物基因、酶基因、激素多肽基因、抗病基因和耐盐基因等的克隆和功能分析。在此基础上，基因转移作为海洋生物遗传改良、培育快速生长和抗逆优良品种的有效技术手段，已成为该领域应用技术研究发展的重点。近几年研究重点集中在目标基因筛选，如抗病基因、胰岛素样生长因子基因及绿色荧光蛋白基因等作为目标基因；大批量、高效转基因方法也是基因转移研究的重点方面，除传统的显微注射法、基因枪法和精子携带法外，目前已发展了逆转录病毒介导法，电穿孔法，转座子介导法及胚胎细胞介导法等。
2.3病原生物学与免疫
随着海洋环境逐渐恶化和海水养殖的规模化发展，病害问题已成为制约世界海水养殖业发展的瓶颈因子之一。开展病原生物（如细菌、病毒等）致病机理、传播途径及其与宿主之间相互作用的研究，是研制有效防治技术的基础；同时，开展海水养殖生物分子免疫学和免疫遗传学的研究，弄清海水鱼、虾、贝类的免疫机制对于培育抗病养殖品种、有效防治养殖病害的发生具有重要意义。因此，病原生物学与免疫已成为当前海洋生物技术的重点研究领域之一，重点是病原微生物致病相关基因、海洋生物抗病相关基因的筛选、克隆，海洋无脊椎动物细胞系的建立、海洋生物免疫机制的探讨、dna疫苗研制等。
2.4生物活性及其产物
海洋生物活性物质的分离与利用是当今海洋生物技术的又一研究热点。现人研究表明，各种海洋生物中都广泛存在独特的化合物，用来保护自己生存于海洋中。来自不同海洋生物的活性物质在生物医学及疾病防治上显示出巨大的应用潜力，如海绵是分离天然药物的重要资源。另外，有一些海洋微生物具有耐高温或低温、耐高压、耐高盐和财低营养的功能，研究开发利用这些具特殊功能的海洋极端生物可能获得陆地上无法得到的新的天然产物，因而，对极端生物研究也成为近年来海洋生物技术研究的重点方面。这一领域的研究重点包括抗肿瘤药物、工业酶及其它特殊用途酶类、极端微生物中特定功能基因的筛选、抗微生物活性物质、抗生殖药物、免疫增强物质、抗氧化剂及产业化生产等。
2.5海洋环境生物技术
该领域的研究重点是海洋生物修复技术的开发与应用。生物修复技术是比生物降解含义更为广泛，又以生物降解为重点的海洋环境生物技术。其方法包括利用活有机体、或其制作产品降解污染物，减少毒性或转化为无毒产品，富集和固定有毒物质（包括重金属等），大尺度的生物修复还包括生态系统中的生态调控等。应用领域包括水产规模化养殖和工厂化养殖、石油污染、重金属污染、城市排污以及海洋其他废物（水）处理等。目前，微生物对环境反应的动力学机制、降解过程的生化机理、生物传感器、海洋微生物之间以及与其它生物之间的共生关系和互利机制，抗附着物质的分离纯化等是该领域的重要研究内容。
3.前沿领域的最新研究进展
3.1发育与生殖调控
应用gih（性腺抑制激素）和gsh（性腺刺激激素）等激素调控甲壳类动物成熟和繁殖的技术[1]，研究了甲状腺激素在金绍生长和发育中的调控作用，发现甲状腺激素受体mrna水平在大脑中最高，在肌肉中最低，而在肝、肾和鳃中表达水平中等，表明甲状腺素受体在成体金银脑中起着重要作用[1]，对海鞘的同源框（homeobox）基因进行了鉴定，分离到30个同源框基因[1]，建立了青鳉的同源框（homeobox）基因[1]，建立了青鳉胚胎干细胞系并通过细胞移植获得了嵌合体青鳉[1]，建立了虹鳟原始生殖细胞培养物并分离出vasa基因[2]，进行斑节对虾生殖抑制激素的分离与鉴定[2]，应用受体介导法筛选gnrh类似物，用于鱼类繁殖[2]，建立了海绵细胞培养技术，用于进行药物筛选[2]，建立了将海胆胚胎作为研究基因表达的模式系统[2]，通过基因转移开展了海胆胚胎工程的研究[2]，研究了人葡糖转移酶和大鼠已糖激酶cdna在虹鳟胚胎中的表达［3］，建立了通过细胞周期蛋白依赖的激酶活性测定海水鱼苗细胞增殖速率的方法[3]，研究了几丁质酶基因在斑节对虾蜕皮过程中的表达［4］，从海参分离出同源框基因，并进行了序列的测定[4]。
3.2功能基因克隆
建立了牙鲆肝脏和脾脏mrna的表达序列标志，从深海一种耐压细菌中分离到压力调节的操纵子，从大西洋鲑分离到雌激素受体和甲状腺素受体基因，从挪威对虾中分离到性腺抑制激素基因[1]；将dna微阵列技术在海绵细胞培养上进行了应用，构建了班节对虾遗传连锁图谱，建立了海洋红藻est，从海星卵母细胞中分离出成熟蛋白酶体的催化亚基，初步表明硬骨头鱼类igf－i原e一肽具有抗肿瘤作用[2]；构建了海洋酵母de—baryomyceshansenii的质粒载体，从鲤鱼血清中分离纯化出蛋白酶抑制剂，从兰蟹血细胞中分离到一种抗菌肽样物质，从红鲍分离到一种肌动蛋白启动子，发现依赖于细胞周期的激酶活性可用作海洋鱼类苗种细胞增殖的标记，克隆和定序了鳗鱼细胞色素p4501acd－na，通过基因转移方法分析了鳗细胞色素p450iai基因的启动子区域，分离和克隆了鳗细胞色素p450iai基因，建立了适宜于沟绍遗传作图的多态性est标记，构建了黄盖鲽est数据库并鉴定出了一些新基因，建立了班节对虾一些组织特异的est标志，从经hiramerhabdovirus病毒感染的牙鲆淋巴细胞est中分离出596个cdna克隆[3]；用pcr方法克隆出一种自体受精雌雄同体鱼类的ß一肌动蛋白基因，从金鲷cdna文库中分离出多肽延伸因子ef－2cdna克隆，在湖鳟基因组中发现了tc1样转座子元件[4]；鉴定和克隆出的基因包括：南美白对虾抗菌肽基因、牡蛎变应原（allergen）基因、大西洋鳗和大西洋鲑抗体基因、虹鳟vasa基因、青鳉p53基因组基因、双鞭毛藻类真核启始因子5a基因、条纹鲈gth（促性腺激素）受体cdna、鲍肌动蛋白基因、蓝细菌丙酮酸激酶基因、鲤鱼视紫红质基因调节系列以及牙鲆溶菌酶基因等［1—4］。
3.3基因转移
分离克隆了大马哈鱼igf基因及其启动子，并构建了大马哈鱼igf（胰岛素样生长因子）基因表达载体[1]。通过核定位信号因子提高了外源基因转移到斑马鱼卵的整合率[1]，建立了快速生长的转基因罗非鱼品系并进行了安全性评价；对转基因罗非鱼进行了三倍体诱导，发现三倍体转基因罗非鱼尽管生长不如转基因二倍体快，但优于未转基因的二倍体鱼，同时，转基因三倍体雌鱼是完全不育的，因而具有推广价值[2]；研究了超声处理促进外源dna与金鲷精子结合的技术方法，将gfp作为细胞和生物中转基因表达的指示剂；表明转基因沟鲶比对照组生长快33％，且转基因鱼逃避敌害的能力较差，因而可以释放到自然界中，而不会对生态环境造成大的危害[3]；应用gfp作为遗传标记研究了斑马鱼转基因的条件优化和表达效率[3]；在抗病基因工程育种方面，构建了海洋生物抗菌肽及溶菌酶基因表达载体并进行了基因转移实验[2]；在转基因研究的种类上，目前已从经济养殖鱼类逐步扩展到养殖虾、贝类及某些观赏鱼类[2.3]。通过基因枪法将外源基因转到虹鳟肌肉中获得了稳定表达[4]。
3.4分子标记技术与遗传多样性
研究了将鱼类基因内含子作为遗传多样性评价指标的可行性，应用sscp和定序的方法研究了大西洋和地中海几种海洋生物的遗传多样性[1]。研究了南美白对虾消化酶基因的多态性[1]；利用寄生性原生动物和有毒甲藻基因组dna的间隔区序列作标记检测环境水体中这些病原生物的污染程度，应用18s和5.8s核糖体rna基因之间的第一个内部间隔区(itc—1)序列作标记进行甲壳类生物种间和种内遗传多样性研究[2]；研究了斑节对虾三个种群的线粒体dna多态性，用pcr技术鉴定了夏威夷gobioid苗的种类特异性。通过测定内含子序列揭示了南美白对虾的种内遗传多样性，采用同功酶、微卫星dna及rapd标记对褐鳟不同种群的遗传变异进行了评价，在平鱼鉴定并分离出12种微卫星dna，在美国加州鱿鱼上发现了高度可变的微卫星dna[3]；弄清了一种深水鱼类（gonostomagracile）线粒体基因组的结构，并发现了硬骨鱼类trna基因重组的首个实例，测定了具有重要商业价值的海水轮虫的卫星dna序列，用rapd技术在大鲮鲆和鳎鱼筛选到微卫星重复片段，从多毛环节动物上分离出高度多态性的微卫星dna，用rapd技术研究了泰国东部泥蟹的遗传多样性[3]；用aflp方法分析了母性遗传物质在雌核发育条纹鲈基因组中的贡献[4]。
3.5dna疫苗及疾病防治
构建了抗鱼类坏死病毒的dna疫苗[1]；开展了虹鳟ihnvdna疫苗构建及防病的研究，表明用编码ihnv糖蛋白基因的dna疫苗免疫虹鳟，诱导了非特异性免疫保护反应，证明dna免疫途径在鱼类上的可行性，从虹鳟细胞系中鉴定出经干扰素可诱导的蛋白激酶[2]；建立了养殖对虾病毒病原检测的elisa试剂盒，用pcr等分子生物学技术鉴定了虾类的病毒性病原，将鱼类的非特异性免疫指标用于海洋环境监控，研究了抗病基因转移提高鲷科鱼类抗病力的可行性，研究了蛤类唾液酸凝集素的抗菌防御反映[2]；研究了一种海洋生物多糖及其衍生物的抗病毒活性[3]；建立了测定牡蛎病原的pcr—elisa方法[3]；研究了latrunculinb毒素在红海绵体内的免疫定位[4]。
3.6生物活性物质
从海藻中分离出新的抗氧化剂[1]，建立了大量生产生物活性化合物的海藻细胞和组织培养技术，建立了通过海绵细胞体外培养制备抗肿瘤化合物的方法[1]；从不同生物（如对虾和细菌）中鉴定分离出抗微生物肽及其基因，从鱼类水解产物中分离出可用作微生物生长底物的活性物质，海洋生物中存在的抗附着活性物质，用血管生成抑制剂作为抗受孕剂，从蟹和虾体内提取免疫激活剂，从海洋藻类和蓝细菌中纯化光细菌致死化合物，海星抽提物在小鼠上表现出批精细胞形成的作用，从海洋植物zosteramarina分离出一种无毒的抗附着活性化合物，从海绵和海鞘抽提物分离出抗肿瘤化合物，开发了珊瑚变态天然诱导剂，从海胆中分离出一种抗氧化的新药，在海洋双鞭毛藻类植物中鉴定出长碳链高度不饱和脂肪酸（c28），表明海洋真菌是分离抗微生物肽等生物活性化合物的理想来源[2]；发现海洋假单胞杆菌的硫酸多糖及其衍生物具有抗病毒活性，从硬壳蛤分离出谷光甘肽一s一转移酶，从鲤血清中分离出丝氨酸蛋白酶抑制剂，从海绵中分离出氨激脯氨酸二肽酶，从一种珊瑚分离出具dna酶样活性的物质，建立了开放式海绵养殖系统，为生物活性物质的大量制备提供了充足的海绵原料[3]；从虾肌水解产物中分离到抗氧化肽物质[4]；从一种海洋细菌中分离纯化出n一乙酸葡糖胺一6一磷酸脱乙酸酶[4]。
3.7生物修复、极端微生物及防附着
研究了转重金属硫蛋白基因藻类对海水环境中重金属的吸附能力，表明明显大于野生藻类[1]，研究了石油降解微生物在修复被石油污染的海水环境上的可疗性及应用潜力[1]；研究了海洋磁细菌在去除和回收海水环境中重金属上的应用潜力[1]；用bacillus清除养鱼场污水中的氮，用分子技术筛选作为海水养殖饵料的微藻，开发了六价铬在生物修复上的应用潜力，分离出耐冷的癸烷降解细菌，研究了海洋环境中多芳香化烃的微生物降解技术[2]；从噬盐细菌分离出渗透压调节基因，并生产了重组ectoine（渗透压调节因子），从2650米的深海分离到一种耐高温的细菌，这种细菌可用来分离耐高温和热稳定的酶，在耐高温的archaea发现了d型氨基酸和无氧氨酸消旋酶，测定了3种海洋火球菌的基因组dna序列，借助于cross／blast分析进行了特定功能基因的筛选，从海底沉积物、海水和北冰洋收集了1000多种噬冷细菌，并从这些细菌中分离到多种冷适应的酶[2]；建立了一种测定藤壶附着诱导物质的简单方法，研究了chlorophyta和共生细菌之间附着所必需的形态上相互作用，研究了珊瑚抗附着物质（dterpene）类似物的抗附着和麻醉作用[3]；分析了海岸环境中污着的起始过程，并对沉积物和附着物的影响进行了检测[4]。
4．展望与建议
生物多样性的研究方法篇7
代谢组学研究的是生物体系受到内在和外在因素刺激产生的内源性代谢变化，可以对那些能描述代谢循环情况的关键化合物进行定性和定量分析。近几年来，代谢组学已经成为生命科学领域一个重要的、有价值的工具，并在不断创新的分析技术推动下稳步发展。虽然代谢组学本身还存在一些不足，但许多研究者以解决问题为出发点，提出了一些新的研究策略、方法和技术。代谢组学发展呈现出整合一体化，定量化和标准化的趋势。本文对代谢组学的概况，现在的发展情况和未来的趋势进行综述。【关键词】 代谢组学研究策略分析方法综述
1 代谢组学的概况
代谢组学(metabonomics)是以组群指标分析为基础,以高通量检测和数据处理为手段,以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支，是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后系统生物学的另一重要研究领域,它是研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢产物变化的科学，所关注的是代谢循环中分子量小于1000的小分子代谢物的变化,反映的是外界刺激或遗传修饰的细胞或组织的代谢应答变化[1]。代谢组学的概念最早来源于代谢轮廓分析[2]。nicholson研究小组于1999年提出了代谢组学的概念[1],并在疾病诊断、药物筛选等方面做了大量的卓有成效的工作[3～5]。fiehn等[6]提出了metabolomics的概念,第一次把代谢产物和生物基因的功能联系起来,之后很多植物化学家开展了植物代谢组学的研究,使得代谢组学得到了极大的充实,同时也形成了当前代谢组学的两大主流领域:metabolomics和metabonomics。经过不断发展，fiehn[6,7]、allen[8]、nielsen[9],villasboas[10,11]等确定了代谢组学一些相关层次的定义，已被学术界广泛接受。第一个层次为靶标分析，目标是定量分析一个靶蛋白的底物和/或产物；第二个层次为代谢轮廓分析，采用针对性的分析技术,对特定代谢过程中的结构或性质相关的预设代谢物系列进行定量测定；第三个层次为代谢指纹/足印，定性并半定量分析细胞外/细胞内全部代谢物；第四个层次为代谢组学，定量分析一个生物系统全部代谢物，但目前还难以实现。
作为应用驱动的新兴科学,代谢组学已在药物毒性和机理研究[12，13]、微生物和植物研究[14]、疾病诊断和动物模型[15，16]、基因功能的阐明[17]等领域获得了较广泛地应用。近来,代谢组学又在中药成分的安全性评价[18]、药物代谢的分析[19]、毒性基因组学[20]、营养基因组[21]、药理代谢组学[22～24]、整合药物代谢和系统毒理学[25,26]等研究方面取得了新的突破和进展。
完整的代谢组学分析的流程包括样品的制备、数据的采集和数据的分析及解释。样品的制备包括样品的提取、预处理和化合物的分离。代谢物通常用水或有机溶剂(甲醇、己烷等)提取。分析之前,常先用固相微萃取、固相萃取、亲和色谱等方法进行预处理，用气相色谱、液相色谱、毛细管电泳等方法进行化合物的分离。预处理后,样品中的代谢产物需要通过合适的方法进行测定。色谱、质谱、磁共振、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、放射性检测、光散射等分离分析手段及其组合都在代谢组学的研究中得到应用。其中,核磁共振（nmr）技术特别是氢谱以其对含氢代谢产物的普适性,色谱以其高分离度、高通量，质谱（ms）以其普适性、高灵敏性和特异性而成为最主要的分析工具。代谢组学研究的后期需借助于生物信息学平台进行数据的分析和解释[27],解读数据中蕴藏的生物学意义。最常用的是主成分分析（pca）法和偏最小二乘（pls）法。
但在研究的几个步骤中，代谢组学还存在一些不足。例如，分析手段存在局限性；全部定量分析难以实现，准确性不足；定性过程复杂。针对这些问题，现在的研究者们在研究策略和方法上做着积极的探索和改进。本文就将综述近年来在代谢组学研究策略和方法上的最新的研究报道，并结合本实验室的研究进行展望。
2 研究策略与方法
后基因组时代众多组学的发展向分析化学提出了更高、更严峻的挑战。对代谢组学，一些关键点的把握显得尤为重要。首先，代谢组学的整体分析平台的提升是未来代谢组学研究的关键环节，这包括：新的复杂样品预处理技术；灵敏、专一、原位、动态、无损、快速的代谢物组检测、表征与操纵技术；代谢物组成、结构和功能信息获取的新型技术和完整的数据采集和成像系统；有效、快速处理代谢组海量复杂数据的新化学信息学方法以及这些技术和方法学的原始性创新、学科间交叉和多维技术联用基本理论研究等。再者，制定代谢组学标准(包括方法、信息和数据库)，以及实现代谢组与基因组、转录组和蛋白质组等数据的整合，是未来代谢组学研究的一个关键问题。针对这些关键点，代谢组学的研究策略和方法得到了新的发展。
2.1 整合一体化
由于现有的分析技术都有各自的优缺点[28],单独使用一种或少数几种已经很难满足代谢组学研究的要求。所以整合的策略已经成为一个重要的趋势，这个整合不仅包括各种技术、方法，还包括不同来源的生物样品（血液、尿液、粪便等）。可以将目前的整合策略归纳为以下几个方面。
2.1.1 分析技术的整合 这个整合包括了不同分离技术、不同的数据获取方式、不同数据分析技术等。这样可以达到分析平台优势互补，使结果更完善、准确。在这方面刘昌孝等[29～31]做了一些液相色谱和质谱联用技术与化学计量学方法结合，应用于代谢组学的研究工作，并对这方面的发展进行了综述。chen等[32]也利用了整合的思想，提出了一套完整的潜在代谢标志物从发现到定性再到生理意义说明的方法。他们将指纹谱分析、多变量分析、液相串联质谱（lcms/ms）、微制备、傅立叶离子回旋共振质谱（fticrms）、气相质谱（gcms）、数据库检索、同位素标记物比对等方法进行了整合，利用整合后的平台对糖尿病进行代谢组学分析。先用uplcms采集数据，经数据处理后寻找到潜在生物标志物，经过微制备后，再利用fticrms和gcms进行分析，得到精确分子量和气相保留指数，再结合碎片分析，通过查询数据库最终确定标志物的组成及结构。再通过同位素标记物的比对，最终明确此化合物并进行了生理意义的说明。这个方法适用于所有进行代谢组学研究的体系，能使标志物的鉴定更为可靠和令人信服，为潜在标志物的寻找提供了一套标准有效的操作流程。还有人研究了多种离子化方式对代谢组学研究结果的影响[33]，发现单用电喷雾离子源（esi）的负离子模式比正负离子模式相结合少了90%的离子量，结合大气压化学电离（apci）后，离子量多了20%，而结合esi、apci、基质辅助激光解析电离（maldi）和多孔硅表面解吸离子化（dios）后，离子量提高了一倍，这在一定程度上代表信息量的增加。此外，亲和液相色谱、反相液相色谱和气相色谱的整合[34，35]、nmr与ms的整合[35]、不同填料色谱柱（如：c8、c18、苯基柱）的整合研究[36]都有报道。对于无商品化和不易得到标准品的物质,lee等[37]在定性分析中使用了绝对淌度和酸解离常数进行辅助解析，这也是整合思想的一个体现。这些研究都表明，整合策略正是现在代谢组学研究策略发展的一个重要方向。
在数据分析技术上，也体现着整合的思想。由于代谢组学分析产生的是信息量丰富的多维数据,因此，需要充分整合化学计量学和多元统计分析方法等技术，对代谢组学数据进行分析说明[38]。目前在代谢组学中运用较多的包括主成分分析、层次聚类分析(hca)、非线性影射(nlm)等非监督分类方法,以及偏最小二乘法判别分析（plsda)、k最近邻法(knn)、神经网络(nn)等监督分类方法。每一种方法都有各自特点，通过比较、整合可以得到更完整的结果。
2.1.2 数据的整合 由于样品分析手段的多样性，产生了许多不同的代谢组学数据，这需要通过数学统计方法对不同数据加以整合,crockford等[39]在进行毒理学研究时，采用了shy（statisticalheterospectroscopy）方法对nmr与ms数据进行了整合，为生物标志物的发现提供了一个系统生物学工具。另外，lcms数据和gcms数据的融合[40]等也有报道。关于数据的另外一个整合是指代谢组学数据与其它一些整体研究数据之间的整合。随着现代自然科学技术不断发展，各种基于整体的研究，如蛋白组学、代谢组学、基因组学等不断出现并相互交叉，通过整合整体研究数据[41～43]，可以更全面和深刻地阐明生物网络复杂性，准确理解代谢物与蛋白质、代谢物与基因之间的关系。廖沛球等[44]就在用代谢组学方法对硝酸钕急性生物效应进行研究时，将大鼠血清中一些重要的生化指标及组织切片光镜图分析结果与代谢组学数据结合讨论。从数据形式上,采用xml通用标记语言的质谱数据可同时适用于蛋白质组和代谢组,同时,在细胞信号通路等领域有重要作用的系统生物学标记语言sbml也正发展成xml形式[45]；有些研究也采用sysbioom数据记录平台,将pedro形式的蛋白质组数据和代谢组数据整合至mageom模式的转录组数据中[46]。组学数据整合可以通过代谢网络支架(scaffold)分析、建模方法或借用有关专业软件来实现[47]。yang等[48]利用代谢组学与蛋白组学技术，并将两者相结合来研究dna免疫调节对脂代谢的影响。在毒理分析中，spicker等[49]就用一个分级模型整合了临床化学数据，基因蛋白表达数据和其他的一些数据。由此看来，对于许多复杂的体系，单一内容的数据已经很难准确反映出体系的性质和变化，这就需要更加重视采用多种数据来共同研究问题、解释问题。这样得出的结果更全面、更准确。
2.1.3 研究对象的整合 通过整合代谢组学(integratedmetabonomics)方法，同时对机体中不同来源的生物样品(尿样、血样、组织样等)进行代谢组学分析、数据比较和综合评价，可以使代谢组学的结果更完整、更准确[50]。nicholson实验组[51]将血样、尿样和肝脏组织样品分别进行代谢组学研究，将研究结果整合来进行毒理研究，得到了更好的研究结果。saric等[52]进行了粪便代谢组学研究，研究揭示了粪便代谢组群的种类变化与肠胃功能的关系。一些研究者还对大鼠毛发进行代谢组学分析[34]，表明毛发在寻找生物标志物上也有重要作用。
2．2 定量化
从代谢组学的各个层次的定义不难看出，定量是人们追求的一个较高的目标。lee等[53]在研究壬基苯酚毒性作用时，就对比了有目标定量研究（针对雌激素、雄激素、肾上腺皮质激素）和无目标代谢指纹谱分析的结果，他们发现无目标、无准确定量的代谢组学研究结果只揭示毒性作用与作用量有关系。而有了准确定量后，毒性作用还表现出了与作用时间的相关性。代谢组学一直朝着全面定量努力。wang等[54]在代谢组学研究中就十分注重量的概念，在神经管畸形的研究中，他们根据先验知识锁定了一碳代谢循环通路，定量了11种物质，同时，也对同一样品进行代谢指纹谱分析，将定量结果加入到指纹谱结果中进行问题的说明。在糖尿病肾病研究中，整合了磷脂类、脂肪酸类、氨基酸类、核苷类和激素类五大代谢循环轮廓谱，定量了百余种物质，将这些再与指纹谱结合，将使代谢组学的研究更全面，更可信，有可能更清晰地去研究疾病的机理，达到疾病预警，指导并评价治疗的目的。
随着重视程度的增加，许多新的定量策略和方法都被提出并得到实验验证。对于定量，内标的使用是一个重要的手段，上文提到的毒性研究实验就是采用雌二醇d4为内标来定量。另外，bajad等[55]在用lcms/ms分析时，同时使用非同位素内标和同位素内标来实现定量，共定量了141种化合物，其中包含了氨基酸和核苷酸代谢的许多相关物质。可以说，内标的使用不但可以进行数据校准，还可以辅助定量。最近，weljie等[56]提出一种用于nmr进行代谢组学研究的定量方法，叫做靶标轮廓法，他们利用许多种纯品的光谱数据建模，从而建立一个数据库，通过检索比对来鉴定并定量代谢物，这个方法解决了低浓度物质和重叠区物质的定性定量问题。同位素比率的方法用于代谢组学定量是一种较新的尝试，huang等[57]在使用二维气相飞行时间质谱进行分析时，用d6标记的mtbstfa作为衍生化试剂对分析物进行衍生化，再根据同位素比率对分析物进行定量。通过对各种定量新方法的比较，可以看出，使用内标进行定量的方法会有鉴定方便，定量准确的优点，比较适用于那些结构非常清楚，内标物比较易得的物质的定量，而建模型数据库进行检索比对的方法的优点是比较简便，成本较低，但准确性有所欠缺。在实际研究中，应该根据每个研究对象的不同特点进行选择。
2．3 标准化
由于代谢组学分析技术和操作条件的多样化，使得大量产生的数据和结果缺乏规范性,这给代谢组学数据的采集、存储、查询、比较、共享和整合等带来诸多不便。这就需要研究者对一整套的过程进行标准化。首先，在生物样品的收集、灭活和储存上，大多研究者就已经按照一些标准化程序来做。其次，在样品的前处理上，alzweiri等[58]系统地比较了乙腈、丙酮、甲醇和乙醇的除血样中蛋白和尿中的盐效果，为建立标准化前处理方法提供一些依据。在样品分析上，内标的使用就在一个更小层次的标准化上起到了一定作用。目前，最主要的标准化还是针对于数据的处理。代谢组数据的标准化也开始尝试类似转录组学和蛋白质组学的方法[59]，具体地规定有关实验和分析方法的数据格式和必要信息。如bino等[60]提出了miamet的代谢物组学数据模式，涉及实验设计、样品收集、处理和分析等各环节；基于miamet，jenkins等[61]提出了更为细致和完整的基于gcms的植物代谢物组学数据标准armet；kell等[62]采用xml标记语言,可将信息标准扩展到包括应用nmr和ms等技术的代谢组学数据中。代谢组数据的标准化工作需要科研、企业及政府机构等多方面力量共同参与。在这方面，倡导者之一的smrs工作组发挥了重要作用[63]，该小组已制订和了有关代谢组分析方法的标准化报告的详细草案[64]。
2．4 新的分析方法
2.4.1 样品预处理 样品预处理是代谢组学研究中的重要内容[65,66]。基于代谢组分析的系统性，整个样品处理和分析过程应尽可能保留和体现样品中完整的代谢物组分信息,所以样品的预处理就显得尤为重要。许多研究工作也聚焦在了新的预处理方法上。webbrobertson等[67]在尿液预处理时，加入叠氮化钠，来防止细菌污染；在气相色谱质谱研究中，相转移催化技术(ptc)可以使分析物与离子对试剂形成离子对，利用它在有机相中溶解性好的特点，提高衍生化效率[68]。kind等[69]在尿液与处理上，采用尿素酶分解了尿中含量很高的尿素，与不进行此预处理的尿液相比，这种方法使一些被掩盖的信息表现出来。
2.4.2 样品分析 现阶段，样品分析和数据采集主要采用nmr和ms两种方法。其中，nmr技术，特别是新发展的高分辨魔角旋转、活体磁共振波谱和磁共振成像等技术使nmr成了代谢组学研究领域最主要的分析技术之一[70]；而现代ms技术也以其高灵敏度和专属性的优势而在代谢组学研究中备受青睐。一些应用于代谢组学研究的新技术也出现在这些相关领域中。超高效液相色谱/高分辨飞行时间质谱(uplc/tofms)技术及联机的markerlynx自动化数据处理软件早已运用到了研究中，为代谢组学研究提供了从样品分析到数据分析全过程的整体解决方案[71]。fticrms具有超高分辨率和准确度,可以配备大气压电离(apci)、纳升级电喷雾(nanoesi)和maldi等各种离子源,在代谢组学研究，尤其是未知物确定上发挥了很大的作用[72～74]；在代谢指纹的快速扫描中,直接输注质谱法的应用日趋广泛[75,76]；电喷雾解吸电离(desi)的质谱技术(ambientms)[77～79]基于多孔硅表面的解吸离子化技术(dios)，突出特点是在常压下能将表面吸附的分析物进行解吸电离，这样就避免了样品预处理和基质背景干扰，从而实现ms对复杂样品进行原位、高通量、非破坏的分析，获得更直接和全面的样品信息[80]。wang等[81]自主研发了一套全自动亲水色谱柱/反相色谱柱加和转换的液质联用体系，从而将极性大的化合物进行了更细致分离，扩大了信息量，有助于全面准确衡量代谢情况。这套体系适合用于任何复杂生物样本的分析中，能简单而有效地完成极性范围很宽的不同物质的分离分析。enke等[82]在飞行时间质谱（tofms）的基础上发展了一套新分析技术，称为飞行距离质谱（dofms），它的分辨率可与四极杆和离子阱相媲美，而且还保持了tofms的优点，并提高了信噪比和动态学应用范围。在气相研究中，研究者创新地使用了纤维填充毛细管柱[68]，它的耐高温性能扩展了气相色谱的使用范围。
2.4.3 数据分析 数据处理的一些新的方法开发和应用，有力地推动了代谢组学的发展。saude等[83]根据不同代谢物和内标物的不同纵向弛豫率，得到校正因子，对代谢物的定量结果进行校正，大大提高了定量准确率；yang等[84]发展了一种峰校准算法，他们先定义了一系列响应比较强的峰，将保留时间划分为几个区间，对各个区间进行校准，并在肝病代谢组学研究中得到应用。oh等[85]开发了一个新的信息处理软件包，可以在样品数据中寻找同种代谢物产生的峰，并能消除杂峰（如污染物的峰），他们还用混合标准品和血样加标验证了软件准确性。在以gcms进行植物实验分类学研究中，splot作为一个能反映出代谢物与分类模型之间的共方差和相关性的工具，被用于鉴别有统计学意义和生理学意义的代谢物[86]。还有svd在线性最小二乘基础上的使用，能在一定程度上削弱峰重叠对峰指认和定量的影响[87]；mzmine和xcms能对保留时间进行校准[69]。这些方法的目的都是尽量减小分析中产生的误差，使结果更准确。
3 展望
目前，国内外许多研究者都在进行代谢组学研究，代谢组学应用的范围和领域也在不断扩大。但这些研究依然存在了许多问题亟待解决。（1）在代谢全谱分析中缺乏量的概念。在这个问题上，我们通过这几年对代谢组学进行的研究，也提出了自己的一些策略和思想，首先是将代谢指纹谱与定量进行了结合，称之为定量代谢指纹谱技术。这个结合包含了两个层次，一个是数据采集技术上的结合；一个是数据分析技术上的结合。这样的结合能实现指纹谱与定量优势互补，将更清晰、更全面、更准确地反映研究对象的代谢情况。（2）虽然代谢组学强调无歧视分析，但对于任何一个体系，都按代谢组学常规步骤按部就班地进行分析，往往最终都没有得到有用的结果。针对这个问题，我们认为要重视先验知识的重要性，了解哪些代谢循环、代谢物质最可能与研究体系相关，利用这样的先验知识指导代谢组学分离分析条件的优化、潜在生物标志物的鉴定，将大大提高代谢组学研究的效率，并能很好地避免研究重心偏离的情况。（3）生物标志物的寻找单一而片面。特别是对于疾病的研究，以前不太重视代谢、蛋白、基因数据与临床数据的结合，各个方面的研究者就在自己的研究数据中进行挖掘，以此来寻找标志物，探寻机理。但实践证明，这样得出的结果都会有片面性，缺乏说服力。在这个问题上，应该强调代谢组学数据与其它数据的结合，特别是临床相关数据，以此来发现包含了不同数据内容的复合生物标志物，这也是今后代谢组学发展的一个重要方面，同时，这也为生物代谢或临床表型多样性研究[88]提供更可靠的方法和工具。
尽管存在许多的问题，但也看到了在研究策略上整合一体化、标准化、定量化的趋势，并且看到了在问题导向下的新技术的不断涌现，这都将推动代谢组学不断持续发展。相信随着关注度的提高、人力和物力的不断投入及应用范围的不断扩大，代谢组学必将得到更为稳健的发展。
【参考文献】
1nicholsonjk,lindonjc,holmese.xenobiotica,1999,29(11):1181～1189
2horningmg,murakamis,horningec.am.j.clin.nutr.,1971,24(9):1086～1096
3nicholsonjk,connellyj,lindonjc,holmese.nat.rev.drugdiscov.,2002,1(2):153～161
4brindlejt,anttih,holmese,tranterg,nicholsonjk,bethellhwl,clarkes,schofieldpm,mckilligine,mosedalede,graingerdj.nat.med.,2002,8(12):1439～1444
5holmese,anttih.analyst,2002,127(12):1549～1557
6fiehno.phytochemistry,2003,62(6):875～886
7fiehno.plantmol.biol.,2002,48(1／2):155～171
8allenj,daveyhm,broadhurstd,healdjk,rowlandjj,oliversg,kelldb.nat.biotechnol.,2003,21(6):692～696
9nielsenj,olivers.trendsbiotechnol.,2005,23(11):544～546
10villasboassg,hojerpedersenj,akessonm,smedsgaardj,nielsenj.yeast,2005,22(14):1155～1169
11villasboassg,mass,akessonm,smedsgaardj,nielsenj.massspectrom.rev.,2005,24(5):613～646
12lindonjc,keunhc,ebbelstmd,pearcejmt,holmese,nicholsonjk.pharmacogenomics,2005,6(7):691～699
13keunhc.pharmacol.therapeut.,2006,109(1／2):92～106
14rochforts.j.nat.prod.,2005,68(12):1813～1820
15chenmj,zhaolp,jiaw.j.proteomeres.,2005,4(6):2391～2396
16gersztenre,wangtj.nature,2008,451:949～952
17catchpolegs,beckmannm,enotdp,mondhem,zywickib,taylorj,hardyn,smitha,kingrd,kelldb,fiehno,draperj.p.natl.acad.sci.usa,2005,102(40):14458～14462
18chenmj,summ,zhaolp,jiangj,liup,chengjy,laiyj,liuym,jiaw.j.proteomeres.,2006,5(4):995～1002
19idborgh,edlundpo,jacobssonsp.rapidcommun.massspectrom.,2004,18(9):944～954
20castleal,carvermr,mendrickdl.drugdiscov.today,2002,7(13):728～736
21mullerm,kerstens.nat.rev.genet.,2003,4(4):315～322
22claytonta,lindonjc,cloareco,anttih,charuelc,hantong,provostjp,lenetjl,bakerd,walleyrj,everettjr,nicholsonjk.nature,2006,440(7087):1073～1077
23nebertdw,veselles.trendspharmacol.sci.,2006,27(11):580～586
24lindonjc,holmese,nicholsonjk.pharm.res.,2006,23(6):1075～1088
25watersmd,fosteljm.nat.rev.genet.,2004,5(12):936～948
26ekinss.j.pharmacol.toxicol.methods,2006,53(1):38～66
27lindonjc,holmese,nicholsonjk.anal.chem.,2003,75(17)384a～391a
28weckwerthw,morgenthalk.drugdiscov.today,2005,10(22):1551～1558
29xieyuesheng（谢跃生）,panguixiang（潘桂湘）,gaoxiumei（高秀梅）,liuchangxiao（刘昌孝）.chinesej.anal.chem.(分析化学)，2006，34（11）：1100～1106
30liwei（李伟）,hanjianping（韩建平）,gaojun（高钧）,liuchangxiao（刘昌孝）.chinesej.anal.chem.(分析化学)，2006，35（12）：1798～1800
31linyanping（林艳萍），siduanyun（司端运），liuchangxiao（刘昌孝）.chinesej.anal.chem.(分析化学)，2007，35（10）：1535～1540
32chenj,zhaox,fritschej,yinp,schmittkopplinp,wangw,lux,haringhu,schleichered,lehmannr,xugw.anal.chem.,2008,80:1280～1289
33nordstroma,wante,northent,lehtioj,siuzdakg.anal.chem.,2008,80:421～429
34inagakis,nodat,minjz.j.chromatogr.a,2007,1176:94～99
35godejohannm.j.chromatogr.a,2007,1156:87～93
36brucesj,jonssonp,anttih,cloareco,tryggj,marklundsl,moritzt.anal.biochem.,2008,372:237～249
37leer,ptolemyas,niewczasl,britzmckibbinp.anal.chem.,2007,79:403～415
38tryggj,holmese,lundstedtt.j.proteomeres.,2007,6(2):469～479
39crockforddj,holmese,lindonjc,plumbrs,zirahs,brucesj,rainvillep,stumpfcl,nicholsonjk.anal.chem.,2006,78(2):363～371
40smildeak,vanderwerfmj,bijlsmas,vanderwerffvandervatbjc,jellemarh.anal.chem.,2005,77(20):6729～6736
41lafayea,junotc,pereiray,lagnielg,tabetjc,ezane,labarrej.j.biol.chem.,2005,280(26):24723～24730
42ippolitoje,xuj,jainsj,moulderk,mennericks,crowleyjr,townsendrr,gordonji.p.natl.acad.sci.usa,2005,102(28):9901～9906
43morgenthalk,wienkoops,wolschinf,weckwerthw.methodsmol.biol.,2007,358:57～75
44liaopeiqiu（廖沛球），zhangxiaoyu（张晓宇），weilai（魏来），liweisheng（李伟生），wuyijie（吴亦洁），lixiaojing（李晓晶），nijiazuan（倪嘉缵），peifengkui（裴奉奎）.chinesej.anal.chem.(分析化学)，2008，36（4）：426～432
45huckam,finneya,saurohm,bolourih,doylejc,kitanoh,arkinap,bornsteinbj,brayd,cornishbowdena,cuellaraa,dronovs,gillesed,ginkelm,gorv,goryaninii,hedleywj,hodgmantc,hofmeyrjh,hunterpj,jutyns,kasbergerjl,kremlinga,kummeru,lenoveren,loewlm,luciod,mendesp,minche,mjolsnessed,nakayamay,nelsonmr,nielsenpf,sakuradat,schaffjc,shapirobe,shimizuts,spencehd,stellingj,takahashik,tomitam,wagnerj,wangj.bioinformatics,2003,19(4):524～531
46xirasagars,gustafsons,merrickba,tomerkb,stasiewiczs,chandd,yostkj,yatesjr,sumners,xiaonq,watersmd.bioinformatics,2004,20(13):2004～2015
47joycear,palssonbo.nat.rev.mol.cellbio.,2006,7(3):198～210
48yangf,yansk,wangf,hey,guoyj,zhouq,wangy,zhangxy,zhangwd,sunsh.j.proteomeres.,2008,7(6):741～748
49spickerjs,brunaks,frederiksenks,tofth.toxicol.sci.,2008,102(2):444～454
50watersnj,holmese,williamsa,waterfieldcj,farrantrd,nicholsonjk.chem.res.toxicol.,2001,14(10):1401～1412
51watersnj,waterfieldcj,farrantrd,holmese,nicholsonjk.j.proteomeres.,2006,5(6):1448～1459
52saricj,wangyl,lij,coenm,utzingerj,marchesijr,keiserj,veselkovk,lindonjc,nicholsonjk,holmese.j.proteomeres.,2008,7(01):352～360
53leesh,woohm,jungbh,leejg,kwonos,pyohs,choimh,chungbc.anal.chem.,2007,79:102～110
54wangy,zhanghy,liangql,yanghh,wangym,liuqf,hup,zhengxy,songxm,cheng,zhangt,wujx,luoga.j.chromatogr.b,2008,863(1):94～100
55bajadsu,luwy,kimballeh,yuanj,petersonc,rabinowitzjd.j.chromatogr.a,2006,1125:76～88
56weljieam,newtonj,mercierp,carlsone,slupskycm.anal.chem.,2006,78:4430～4442
57huangxd,regnierfe.anal.chem.,2008,80:107～114
58alzweirim,watsondg,robertsonc,sillsgj,parkinsonja.talanta,2008,74:1060～1065
59quackenbushj.nat.biotechnol.,2004,22(5):613～614
60binorj,hallrd,fiehno,kopkaj,saitok,draperj,nikolaubj,mendesp,roessnertunaliu,bealemh,tretheweyrn,langebm,wurtelees,sumnerlw.trendsplantsci.,2004,9(9):418～425
61jenkinsh,hardyn,beckmannm,draperj,smithar,taylorj,fiehno,goodacrer,binorj,hallr,kopkaj,lanega,langebm,liujr,mendesp,nikolaubj,oliversg,patonnw,rhees,roessnertunaliu,saitok,smedsgaardj,sumnerlw,wangt,walshs,wurtelees,kelldb.nat.biotechnol.,2004,22(12):1601～1606
62kelldb,brownm,daveyhm,dunnwb,spasici,oliversg.nat.rev.microbiol.,2005,3(7):557～565
63castleal,fiehno,kaddurahdaoukr,lindonjc.briefbioinform.,2006,7(2):159～165
64lindonjc,nicholsonjk,holmese,keunhc,craiga,pearcejtm,brucesj,hardyn,sansonesa,anttih,jonssonp,daykinc,navarangem,begerrd,verheijer,amberga,baunsgaardd,cantorgh,lehmanmckeemanl,earllm,wolds,johanssone,haseldenjn,kramerk,thomasc,lindbergj,schuppekoistineni,wilsonid,reilymd,robertsondg,sennh,krotzkya,kochhars,powellj,vanderouderaaf,plumbr,schaeferh,spraulm.nat.biotechnol.,2005,23(7):833～838
65brownsae,simpsonaj,simpsonmj.environ.toxicol.chem.,2008,27(4):828～836
66lauridsenm,hansensh,jaroszewskijw,cornettc.anal.chem.,2007,79(3):1181～1186
67webbrobertsonbjm,lowryadf,jarmankh,harbosj,mengqr,fuciarelliaf,poundsjg,leekm.j.pharm.biomed.anal.,2005,39:830～836
68kaale,janssenhg.j.chromatogr.a,2008,1184:43～60
69kindt,tolstikovv,fiehnoetal.anal.biochem.,2007,363:185～195
70bollardme,stanleyeg,lindonjc,nicholsonjk,holmese.nmrbiomed.,2005,18(3):143～162
71yinpy,zhaoxj,liqr,wangjs,lijs,xugw.j.proteomeres.,2006,5(9):2135～2143
72dettmerk,aronovpa,hammockbd.massspectrom.rev.,2007,26(1):51～78
73wantej,cravattbf,siuzdakg.chem.biochem.,2005,6(11):1941～1951
74brownsc,kruppag,dasseuxjl.massspectrom.rev.,2005,24(2):223～231
75dunnwb,baileynjc,johnsonhe.analyst,2005,130(5):606～625
76allenj,daveyhm,broadhurstd,healdjk,rowlandjj,oliversg,kelldb.nat.biotechnol.,2003,21(6):692～696
77weij,buriakjm,siuzdakg.nature,1999,399(6733):243～246
78takatsz,wisemanjm,gologanb,cooksrg.science,2004,306(5695):471～473
79cooksrg,ouyangz,takatsz,wisemanjm.science,2006,311(5767):1566～1570
80wisemanjm,puolitaivalsm,takatsz,cooksrg,capriolirm.angew.chem.int.edit,2005,44(43):7094～7097
81wangy,wangjs,yaom,zhaoxj,fritschej,schmittkopplinp,caizw,wandf,lux,yangsl,gujr,haringhu,schleichered,lehmannr,xugw.anal.chem.,2008,80:4680～4688
82enkecg,dobsongs.anal.chem.,2007,79:8650～8661
83saudeej,slupskycm,sykesbd.metabolomics,2006,2(3):113～123
84yangj,xugw,zhengyf,konghw,wangc,zhaoxj,pangt.j.chromatogr.a,2005,1084:214～221
85ohc,huangx,regnierfe,buckc,zhangx.j.chromatogra,2008,1179:205～215
86wiklunds,johanssone,sjostroml,mellerowiczej,edlundu,shockcorjp,gottfriesj,moritzt,tryggj.anal.chem.,2008,80:115～122
生物多样性的研究方法篇8
中药新药研究具有系统性、阶段性和复杂性的特点，其研究涉及药学、药效毒理、临床等多方面的内容。每一方面的研究内容都包含大量的试验，通过这些研究获得科学的试验证据，以了解和确认药品的安全性、有效性和质量可控性。对研究用样品进行良好的质量控制，用质量均一的样品进行研究是正确认识药品安全性、有效性、质量可控性的前提，也有利于对试验过程中出现的问题进行分析。笔者拟对目前中药新药药理毒理研究用样品在质量控制方面的注意事项进行初步分析和讨论，供同行参考。
1中药新药研究用样品进行质量控制的必要性
中药新药研究的系统性要求对研究用样品进行良好的质量控制。新药研究需要多学科协同，运用不同方法，从不同角度对相同的对象进行研究。如果中药新药的药效、毒理等研究中使用了不同批次的样品，则可能因样品的质量差异较大，而难以准确判断药品的安全性和有效性。特别是当新药研究的不同试验分别由不同单位承担时，尤其需要关注研究用样品质量的均一性，并进行严格的质量控制。
中药新药研究的阶段性要求对研究用样品进行良好的质量控制。在新药研究的不同阶段，药材、工艺及稳定性等研究的成熟程度不同，样品的质量也有一定的差异。故需要将研究用样品的质量波动控制在一定的范围内，才能保证不同阶段研究结果之间的衔接。一般而言，药理毒理研究用样品、临床试验用样品，以及大生产样品的质量应基本一致，这样才能使临床前研究结果为临床试验提供可靠的参考，使临床试验准确反映上市后产品的有效性及基本的安全性信息。尤其当新药研究的时间跨度较大时，需要关注不同研究阶段所用样品质量的均一性。
中药新药成分的复杂性要求对研究用样品进行良好的质量控制。由于中药新药所含成分相对复杂，大多数中药复方制剂的有效成分、毒性成分都不十分明确，且影响中药质量的因素较多，需要从原辅料、制备工艺、质量检验、贮存条件、包装等多方面进行全过程的控制，才能保证中药新药研究用不同批次产品质量的相对一致，保证研究结果准确、可靠，并经得起重复。
2药效毒理研究用样品的质量控制
中药药效毒理研究用样品的形式一般有药材粉末、浸膏(包括经调节pH或渗透压、除鞣质、加表面活性剂、增稠剂等处理后的浸膏)、有效成分及有效部位、制剂、含药血清等，应根据研究需要制备符合相应要求的样品。
2.1样品的制备
一般应在处方、工艺等基本确定后，在中试以上规模制备样品。以浸膏等中间体的形式给药时，可采用中试规模的中间体为样品。
2.1.1药材粉末
往往需要加一定量的水，将药粉混匀后以混悬液的形式给药。此时需关注药粉混悬的均匀度，特别是当处方中含矿物药或不同药材粉末的相对密度相差较大时，需避免不同相对密度药材粉末分布不均匀的现象，每次吸取混悬液时应充分混匀；必要时可添加助悬剂，并充分搅拌，但需说明其种类、用量及加入方式等。
2.1.2浸膏
在进行药效毒理研究时，往往需要设立多个不同给药剂量组，一般可通过改变浸膏中所含生药量(浓度)或给药容量来解决。应说明样品的完整制备过程，避免不同批次样品在制备过程中可能的质量差异。如提取物浓缩或干燥的方法或条件(温度、压力、受热时间等)不同，对样品中所含成分可能产生不同的影响。研究过程中，如给予试验动物染菌的样品，可能引起动物的炎性反应等，影响试验结果。可根据情况对浸膏进行必要的灭菌处理，以保证卫生学符合要求，应详细说明灭菌的方法和条件，并尽量与制剂的灭菌方法和条件相近，避免灭菌条件过于剧烈而破坏药物的成分。
2.1.2.1整体试验用浸膏
①水溶性浸膏：浓度合适的可直接给药。当样品为相对密度较大的浸膏或干浸膏时，为方便给药和剂量的准确分配，往往需要加水稀释，此时需说明为保证样品的均匀性而采取的措施，如搅拌的方式和条件等。②脂溶性浸膏：可采用多种方式使药物成分均匀分散，以便于给药，如加入适量表面活性剂增溶后给药；或加入高分子材料并采用固体分散技术制成固体分散体，分散后给药；或将干浸膏分散于水中，加入增稠剂并搅拌制成均匀的混悬液后给药等。浸膏的这些处理可能会改变药物的吸收利用情况，从而对样品的安全性及有效性产生影响，需慎重选择样品的处理方式，并进行相应的研究。
2.1.2.2离体试验用浸膏
此类试验包括离体组织器官、细胞及分子水平试验等，所用样品往往需要进行预处理，如调节渗透压及pH值，离心或过滤，排除鞣质或金属离子等杂质的干扰等。需尽可能在模拟人体内环境下进行试验，并进行细胞毒或其他干扰试验。此时，应关注向样品中加入的pH及渗透压调节剂等的种类及用量，样品处理的方法和条件等。
2.1.3有效成分及有效部位
一般可用适当溶媒溶解或混悬后给药，难溶性药物可采用与难溶性浸膏相同的方法处理；特殊制剂需以完整的制剂形式给药。
2.1.4制剂
在制剂对药物的吸收利用影响较大或给药途径特殊的情况下，应以制剂的形式给药，如缓控释制剂、注射剂、肠溶制剂、外用制剂等。为适应不同给药剂量的需要，固体制剂可通过调整辅料用量制成含生药量不同的规格；液体制剂通过调整溶媒量制成含药浓度不同的规格；皮肤给药的外用制剂可制成面积不同或含药物量不同的规格等。毒理研究中为充分暴露药物的毒性，应尽可能提高制剂中药物的含量(或浓度)，如注射剂可专门制备含药量较高的规格(提高药物含量，降低辅料用量，并保持渗透压平衡)；外用制剂也可通过提高制剂的含药量、增大与皮肤接触的有效面积等方法充分暴露毒性。
一般应以中试以上规模的样品作为供试品，特殊情况下也可以在较小的规模下(仅指制剂成型部分)制备供试样品。如因人用制剂的规格较大，不便于给药，可制成供小鼠用的小胶囊等专用规格进行研究；但缓控释制剂、注射剂等制剂的成型工艺应在中试以上规模进行，以避免制剂工艺的差异对药物成分及其吸收利用产生影响。肠溶制剂可用肠溶胶囊、肠溶片等形式直接给药。缓控释制剂应在不破坏制剂的情况下给药，避免对制剂的控释膜、制剂形态等的损伤。
2.1.5含药血清
需明确制备含药血清的详细方法，如动物的情况(动物品系、等级、性别、体重、健康状况等)、样品情况、给药剂量、给药周期(包括每日给药次数、连续给药天数等)、取血方式和时间、血清灭活及保存的方法及条件等。
2.2样品的检验
以浸膏或其他中间体为试验供试品的，应参照制剂的质量标准进行检验，并推算指标成分的含量、限量检查等是否符合要求；以不同规格制剂为供试样品的，同样可参照制剂质量标准进行检验，并按规格进行折算。为较好控制浸膏等样品的质量，应根据需要建立有针对性的质控指标和方法，并明确质控要求，如应对浸膏的相对密度、微生物限度等进行控制。
2.3样品的稳定性
以制剂形式给药的，可参考制剂稳定性研究结果确定合适的有效期及贮存条件，并在制剂的有效期内进行试验。
以浸膏形式给药的，需要研究在所用包装下浸膏的有效期及贮存条件(相关稳定性研究资料应附在相应试验资料后)。如应保证长期毒性研究用浸膏在试验期间的质量稳定，避免因长期存放在不合适条件下对样品质量的影响。可向浸膏中加入适量防腐剂，但应关注其种类及用量是否符合要求，是否影响其生物活性。应明确样品的使用要求，如密封于玻璃瓶或药用塑料瓶中的浸膏，开封后如不能一次用完，需在低温下密闭保存，并在规定的时间内使用。必要时应选择合适的装量规格，使浸膏在开封后的较短时间内用完。浸膏给药的，还应采用符合药用要求的包装材料包装，并在包装上标明品名、批号、贮存条件及有效期等。
3常见问题
新药的药效毒理研究中，与样品有关的常见问题有：①研究过程中，对处方、工艺等进行过多次调整，但未采用处方及工艺最终确定后生产的样品为研究对象进行药效毒理研究，而采用中间过程样品的研究数据替代；或者生产规模较小，在中试以下规模制备样品，其质量与临床试验用样品相差较大，难以为临床试验提供可靠的参考。②申请注册的资料中，研究样品的背景不明确，如所用药材的产地、基原及质量状况不明；样品的批号、制备工艺参数，以及所用原辅料等情况不明；样品中所含药材量不明，难以准确分析不同试验结果之间的关联等。
4建议
生物多样性的研究方法篇9
中药新药研究具有系统性、阶段性和复杂性的特点,其研究涉及药学、药效毒理、临床等多方面的内容。每一方面的研究内容都包含大量的试验,通过这些研究获得科学的试验证据,以了解和确认药品的安全性、有效性和质量可控性。对研究用样品进行良好的质量控制,用质量均一的样品进行研究是正确认识药品安全性、有效性、质量可控性的前提,也有利于对试验过程中出现的问题进行分析。笔者拟对目前中药新药药理毒理研究用样品在质量控制方面的注意事项进行初步分析和讨论,供同行参考。
1中药新药研究用样品进行质量控制的必要性
中药新药研究的系统性要求对研究用样品进行良好的质量控制。新药研究需要多学科协同,运用不同方法,从不同角度对相同的对象进行研究。如果中药新药的药效、毒理等研究中使用了不同批次的样品,则可能因样品的质量差异较大,而难以准确判断药品的安全性和有效性。特别是当新药研究的不同试验分别由不同单位承担时,尤其需要关注研究用样品质量的均一性,并进行严格的质量控制。
中药新药研究的阶段性要求对研究用样品进行良好的质量控制。在新药研究的不同阶段,药材、工艺及稳定性等研究的成熟程度不同,样品的质量也有一定的差异。故需要将研究用样品的质量波动控制在一定的范围内,才能保证不同阶段研究结果之间的衔接。一般而言,药理毒理研究用样品、临床试验用样品,以及大生产样品的质量应基本一致,这样才能使临床前研究结果为临床试验提供可靠的参考,使临床试验准确反映上市后产品的有效性及基本的安全性信息。尤其当新药研究的时间跨度较大时,需要关注不同研究阶段所用样品质量的均一性。
中药新药成分的复杂性要求对研究用样品进行良好的质量控制。由于中药新药所含成分相对复杂,大多数中药复方制剂的有效成分、毒性成分都不十分明确,且影响中药质量的因素较多,需要从原辅料、制备工艺、质量检验、贮存条件、包装等多方面进行全过程的控制,才能保证中药新药研究用不同批次产品质量的相对一致,保证研究结果准确、可靠,并经得起重复。
2药效毒理研究用样品的质量控制
中药药效毒理研究用样品的形式一般有药材粉末、浸膏(包括经调节ph或渗透压、除鞣质、加表面活性剂、增稠剂等处理后的浸膏)、有效成分及有效部位、制剂、含药血清等,应根据研究需要制备符合相应要求的样品。
2.1样品的制备
一般应在处方、工艺等基本确定后,在中试以上规模制备样品。以浸膏等中间体的形式给药时,可采用中试规模的中间体为样品。
2.1.1药材粉末
往往需要加一定量的水,将药粉混匀后以混悬液的形式给药。此时需关注药粉混悬的均匀度,特别是当处方中含矿物药或不同药材粉末的相对密度相差较大时,需避免不同相对密度药材粉末分布不均匀的现象,每次吸取混悬液时应充分混匀；必要时可添加助悬剂,并充分搅拌,但需说明其种类、用量及加入方式等。
2.1.2浸膏
在进行药效毒理研究时,往往需要设立多个不同给药剂量组,一般可通过改变浸膏中所含生药量(浓度)或给药容量来解决。应说明样品的完整制备过程,避免不同批次样品在制备过程中可能的质量差异。如提取物浓缩或干燥的方法或条件(温度、压力、受热时间等)不同,对样品中所含成分可能产生不同的影响。研究过程中,如给予试验动物染菌的样品,可能引起动物的炎性反应等,影响试验结果。可根据情况对浸膏进行必要的灭菌处理,以保证卫生学符合要求,应详细说明灭菌的方法和条件,并尽量与制剂的灭菌方法和条件相近,避免灭菌条件过于剧烈而破坏药物的成分。
2.1.2.1整体试验用浸膏
①水溶性浸膏：浓度合适的可直接给药。当样品为相对密度较大的浸膏或干浸膏时,为方便给药和剂量的准确分配,往往需要加水稀释,此时需说明为保证样品的均匀性而采取的措施,如搅拌的方式和条件等。②脂溶性浸膏：可采用多种方式使药物成分均匀分散,以便于给药,如加入适量表面活性剂增溶后给药；或加入高分子材料并采用固体分散技术制成固体分散体,分散后给药；或将干浸膏分散于水中,加入增稠剂并搅拌制成均匀的混悬液后给药等。浸膏的这些处理可能会改变药物的吸收利用情况,从而对样品的安全性及有效性产生影响,需慎重选择样品的处理方式,并进行相应的研究。
2.1.2.2离体试验用浸膏
此类试验包括离体组织器官、细胞及分子水平试验等,所用样品往往需要进行预处理,如调节渗透压及ph值,离心或过滤,排除鞣质或金属离子等杂质的干扰等。需尽可能在模拟人体内环境下进行试验,并进行细胞毒或其他干扰试验。此时,应关注向样品中加入的ph及渗透压调节剂等的种类及用量,样品处理的方法和条件等。
2.1.3有效成分及有效部位
一般可用适当溶媒溶解或混悬后给药,难溶性药物可采用与难溶性浸膏相同的方法处理；特殊制剂需以完整的制剂形式给药。
2.1.4制剂
在制剂对药物的吸收利用影响较大或给药途径特殊的情况下,应以制剂的形式给药,如缓控释制剂、注射剂、肠溶制剂、外用制剂等。为适应不同给药剂量的需要,固体制剂可通过调整辅料用量制成含生药量不同的规格；液体制剂通过调整溶媒量制成含药浓度不同的规格；皮肤给药的外用制剂可制成面积不同或含药物量不同的规格等。毒理研究中为充分暴露药物的毒性,应尽可能提高制剂中药物的含量(或浓度),如注射剂可专门制备含药量较高的规格(提高药物含量,降低辅料用量,并保持渗透压平衡)；外用制剂也可通过提高制剂的含药量、增大与皮肤接触的有效面积等方法充分暴露毒性。
一般应以中试以上规模的样品作为供试品,特殊情况下也可以在较小的规模下(仅指制剂成型部分)制备供试样品。如因人用制剂的规格较大,不便于给药,可制成供小鼠用的小胶囊等专用规格进行研究；但缓控释制剂、注射剂等制剂的成型工艺应在中试以上规模进行,以避免制剂工艺的差异对药物成分及其吸收利用产生影响。肠溶制剂可用肠溶胶囊、肠溶片等形式直接给药。缓控释制剂应在不破坏制剂的情况下给药,避免对制剂的控释膜、制剂形态等的损伤。
2.1.5含药血清
需明确制备含药血清的详细方法,如动物的情况(动物品系、等级、性别、体重、健康状况等)、样品情况、给药剂量、给药周期(包括每日给药次数、连续给药天数等)、取血方式和时间、血清灭活及保存的方法及条件等。
2.2样品的检验
以浸膏或其他中间体为试验供试品的,应参照制剂的质量标准进行检验,并推算指标成分的含量、限量检查等是否符合要求；以不同规格制剂为供试样品的,同样可参照制剂质量标准进行检验,并按规格进行折算。为较好控制浸膏等样品的质量,应根据需要建立有针对性的质控指标和方法,并明确质控要求,如应对浸膏的相对密度、微生物限度等进行控制。
2.3样品的稳定性
以制剂形式给药的,可参考制剂稳定性研究结果确定合适的有效期及贮存条件,并在制剂的有效期内进行试验。
以浸膏形式给药的,需要研究在所用包装下浸膏的有效期及贮存条件(相关稳定性研究资料应附在相应试验资料后)。如应保证长期毒性研究用浸膏在试验期间的质量稳定,避免因长期存放在不合适条件下对样品质量的影响。可向浸膏中加入适量防腐剂,但应关注其种类及用量是否符合要求,是否影响其生物活性。应明确样品的使用要求,如密封于玻璃瓶或药用塑料瓶中的浸膏,开封后如不能一次用完,需在低温下密闭保存,并在规定的时间内使用。必要时应选择合适的装量规格,使浸膏在开封后的较短时间内用完。浸膏给药的,还应采用符合药用要求的包装材料包装,并在包装上标明品名、批号、贮存条件及有效期等。
3常见问题
新药的药效毒理研究中,与样品有关的常见问题有：①研究过程中,对处方、工艺等进行过多次调整,但未采用处方及工艺最终确定后生产的样品为研究对象进行药效毒理研究,而采用中间过程样品的研究数据替代；或者生产规模较小,在中试以下规模制备样品,其质量与临床试验用样品相差较大,难以为临床试验提供可靠的参考。②申请注册的资料中,研究样品的背景不明确,如所用药材的产地、基原及质量状况不明；样品的批号、制备工艺参数,以及所用原辅料等情况不明；样品中所含药材量不明,难以准确分析不同试验结果之间的关联等。
4建议
生物多样性的研究方法篇10
【关键词】中药化学;研究思路
中药是我国传统防治疾病的武器，中医中药在临床应用了几千年，其疗效经过了实践的检验，并成为世界文化的一朵奇葩。但是由于生产工艺比较落后，质量监控亟待改进，特别是中医独特的哲学思想使西方人难以理解，成为中医药在全世界进一步推广发展的严重障碍。另一方面随着现代科学技术的日新月异和人们对生活与健康水平要求的不断提高，在以科学技术和知识经济为主体的21世纪，要使我国的传统中药以治疗药物的身份堂堂正正地进入国际医药的主流市场，加强中药的基础性研究，加速中药的现代化迫在眉睫。由此国家科技部倡导了“中药现代化科技产业行动”。而中药化学正是中药现代化的基础和前提，如何研究中药化学，是我们每个中药工作者都认真思考的问题。
1中药化学研究现状
近几十年来，中药在化学成分研究方面取得了长足的进展，已对500余种常用中药进行过系统的化学成分研究，发现了近万余种化合物[1]，其中活性成分600余个，大多数为生物碱、黄酮、萜类等低极性的化学成分。从中开发出了40多种一类新药[2]，如青蒿素、人参皂苷Rg3、川楝素等。近年来对极性较大的成分和水溶性成分如皂甙、鞣质、多糖等也进行了研究。但由于缺乏合适的药理筛选模型，加上未能按生物活性导向进行分离，致使绝大多数中药和复方的药效物质基础尚未阐明，因此对单味中药和复方有效成分的研究还未取得真正突破性的进展。
2目前在中药化学的研究中还存在以下几个问题
2.1选题太偏:一部分科研工作者为了避免与他人重复，选择一些极不常见的甚至根本就没有药用价值的植物进行研究，研究成果可能会有新的发现，但大多数毫无价值，至少在医药学上没有价值。中医药是经过几千年实践检验的成果，有疗效的药材才会流传下来，疗效不确切的、无用的药材必然会被淘汰，想从不常用植物中寻找新药，笔者认为是走弯路。
2.2研究目的不明确:中药化学研究的目的是为中医药服务的，而很大一部分中药化学工作者，一味的为研究化学而研究中药化学，以发现新化合物为荣，以发现新化合物的多少来判断科研水平的高低，而不管其是否具有药理活性。
2.3水溶性成分的研究较少:大多数中药在民间常用水煎方式进行口服，然而中药化学工作者较少注意进行水溶性成分的研究。这主要是因为水溶性成分大多是一些高分子成分，难以分离和鉴定结构所造成的。
2.4不注重复方的研究:中药很少以单味药来运用，多以复方形式在临床配伍应用，但是由于科研难度的较大，目前复方药物的研究还是相对比较少见的。
2.5与药理研究相脱节:这一方面有实验经费等客观条件的限制，另一方面也有研究者自身的思想问题，部分中药化学工作者认为找得到找不到化学物质是自己的事，有没有药理活性是药理的事，与己无关。
3如何避免这些问题，笔者认为要注意以下几个方面
3.1要充分注意利用我国丰富的中草药资源以及临床积累的丰富经验。这是我们的一个优势，我们筛选新药要比西方盲目的筛选有针对性。我们参考中医药理论不只是看中药的功能主治，还要看它的煎煮服用方法、配伍应用、采收加工炮制等，这样可以使我们少走许多弯路。如青蒿素的发现就是得益于传统中医药学的典型例子。我国自1967年起筛选治疗疟疾的中草药三千二百多种（包括青蒿，但未成功），均未获满意结果。1969年中国中医研究院中药研究所接受抗疟新药研究的任务，命屠呦呦任课题组长，她以继承发扬祖国医药学为指导思想，从系统收集整理历代医籍本草入手整理出一册以640余种为主的方药集。在此基础上，以鼠疟、猴疟为动物模型，筛选200多个方药，屡经失败，经用现代方法结合古代用药经验，特别结合东晋葛洪《肘后备急方》青蒿“青蒿一把绞汁服，可以治疟”记载，考虑可能有温度、酶解等影响因素问题，反复改进提取方法，终于1971年10月发现青蒿的中性提取物对鼠疟、猴疟有100%的疟原虫抑制作用。经进一步研究分离得到抗疟有效单体，命名为青蒿素[3]。
3.2研究重点要放在中药基础理论的研究上，不要只认准新化合物这条路。对一些中药原理方面的阐述，意义重大。如乌头炮制解毒，何首乌炮制后降低泻下作用等。重视中药基础理论的研究，就是要运用传统理论和现代中药化学研究方法，开展对中药的四气、五味、归经、十八反、十九畏、七情配伍及禁忌等中药理论研究，提示其内在规律和科学基础，从而达到对中药基础理论的科学阐述，最终构建现代中药理论体系。这也是防止中药现代化向中药西药化方向转化的保证。
3.3要与药理研究工作紧密联系。
在现代中药化学的研究过程中，从药材的提取、粗分、细分、纯化到得到单体一直与药理工作相联系，始终对有药理活性的部分，进行深入研究，这样得到活性成分的机率才会增大。否则那些含量甚微又难于分离的活性成分在分离途中极可能丢失，且丢失也难于察觉。与药理工作紧密联系还可以在药材、有效部位和有效成分等不同化学层次进行综合评价，阐明中药的作用机理。
3.4重视民族民间药的研究。研究民族民间药用资源是我国中药的宝库之一，各少数民族积累了不少天然药物用药经验。有些民族在其长期的使用中已形成独特的理论体系，如藏药、蒙药等。民间药物靠代代口述相传，经过了历史的考验。一般来说，民族民间药物，疗效确切，且处方较小，从中发现活性成分或活性部位的机率很高。3.5注重药材中微量成分的研究。随着提取分离及分析技术的不断发展进步，一些过去未知的药材中所含的微量成分被发现，其中不乏具有较强生物活性的成分，如人参和三七中的环肽，可能是一类新型活性成分。
3.6体内活性成分的研究。中药化学成分虽然多种多样，但是当作为口服药物应用时，只有那些能被吸收的成分才是活性成分研究的目标。将药材的水或醇提取物给大鼠服用后，收集血清、尿及胆汁样品，比较投药前后的化学物质差别。随后分离纯化投药之后在血清、尿及胆汁样品中出现的新成分，鉴定它们的结构，探讨它们的活性，确定中药药效物质基础。该方法应用于中药复方的研究，用以明确中药复方以何种形式进入体内，进入体内后如何变化，药物配伍对血中成分的影响，把握中药复方的内在实质。
3.7构效关系的研究构效关系的研究是以活性成分为先导物，合成一系列同类化合物，用适当的药理模型筛选，分析比较活性与无活性分子的构象差异，进行构效关系研究。在本学科中这方面的研究内容很少，基础相对薄弱。近5年来仅有3项相关研究，即对14种新人参皂苷抗吗啡成瘾的构效关系研究、对黄芩的抗焦虑活性成分及其构效关系研究和对广西5种抗癌中草药有效化学成分及构效关系的研究[4]。一些中医药工作者认为，将中药中提取的有效成分进行结构修饰，已经不再是中药。笔者认为，做为一项基础研究，探讨中药活性成分的作用机理，构效关系的研究是非常必要的。如何研究，如何保持中医药的特色而不备西药化，还需进一步的探讨。
3.8加强对复方药物的研究。中药复方研究是采用现代科学技术方法阐明中药方剂治疗作用的物质基础及作用原理，对阐明中医药理论、将中药方剂推向国际社会具有重要的意义。对中药复方治疗作用的物质基础及作用原理依然所知甚少，中药复方研究尚未走出一条中医药独特的道路。
3.8.1中药复方研究目前存在的问题主要是：①目前中药复方物质基础研究还过多地集中在寻找与单一药效作用相关的单体成分，对复方多成分共存状态下的化学——药效相关性的系统研究并未得到足够的重视，中药质量标准的控制上也多采用测定其中某一单一成分。②中药复方的实验药理学研究虽然逐年增加，但绝大多数也仅限于药效学的观察，而且由于没有中药化学工作者的有效配合，方剂组成多不稳定，药效重现性较差，难以准确反映复方的药理学作用。
3.8.2对中药复方研究的总体思路是：①将中药复方作为一个整体进行研究。中药复方配伍后的化学成分并非是单味药化学成分的简单加和，复方在煎煮过程中有化学成分含量及种类的变化，如：柴胡和赤芍配伍后，既有成分的增溶现象，又有成分的减弱现象，同时还有新峰产生[5]。显然，将单味化学成分提纯，在配伍的方法，不能反应中药复方的特色。②采用多指标活性评价体系。中药复方采用多途径、多靶点、整合调节机制发挥药效作用。中药作用的多样性给活性成分研究带来了机遇的同时，也带来了困难。因此在追踪分离活性成分过程中，像西方那样只用单一活性筛选体系追踪分离得到的活性物质很难合理说明中药的真正作用物质基础。应采用多指标活性评价体系，以便尽快追踪分离得到目标活性成分。③在目标活性成分为等剂量条件下进行目标活性成分、单一药材及复方的药效学对比，探讨复方的组方依据及作用原理。④标准处方和标准汤剂的研究，用现代药理学手段确认标准汤剂的药效。中药复方多水煎服用，按照制定的标准工艺做成标准汤剂，采用现代药理学研究方法正确表达与确认标准汤剂或其冻干粉的临床疗效。此项工作是整个中药研究的前提。⑤采用全成分综合分析的方法。对中药化学成分的研究不能脱离中医药理论，中药用药讲究整体，是多组分协同作用。对复方的研究中药复方由多味药材组成，每种药材均含有很多化学成分，这些成分尽管其中一些已被提取、分离和鉴定，但仍有很多是未知的化合物。因而对中药复方除了进行“有效成分”的研究外，还应从全成分综合分析的方法去认识其作用的化学物质基础。该法也同样适用于单味药的研究。
综上所述，中药化学要想取得突破性的进展，还任重道远，需要我们每一位药学工作者共同的努力，进行多学科合作，结合中医药理论，引进现代科学技术和方法，进行长期深入持续性研究，根深叶茂，厚积薄发，为中药现代化奠定坚实的基础。
参考文献
[1]果德安．浅谈中药现代化过程中的几个关键问题[J]．中草药，2003，34：9～11
[2]刘建利．中草药活性成分的结构修饰与新药研发[J]．中草药，2003，34：73～77
[3]杨光华，饶淑华．青蒿素发明发现的方法学研究[J]．医学与哲学，1997，18（12）；641～644