细胞生物学实验技术篇1
细胞工程课程在生物科学专业的设置
本课程自从2007年在我校新办生物技术专业开设以来，根据学校对本科生物技术专业的培养计划，细胞工程是生物技术专业的主干课程，并于2009－2010学年第二学期开始开设。通过对该课程的教学，使学生掌握细胞工程所涉及的基本概念、原理、技术方法、应用基础等内容。通过近三年的教学实践，不断加强课程建设与发展，理论教学体系已经基本完善，实验教学平台基本建立。通过全面进行教学改革，已逐渐形成本校建设的特色课程。21世纪，生命科学全面快速发展。根据学科发展和社会需求趋势，在新办生物技术专业基础之上，2009年我校新办生物科学专业。然而，新办生物科学专业的困境是专业范围宽泛;如何在有限的时间内，全面、高效地培养适应社会需求的合格人才，是每位任课教师和教学管理者必须认清的首要问题。为了充分发挥我们医学院校的资源优势，在培养学生方向定位上，以健康教育为主要方向，兼顾生物制药等，但又与生物技术的培养方式不同。由于细胞工程是由细胞生物学、分子生物学、基因工程、工程学等学科理论技术有机结合的一门崭新学科，因而被设定为新办生物科学专业本科生培养计划的必修课程。
细胞工程课程在生物科学中的开设，是以普通生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、分子生物学、微生物学、免疫学等先修课程为基础。同时，将本课程的学习与基因工程、生物技术等课程的学习互相补充和相互促进，为将来从事生命科学基础理论研究、生物制品的开发和应用、疾病诊断技术的开发与应用等领域的工作打下必要的基础。在教材方面，以李志勇编著《细胞工程》(高等教育出版社)为基本教材，以杨吉成编著《细胞工程》(化学工业出版社)、安利国编著《细胞工程》(第二版，科学出版社)等为主要参考教材。在教师队伍配置方面，既有细胞生物学领域教学经验丰富的教授，也有年富力强的专业知识扎实的中青年骨干教师。细胞工程的理论教学和实验教学全部由既具有扎实生物工程学相关知识背景，又有基础细胞理论与实验技术背景的骨干教师承担。
细胞工程教学内容的设定与改革
细胞工程课程的特色，是以细胞工程技术方法的基本原理为课程教学切入点。在教学内容上，基本理论的讲授与技术方法过程的介绍并重;在本学科知识的系统性方面，既有本学科理论的系统性，又加强与其他相关学科的相互渗透交叉，尤其是以细胞生物学、生物工程的基础知识背景，为本学科的理论教学奠定基础;通过将现有技术的原理、应用归纳，与本学科相关技术的发展趋势讲解相结合;从内容上，客观系统地反映本学科相关领域应用前景、重点研究方向和尚待解决的科学问题;在理论上自成体系。根据教学计划，细胞工程在我校总学时设定为80学时，其中理论50学时，实验30学时。本课程的开设，一般在第三学年的第二学期，在普通生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、组织胚胎学等课程修完之后进行。细胞工程在教学内容、教学方法上又与以上学科大不相同，本课程教学是以技术方法的原理为基础理论的学科，因此实验与理论教学并重。细胞工程课程的理论课程内容，根据研究对象一般分为三大部分内容，分别为:细胞工程概论与基本技术、植物细胞工程、动物细胞工程。根据我校的教学实际情况和培养计划，我们对教学内容进行了适当的改革与调整。课程的内容重点在第一部分细胞工程概论与基本技术和第三部分动物细胞工程［1－4］。
细胞生物学实验技术篇2
庄河市中心医院，辽宁大连116400
[摘要]观察流式细胞术在临床检验中的应用研究，随着我国医疗卫生事业的进步，在临床的检验中可以依托于科学方法进行病症的治疗。通常情况下，采用流式细胞术进行病症的治疗，不仅能够对细胞的表面抗原与受体予以详细的分析，还可以对细胞中的抗原体和分子进行科学地检测。由于科技的不断进步，促使细胞微球实验技术得到医学临床的广泛应用和推广。就现阶段的发展而言，流式细胞术在临床检验中的应用主要是对淋巴瘤、白血病、中性粒细胞与红细胞的分析、肺泡灌洗液中的t细胞的亚群检测与分析等病症的临床分析和检测。
[
关键词]流式细胞术；临床检验；应用研究
[中图分类号]R197 [文献标识码]a [文章编号]1672-5654（2014）10（a）-0162-02
随着我国医疗卫生事业的不断发展与完善，促使医疗监测方法也开始趋于成熟，流式细胞术在临床检验中的应用频率开始增加，并且具有良好的发展前景。可以依托于流式细胞术对需要检测的细胞进行细胞内部的抗原和分子检验，能够得到科学的结果，为医疗卫生事业的发展予以很好地推动。目前，我国对于细胞微球实验技术的应用上，主要应用在对患者血清和血浆的检测与分析中，并能够对可溶性的蛋白与细胞因子加以科学与详实的研究分析。笔者根据自身对流式细胞术在临床检验中的应用研究，并进行了临床效果观察，现将临床观察与研究的结果进行如下报道。
1流式细胞术
在医学研究领域中，流式细胞术（FCm）主要是近代生物学和分子生物学、流体力学、分子免疫学、激光技术等进行高度结合的产物[1]，能够对单细胞或者是其他细胞粒子以及抗原体进行科学与速度的检测，并能够借助于科学技术的选用对检测结果进行科学的分析。
就现阶段的发展而言，流式细胞术技术同现代单克隆抗体技术进行有机的结合，能够对单个细胞中的多个参量进行定量、定性的分析的同时，还能够将技术本身所具备的高速、精准的特性融入其中，并得以展现出来。在医学研究领域中，流式细胞术技术已经得到医学临床实验的广泛性应用，并且主要用于对大量样品的检测，这种技术能够在肿瘤学、血液学、免疫学等多个学科间进行科学的分析与应用，借助于多学科的理论常识进行细胞粒子、单细胞的研究。
1.1流式细胞术对细胞表型的分析
分析细胞表型，是目前最为常用的一种临床应用技术。在单克隆抗体同流式细胞术的结合应用中，首先要进行的步骤就是对细胞表型的研究和分析，比如：分析细胞表面CD8和CD4等的表达[2]。由于分化抗原的深入发展，对细胞表型分析得到临床的广泛应用，比如：对白血病和淋巴瘤病症的诊断方面，对中性粒细胞、红细胞的检测方面等。
1.2流式细胞术对细胞中抗原或分子进行的检测
受到乙醇、皂角素、甲醛等细胞膜渗透剂发展的影响，促使细胞中的抗原或者分子的检测技术得到一定程度的发展。在研究的初期，对细胞内检测技术的应用主要是对细胞的倍体和周期进行分析，并借助于冷乙醇对细胞膜加以通透性的提升，再依托于碘化丙啶对细胞中的Dna进行染色，方便研究的观察。
1.3细胞微球试验
细胞微球试验是一种新型的医疗检测技术，可以对细胞分泌释放出的细胞因子、可溶性蛋白等进行科学地检测[3]。通常情况下，每个细胞微球试验中的微球都有其特定的荧光强度，并且具有大小一致的特性。细胞微球试验具有检测灵敏度高、检测效率准确、重复性好的优势。
2流式细胞术在临床检验中的应用
2.1流式细胞术在免疫学中的应用
随着流式细胞术在临床检验中得到广泛的应用和推广，可以为试验室的研究提供具有诊断性的研究指标。关于对白血病和淋巴瘤病症的免疫表型分析中，能够借助于免疫学的原理，利用抗原抗体的特异性反应，对不同的单克隆抗体进行不同荧光染料的标记[4]，当细胞受到激光的照射后，细胞膜的抗原体能够发出不同的激光荧光，并同相应抗原进行结合，促使细胞表面抗原量的生成。通常情况下，细胞免疫反应有两种，分别是细胞的直接免疫反应和细胞的间接免疫反应。细胞的直接免疫反应是细胞表面的抗原能够同带荧光探针的单克隆抗体进行结合的一种免疫反应[5]；而间接免疫反应则是指细胞表面的抗原能够同单克隆抗体进行有机的结合，并促使第二抗体可以同抗体进行结合，与此同时，导致抗原抗体复合物也带有荧光探针[6]，产生了机体的免疫功能。通过对人体细胞免疫功能的检测，能够对患有淋巴瘤和白血病的患者进行淋巴细胞亚群的检测，并为患者进行科学的治疗。
2.2流式细胞术在血液中的应用
在医学临床研究领域中，通常都是依托于对患者进行血液或者是骨髓的采集，并将其作为临床诊断的标本进行详实的分析研究。由于血液样本能够呈现出悬浮的状态[7]，便于流式细胞术对其进行分析和选择，促使在医学临床领域中，流失细胞术可以得到重要的应用和推广。流式细胞术能够对外周血细胞进行检测分析，并对白血病与淋巴瘤等疾病进行血液的诊断和分析，同时还可以对其进行预后的判断与治疗做出重要的贡献。流式细胞术可以依托于抗血细胞表面分化抗体的程度不同，进行细胞参数的设定，从而可以对细胞的属性予以合理化的判定。通过对Dna倍体与细胞周期的测定，可以指导医护人员对患者进行的白血病化疗的治疗，并能够对细胞增殖情况进行实时地观察，对相应药物的治疗效果予以提高。流式细胞术在血液中的应用分析，可以对细胞中所含药物的浓度进行适度的降低，并能够在一定程度上将耐药程度予以很好地反应出来。
2.3流式细胞术在临床微生物检测中的应用
由于流式细胞术具有灵敏、快速与高效的特性，促使其可以同时进行多项参数的分析，尤其是在临床微生物的检测实验当中，更有利于其作用的施展。流式细胞术既能够用于对受感染的细胞进行内部病毒的抗原检测，还能够对受感染的细胞表面进行病毒抗原的检测[8]。借助于特异性识别的特征对细胞表面进行抗原单克隆抗体的检测，并能够进行定量、定性的受感染细胞的检测。流式细胞术体外抗生素的药敏试验中，主要是依托于流式细胞术对染料和病原体结合后产生的不同荧光强度进行检测[9]，并能够间接地将病原体的活性与功能进行反应。随着科学技术同医疗卫生事业的稳健发展，流式细胞术技术在细菌的药敏试验中得到有效的研究与应用，并能够依托于临床微生物学的作用发生原理进行科学地检测与指标的分析，帮助医学临床研究领域对流式细胞术的应用研究成果的分析。
2.4流式细胞术在肿瘤学中的应用
流式细胞术在肿瘤学中的应用，是对医学临床研究成果的一大突破。在肿瘤学中的应用主要是对Dna的含量进行科学地测定，并可以依据检测出来的结果帮助医护人员对患者进行化疗治疗和药物控制含量的指导。通过流式细胞术对肿瘤的研究与分析，可以对恶性肿瘤的早期诊断，进行临床治疗方案的提出，并能够将高分辨率与精确度的特性应用到临床分析中，辅助肿瘤的治疗和预后护理治疗。流式细胞术技术的应用不仅能够对患者的恶性肿瘤中的Dna进行含量的分析，还能够依托化疗中肿瘤分布直方图的变化进行患者治疗效果的分析，提升对患者的治疗效率。流式细胞术能够同肿瘤学进行有机的结合，可以推动医学研究领域在肿瘤治疗方面的治疗效果。
3流式细胞术在临床细菌学检验中的潜在应用分析
医疗卫生事业的不断发展，促使流式细胞术应用的范畴不断扩大，并能够同其他具有现代化的医疗技术结合使用，能够在细菌学的检验中得到巨大发展前景的保障，比如：可以直接检测出细菌与真菌、病毒、寄生虫等病原体感染的程度，帮助医学研究领域对各种疾病的诊治与检测。随着科学技术的快速更新，流式细胞术的药敏试验成为医疗卫生事业中发展速度较快的一种医疗检测技术。而流式细胞术的药敏试验主要是借助于不同荧光染料进行病原微生物的染色，可以根据荧光强度的不同对病原微生物的抗生素处理结果和状态进行分析与判定。流式细胞术还被医学研究领域应用到抗生素的检测中，这样一来就能够将其本身所具备的高效、快速、灵敏的特性充分发挥出来。流式细胞术同其他技术的结合应用，能够在很大程度上帮助医疗卫生事业的发展，并对病症的治疗提供精准的治疗方案。
4结语
在医学研究领域中，流式细胞术技术的应用能够对细胞进行细化的分析和研究，比如：白血病、淋巴瘤等病症的治疗、药敏试验、细菌异质性等方面。流式细胞术在临床检验中的应用，能够对医疗研究领域的成果做出巨大贡献，并具有一定的临床实验意义，可以得以新的推广与应用。
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参考文献]
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细胞生物学实验技术篇3
细胞生物学是生命科学相关专业学生的基础课程，包含了细胞生物学理论与细胞生物学实验课程。作为一门实验性很强的学科，需要学生具有良好的动手与思考能力。为了更加有效地促进本科生学习细胞生物学的热情与效果，很多高校进行了细胞生物学实验教学体制改革，达到了不错的效果[1-4]。而笔者也一直尝试细胞生物学实验课程的教学改革，从教学体系、教学内容、教学手段等方面积极探索，本着开拓创新的精神去激发学生开放式思维，鼓励学生探索性地开展科学研究实验，笔者将基础性实验、综合性实验、探索设计性实验依次进行，循序渐进地培养学生在实验中的积极主动性和科研创新的能力。
研究生教育是本科教育之后的继续深造学习阶段，本科教育强调的是掌握基本的基础知识与从事科研的能力，而研究生教育强调的是具有坚实的基础理论与深入的专业知识，具备创新能力和独立从事科研的能力[5]。越来越多的生命科学领域的学生选择在本科学业完成之后进入研究生教育阶段，继续学习生命科学领域最前沿的知识和技术以及开展相应的科学研究工作。怎样才能有效地将差异化培养目标的本科生与研究生教育进行顺利对接，以减少本科生向研究生过渡的时间段，提高研究生学习的质量，是每一位从事教育事业的教师应该思考的问题。江苏师范大学生命科学学院细胞生物学教研组结合细胞生物学实验课程教学实践，探讨课程改革，以期有助于本科生综合发展与快速成长，加快本科生与研究生教育的培养对接。
1教育培养改革措施与建议
1.1加强细胞生物学实验前沿性与交叉性实验建设
生命科学特别是细胞生物学是一门实验性质很强，研究成果日新月异，实验技术突飞猛进的学科，细胞生物学是本科生与研究生的基础性学科，要进行本科生教育与研究生教育的有效对接，则应该在条件允许的情况下，将当下较为前沿的实验与技术融入细胞生物学实验课程，及时展示最新的研究成果与技术，合理有效地促进细胞生物学理论与实验的同步化发展，增进学生对于最前沿知识与技术的了解和对于细胞生物学的兴趣，增强其好奇心，从而有效促进学生的积极主动性。
目前生命科学前沿学科发展迅猛，各个分支学科也存在交叉融合，出现很多交叉领域，比如分子细胞生物学、神经细胞生物学等，因此单一的实验内容与技术往往不能够有效地满足科学研究的要求。比如，细胞生物学实验课程中一般都是采用显微镜观察的手段去观察细胞、组织的形态结构，分子生物学实验课程与生物化学实验课程又分别从基因、蛋白等角度去学习相关的技术，该部分内容在本科生培养阶段是孤立学习的，没有让学生形成实验内容与手段是科学研究的有机整体的思维，只有通过各个层面的实验分析才可以得出较为完美的实验结果，而在研究生的科学研究当中又需要使用这一系列的实验手段去进行实验，因此是脱节的，需要加强这方面的改革。在学习完细胞生物学实验课程、分子生物学实验课程与生物化学实验课程之后，笔者在大四上学期设计了综合性生物技术大实验，将细胞生物学等相关学科主要实验技术综合运用，训练学生系统性的科学研究思路，使其深入了解生物学研究的综合性与复杂性，提前接触科学研究者要具备的综合基础知识。
1.2加强细胞生物学实验灵活性与学生科学素质培养
生命科学是一门实验性较强的学科，要加强实验课程的内容，要为以后进入研究生阶段培养或进入企事业单位研发部门的学生之后的科学研究做好充分的准备。在安排实验课程的时候，应充分考虑到生命科学实验课程的特殊性。
1.2.1合理安排实验过程，灵活运用教学时间。因为有时实验等待的反应时间较长，一方面可以安排穿插细胞生物学理论课程的讲授，另一方面可以安排其他细胞生物学实验操作，这种科学统筹的安排会给学生起到示范作用，教会学生合理安排时间，尤其是到了研究生阶段，同时操作几个实验是经常发生的。要使得研究生具备统筹规划、合理安排时间的能力，那么就必须在本科阶段就开始培养。另外，除了上实验课进行操作的时间之外，为鼓励学生灵活性地自主学习实验相关技术，笔者开辟了网络信息化实验教学手段：江苏师范大学生物学教学实验中心（http：//biolab.jsnu.edu.cn），改变传统实验课堂的单一性，全方位立体覆盖课外与课内空间，实现课堂外实验技术的学习。“工欲善其事必先利其器”，熟练掌握相关实验技术是研究生进行科学研究的关键，是获得基本、可靠、真实的科学事实的重要先决条件，因此需要加强本科生进入研究生之前的技能培训。
1.2.2加强实验室规章制度与仪器设备管理规范建设。在本科生实验课程过程中，要求学生遵守实验室实验纪律，在实验过程中严格遵循实验室仪器操作规范，养成实验室重要的仪器使用预约与登记习惯，以及向他人咨询未使用过的实验室仪器操作步骤的习惯；养成做实验的良好习惯，例如实验室中试剂使用完毕后要归置原位，废液废物要分门别类贴标签处理，使用后的瓶子试管要清洗烘干等。良好的实验习惯是个人品质的延伸，是确保实验成功的保障，是研究生科学研究的基本素养。
1.2.3调动学生实验分析的积极性，使学生参与到实验课程的学习中来。细胞生物学实验课程很多的课程内容是属于可以预知实验结果的验证性实验，但有时也会出现结果不理想的状态，一般情况下教师会告知哪些因素影响了正确结果的出现，但是为了更加激发学生的积极性与好奇心，教师应当鼓励学生动手查阅相关资料与文献，充分利用学校的图书馆与网络数据库资源，进一步分析问题形成原因，并且通过实验来验证是否改变这些因素就能够使实验结果达到预期，以此加深学生对于实验的理解，满足实验成功的成就感，促进其主动性与科学思维能力。另外，实验课上的各个实验小组可以模仿研究生组会的形式，将各实验小组的实验结果展示出来，汇报各个小组的实验结果，共同分析非预期结果的根源，找出问题所在，通过该途径可以培养学生的学术交流能力，有助于学生进一步适应将来工作或者学习上与其他科研工作者的科学问题讨论氛围。
1.3加强学生科学的逻辑思维、分析能力与科学实验严谨性精神的培养
生命科学是一门具有逻辑性和严谨性的科学，真理的发现是由辛勤工作的科学家一点一滴积累起来的。细胞生物学实验课对于培养学生实践探索能力和科学创新能力具有理论课无法替代的重要作用，是提高学生科学素质的有效途径[6-7]。教师在实验课程教学时，要本着实验的科学性、严谨性、逻辑性去教育学生，从本科阶段就应该培养学生严谨的科学精神和分析思维能力。
1.3.1撰写实验报告。向学生强调应如实描述在实验过程中所得到的实验结果，要真实的去反映基本科学事实。实验报告中所张贴的实验结果图片要进行必要的标注与说明，比如，在细胞生物学实验课程中，很多学生在写实验报告时，实验结果展示部分仅仅把得到的实验图片贴上去，不进行标注，这是不科学的，教师应教育学生将实验图片的比例尺、标注与说明做好。如果所得到的实验结果不是预期的，那么可以科学分析产生的原因，以及提出改进的措施，并将这些内容写到实验结果分析中。
1.3.2要向学生讲述怎么进行科学的设计实验，讲述实验过程中要设立对照组实验的意义，灌输实验设计的逻辑性，更好地培养学生的分析能力。在进行细胞生物学实验时，实验内容都是教师在上课时讲述的，包括实验内容、实验步骤与注意事项，最后让学生按照既定的实验路线去做，但是这种灌输式的教学方式效果不甚理想。在探索教学改革的过程中，笔者采用阶梯式、渐进式的实验内容安排方案，将基础性实验与综合性设计实验相结合，以此激发学生主动性与创新性[8-9]。如，在细胞生物学实验课程之后安排了大四的细胞工程大实验，通过进阶式学习，逐步实现自主性实验操作与教师合理指导的模式。进一步应该在各个分支学科基础性实验的基础上，将生物学的各实验进行有效融合，形成行之有效的综合设计性实验，才更能体现出生物学各分支学科的交叉性与前沿性，为以后的研究生教育奠定基础。设计实验实施过程应循序渐进、由易到难、由浅入深，在教师的悉心指导下，学生进行实验相关的操作，到实验的后期，分析实验数据，整理实验数据并撰写实验报告。并且，有部分的设计实验与教师的科研题目挂钩，由科研项目教师结合自身科研课题设计题目，让学生去查阅文献、设计方案、讨论实施，并鼓励学生参加大学生创新实验项目，在实践实验过程中可以促进学生思考问题、分析问题、解决问题的能力，提高自身的同时也促进教师科研项目的开展。当由基础性实验至综合交叉性设计实验逐步过渡，学生就会逐步融入到科学的海洋。
细胞生物学实验技术篇4
【关键词】现代生物科技专题；植物细胞工程；基本技术；教学设计
中图分类号：G633.91文献标识码：a文章编号：1671-0568（2017）15-0094-02
一、教材分析
“植物细胞工程的基本技术”是“人教版”高中生物学教材《现代生物科技专题》（选修3）专题2“细胞工程”的内容。本小节的重点在于阐明植物组织培养的原理和过程、植物体细胞杂交的过程，难点是植物组织培养的实验和植物体细胞杂交过程。植物组织培养技术涉及的主要相关内容，如细胞全能性和细胞分化，以及植物体细胞杂交技术涉及的细胞膜的流动性等知识，学生已经通过必修一和必修二的学习对相关基础知识有了一定的了解和认知，但是植物组织培养和体细胞杂交技术都是实验技术难度较高、过程抽象的现代生物技术，对学生来说仍然是一个全新的领域，学习起来有一定的难度。
为此，教学中应注意利用学生的知识迁移能力，指导学生进行自主学习和小组互助学习，并借助多媒体教学手段，采用创设情境、设置问题的教学方法，实现让学生把困难的问题简单化的目的。鉴于本小节是实验技术，但实验室无法满足真实做实验的要求，于是笔者设计了3D模拟实验，并把模拟实验搬到课堂，让学生动手参与进行模拟操作，帮助学生把抽象复杂的过程变得具体简单，增强学生的感性认识，从而化难为易，突破重难点。
二、教学目标
1.知识目标
简述细胞全能性的概念含义；简述植物组织培养的过程；简述植物体细胞杂交技术。
2.能力目标
通过对植物组织培养和植物体细胞杂交的过程设计，培养学生知识的迁移能力；通过植物组织培养的动手模拟操作，培养学生的动手能力。
3.情感目标
通过学生动手体验植物组织培养，激发学生敢于实验的科学精神；通过植物体细胞杂交技术的学习，认同科学是一个不断发展的过程，激发探索生命奥秘的热情。
三、教学过程
1.情境创设导出新课
结合现在流行种植多肉植物的现象，给学生播放“多肉植物组织培养”的视频，并让学生带着问题观看，教师设疑：为什么多肉植物的一个小块组织就可以长成一个完整的多肉植物，这与哪项生物技术有关联，体现了植物细胞的什么特性？通过视频引起学生的兴趣，激发学生的探究欲望，引导学生回忆细胞全能性的概念，理解全能性的原因和本质，并启发学生思考生物体内的细胞有没有全能性，为什么多肉植株体内的细胞没有表现出细胞的全能性。接着进一步提问：“动物细胞有全能性吗？生物体所有细胞的全能性大小一致吗？”自然引出并补充有关细胞全能性大小的比较的知识。
2.植物组织培养技术
教师根据视频内容追问：“刚才视频中显示的多肉植物的长成，大家讨论并总结一下怎样才能由一块组织通过培养得到一株完整的多肉植株，实现其细胞全能性的？”然后指导学生阅读教材中相关内容，并思考相关问题：①植物组织培养的理论基础是什么？②什么是愈伤组织及其结构功能特点？③离体的器官、组织或细胞如果不进行脱分化处理，能否培养成完整的植物体？并总结植物细胞表现出全能性的条件：离体状态、一定的营养物质、植物激素、无菌环境、适宜的温湿度等外界条件。然后，教师就相关概念，如脱分化、愈伤组织、再分化、胚状体等给学生加以讲解，并让学生当堂齐读概念，加强对新概念的理解和记忆。最后由学生概括出植物组织培养技术的过程。那具体的操作过程是什么样的，要注意哪些事项呢？指导学生参考教材中胡萝卜的组织培养实验，并分组利用实验材料（胡萝卜、小刀、镊子、锥形瓶、酒精瓶等）和3D模型（愈伤组织块、丛芽、小植株、培养基等）自己动手体验其过程！待全体学生完成后让各小组选派代表分别汇报学习成果并回答问题：植物组织培养过程中为什么要进行一系列消毒、灭菌处理，并且要求无菌操作呢？对哪些材料进行消毒灭菌以及如何进行消毒灭菌？愈伤组织是什么颜色的？愈伤组织的形成、丛芽的形成和诱导生根为什么要转换培养基？教师根据问题补充植物激素是影响植物细胞脱分化和再分化的一个重要因素。当细胞分裂素与生长素共同使用时，能强烈促进愈伤组织的形成，而两者不同的浓度配比在再分化过程中，分别对诱导根和芽的产生起关键作用。最后教师各小组情况进行点评和小结，改进完善流程图，并板书正确的流程图（见图1）。
通过让学生亲自动手模拟实验过程，感受该项技术，加深了对植物组织培养技术的理解和学习，也培养了学生的动手能力、团队合作能力和进行生物实验技术的素养。接下来进一步引导学生思考：①同一株植物不同部位的细胞经植物组织培养获得的植株基因型相同吗？为什么？②以植物的花药来进行离体培养属于哪种育种方式的重要环节？这种育种方法的流程是怎样的？通过设疑引导学生回顾必修二“单倍体育种”的内容，更深刻理解单倍体育种的两个重要步骤，而且更加明确植物组织培养技术和单倍体育种的区别与联系。
3.植物体细胞杂交技术
通过提问让学生回忆并比较马铃薯和番茄的生长特点和营养价值，然后引导学生思考：能否让番茄和马铃薯杂交，获得一种地上长番茄，地下结马铃薯块茎的一箭双雕的“超级作物”呢？如果要实现这一设想，可以采用哪些方法？学生根据物种间存在生殖隔离的知识，否决传统有性杂交的可能，进而大胆提出具有创新性的方案。
教师对学生提出的设想分别进行点评，并指出科学家们历尽艰辛，成功实现了两个物种间的杂交。多媒体展示体细胞杂交过程，并逐步引导学生思考：①要想让两个来自不同植物的体细胞融合在一起，遇到的第一障碍是什么？该如何解决？并比较如果是两个动物细胞融合需要此步骤吗？②如何诱导原生质体融合？有哪些人工诱导的方法？③植物细胞融合的原理和完成的标志分别是什么？细胞融合后需要筛选吗？如何筛选出杂种细胞？④如果得到了杂种细胞如何长成一个植物体？杂交完成的标志是什么？⑤植物体细胞杂交的过程可分为几个步骤，试用流程图来表示？（见图2）⑥植物体细胞杂交成功的重要意义是什么？该技术有何局限性？学生对以上问题进行分析和讨论，教师进行点评和小结，最后指出科学家得到的马铃薯―番茄“超级作物”并没有如科学家们所愿，地上长番茄，地下结马铃薯，教师对此结果引导学生根据已有知识解释：生物体内的基因表达并不是孤立的，他们之间相互协调相互影响，所以超级作物的遗传物质会相互干扰。但是，马铃薯―番茄“超级作物”还是在客服远缘杂交的障碍上取得了巨大的突破。同时给学生通过图片展示其他的杂种植物：烟草―海盗烟草、胡萝卜―羊角芹、白菜―甘蓝等。最后通过白菜―甘蓝的3D模型让学生更直观的感受到杂种植株，同时归纳比较植物体细胞杂交和传统杂交的优缺点，把新旧知识有机的结合起来，学习接受新知识的同时复习记忆旧知识！
4.课堂小结与拓展
通过板书的知识网络带学生回顾本节所学的知识内容，并指出本节课的重点内容，然后开展难度适当的习题进行当堂反馈！最后开放性问题，结合课本异想天开：会进行光合作用的奶牛！能否让植物细胞与动物细胞进行杂交？具体实验方案是怎样的，注意哪些问题，与植物体细胞杂交有什么不同点？由此实现课内知识的迁移应用，激发学生创新的热情。
四、教学反思
教师通^联系现实，创设问题情境，开展教学活动，并设计难度适宜的问题让学生自己分组讨论，调动学生的积极性并锻炼思维表达能力和团体协作意识。实践发现，学生对动手演练更感兴趣，在教学中善于化抽象为具体，通过学生动手参与的过程来实现重难点的突破。生物课程是理科中偏文科的学科，侧重记忆的内容较多，所以学习新内容的同时要注意复习相关的旧知识，这样让知识有机地结合在一起，成为知识网络，便于学生接受和学习。另外，课堂上讲完一个知识点需及时归纳、总结，帮助学生理清知识点网络，便于对知识的理解和记忆。一节课的最后可以有三五个难度适宜的试题进行当堂检测反馈学生接受情况，便于教师了解学生掌握程度或存在的问题。
参考文献：
细胞生物学实验技术篇5
光镊(opticaltweezers)又称为单光束梯度力光阱(single-beamopticalgradientforcetrap)，是一种利用高度汇聚的激光束形成的三维梯度势阱来俘获、操纵微小粒子的技术[1]。其中，势阱是指一个包围着局部最小势能的区域，因形如陷阱而被称为势阱。光镊自1986年由美国科学家arthurashkin[2]发明以来，已被广泛应用于生物医学、物理、化学等领域，成为一项重要的研究工具。最初，基于光学显微镜的光镊系统满足了对生物系统同时进行操纵和观测的需要。随着研究的深入，生命科学要求能够进行单分子层次的研究，光镊配套的成像观测系统因此发展出了在秒级时间尺度上的位移测量精度为10－10m级的光镊以提高空间分辨率；为了避免光镊高强度聚焦激光束可能产生的热效应和光化学效应，近场光镊和飞秒脉冲光镊应运而生，克服了传统光镊的热效应问题，有利于保持生物分子的稳定性。为适应生物系统的复杂性，双光镊、三光镊、四光镊和全息光镊等系统的出现实现了多粒子操控。随着光镊的进一步发展，光镊将有可能走出实验室，进入制造业、临床诊断等主流产业中去。本文将综述光镊及拉曼光镊的基本原理和特点，及其在生物医学领域中的研究进展、现状和展望。
光镊的原理和特点
光镊原理简述
光镊是基于光的力学效应的一种新的物理工具。这里以透明电介质小球为模型来阐明光镊的基本原理。如图1，当一束光穿过电介质小球时，将发生反射和折射，在这个过程中，光子与小球碰撞产生的动量变化将使小球受到散射力和梯度力。散射力(Fs)正比于入射光强，方向沿光传播的方向；梯度力(Fg)正比于入射光强的梯度，方向沿光强的梯度方向。光镊是依靠光的梯度力形成的，当达到焦点附近的梯度力大于散射力时才能形成一个稳定的三维光学势阱来稳定地捕获生物粒子。这一稳定的三维光学势阱是由一束激光通过一个短焦距透镜汇聚来实现的。如图2所示，无论入射光从法线之上或者法线之下入射小球，小球所受到的合力均指向焦点(f)，从而使小球被稳定“钳夹”在焦点的位置。
光镊的特点
光镊的基本功能赋予了其在生物医学研究领域中的独特优势。1)光镊可捕获和操控数十纳米到数十微米的微粒，而大多数生物微粒，诸如细胞、细胞器甚至生物大分子，都恰好在这一尺度范围内。因此，光镊可用于操控和研究生物微粒。2)光镊以一种温和的、非机械接触的方式完成夹持和操纵物体，捕获力是施加在整个微粒上，而不是像机械捕获那样集中在很小的面积上，不会对捕获的生物微粒造成机械损伤和污染。3)由于光的无形性和穿透性，光镊可以在保持细胞自然生活环境的情况下对其进行捕获与操纵，而且，光镊的所有机械部件离捕获对象的距离都远大于捕获对象的尺度(1000倍)，是遥控操作，几乎不干扰生物粒子周围环境和它的正常生命活动。4)光镊能产生皮牛顿量级的力，且在捕获焦点附近表现出虎克弹簧的性质，能满足单分子力学和单细胞研究的需求，是重要的传感探测工具。另外，光镊与拉曼光谱结合被称为拉曼光镊技术。拉曼光镊被广泛应用于生物医学研究中，因其具有微量检测、快速和高精度等优点，特别适合生物样品的化学成分分析[3]。单独使用拉曼光谱进行测量时需要将激光束聚焦到样品上，再探测光束焦点处样品激发的光谱信号。用拉曼光谱技术研究活细胞时，待测细胞需要固定在载玻片上，这样就改变了细胞周围的微环境，可能对细胞机能产生影响。光镊的引入避免了这种情况，因为它可以非接触地操纵活细胞。因此，拉曼光镊可以获得单个活细胞的拉曼光谱，提取单个活细胞的结构信息[4]。
光镊和拉曼光镊技术在生物医学领域中的研究进展
基于多种成像技术的发展，光镊已经从物理学领域中脱颖而出，演变为一项适用于生物医学研究的多功能工具，这是由于光镊可以从单细胞的研究中获得详细的信息。其中，多光镊应用于单细胞的分析拥有巨大潜力，利用其平行测量功能，可以为研究人员提供良好的分析数据，例如，多光镊用于细胞异质性的研究、生物力的测量用于单细胞机械性能的研究等。利用光镊对分子马达和单分子力的研究可以得到其他方法难以获得的研究结果。光镊应用于细胞信号传导和组织工程也有广阔的前景。另外，光镊与微流控系统结合时，可以精确地控制细胞的化学环境，因而可以实现对酸碱性、渗透压、药物和温度等环境因素的实时、动态研究。随着自动化及其它便于操作的光镊设备的发展和跨学科学术合作的日益频繁，光镊技术将成为生物医学领域中一种经常使用的研究工具。
应用于血细胞和血液系统疾病的研究
血细胞
由于生物细胞的多样性和复杂性，在许多情况下，为了从研究中得到相关信息，需要对大量细胞进行研究。如果对细胞一个接一个地研究，研究过程会过分耗时。为了解决这一问题，多光镊被开发出来以实现对单细胞的平行研究。Ramser等[5]开发了双光束光镊系统来研究红细胞，并使用不同波长的激光获得了红细胞的拉曼光谱，发现波长514.5nm的激光激发出的光谱质量最好，且500～1650cm－1范围内的光谱峰随时间发生了变化，这是由于这一区域的光谱对氧从血红素中解离的光解作用较为敏感所致。Cojoc等[6]应用多光镊技术在多个位置成功捕获了红细胞，他们使用衍射分光镜将激光分裂为多光束，使用氩离子激光探测被捕获的红细胞。多光镊技术与单光镊相比有三个独特的优势：1)允许细胞在三维空间内排布；2)允许细胞的侧向移动，激光可从不同位置激发拉曼光谱；3)入射在细胞上的激光强度分散，降低了光损伤的可能性。国内外有许多应用拉曼光镊对血细胞进行研究的报道。拉曼光镊基于光子的非弹性散射，通过获得入射光子与散射光子的能量差异，观察分子键的振动状态，从而获得丰富的分子结构信息。因此，拉曼光镊可以快速灵敏地分析红细胞，特别是分析血红蛋白的状态。Deng等[7]使用拉曼光镊技术研究了酒精对红细胞的作用，他们记录了细胞与20%酒精接触过程中的拉曼光谱随时间的变化情况，发现表示血红蛋白的光谱带强度随着红细胞与酒精接触时间的延长而下降。王桂文等[8]应用拉曼光镊技术俘获形态正常和发生形变的红细胞并获得其拉曼光谱，以平均光谱、主成分分析(principalcomponentanalysis，pCa)等方法分析不同形态红细胞的光谱差异与胞内血红蛋白的变化，以及这些差异和变化对光谱诊断分析的影响。结果发现，在正常的生理环境下，红细胞发生皱缩甚至形成棘形细胞，都不会影响光谱判别分析。最近，该实验组应用拉曼光镊结合气体循环供给装置，收集并分析了不同氧合状态的单个红细胞的拉曼光谱[9]，发现较强功率的激光照射会导致血红蛋白凝集特征峰(1248cm－1和1371cm－1)升高。i1638/i1547比值是区分氧合态与去氧合态的良好标志，经较长时间保存的红细胞氧合能力增强，但去氧能力没有显著变化；α地中海贫血HbH-CS患者的红细胞氧合能力比正常对照强，但其去氧能力较差。由此可见，拉曼光谱特别适合分析血红蛋白。这主要因为血红蛋白的活性中心由卟啉环组成，卟啉环可以吸收几个可见光区的波长，使用接近这些波长的激光照射红细胞，就会出现共振效应，测量集中在血红蛋白分子上，而不会受到其他细胞成分和环境的干扰。由于在全血中可以检查到许多血细胞缺陷，血液细胞的分选受到关注。Grover等[10]使用两束相反方向的激光，在光捕获的基础上，通过图像处理系统区分红细胞、白细胞和血小板，并最终将分选好的各类细胞转运到微流系统的指定容器中。该分选方法快速、精准。这说明当分选对象在大小、形状上存在较大差异时，可以利用其在光场中所受作用力的不同对其进行分选。paterson等[11]利用Bessel光产生的环形对称光场将红细胞与淋巴细胞分开，正是由于两种细胞的受力不同，在光场中的行为也不同。在该研究中，研究者发现双凹形的红细胞在Bessel光的外环上聚集后才到达Bessel光中心，而球形的淋巴细胞则直接到达Bessel光中心。最近，Yang等[12]使用光镊技术来测量凝血细胞之间的力，通过观察血红细胞的活动，发现凝血共经历三个阶段；通过测量血红细胞间的相互作用力，发现肝素使血细胞之间的力变小并延长了凝血时间，而氨甲环酸使凝血过程跳过前两个阶段而直接进入最后阶段。由于光镊的力范围在飞牛至纳牛，正好涵盖了许多细胞内和细胞间的生命过程，所以，可以很好地应用于测量细胞间或细胞内分子之间的相互作用力。
血液系统疾病
血液系统疾病主要表现在血细胞的异质性，由于拉曼光镊可以获得详细的生物细胞分子的结构信息，因此，可用于对细胞异质性的研究。Chan等[13]利用拉曼光镊技术获得了正常和癌变白细胞的拉曼光谱，发现癌变的白细胞Dna光谱带强度比正常白细胞低。Chan等[14]还通过捕获白血病病人的活体白血病细胞获得了可复制性的拉曼光谱，并应用pCa方法将正常和癌变白细胞的拉曼光谱进行了区分。由主元线性鉴别分析法(principlecomponentlineardiscriminantanalysis，pC-LDa)进行监督分类，敏感度可达到95%。因为使用了真实的临床病例，提高了这项研究的应用价值。Jess等[15]应用双光镊并结合拉曼光谱和微流控芯片，获得了单个Hi60人类早幼粒白血病细胞的拉曼光谱。微流控芯片的应用显著加快了细胞的拉曼光谱检测进程。DeLuca等[16]采用拉曼光镊技术，在单细胞水平上研究了β-地中海贫血红细胞的携氧能力和细胞膜脆性，发现地中海贫血红细胞的携氧能力下降，且其对于氧分压更为敏感；测量到的膜剪切系数显示地中海贫血红细胞膜脆性增加了40%，证实主要影响血红蛋白合成的基因缺陷对于红细胞的机械性能也存在强烈的影响。王桂文等[17]应用拉曼光镊技术收集了一例重型α地中海贫血患者单个红细胞的拉曼光谱。结果发现，重型α地中海贫血患者红细胞的拉曼光谱信号显著低于正常对照，并检测到一定比例的有核红细胞；正常对照的红细胞拉曼光谱均一，而重型α地中海贫血患者的细胞形态和拉曼光谱均显示出多样性；中等大小、形态接近正常的一类红细胞，其细胞间光谱差异最大；可观察到部分外表形态正常的红细胞，但其血红蛋白可能发生了血红素凝集和蛋白质变性。该实验组[18]还将pCa和反向传播Bp网络预测模型相结合，进行了地中海贫血红细胞类型的判别。pCa结果显示，正常对照与中间型α地中海贫血细胞(HbH-CS)基本可以区分，但正常对照与重型β地中海贫血细胞及HbH-CS与重型β地中海贫血细胞间的差异不明显。将归一化处理的前5个主成分进行Bp网络训练及预测，结果发现，正常对照与HbH-CS间的预测正确率高达97.90%，正常对照与重型β地中海贫血细胞及HbH-CS与重型β地中海贫血细胞间的预测正确率分别为90.72%和86.28%。综上所述，通过将光镊与拉曼光谱和微流控芯片相结合，可用于检测血细胞中血红蛋白的生理状态，并对血细胞进行分选，具有很大的临床应用潜力。应用该方法，可以获得异质红细胞与正常红细胞的拉曼光谱，通过pCa等数据分析手段实现对异质红细胞的鉴别和分选。另外，多光镊的应用明显扩大了对血细胞的研究范围，提高了研究效率。
光镊和拉曼光镊技术应用于微生物和感染性疾病的研究
微生物
大肠埃希菌
由于通过拉曼光谱可获得被分析物的分子指纹，因此，拉曼光镊也可被应用于对单个微生物细胞组分的研究。Xie和Li[19]使用波长为785nm的激光获得了大肠埃希菌的拉曼光谱，用此方法获得的光谱具有较好的信噪比(signalnoiseratio，SnR)和较小的背景干扰。他们发现，大肠埃希菌在60℃以上培养时，代表核酸的光谱带强度显著下降。该实验组进一步的研究[20]还发现，使用拉曼光镊能够区分不同培养条件下平台期的细菌。生物对激光的反应取决于激光的波长和强度。与可见光相比，近红外激光能够降低光损伤。neuman等[21]研究了波长为790～1064nm的激光对大肠杆菌的近红外光效应，发现光损伤最小的激光波长为830nm和970nm，而光损伤最大的激光波长为870nm和930nm。Rasmussen等[22]研究光镊捕获对大肠杆菌的生理损伤，通过测量胞膜内外pH梯度来确定细菌的生理状态，发现，波长1064nm、功率6mV的激光捕获大肠杆菌60min，其细胞膜内外的pH梯度无显著下降，而用同样波长、功率18mV的激光捕获仅几分钟，大肠杆菌细胞膜内外的pH梯度就明显下降；他们还发现，振荡条件下培养的大肠埃希菌比非振荡条件下培养的受到的生理损伤小。mirsaidov等[23]对大肠杆菌的生存力进行了研究，与之前的研究结果不同，研究人员发现光损伤与近红外激光波长(840～930nm)的关系微弱，但与激光强度呈线性相关，大肠杆菌的致死光能量为5J。moritz等[24]通过拉曼光镊技术结合pCa方法，在单细胞水平上研究了大肠埃希菌对抗生素的反应，发现，培养4h，无抗生素组在729和1245cm－1出现谱峰，而在1660cm－1没有谱峰；1vol%青链霉素组和5vol%青链霉素组在1660cm－1出现谱峰，但是在729和1245cm－1没有谱峰。头孢菌素组的光谱在729和1245cm－1与青链霉素组相似，反应了抗生素存在下细菌胞内腺嘌呤的生理变化。但是，头孢菌素组的光谱在1660cm－1没有谱峰，这可能与青链霉素引起70S核糖体单体在细胞内的聚集有关。可见，通过对获得的拉曼光谱进行数据处理分析，可得知细胞内外生物大分子的变化情况，因此，拉曼光镊可用于研究环境因素对微生物的作用及其机制。
酵母菌
Xie等[25]通过拉曼光镊技术获取酵母菌的拉曼光谱，再通过与已知正常和死亡酵母菌的拉曼光谱进行比较来筛选正常酵母菌。由于伊红只能使死亡的酵母细胞着色，因此通过拉曼光镊技术分选出的酵母细胞可以通过伊红染色的方法复查。应用此方法对6个酵母细胞进行筛选的精确度为100%。说明可以利用拉曼光镊对酵母菌进行筛选。然而该研究只用了6个细胞，该方法的可靠性需要更大的样本量来加以验证。Creely等[26]通过波长785nm的激光获取酵母菌的光谱，研究该波长的激光对酵母菌的损伤，发现酵母菌被785nm的激光捕获2h未出现细胞损伤，未在拉曼光谱中观察到蛋白质构型的改变，说明785nm的激光对酵母菌的光损伤很小。eriksson等[27]将光镊与微流控芯片相结合，研究酵母细胞氧化应激的信号路径。其中，绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFp)与信号路径中的蛋白相结合，可通过荧光显微镜观察细胞的反应。他们发现，转录因子Yap1p是在抵抗氧化应激中起主要作用的调节因子。当细胞受到氧化应激时，Yap1p-GFp进入细胞核，而在正常情况下，Yap1p-GFp应回到细胞胞质中。该实验组还以同样的方式研究了不同葡萄糖浓度下的Snf1路径。tao等[28]应用拉曼光镊技术探测粘红酵母细胞内的胡萝卜素、核酸及其他重要生物分子。他们发现，胡萝卜素和脂质的合成在对数期末才出现显著增加，在平台期之后总量达到最大；核酸在早期的合成增加，随着酵母菌生长逐渐平稳，核酸合成反而逐渐下降。这些实验说明拉曼光镊系统作为一种快速、便捷、可靠的方法，可以用于胡萝卜素合成过程的菌体内研究。一般来说，生物对激光的反应取决于激光的波长和强度。通过改变捕获激光的光学性质，可以实现不同的研究目的。就非损害的光学捕获而言，应该使用近红外激光。但是，由于不同的生物分子和细胞对激光的反应不同，光镊用于捕获微生物时，应该探索特定波长和强度的激光对该生物的影响。将拉曼光谱与光镊相结合，能够获得细胞内各组分和细胞外分子的详细信息，可用于鉴别不同微生物，检测其生活状态及生命过程。另外，荧光显微镜和特定荧光团的使用能够帮助检测到细胞内某些特定物质的生命活动。
感染性疾病
mohanty等[29]基于红细胞在光镊夹持下的旋转运动提出了疟疾的高效诊断方法。当健康红细胞与高渗缓冲液接触时，红细胞变为半月形并在光镊捕获下旋转，而疟疾感染的红细胞不旋转，受感染个体中健康的红细胞低速旋转。该特征可被用于筛查血样。通过该方法在30s内可分析完成20个红细胞。最近，Saraogi等[30]通过用光镊测量受到疟原虫感染的单个红细胞的布朗运动来研究红细胞物理性质的改变。光镊捕获力是该实验的一个重要参数，因为光镊捕获力与激光强度、被捕获对象的物理性质有关。测量布朗运动的功率谱是确定光镊捕获力的方法，该实验就采用测量功率谱的办法来确定光镊的捕获力，进而了解被捕获红细胞的物理性质。研究发现，正常红细胞与被感染红细胞的功率谱出现具有统计学意义的角频率不同。由于感染引起红细胞物理性质的改变，从而使角频率发生变化，但是角频率的变化与感染各个阶段的关系不大。实验中发现仅有不到10%的红细胞受到寄生虫感染，但是，从感染病人血液中提取的未受疟原虫侵染的细胞，角频率也存在明显的增加，这说明了旁观效应的存在。由于疟原虫可以引起血红细胞性质的变化，因此，通过光镊对受感染红细胞的运动、物理性质等数据进行测量，可为诊断疟疾提供帮助，有望成为疟疾的辅助诊断工具。目前，在口腔医学领域中应用光镊或者拉曼光镊技术进行的研究不多。梁裕芳等[31]应用拉曼光镊技术比较分析了口腔毛滴虫和阴道毛滴虫的拉曼吸收峰，并寻找具有分类学鉴别价值的特征拉曼峰。通过光镊随机俘获单个大小一致、有活力的虫体并记录其拉曼光谱，收集数据并做pCa分析。通过实验发现，不同来源的虫体在937cm－1、1002cm－1和1446cm－1谱峰的强度和谱型有差异，因此，根据1002cm－1谱峰的信号强度，并结合937cm－1和1002cm－1峰强度比值(i937/i1002)及1002cm－1和1446cm－1峰强度比值(i1002/i1446)，可以作为区分阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的量化指标。可见，拉曼光镊技术可以用于鉴别两种毛滴虫。
光镊和拉曼光镊技术应用于肿瘤疾病和抗癌药物的研究
肿瘤疾病
乳腺癌
由于癌细胞在生物分子构成上发生了显著变化，癌细胞的大小、物理性质等也会发生相应的改变。Guck等[32]使用以光镊为基础设计的“光担架”研究乳腺癌细胞，发现乳腺癌细胞比正常乳腺细胞更容易发生形变。更强的形变能力被认为与恶性肿瘤细胞需要形变后进入循环系统而发生远处转移有关。这一方法可以用于微流细胞筛选，并根据细胞膜变形能力进行诊断。
前列腺癌
由于前列腺特异性抗原检测的高假阳性率，临床上迫切要求提高诊断前列腺癌的准确性。由于拉曼光谱中包含了大量的化学物质结构信息，拉曼光镊被广泛应用于肿瘤细胞与正常细胞的鉴别。Harvey等[33]应用拉曼光镊技术结合pCa，区分前列腺癌细胞(pC-3)和膀胱细胞系(mGH-U1)，发现mGH-U1比pC-3含有更多的核酸和蛋白质。这项研究显示拉曼光谱包含大量化学物质的结构信息，例如，氨基化合物Ⅰ和氨基化合物Ⅱ的光谱带分别位于1650cm－1和1570cm－1，脂质的光谱带在1200cm－1至1400cm－1的区域内占优势，含苯丙氨酸的蛋白质在1002cm－1能被清楚地观察到，也有蛋白质在860cm－1的位置出现光谱带，在800cm－1以下区域的弱带一般代表核酸。Harvey等[34]还采用化学方法固定前列腺癌细胞、早期前列腺良性肥大细胞和尿道细胞，并应用拉曼光镊技术对这三种细胞进行鉴别。实验结果显示，敏感性大于72%，特异性大于90%。可见，该研究方法有可能应用于临床，通过简单的尿液检查对前列腺癌进行诊断。与活体组织检查相比，该方法对患者造成的痛苦少，但就其敏感性和特异性而言，仍无法取代活检。
结直肠癌
Zheng等[35]应用拉曼光镊技术获得了200个正常和200个癌变结直肠细胞的拉曼光谱，并使用ann和pCa对光谱进行分类。结果显示：80个光谱的单盲试验，敏感性和特异性均达到86.3%；双盲试验，敏感性达到85%，特异性达到92.5%。Chen等[36]制备了取自直结肠癌变组织的细胞悬液，用光镊捕获正常和癌变结直肠上皮细胞并获得其拉曼光谱，分析显示癌细胞包含更多的核酸和蛋白质。通过单盲试验，敏感性达到82.5%，特异性达到92.5%。Deng等[8]使用拉曼光镊技术对正常和癌变的直结肠细胞进行研究，发现正常直结肠细胞的光谱带强度比(1002/1300)为1.08，而癌变直结肠细胞的光谱带强度比为0.85。1002cm－1的光谱带代表蛋白质，1300cm－1的光谱带代表脂质，可见，正常的直结肠细胞比癌变的直结肠细胞含有更多的蛋白质和更少的脂质，因此通过选择合适的参数(如光谱带强度比)，可实现对细胞良、恶性的快速鉴别。
其他肿瘤
Banerjee和Zhang[37]应用拉曼光镊来区分星形胶质细胞和它的癌变细胞，与其他肿瘤的研究结果相似：癌变细胞的蛋白质和脂质的光谱带强度比星形胶质细胞的光谱带强度高，这项研究说明拉曼光镊有在较为复杂的领域中进行研究的潜力。姚辉璐等[38]利用拉曼光镊获得了鼻咽癌细胞株和正常人鼻咽部气道上皮细胞株的单细胞拉曼光谱，结果显示：正常细胞和癌细胞的平均拉曼光谱有显著差异，正常细胞的光谱强度比癌细胞明显要高，正常细胞的光谱带强度比(1304/1336)为1.05，癌细胞为1.22。证明拉曼光镊可以成为区别正常鼻咽细胞和鼻咽癌细胞的有效手段。该实验组[39]还应用相似的实验模型获得了正常肝细胞株和肝癌细胞株的单细胞拉曼光谱，得到了类似的结果：正常细胞和癌细胞的平均拉曼光谱存在显著差异；癌细胞谱线强度整体变弱；正常细胞1658cm－1处峰和1450cm－1处峰的强度比值为0.63，癌细胞为0.99；癌细胞的核酸、蛋白质、脂类等重要生物分子在结构或含量上都发生了不同的改变。用pCa方法对单个细胞的平均拉曼光谱进行分析，结果发现pCa可以正确区分出正常细胞和癌细胞。
抗癌药物
国外学者使用光镊研究Dna插入药物与Dna的结合方式和亲和性。过去的研究发现喹唑酮类药(pD153035)为新型酪氨酸激酶抑制剂，还发现pD153035可以直接插入Dna，说明这种多靶向定位药物具有很大的治疗人类恶性肿瘤的潜能。Cheng等[40]使用双光镊来确定pD153035的亲和性常数(Ka)和插入位点之间最小的碱基对数(n)。光镊系统与一个倒置的光学显微镜结合，包含两束激光，一束采用减反射镜来控制，作为固定势阱，另一束采用扫描镜来控制，作为扫描势阱。另外，用一个四象限光电二极管探测被捕获微珠的位置。为了构建Dna-微珠复合体，将噬菌体Dna片段的生物素酰化末端与t4Dna连接酶捆绑，末端附着于抗生蛋白链霉素包裹的平均直径为1.87μm的微珠上。实验结果表明，Dna在1mmol/L的甲次砷酸钠液中明显增长，在(23±0.5)℃的环境温度下，Ka=(1.18±0.09)×104mol－1L，npD153035=11bp。在测量Dna分子力的实验中，直接进行Dna的操作并不方便，通常需要将Dna链的一端与微珠相连，以便于对Dna的操控。
光镊和拉曼光镊技术应用于亚细胞结构的研究
除了细胞水平的研究，拉曼光镊也可应用于对亚细胞结构(如染色体、线粒体、Dna、Rna等)进行研究。ojeda等[41]采用拉曼光镊技术，捕获操控染色体并获得即时光谱，成功鉴别了三个不同的染色体。他们使用光镊分离三个不同的染色体，获得拉曼光谱并进行GDa分析，再用光镊将染色体放置于载玻片上，通过G带染色来验证光谱的检测结果。实验结果表明能够根据拉曼光谱区分这三个染色体，从而证实了使用拉曼光镊技术无需染色就能够鉴定人类染色体。Reiner等[42]使用光镊技术从溶解的人HL-60细胞中成功提取出单个线粒体并完成线粒体Dna异序性的检测。用线粒体绿色荧光染料(mitotrakerGreenFm)对线粒体染色标记，利用紫外光使细胞溶解，用荧光辨认单个线粒体，再用红外激光捕获线粒体并将其移动到微小的吸液管尖端，线粒体被吸入缓冲液，为分析线粒体Dna(mtDna)做准备。使用pCR技术3次Dna扩增后，通过基因测序的方法发现单个线粒体中mtDna的异序性比率约为50%。该研究说明，荧光显微镜及荧光染料的发展为光镊对细胞中某些特定物质的研究打下了基础。tang等[43]应用拉曼光镊技术研究从大鼠的肝脏、心肌和肾脏组织中提取出来的线粒体。首先记录脂质、蛋白质、核酸的拉曼谱峰，再通过拉曼光镊获得各组织中提取出来的线粒体的拉曼光谱，发现从不同组织中提取的线粒体的差异是由于各组织中线粒体组分的不同造成的，例如，肝脏线粒体和心肌线粒体的光谱差异源于脂质的结构和蛋白质的分子量不同。tang等还发现，当线粒体与含100μmol/LCa2+的KCl缓冲液接触时，1602cm－1的拉曼谱峰强度下降。这项研究说明拉曼光镊技术可以研究单个线粒体的生命活动及其与药物、毒素接触时的组分变化情况。
光镊和拉曼光镊技术应用于生物学基础研究
在一些研究中，需要以可控的方式去除某些细胞成分而又不损伤其他细胞组分。此时，可以采用脉冲紫外激光或者近红外激光作为光刀攻击细胞器，使其不可逆地失去功能。paterson等[11]使用紫外光二极管为光源，以相对较低强度的光切细胞膜，向仓鼠卵细胞中引入外源Dna。Stevenson等[44]使用钛宝石激光，以同样的实验模型研究细胞的转染率和生存力，研究显示光手术非线性地依赖于光强度，作用于细胞膜上的激光强度为1.2μJ/cm2时，细胞转染率为50%。光刀也可应用于研究细胞不同部分的功能。Grigaravicius等[45]将光刀应用于老化研究。Dna的自我修复作用在维持胞内生化反应中起着至关重要的作用，为了更多地研究Dna修复分子与Dna损伤位点之间的动力学，在时间和空间上有控制地敲除特定Dna很重要，光刀提供了卓越的空间和时间控制，因而成为该实验的理想工具。将光刀与荧光显微镜结合，他们发现，对Dna轻度损伤的修复发生在实际发生Dna损伤位点的旁边而并不直接位于该位点上，其原因需要进一步的研究。另外，紫外激光也可在细胞膜上钻孔，以观察荧光染料在细胞内的扩散，该技术被应用于研究细胞内区室之间的连接情况[46,47]。将紫外光导向相邻两个细胞的邻接点可引起两个细胞的融合，He等[48]应用这种方法，使用1550nm的飞秒脉冲激光将人肝癌细胞与人子宫颈癌细胞融合，细胞融合率为37%。多光镊的出现实现了多个粒子的同时操作，而使激光穿过空间光调制器(SLm-spatiallightmodulator)可得到需要的光结构。随着成像技术和计算机的发展，实现了全息计算直接与SLm连接，最终建立起全息光镊系统。monnoret等[49]将设计的储液池与全息光镊结合，引导多个橡胶微珠与cos-7细胞的特定区域结合，这项研究作为使包裹配合基的橡胶微珠与细胞膜密切结合的基础，可应用于细胞膜受体的动力学研究。此外，光镊在组织工程学研究中有巨大的应用潜力，mirsaidov等[50]通过将微流控系统与分时光镊结合，成功构建了人工合成组织。其中，微流控系统将细胞导入组织装配区；分时光镊用于将细胞组装成为复杂的培养组织，之后，这些细胞被包裹在模拟细胞外基质的可光聚合水凝胶中。通过上述过程的反复操作，该人工合成组织的体积逐渐增大。
细胞生物学实验技术篇6
该实验室积极从国内外引进优秀学术带头人和学术骨干，已经形成了具有创新活力、较强研究实力的全职团队，包括20位正副教授和正副研究员。他们大多具有博士学位和留学工作经历。另外，聘任姚新生院士、袁隆平院士、孔祥复院士、辛世文院士为双聘教授。
实验室针对人类对健康新的巨大需求和21世纪生命科学技术发展的优先方向和核心领域开展健康科学与技术研究，着眼于整体学科的建设和布局，强调与人类健康和疾病相关的多学科集成的综合性、创新性基础研究和应用基础研究，从而提供一个较全面地服务于健康产业的多方位综合性技术服务平台及自主创新的技术引擎。
蔡国平教授始终为实验室的主要研究方向掌舵护航，其研究方向主要包括：强调与人类健康和疾病相关的创新性基础研究及应用基础研究；药物和生物技术及技术产品的源头创新；多学科集成的营养与食品科学和技术研究；以抗体工程和基因治疗为重点的生物技术平台；面向新的医学模式的生物医学工程和技术平台；开拓以个体化的健康管理研究与教育。
2010年，实验室科研项目146项、总经费约2207万元，包括承担国家与政府项目127项，年服务企业（机构）12个，承担企业或社会项目7项。同期，共发表科技论文85篇，其中，SCi52篇、ei25篇。发明专利申请受理7项，专利授权4项，现已拥有发明专利15件。
多年从事健康科学与技术的教学与研究
作为清华大学深圳研究生院的生物学和海洋生物学博士生导师，蔡国平教授曾任生命学部主任、深圳市健康科学与技术国家重点实验室主任。目前还担任深圳市超级水稻研究重点实验室常务副主任、深圳国家生物产业基地深圳研究生院海洋生物技术中心主任、深圳市中药及天然药物研究中心-清华大学深圳研究生院生物技术与创新药物联合实验室副主任、清华深圳研究生院-深圳市北科生物技术有限公司干细胞研究联合实验室主任理事。深圳市科技专家委员会专家、广东“千百十工程”省级培养人才指导教师。中国健康管理学会理事、中国针灸学会经络分会理事、中国药理学报理事。先后在日本机能性肽研究所，香港科技大学，美国tomasJefferson大学医学院和CasewesternReserve大学医学院等为客座研究员。
已发表科研论文100余篇，SCi收录40多篇，参与编写著作4部、译著一部，申请和获得国家专利多项。还获得国家发明奖、北京科技进步奖、卫生部科技进步奖等奖项。
蔡国平教授致力于医学细胞分子生物学及健康科学与技术学术方向的研究，并在创新性基础研究和应用研发的统一，学科交叉融合与协作，探索学术与技术创新，形成了一定的学术特色。
主要研究领域与研究工作：
1.细胞因子的研究：
(1)血管生长因子的研究
基于体外脐带静脉血管内皮细胞的研究数据，提出假说：血管内皮细胞的增殖生长要经历细胞存活、有丝分裂和细胞迁移三个关键步骤，揭示细胞存活因子apoH、补体Bb，有丝分裂刺激因子insulin、FGF、细胞迁移因子和血清因子等相关因子在血管内皮细胞的增殖生长的作用。
(2)自身免疫病如抗磷脂综合症相关因子
载脂蛋白H在抗磷脂抗体综合症中作用的细胞与分子机理，发现载脂蛋白H自身抗体一类自身抗体的多重结合特性（特异抗原、磷脂、Fc、凝血酶等）及机体正常抗体作为中和自身抗体的生理缓冲池作用。探讨这种相互作用的生理病理意义。
(3)促溶栓因子研究
在纤溶系统作用机制创新研究中，发现一类新的促纤溶物质（简称Fpa）能使血纤维蛋白溶酶－tpa纤溶系统的纤溶活性提高十多倍之高，并且对凝血与纤溶系统的平衡有双向调节作用。研究Fpa与靶分子作用的结构分子生物学机理，为研究开发新型促溶(血)栓药物提供新的研究思路。
(4)巨噬细胞来源的纤维化疾病相关因子（iSBLp58）的基因克隆和功能研究。
2.血管生长和干细胞分化的研究，开展周血与骨髓基质干细胞向内皮细胞、成骨细胞和成脂细胞分化的机理研究。
3.膜和细胞生物物理学研究：
1）电磁场对细胞的作用
2）细胞凋亡分子机制
细胞凋亡的能力学过程及调节机制细胞凋亡的能力学及胶原抗羟自由基诱导的细胞凋亡的热力学分析；端粒酶的表达和活化与Bcl-2的表达之间的负相关性及两者间的内在联系与细胞凋亡；细胞凋亡的分子进化。
4.细胞外基质的研究：
1）胶原蛋白、蛋白多糖等细胞外基质的生物化学、生物物理学、分子与细胞
生物学及分子免疫学研究。
2）基质干细胞分化相关疾病（肺纤维化与肝硬化、骨质疏松症、疼痛等）的生理病理机理研究。
3)提出经络功能集成体（function-grity）的概念，提出细胞外基质在经络功能集成体中作为重要的载体，形成物质、能量与信息流的储存、传输和调节与缓冲的介质连续体,构成一个机体自检、自稳网络系统和功能集成体并与脑的高级意识和自稳系统协调一致。其机制首先是细胞外基质构成细胞间巨大的生理缓冲池，且胶原纤维等细胞外基质能直接地、长距离地传输电子与能量（包括电磁、机械力和热等能量形式），更重要的是细胞外基质通过与神经、血管的联系，在不同的躯体部位之间，躯体与内脏之间和不同脏器之间的信息传递和汇聚中起重要的传导介质作用，即所谓“行气血，通阴阳，以荣于身也”。同时，它们又可以与细胞内的功能集成体相连接和相互作用，从而在细胞层面上发挥其调节功能。
5．代谢性疾病的细胞分子学研究，着重开展糖尿病、高血脂症和血管硬化及血栓等的细胞分子学研究。
6．创新药物和保健品的研究开发，主要针对代谢性疾病、干细胞分化相关疾病和细胞外基质相关疾病等的化学药物、生物技术药物的研究开发。
7．海洋生物学与海洋生物技术的研究，有针对性地进行海洋生物功能基因等海洋生物学基础研究，开展海洋资源、海洋生物活性物质的研究，开展海洋生态环境保护与海洋药物等研发相关的生物技术研究。
科研成果还体现在多项科技发明专利
《硫代磷酰化氨基酸及其甲酯在制备缓解慢性疼痛药物中的应用》，通过实验发现硫代磷酰化谷氨酸和硫代磷酰化谷氨酸甲酯不仅对CCⅠ模型大鼠损伤神经的异位自发放电的放电频率具有显著的抑制作用，还能降低CCⅠ模型大鼠损伤侧足的热痛刺激敏感程度并可阻碍其进一步的发展。显示硫代磷酰化氨基酸及其甲酯可大大缓解神经性慢性疼痛症状，以硫代磷酰化氨基酸或硫代磷酰化氨基酸甲酯为活性成分，可制备用于缓解慢性疼痛（特别是神经性慢性疼痛）的药物。
《薤白提取物及其制备方法与应用》，从该植物提取物分离到有效活性分子，显示该化合物具有改善骨骼肌的能量代谢，加强胰岛素敏感性，减少腹部脂肪，降低血糖，促进脂代谢等作用，可用于目前日益增加的代谢综合征的防治或2型糖尿病的早期预防。
《肝宁在抗肝纤维化中的新用途》专利发明显示，肝宁能显著改善小鼠实验性肝纤维化程度。显示肝宁可能成为一种有很好前景的抗肝纤维化新药。
细胞生物学实验技术篇7
王志梁，南京医科大学第二附属医院生物治疗中心主任，医学博士，特聘教授。美国匹兹堡大学医学院心肺移植研究所、器官移植中心副教授；美国移植外科医生学会会员，国际移植学会会员，美国免疫学家协会会员，中国旅美科技协会理事、前副会长，中国旅美科技协会匹兹堡分会会长。1997年赴美国匹兹堡大学医学院留学，2002年获得免疫学博士学位。2003年作为显微外科专家，副教授，受聘于匹兹堡大学外科，从事器官移植免疫排斥和免疫耐受性的研究。两次获得“青年科学家奖”荣誉。作为独立研究员的研究项目先后获“美国国立医学研究院（niH）”和“美国心脏学会（aHa）”的科研基金。在Blood，american Journal of transplantation，transplantation等专业期刊发表55篇文献，被国务院侨办评为建国60年以来为祖国的科技发展做出杰出贡献的60名海外科学家之一。
2010年底作为特聘教授回到南京医科大学第二附属医院工作，任职“临床器官移植、生物治疗中心”主任。回国以来，先后荣获江苏省“双创人才”奖励、科技部和教育部联合举办的“春晖杯”一等奖。2011年国家自然基金一项，江苏省社会发展基金重点项目一项，被列为南京医科大学优秀人才重点培养对象，申请了4项专利，作为领军人才所领导的创新团队，荣获江苏省“省级创新团队”荣誉称号。
“发现免疫系统激活的关键原理，革命性地改变我们大家对免疫系统的理解。”2011年诺贝尔生理学或医学奖颁发给了发现免疫系统激活关键原理的科学家，评审委员会毫不吝啬地给予了最高的评语。
免疫应答作为一种能帮助人类与其它动物抵御细菌及其它微生物的生理过程，长久以来，科学家们一直在寻找它的“守护者”。近年来，随着肿瘤免疫学、分子生物学、生物工程技术的发展，如何从免疫和细胞这些癌症发病的根本原因入手，调动机体的防御机制，调节机体的免疫力，增强抗癌能力，从而抑制肿瘤生长、转移、复发，延长癌症患者的生存时间，已经成为世界各国科学家治疗癌症的方向，这也是癌症治疗的根本出路。
对此，长期从事细胞免疫学研究的南京医科大学第二附属医院生物治疗中心主任王志梁教授说：“细胞免疫治疗是一场免疫细胞的体外‘大练兵’，肿瘤治疗已经进入到一个全新的细胞免疫治疗时代！”
部署战场：抗癌长征路
手术、放疗、化疗，是癌症治疗的三种常规手段，几乎每个癌症病人和家庭都在沿着这条路艰难地前行。
“这些常规治疗虽然能暂时遏制肿瘤的发展，却无法从根本上解决其复发、转移和扩散问题；同时，巨大的毒副作用让自身免疫力下降，残存癌细胞迅速死灰复燃，反而加速了病情恶化。”王志梁说。
杀敌一千，自残八百！这是一场多么残酷的战争！每每说到这里，王志梁都带着悲痛的表情。因为，他也是这个过程的亲历者。当年，父亲不幸罹患肺癌，历经病痛的折磨，在长期的“以毒攻毒”式的治疗后，被癌症折磨得瘦骨嶙岣，极度虚弱。尽管如此，在经历了手术、放疗、化疗之后，病魔还是夺去了父亲的生命。
当时的王志梁已是一名出色的外科医生，他于1989年毕业于天津医科大学，1994年师从王鹏志、朱立伟教授读研，曾参与开展天津市第一例肝移植手术。但是，父亲的离去让他深刻地了解到当时国内医疗条件的落后及医疗技术发展的滞后。他坚信站得更高，才能望得更远，所以，他做出了一个重要决定：跨出国门，学习最先进的医疗技术，只有让自己医术更精才能对病人更好地负责！
1997年，王志梁赴美国匹兹堡大学医学院留学，经过五年的医学攻坚战之后，他获得了免疫学博士学位，并于读博期间通过美国职业医师考试。2003年作为显微外科专家，受聘于匹兹堡大学外科，从事器官移植免疫排斥和免疫耐受性的研究，并参与临床诊疗工作；2009年在美国allegheny General Hospital移植外科工作，主刀或参与了近百例肝、肾和胰腺移植手术。
这期间，一个全新的研究领域闯入了他的视野――细胞免疫学。
在长期的基础科研中，他首先发现了树突状细胞对移植的心脏有保护作用，进一步研究发现了树突状细胞的诱导免疫耐受作用。所在课题组在世界上第一个利用雷帕霉素修饰树突状细胞，使这种细胞变成疫苗样的状态稳定的致免疫性的树突状细胞，用来诱导器官移植后的免疫耐受。相关的研究工作先后从美国niH。美国心脏协会（aHa）获得总计905万美元的科研基金；由于出色的研究成果，他曾于2000年荣获国际移植学会颁发的“青年科学家奖”、2002年荣获全美移植学会颁发的“青年科学家奖”。
近3年来，依托匹兹堡大学平台，联合德国、意大利共三家移植中心，王志梁已经全面开始了临床应用的研究工作，并取得了稳定的具有显著临床应用价值的结果。同时，作为一名显微外科医师，他是目前世界上仅有的五位可做小鼠肝脏移植的专家之一。并先后获得“美国匹兹堡大学医学院心肺移植研究所、器官移植中心副教授”、“美国移植外科医生学会会员”、“国际移植学会会员”、“美国免疫学家协会会员”、“中国旅美科技协会理事、前副会长”、“中国旅美科技协会匹兹堡分会会长”等职称与荣誉。
在美国工作的10多年里，王志梁始终关心着中国在器官移植和细胞免疫领域的发展，一直和国内包括黎介寿院士的几大移植中心保持密切联系，曾先后应邀到中国科学院、天津医科大学、南京医科大学等进行学术交流。培养指导了10余名来自中国的进修医师和博士后，协助许多中国高校和医院与匹兹堡大学建立合作与交流关系，帮助和促成许多中国医生在匹兹堡这个世界最先进的移植中心学习和培训，使器官移植这一先进的医学领域在祖国得以迅猛发展。因而，王志梁被国务院侨办评为建国60年来为祖国的科技发展做出杰出贡献的60名海外科学家之一。
同时，在国外习得十八般武艺的王志梁始终也没有忘记当初出国的初衷。尽管国内的医疗条件以及技术得到了很好的发展与取得了长足的进步，但目前肿瘤医疗的局面仍需很大的完善与改进。2010年，王志梁作出了一个更重要的决定：回国。作为南京医科大学第二附属医院特聘教授，他把细胞免疫学的先进技术带回来了，并用这些技术打造一支战斗力超强的特种部队。特种部队：不战而屈人之兵
曾有免疫学专家说：“世界上每一个人最好的医生就是他自己的免疫系统。”的确，人体的免疫系统就像一支训练有素的军队，保护着人们的健康。它的强弱，决定着人们抵御疾病入侵时的能力。人之所以患肿瘤，是因为人体内对肿瘤具有识别杀伤的免疫细胞遭到破坏，从而无法有效地抵抗肿瘤细胞的疯狂增长。细胞免疫治疗技术正是通过从患者体内抽取部分免疫细胞，然后在其体外进行培养、诱导、激活等一系列操作，使其抗肿瘤的活性大大提高后，再把这些本来就来源于病人自身并在体外激活了的抗肿瘤细胞回输到病人体内，让这支经过特殊训练的“特种部队”去杀灭肿瘤细胞。
我们都知道，在战争中要实现以最高的效率、最低的损耗，在最短的时间取得最大的胜利，情报、武器、战略、战术、后勤保障等因素缺一不可，且看王志梁麾下的这支“特种部队”有着：
――最称职的情报员：DC细胞
情报在战争中有着举足轻重的作用，有时甚至决定着一场战争的成败。而在细胞免疫治疗中的“情报员”树突状细胞（DC），像“雷达”一样，能主动搜索、识别肿瘤细胞，并把信息传递给免疫细胞，激活免疫细胞杀灭肿瘤。“通俗地讲，DC细胞相当于信使，将抗原信息传递给可以发挥免疫效应和杀伤功能的效应者即t细胞。”王志梁说。DC细胞是目前已知的体内功能最强的抗原提呈细胞，能够刺激初始型t细胞增殖活化，识别肿瘤细胞，并能抑制肿瘤血管生成，同时激发免疫记忆保护。它广泛分布于淋巴结等体内各个部位，一旦有异物侵入，即将其拖入细胞之中，并分解为抗原分子。与此同时，它还会在细胞表面提示异物的特征信息，向其它免疫细胞通报攻击对象。
――最精良的武器：CiK细胞
CiK细胞是杀伤肿瘤细胞的“精确导弹”，因为它对肿瘤细胞的识别能力很强，能“瞄准”肿瘤细胞进行杀伤，且不伤及“无辜”。CiK细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞，即nK样t淋巴细胞，它是自体外周血单个核细胞，经过特殊的培养技术，CiK细胞在数量上可获得数千倍的增长，对癌细胞的杀伤能力可增强数十倍。CiK疗法不仅能直接杀伤癌细胞，还能增强机体免疫系统，最大可能地恢复细胞正常的生长调节，为彻底进行癌症治疗提供了新的途径。
――最坚实的战略：以子之矛攻子之盾
肿瘤细胞是因正常细胞发生变异，逃逸机体免疫系统的监控而破坏正常组织。生物细胞免疫治疗正是通过患者免疫系统中的“抗癌因子”来杀灭肿瘤，具体治疗过程为：从肿瘤患者自身外周血中分理出专门杀灭肿瘤的DC和CiK单核细胞，通过实验室培养增殖后，以“输液”的方式回输患者体内，进入患者体内的DC细胞可识别病原，激活获得免疫系统；再利用细胞因子诱导的杀伤细胞CiK，发挥自身细胞毒性与分泌细胞因子，杀伤肿瘤细胞，对身体没有伤害，还能修复提高患者免疫系统，有效减少肿瘤转移和扩散，克服传统治疗方式“不彻底、易转移、副作用大”的弊端。同时，因为DC－CiK细胞是诱导、激活的自体细胞，没有通常放疗、化疗后明显的毒副反应。简单地说，DC－CiK细胞免疫治疗就是“用自己的细胞治自己的病”。
――最高效的战术：“雷达＋导弹”精准杀瘤
以信息技术为核心的高新技术在军事领域的广泛运用，使得精确作战具有很高的作战效能。在这场抗癌大战中也是这样，DC－ClK细胞免疫治疗相当于“雷达＋导弹”。它产生了一个高效和谐的免疫体系，经专项实验室诱导、增值、活化后，再回输到患者体内，可以显著抵制肿瘤细胞的生长、增殖，帮助机体恢复同肿瘤细胞作斗争的能力，最大限度地调动人体免疫功能，全方位防止复发和转移，明显改善患者的生活质量，有效延长生存期。由于DC和CiK细胞两者在抗肿瘤细胞中的互补作用，联合应用可取得“1＋1＞2”的疗效。
――最彻底的革命：“癌怕”突破自体免疫耐受
无论是nK技术、CiK技术或DC－CiK技术，在临床应用上都存在一个难题，那就是如何解决肿瘤细胞的免疫逃匿机制，它们难于突破自体免疫耐受，迫切需要新的手段来提高疗效。这种新手段就是iapa技术，人们形象地称之为“癌怕”。这是一种怎样的技术呢？王志梁说，iapa技术是通过靶向性抑制机体内免疫细胞信号传导通路关键性抑制因子SoCS1，使机体突破免疫耐受，诱发强大的抗肿瘤特异性免疫反应，从而提高肿瘤细胞治疗的疗效，在一定程度上解决了肿瘤细胞的免疫逃匿难题。
所谓“不战而屈人之兵，善之善者也”，兵圣孙武在2000多年前提出的不战而胜的“全胜思想”，应用到细胞免疫治疗中，形成的是一个绿色抗癌的战场。临床证明，细胞免疫治疗能克服手术、放疗、化疗三大传统治疗方式的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端，部分患者可提高三到五年生存率近一倍，是国际公认的有望消灭癌细胞的肿瘤治疗第四大新技术。
后勤基地：生物治疗中心
古语有云，“兵马未动，粮草先行”，后勤保障是增强部队战斗力和凝聚力的基础。2010年，刚回到南京医科大学第二附属医院的王志梁就着手建设一个“特种部队”的后勤基地。
2011年11月，在王志梁的主持下，南医大二附院生物治疗中心成立了。这是一个按照现行的国际标准建立的生物治疗中心，具有高规格的细胞实验室，核心洁净区（整体万级，局部百级）大于面积300平米，符合国家食品药品管理局行业标准（GLp）要求。配置先进的实验设备，建成符合国家Gmp标准的细胞制备实验中心，并已通过权威机构认证检测，引进来自美国匹兹堡大学和美国贝勒医学院的最新生物技术。
生物治疗中心致力于生物技术领域的研究，目前中心拥有的生物技术包括：免疫细胞技术（Dc＼CiK、iapa＼DC＼CtL），主要用于治疗肿瘤、肝炎等；干细胞技术（脐血mnC、脐带mSC、脂肪mSC、HRpe），主要治疗糖尿病、心脑血管疾病、自身免疫系统疾病、神经系统疾病等；组织工程医学技术（胰岛细胞移植），主要治疗糖尿病等；基因角蛋白检测技术，主要进行早期癌症筛查。同时，按照现行的国际标准改造了动物实验中心；并利用自己独特的显微外科技术建立了一些与临床工作相关的动物疾病的实验模型。目前已取得有价值的预实验结果，为科研工作提供了良好的技术支撑平台。
在王志梁教授的带领下，南医大二附院生物治疗中心秉承“临床发现－实验室－临床实践”的转化医学的创新理念，为无数被病魔折磨、甚至面临死亡的患者带来了福音。团队独家拥有的国际专利一iapa（antigen presentationattenuator），是一种新型的抗肿瘤、免疫细胞治疗技术，用于治疗恶性肿瘤。它完全打破传统免疫学理论，创新性强，处于国际领先地位。目前，研究成果已在《nature medicine》等国际一流杂志发表，受到医学界高度关注。中心成立至今，已诊治了来自包头、青岛等地的100多名患者，主要包括肺癌、肝癌、乳腺癌、胆管癌、胃癌、宫颈癌等多种疾病，治疗后，根据复查结果，大多数患者各项指标均有明显好转，有效率达到82.79％，取得了良好的治疗效果，得到相关专家的肯定。
中心在王志梁教授的主持下，创建了一支由多名博士、硕士组成的治疗团队。仅仅一年时间，他们已经承担了多项国家和省部级科研项目，拥有完善的研究体系和技术平台。同时开展了肿瘤的生物治疗的临床研究，取得了良好的临床疗效。创新团队去年荣获江苏省卫生厅的“医学领军人才与创新团队”称号。王志梁个人先后荣获江苏省“双创人才”奖励、科技部和教育部联合举办的“春晖杯”一等奖，被列为南京医科大学优秀人才重点培养对象。接下来，王志梁说，他将利用国际合作关系，建设一支具有国际水平的临床及科研专业人才梯队，培养出国家“”级专家、333工程第一层次人才，以“干细胞对移植胰岛的保护作用研究及其临床应用”为研究方向，力争短期内使其细胞治疗的水平在国际上处于领先地位。
反哺社会：弘扬大爱，温暖人心
2012年8月，南京莱茵达大酒店，“肿瘤患者康复公益课堂”里挤满了人，王志梁教授在耐心地为在场的患者解答疑惑、提供建议。
“我们希望让更多的人知道这种绿色疗法，使更多癌症患者避免治疗误区，减轻治疗痛苦。”王志梁说。为了帮助广大肿瘤患者及家属解决肿瘤治疗过程中面临的问题与困境，鼓励肿瘤患者以健康积极的心态面对自身病症，更为减轻无数个肿瘤患者家庭不幸、为他们重塑幸福的人生，南京医科大学第二附属医院生物治疗中心联合南京癌友康复协会合力开办“肿瘤患者康复公益课堂”，为患者带去最前沿的肿瘤治疗绿色科技。迄今为止，这个课堂已成功举办四次。
肿瘤康复课堂主要针对各种肿瘤患者病症，以专家面对面的形式为患者解决肿瘤治疗过程中遇到的难题与困境，更为处在康复期的患者提供康复期应该注意的重点与必要的治疗保健措施。王志梁和其他专家在现场的诊疗无疑为患者在治疗和康复期间提供了很好的专业性咨询机会。在这里，王志梁和生物治疗中心的每位工作人员也以积极向上的心理状态去感染每个被癌症折磨却坚强求生的肿瘤患者，为他们在减轻治疗带来的生理痛苦的同时，鼓励他们以更加积极乐观的心态与癌症作斗争。
此次康复课堂主要面对的是处于肿瘤康复期的患者，大多数人已经尝试了前期的治疗，但目前他们最为担忧的还是康复期间如何防止肿瘤的复发与转移。对此，该系列课堂特地为患者提供了更多减少或延缓防复发转移的技术与方法。
对于肿瘤康复期的患者，在保持良好的心态的同时，应该讲求预防复发转移的方法方式，除了定期做检查，还应利用手术或放化疗之后那段最佳的时间，利用其他治疗手段进行巩固并进一步清除体内癌细胞，这对后期患者的康复以及减少或延缓肿瘤的转移复发具有显而易见的功效。而该中心采用的iapa免疫细胞治疗是继手术、放疗、化疗之后，肿瘤治疗的第四大模式，可以辅助前期传统治疗的治疗效果，减轻患者治疗过程中的痛苦，提升患者的免疫力与生活质量。
所有的癌症患者都需要被关爱，无论是处于肿瘤治疗的何种阶段，治疗过程中身体面临的伤害与精神面临的巨大压力，都会影响患者的对生活的态度及对幸福的感受与认知。所以，王志梁强调，联合治疗，在有效增强治疗效果的同时，也将对人体的伤害减到最小，让患者能够自主享受生活中的每份自由与惬意。
“21世纪是细胞治疗的世纪，每一个生物体都是或者曾经是一个细胞，生物学问题最终都要追溯到细胞中去解决！”采访最后，王志梁教授对细胞免疫治疗的未来充满了信心。在他自信的话语和憧憬的眼神中，我们仿佛听见绿色抗癌的“集结号”已经吹响，而他，带领着他的久经训练的“特种部队”，整装待发。
平台依托
冬青南京生物科技有限公司
冬青南京生物科技有限公司（Holly（nanjjng）Bio－technology Co.，Ltd）成立于2012年5月8日，注册资本200万元，是由留美生物医学专家团队全资创建独立法人资格的高新生物技术企业。
公司致力于细胞生物技术（细胞、组织工程、基因技术）的研发与推广，遵循“临床一实验室一临床”的宗旨，加快细胞生物技术（细胞、组织工程、基因技术）的临床转化，实现有效临床治疗，解除病患痛苦。
公司已建立Dc肿瘤疫苗技术等三大核心技术平台，可生产针对13种恶性肿瘤，近40种DC疫苗产品，提供一种全新的肿瘤治疗方法与个性化治疗模式；并着手建立干细胞技术平台，主要用于多种疾病的治疗，目前已用来治疗如自身免疫系统疾病、脊髓损伤、小儿脑瘫、脑萎缩、老年痴呆、中风脑出血、脑梗塞、脑外伤、视神经萎缩、进行性肌营养不良、股骨头坏死、下肢血管性疾病、糖尿病、慢性肝病等尚不能用传统疗法治愈的顽疾；同时致力于研发treg疫苗，试图通过细胞治疗来纠正不孕症患者体内treg的表达水平，解除抗的免疫反应，达到妊娠的治疗目的。
北京英默生物科技有限公司
北京英默生物科技有限公司以美国贝勒大学医学院细胞与基因治疗中心独家发明全球pCt专利一iapa技术为依托，以自主创新研发的专利技术与产品为核心竞争力，旨在打造世界一流的专业化肿瘤和肝炎的综合生物治疗中心，集治疗、诊断、预防、康复、科研、开发为一体，为实现肿瘤的早期诊断、早期治疗，使肿瘤由恶性、突发性不治之症转变为慢性、可控制性疾病，提高病人生命质量、延长生存期而不懈努力。
英默生物是科研转化公司，与美国贝勒大学医学院肿瘤细胞与基因治疗中心、南加州大学美国南加州大学医学院norris肿瘤综合治疗中心建立了长期的战略合作关系。公司拥有强大的持续研发能力，在北大首钢医院吴阶平泌尿外科中心二层投资千万自建了1000平米国际领先的生物细胞实验室。
细胞生物学实验技术篇8
[关键词]干细胞；治疗乱象；监管政策
[中图分类号]D63[文献标识码]a[文章编号]1002-8129（2017）01-0072-07
干细胞研究是当今生命科学中关注度较高的前沿领域之一，多次入选美国《科学》杂志每年公布的世界十大科技成果。干细胞技术将在细胞生物学、发育生物学、再生医学、动植物品种改良及其生物反应器研发、新药研发与评价等方面扮演十分重要的角色。
2016年8月8日，国务院正式印发了《“十三五”国家科技创新规划》，干细胞技术被列入战略性前瞻性重大科学问题。《规划》指出，要开展干细胞与再生医学等关键技术研究，构建具有国际竞争力的医药生物技术产业体系；要将干细胞及转化列为我国战略性、前瞻性重大科学问题，实现重大科学突破、抢占世界科学制高点。
然而，经过2012年上半年以行政措施为主要手段的整顿后，我国的非法干细胞治疗仍较为普遍。这不仅给接受干细胞疗法的患者带来人身财产损失，而且给医学界造成严重不良影响。2009年和2012年，国际期刊《自然》两次以头条文章对中国某些医疗机构提供干细胞疗法的做法表达严重关切，并“质疑中国干细胞治疗的安全性”。为确保干细胞技术及产业健康稳定发展，必须建立严格有效的干细胞监管机制。
一、干细胞治疗乱象
目前，干细胞治疗应用在国内外学界还处于探索阶段。对于某些人称的干细胞可以治疗中风、小便失禁、肺部疾病，甚至癌症、肌萎缩侧索硬化、帕金森病、自闭症等一系列疑难杂症等，医学研究均尚未证实；目前也没有证据显示干细胞提取技术能够完整、无菌地提取细胞。此外干细胞治疗还存在一定风险，如诱发肿瘤，产生免疫反应，导致移植物抗宿主病。
干细胞药物和治疗需要严格审批。国内外业界都普遍认同，只有经过医药卫生主管部门批准的医疗单位和干细胞治疗技术或药物，才能进入临床应用。干细胞治疗乱象就是指一些医疗机构未经国家药监机构批准，在不具备充分的科学依据、缺乏透明度、没有监控机制的情况下，以营利为目的开展干细胞临床研究和应用项目。
（一）案例：干细胞旅游
近年来，越来越多的病患奔赴海外接受干细胞治疗，形成了所谓的“干细胞旅游”（StemCelltourism），其最常见的目的地集中于美国、中国、印度、泰国、墨西哥、德国、巴西等国。一般来说，这些病患极度渴求治愈疾病或改善身体状况，在本国无法获取或无力承担干细胞治疗，网络信息获取的便利性使他们无法忽视非法医疗机构夸大其词的推销和毫无根据的承诺，加之新闻媒体对干细胞疗法言过其实的报道[1]，最终促成了海外求医之旅。上述国家之所以成为“干细胞旅游”热门目的地，并非因为其干细胞治疗技术有多先进，主要是因为其针对干细胞治疗的监管相对宽松甚至监管缺位，暴露出或大或小的法律漏洞。[2]
干细胞诊所通过互联网进行的宣传广告是诱导患者接受干细胞治疗的重要因素。尽管这些诊所提供的治疗都未经临床验证，其安全性和有效性几乎没有任何保证，但多达90%的诊所言之凿凿地声称其治疗安全可靠，甚至15%的诊所声称“毫无风险”，多达88%的诊所称其治疗有效，其中9%的诊所指向了相关的研究出版物以证明其结论。34%的诊所会提及其治疗过的病患人数，25%的诊所还会提供治疗结果的相关数据。干细胞诊所声称可以改善或治愈的病症五花八门，其中最常提及的疾病是多发性硬化症、帕金森症、中风、脊髓损伤、脑瘫等目前难以攻克的顽症，这正好契合了患者的需求。[3]
声名狼藉的X细胞中心曾是许多病患进行“干细胞旅游”的首选。2007年，一名具有制药业背景的荷兰人CornelisKleinbloesem在德国创立了这个干细胞诊所。由于当时德国的干细胞治疗相关法规存有漏洞，允许进行实验性干细胞治疗。正是利用了这一可乘之机，X细胞中心堂而皇之地在德国开业行医。在其营业期间，X细胞中心治疗过成千上万的海外患者，其干细胞治疗最低定价3000欧元，最高可达10000多欧元。X细胞中心的商业性“成功”主要归功于其利用了将干细胞视为“万能灵药”的全球性狂热，利用了干细胞患者对干细胞治疗的高心理预期，通过天花乱坠的宣传把不切实际的希望贩卖给穷途末路的患者和患者家属。中心网站还分享了病患通过干细胞疗法治愈的故事，煽情渲染了干细胞疗法创造奇迹的伟力。此外，中心还巧妙通过租用天主教会医院大楼作为办公场所来营造可信可靠的印象。[4]
2010年5月，一名10岁的阿塞拜疆男孩在脑部注射干细胞后出现了严重的脑出血。三个月后，一名18个月大的罗马尼亚男婴在接受类似治疗后死亡。星期天电讯报（Sundaytelegraph）对这两起不良事件进行卧底调查发现，X细胞中心的干细胞疗法没有任何科学数据依据；中心大多数病患数据源自通过电子邮件或电话完成的调查问卷，而不是科学的临床试验。德国政府因此对X细胞中心的合法性重新进行审查，同时立即采取行动弥补法律漏洞。X细胞中心于当年关闭。[5]然而不久之后，CornelisKleinbloesem故伎重演，利用黎巴嫩的法律漏洞，在其首都贝鲁特成立诊所Cells4health，继续开展干细胞治疗。
（二）乱象原因
干细胞治疗乱象是多种因素综合作用的结果。为了获取干细胞治疗安全、有效的证据，通常需要花费很多年时间进行临床试验，且需花费近千万美元的资金。一些机构为了尽快营利而选择了非法经营的“捷径”。非法机构的虚假声称促使患者产生摆脱痛苦病症的迫切渴望；加上新闻媒体哗众取宠的报道、对专家话语的扭曲转述，以及社会知名人士目的暧昧的推荐，共同促成了患者不切实际的希望。民众普遍缺乏专业的宣传教育，正规医疗卫生机构和专业学会对干细胞疗法的风险揭示和警示不足，信息严重不对称。此外，监管机构的法规不严谨、政策不明晰或执行不到位，都会被不法之徒加以利用。
二、各国监管经验
由于干细胞临床应用远未达到成熟阶段，非法干细胞治疗严重损害了患者利益，一些国家也纷纷在探索中建立干细胞应用监管机制和措施，对干细胞治疗的安全性、干细胞技术临床应用的监控和管理愈加重视。其中，美国、欧盟、日本、韩国等国的干细胞技术发展较为领先，相应的监管政策也较为完善。
（一）美国做法
美国在干细胞研究领域保持着全球领先地位。虽然由于和政党政见不统一等原因，干细胞研究几经废立，但随着美国新政策的解禁和产业界对干细胞治疗的大力支持，美国干细胞产业呈现加速发展的态势。
FDa把干细胞定义为“人体细胞、组织以及细胞和组织产品（HCt/ps）”。干细胞临床试验、干细胞治疗、干细胞产品生产、销售等环节均由FDa下属的生物制品评估与研究中心（CBeR）负责监管。美国的干细胞产品审批过程和时间与其他生物制品药品一致。总的来说，其监管重点集中在三个方面：限制从捐赠者到接受者传染病传播的风险；建立生产质量管理规范，使感染的风险降到最低；收集干细胞制品在加工过程中的安全性及有效性证明。[6]
CBeR根据风险的等级采用分级分类管理模式，以确保细胞产品的安全性和有效性。异体来源、经过复杂处理制备的、非同源使用的细胞产品（351产品）7受到严格监管，必须通过和药品一样的审评审批程序才能投入临床使用。即此类细胞产品须在经过严格的Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期临床试验，并且在结果可靠的前提下向FDa提交生物制品许可证申请（BLa）或新药申请（nDa），获得审批后才可进入市场。自体来源、未经体外细胞复杂处理、同源使用的细胞产品（361产品），包括人造血管、腱、等。这类细胞产品可由执业医师作为“医疗操作”（practiceofmedicine）“t疗程序”（medicalprocedure）的一部分在患者身上使用，而无需FDa批准。[8]
FDa还出台了指导企业及临床试验研究的技术性指南。根据指南规定，适用pHSact361的产品必须只能经过最低限度的处理（minimalmanipulation），即通过简单的手术步骤取自患者身体并置回患者体内，且没有和水、晶体和保鲜剂以外的物质或器械结合使用。[9]
但是，探究当前美国干细胞治疗乱象，可以发现监管法规的不明晰是一个重要的原因。根据法律规定，细胞产品是否经过“复杂处理”，是判断其为351产品或361产品的重要标准，因而也是决定其是否需要经过FDa批准的关键因素。但到底什么程度的处理堪称复杂，多么微小的处理堪称最低限度，法律和指南都没有予以明确而不容置疑的界定或者进行完整而不容混淆的罗列。此外，指南还有豁免条款。指南指出，如果某组织从病患身上取出，并在同一手术过程中重新注入病患体内，那么该组织就被视作361产品，而无需满足其他要求。一些制药公司和非法诊所就利用了这写法律漏洞来谋利。他们声称自己生产或采用的是仅仅经过简单处理制备的361产品，无需经过审批。此外，通过同情用药（compassionateuse）机制10，临床研究之外的身患绝症或无药可救的患者可以使用在研干细胞产品。
（二）欧盟做法
在干细胞治疗应用的监管上，欧盟于2004年颁布有关人体组织和细胞研究及应用的母指令，为捐赠、获得、测试、加工、保鲜、储存和分配人体组织和细胞制定的质量和安全标准，为成员国相关立法提供了一个制度框架；2006年颁布2个技术指令，为成员国相关立法提供了详细的技术基准。2008年12月，欧盟开始实施新型医疗产品11（advancedtherapymedicinalproducts，atmp）法规Regulation（eC）no1394/2007。该法规定，如果细胞疗法中所使用的细胞已经过超过最小限度的处理、或这些细胞的用途有别于其在人体内的一般功能，那么这种细胞疗法应被定义为医疗产品。[12]干细胞产品是新型医疗产品，新型医疗产品规范适用于所有干细胞产品。该法还规定，具有医疗设备性质的新型医疗产品须通过集中审批程序上市；成立新型医疗委员会（Cat），对新型医疗产品评估进行评估，为新型医疗产品分类提供科学建议，为临床研究设计提供建议，对临床研究质量和非临床早期数据进行认证；不同产品需满足特定的技术要求、风险管理和可追溯要求；对中小企业提供特别激励政策。[13]
欧洲药品管理局（ema）和新型医疗委员会（Cat）负责审查干细胞治疗产品上市许可申请。特殊情况下也可以采取单项评估的方式独立评估技术或制品的有效性和安全性。干细胞产品审查时间与其他医疗产品一样，评估最多需要210多天，由欧盟集中审查。[14]
此外，和美国类似，在两种情况下，未经审批的在研干细胞产品可以获得atmp法规的豁免，由临床试验以外的患者使用。一是同情用药机制，二是允许专业医生将包含患者本人干细胞的私人订制的医疗产品作为“医疗操作”（medicalpractice）在患者身上使用。[15]
新型医疗产品的临床试验由各成员国自行监管。各国还须采取措施确保干细胞产品的生产企业符合母指令要求。英国在干细胞技术产品及药品监管上成立了人体组织管理局（Hta）及药品和保健产品监管署（mHRa）两个监管机构。Hta监管应用于临床治疗中的组织和细胞；从这些细胞和组织中获得的产品，归类为医药产品，则由mHRa监管。Hta规定干细胞基础研究和临床应用的各种标准，负责监督干细胞采集、处理、储存、分配以及患者的知情同意和临床治疗；mHRa是卫生部的执行机构，属于政府机构，负责监管干细胞产品的生产、加工、销售、评估及授权、不良反应监测。[16]
（三）日本做法
由于积极的社会支持和不断增长的社会投资，目前日本拥有众多世界级领先的干细胞研究项目。同时，日本政府支持研究所和大学从事干细胞产品及技术研究，鼓励聘用精通西方专利系统、有海外工作经历的专家，对日本研究机构提供干细胞专利应用战略咨询。
2014年11月以前，日本根据《药事法》规范细胞和组织医疗产品上市。干细胞产品可作为药品或医疗器械申请上市。为了提升再生医疗的安全性，日本于2013年通过了《再生医疗安全性确保法》。同时，由于原有《药事法》的规定已不再适应再生医疗细胞产品的特点，日本对其进行修订，并将其更名为《日本药品、医疗器械和其他医疗产品法》。随着2014年11月两部法律实施生效，日本干细胞监管体系发生重大变革。
《再生医疗安全性确保法》的适用对象为所有安全性和有效性尚未得到证实的细胞治疗技术，不仅包括研究机构关于干细胞疗法的临床试验，也包括常规操作中使用经过处理的细胞进行治疗的细胞疗法，如使用免疫细胞治疗癌症或干细胞美容等。已被证实安全性和有效性的疗法，如器官移植不在该法规范范围内。
该法根据干细胞疗法对人体潜在风险的高低程度将其分为三类，不同分类的干细胞疗法的临床试验申请须经过不同的审批程序。第三类技术是低风险等级，医疗机构须向经认证的再生医疗委员会提交该疗法的临床试验计划。计划获批并提交至厚生劳动省后方可进行临床试验。第二类技术为中风险等级，医疗机构须向经认证的专门的再生医疗委员会提交该疗法的临床试验计划。该委员会应具备第三方机构的独立性，并掌握较高的审评技术。计划获批并提交至厚生劳动省后方可进行临床试验。第一类技术为高风险等级。医疗机构的临床试验计划获再生医学委员会批准并提交至厚生劳动省后，厚生劳动省后可将临床试验计划延期至多90天。在此期间，厚生劳动省可就临床试验计划的恰当性咨询健康科学委员会（HealthScienceCouncil）。如果计划不符合厚生劳动省设定的安全标准，申请机构应更改计划。使用诱导多功能干细胞和胚胎干细胞的治疗和研究被划分第一类技术。
该法将医疗机构或营利设施使用的经过处理的细胞定义为特别处理细胞，而不属于《日本药品、医疗器械和其他医疗产品法》所定义的再生医疗产品。营利设施进行细胞处理必须获得厚生劳动省颁发的许可证，而医疗机构须公告。该法还允许医疗机构的医生在营利设施进行细胞处理，以此促成研究机构和业界在研究初期阶段的交流合作，在细胞处理方面加速创新技术投入使用，同时保证其安全性和有效性。[17]
《日本药品、医疗器械和其他医疗产品法》主要对再生细胞医疗产品（regenerativemedicalproduct）的生产和上市进行规范。干细胞产品属于医疗再生产品。干细胞产品生产企业须向日本药品与医疗器械管理局提交上市申请，由厚生劳动省进行审评。再生医疗产品既可通过一般的新药审批途径上市，也可在临床试验初期，在验证产品的安全性、并预期产品有一定的有效性之后，获得“有条件的限时上市”（conditionaltime-limitedmarketingauthorization）。但产品上市后仍需继续验证其安全性与有效性才能获得二次批准，最终正式上市。通过后者可以大大加快审批速度，在确保安全性的前提下使患者尽早获得治疗。[18]
（四）韩国做法
韩国政府大力支持投资干细胞研究，韩国总统把干细胞产业形容为国家经济的“新增长引擎”。在韩国干细胞研究领域推动发展的同时，韩国还相应成立“国家干细胞银行”，以此进一步推动干细胞领域的生产、储存以及管理的标准化构建。[19]
2013年，韩国食品药品局提升为韩国食品药品安全部（KoreanministryofFoodandDrugSafety，mFDS），负责制定、修订干细胞的相关法规和指南，行使细胞治疗产品的审批权。韩国将干细胞产品归类于细胞治疗产品（celltherapyproducts，Ctps），作为生物制品来管理。干细胞产品须先进行新药临床试验申请，经批准后进入i期、ii期和iii期临床试验阶段，验证其安全性和有效性。通过临床试验后，方可提出新上市许可申请。经批准后才能上市。[20]
为了加速干细胞产业化发展进程，韩国国会议员曾多次提议立法缩减干细胞产品的临床试验过程，此后韩国政府推出了关于推进干细胞产业投资发展的政策，简化干细胞治疗产品授权的过程。[21]其中，对干细胞产品在同行评审数据公布之前予以上市批准、允许iii期临床试验阶段的干细胞产品进行销售的措施饱受争议。222011～2012年，当时的韩国食品药品管理局（KFDa）在短短半年时间里批准了三款干细胞药物，尽管KFDa坚称已采用国际最佳标准对这些干细胞药物进行安全性和有效性验证，但如此迅速的审批过程仍引发了国内外学界的质疑。
三、结论
有效的监管机制和监管科学的发展往往相对滞后于新兴技术和产业的发展，干细胞技术的情况也是如此。现阶段世界范围内尚未形成针对这一新兴疗法的有效监管措施。
从美、英、日、韩对干细胞研究与应用的监管情况可以看出：
不少国家的药监机构都认识到现有的药品监管体系未必适用于干细胞产品，一些国家或地区近年开始改革现有监管体系或就干细胞单独立法，如欧盟于2008年开始实施新型医疗产品法规，日本于2014年底开始实施《再生医疗安全性确保法》和修订后的《日本药品、医疗器械和其他医疗产品法》。
根据风险等级进行分级管理是干细胞监管的主要特点，高风险干细胞产品须通过和药品一样的审评审批程序才能上市，低风险干细胞产品在一定条件下可视为“医疗操作”、“医疗程序”，无需监管机构审批。其中日本对干细胞临床试验也采取分级管理。
根据多数国家规定，判断某干细胞产品是否低风险的标准之一是，该干细胞是否仅仅经过最低限度处理。但对于哪些操作是最低限度处理，各国的规定都比较含糊。
高度重视干细胞产业化发展的日本和韩国都采取了加速干细胞产品审评的措施，但这些措施是否会影响产品安全性和有效性验证还有待考察，如何在产业发展和公众安全中取得平衡仍是亟待解决的问题。
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[7]351产品适用《公共卫生法》第351节的规定，361产品适用第361节的规定。
[8]Hermestaylor-weiner，andJosh-
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[9]ibid.
[10]2009年，FDa设立了“同情用药”机制，即“拓展研究中药物在治疗中的使用”（eaiDFtU）。同情用药申请程序的启动需要满足一个先决条件――负责治疗这位患者的临床医生和制药企业愿意为了救治这名患者而向FDa提出申请。但随后，美国出现了几起患者利用社交媒体争取公众支持的轰动事件，旨在向药厂施压，以获得他们的实验药物。专家认为，同情用药并不是一个简单通用的解决方案，有违公平原则，而且同情用药不能取代临床试验。
[11]又译作先进医疗产品、新兴医疗产品等。欧盟定义的新型医疗产品包括：体细胞疗法治疗产品（somaticcelltherapymedicalproduct）、基因疗法治疗产品（genetherapymedicalproduct）、组织工程化产品（tissueengineeredproduct）。
[12]CasimirmacGregor，alanpetersen，meganmunsie.RegulationofunprovenstemcelltherapiesCmedicinalproductormedicalprocedure？[eB/oL].
[13]Srinivasann.Kellathur，Huei-XinLou.Cellandtissuetherapyregulation：worldwidestatusandharmonization[J].Biologicals，40，2012.
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[18]ibid.
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细胞生物学实验技术篇9
关键词：细胞生物学教学能力培养生物技术实验技能
当前处于知识爆炸阶段，科学技术突飞猛进，理论和技术日新月异。细胞生物学是生物技术专业的一门重要的专业基础课，由于该科目涵盖面广，内容庞杂，加之近些年细胞生物学科的迅猛发展，使得细胞生物教学任务更加繁重［1］。为使学生适应科学技术的飞速发展的现状，教学中不仅要抓好本专业科学知识的传授，同时仍不可忽视对学生能力的开发，既要打好专业基础，又要培养日后探索和掌握知识新技术的能力。我在二十余年的教学生涯中，除重视基础理论知识、基本操作技能的传授外，还注重培养学生分析问题、解决问题的能力，现将做法和体会总结如下。
一、把课堂教学作为培养学生思维能力的重要环节
1.组织自学和讨论，启发学生思考。
为充分调动学生的思维活动，必须对课堂上老师讲学生听的教学结构进行改革，有计划地组织自学和讨论，以自学―讨论―小结的方法进行部分内容的教学，培养学生的独立思考和阅读能力。
首先是在通俗易懂的段落章节进行。如：原核生物与真核生物的区别等。先提出问题，让学生带着问题自己阅读找答案，讨论，教师小结。针对细胞壁、核膜、染色体、细胞器等基本结构，让学生找出异同点，加以鉴别。然后对难度较大的问题组织自学阅读。如讲电子显微镜技术时，先介绍电子显微镜的基本知识。提出：为何电子显微镜的放大倍数可达到106?学生带着问题看书、讨论，找出答案。
在难度较大的细胞凋亡――凋亡的生理意义、检测方法、分子机制讲完后，让学生归纳分类，这样既锻炼了学生归纳问题的能力，又便于记忆。接着又提出Caspase依赖性和Caspase非依赖性的细胞凋亡途径，动物是如何进行生死抉择：细胞凋亡的调控？把学生思维引向深入，使思路更加开阔。
2.运用启发式教学，引导学生思考。
课堂教学是培养学生分析问题，解决问题能力的重要途径。授课同时要善于启发，从问题入手，鼓励学生质疑，引导学生思考。如讲细胞周期调控时，提出：早熟染色体凝集（pCC）现象的发现与非洲爪蟾卵母细胞减数分裂实验是如何证明细胞分裂促进因子（mpF）的存在？p34cdc2激酶与周期蛋白的发现与mpF的关系？细胞周期运转是如何调控的？不断提出问题，激发学生思考，吸引学生的注意力，再进行讲解。课堂教学生动活泼，学生听起来亦感兴趣，收效大。
3.搞好课堂、课后练习，促进学生思考。
课后要留一些书本上找不到现成答案，学生需经一番思索才能回答的思考题。这样能促进学生的思维活动，改变传统的背诵习惯，使学生学会动脑分析。如讲完抗原的内容后，举例：我们吃鸡蛋、喝牛奶、给动物输葡萄糖水，这是否为抗原？为什么？让学生分析，判断、提出依据。
每次课前提问，检查学生灵活运用知识的能力。不提问书本上的原题，从另一个角度提问题，使学生养成勤思考、善分析、爱钻研的习惯。
二、把实验教学作为培养学生实际能力的重要途径
实验课教学的任务，一是验证理论，二是学习实验方法，而根本目的是培养学生的实际应用能力。具体方法是：
1.明确规定实验课的基本技能。
三项基本技能：荧光显微镜的使用；细胞固定技术及超活染色方法；无菌操作。这三项基本技能，既是细胞生物学实验操作本身所要求的，又为后期的专业课打下必要基础。
2.明确实验目的，严格要求。
实验有明确目的和要求，实验后，按目的要求检验效果。如细胞超活染色实验，学生用油镜观察自己制作的染色标本时，老师逐个检查涂片是否均匀、着色情况是否达到要求，若未达到要求，则帮助找原因，令其重做，直至掌握为止。
3.注意培养学生独立操作能力。
开始实验时，先老师示范，然后学生做；然后逐步让学生按实验指导的要求操作，老师补充；最后由学生按实验指导独立操作，显著提高了学生的独立操作能力。
4.认真批改实验报告。
书写实验报告是锻炼学生书写能力，分析实验结果和表达能力的重要手段。每次实验都要求写实验报告。具体要求：层次清晰、纪录真实、分析有据，认真批改，写出评语。
采取了以上方式，学生独立操作能力有明显的提高。
三、把考试作为检查教学效果、培养能力的重要手段
考试不但是知识系统化、加深理解、巩固和提高的过程，同时还是一个培养、提高学生思维能力的过程。期中考试，出多种类型题，如综合性问题，学生针对多种内容如何进行综合分析的能力得到了锻炼。有些内容来自教材，对促进学生提高阅读能力，起一定的推动作用。考试的方式、内容，对学生起很大的引导和潜移默化作用，通过考试可引导方向、开阔思路、培养能力。
为了检查教学效果，几届本科生期终考试时，出了多种类型的题，量大、面广、难度相当。严格评卷后，考试结果成绩：不及格4％；60―70分17％；70―80分28％；80―90分40％，90分以上11％，属正常分布。学生也不觉得考题太难。这主要是由于在整个过程中，注意了思维能力的锻炼，灵活运用知识的锻炼，以及独立操作能力的锻炼，学生各方面的能力有较大的提高。
总之，细胞生物学是一门发展较快的学科，如何让教学跟上时代的步伐，是摆在每一位授课教师面前的问题。教师只有在课堂教学中注重思维能力，实验教学中培养实际能力［2］，本着两手一起抓的思想，不断进行必要的知识更新、补充，才能培养出融知识、能力于一体的高素质的生物技术专业人才。
参考文献：
［1］蒋盛岩，李新社，陈立德.细胞生物学教学改革与实践［J］.湖南科技学院学报，2008，29（4）：72-73.
细胞生物学实验技术篇10
【关键词】中药；细胞级粉碎；中药药剂学；应用研究
中药是一种天然的药物，中药细胞级粉碎细胞级粉碎是一种粉本作业，其目的不是粉体的细度，粉体细度是一种宏观检测手段，可以间接反映生物细胞破壁的程度，追求的是细胞95%以上的破壁率，中药进行细胞级粉碎后称为细胞级微分中药，能够使药品的质量以及生物利用率得到提高，使得药力资源的浪费与消耗有效的降低，对提高企业经济及社会效益而言，具有非常重要的意义和价值[1]。目前常用的粉碎设备有振动磨、球磨机、带筛转子粉碎机等等，这些技术的最终目的都是破坏细胞壁，增加药物有效成分的溶出速度，提高吸收率、利用率[2]。为了进一步探讨研究将细胞级粉碎应用于中药药剂学的效果及意义，作者特做了相关的研究分析，现得到如下报告。
1资料与方法
1.1一般资料取川贝母、西洋参、云芝、三七、天麻各1000g，将其分为实验组和对照组两组，每组各取贝母、西洋参、云芝、三七、天麻500g。实验组采用细胞级粉碎技术，而对照组采用常规的粉碎技术。
1.2处理方法粉碎前显微镜下检测并记录粒度的大小，实验组：取贝母、西洋参、云芝、三七、天麻各500g，经过振动磨将其粉碎。对照组：采取常规粉碎技术将其粉碎。然后在显微镜下分别检测记录两组药物的粒度。
1.3观察指标观察并记录粉碎前后药物粒度的大小。
1.4统计学方法统计分析时采用SpSS17.0软件分析，用（x-±s）表示计量资料，用t检验比较组间，以p
2结果
经观察比较，实验组粉碎后粒度变化程度明显高于对照组的粒度变化程度，差异具有统计学意义（p
3讨论
目前常用的粉碎设备有振动磨、球磨机、带筛转子粉碎机等等。本次研究所使用的就是振动磨，其工作原理是：通过高速的震动使得其中的介质受到振动冲击并产生介质回转，正向撞击带粉碎料的同时，还使其受到剪切力，高速、高能量的将其粉碎[3]。为了适应于不同物料的粉碎，可以调节振动磨的正压力及其剪切力。这样、既克服了传统粉碎方式的局限性，又具有粒度细、粒度可调、效率高、适用范围广等优点[4]。
中药细胞级微粉碎可以影响药物在患者体内的吸收，植物药材通过细胞微粉碎破壁后，有效成分不再受细胞壁的阻碍，被人体吸收变得更加容易简单。入胃中的药物，在胃液作用下其可溶性成分被溶解，然后进入小肠被吸收。由于粉碎后的药物是粒度极细的超细中药，即使是不溶性的成分也非常容易附着在肠壁上，肠壁会很快将吸附在细胞壁上的有效药物成分吸收掉，进入血液后，受到超微粒子附着力的影响，使其排出体外所需要的时间增加，进一步促进了药物的吸收率[5]。另外，细胞壁因粉碎而破坏，有效成分从细胞内迁移至细胞外的时间变短，明显加快了吸收速度，同时使吸收量也呈现明显的增加。
根据本次研究结果，经细胞级粉碎技术粉碎后的中药粒度明显小于常规方法粉碎后的粒度，粒度越细，其溶出度越高，也就是说细胞壁破坏程度越大，阻碍作用越小，那么药物的吸收率、利用率也就越高。因此，将中药细胞级粉碎技术应用于中药药剂学，可以促进中药有效成分的溶出，使其更容易被人体吸收，有效成分利用率明显提高，值得作进一步的研究与推广。
参考文献
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