免疫组化染色篇1
[关键词]免疫组化；染色；组织固定；抗原修复
[中图分类号]R446.8[文献标识码]C[文章编号]1673-7210（2007）09（a）-144-01
免疫组化染色目前已成为临床病理学的重要诊断手段之一，其作用毋庸置疑，同时还可用于鉴别诊断、评估预后、指导化疗等方面。一张良好的免疫组化染色片是正确判断染色结果的基础和前提，但免疫组化染色步骤繁琐且每一步都可能影响染色的最终结果，故保证染色质量是贯穿于免疫组化实验过程的核心。要得到一张高质量的免疫组化染色片，不是一件容易的事。如同苏木精―伊红染色一样，需要病理技术员和病理医生的互相配合、协调、共同努力。尽管如此，工作中我们还是常常遇到各种问题。笔者通过临床工作和实践，总结如下，仅供同行们参考。
1组织固定
固定的目的之一是最大限度地保存组织细胞内的抗原性。固定液选用10%缓冲福尔马林液。组织离体后，应尽快（最好在30min内）固定12~24h。这样做是因为临床实际工作中，手术量往往较大，而且经常是标本送来后的第2天取材。取材后，常常即刻进入全自动脱水机程序化处理，个别标本不能得到及时、充分的固定。因此，我们采取的方法是手术标本送来后，即刻将大标本剖开，及时固定，保持固定液在组织的10倍以上，以免蛋白质变性，抗原丢失。特别是夏季更应慎重。
免疫组化染色过程长，步骤多，且抗原修复时需要加热至95℃以上，虽然经过及时固定组织块和apeS胶处理玻片，组织片仍偶有脱落、破碎、不完整或边缘卷起的现象，影响镜下观察。我们发现，边缘卷起的切片一般都有假阳性染色。如何解决这一问题呢？我们的做法是首先做好组织的前期处理，从第一步组织取材开始到包埋结束，每一步都要严格规范化，取材厚度不超过3mm。控制好固定、脱水、透明、浸蜡每个步骤的时间、温度，真正做到充分、合理。经过这样处理后的优质蜡块，再加上锋利无痕的刀具，娴熟的切片手法，切出一张薄而完整、均匀的切片应该不是一件难事。其次，烤片是一个不容忽视的环节，它较苏木精―伊红染色时间长，一般热修复高压法烤片要3h以上，温度要求高于包埋蜡2℃。这样就尽量克服了上述的不足，大大减少了医生阅片时的困难。
2抗原修复
由于甲醛固定时，组织中许多分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭，相当部分抗原不能与抗体很好地进行反应。因此，抗原修复是做好免疫组化染色的关键环节。目前，用作抗原修复的方法有两种：热修复和酶消化。热修复包括高压、微波、水浴。我们认为高压法较易掌握，临床应用广泛。酶消化有胃酶和胰酶两种消化。热修复用于大多数抗原，尤其是核抗原，如pR、eR、Ki67、p53等。抗原修复液一般用0.1mol/L柠檬酸或柠檬酸盐液，pH为6.0。胰酶消化适用于细胞内抗原；胃酶消化适用于细胞间抗原。还有些抗原需双暴露法，即热修复+酶消化。总之，应严格按照抗体说明书要求进行修复。
3严格按照染色步骤要求操作
整个免疫组化过程步骤多，过程长。每一步都应严格按照要求进行操作，如脱蜡时间一定要充分；室温过低时，应先将二甲苯放入温箱加热，脱苯用的酒精也应设法加热以充分脱苯。其他染色步骤所用的试剂，也是如此。室温过低时应尽量设法提高试剂的温度（利用水浴箱、热台等），否则易导致染色失败。每一步pBS（pH为7.2~7.4）冲洗时间、次数一定不能省略，因pBS液内含有盐，可以减少背景染色。
4显色反应
作为临检工作的免疫组化染色，由于每次试验所作标本、组织来源不同，抗原含量不等。因此，切片显色要求镜下观察，控制显色时间。最好先看苏木精―伊红切片，了解基本病变，熟悉抗体定位特点，排除假阳性着色干扰，找准切片中的病变位置。滴加显色剂时，一次不要加得过多，以免来不及观察，而致显色过度。有些抗体如CD系列显色反应较快，应先镜下观察，eR、pR等抗体显色较慢，可以稍往后放。显色程度的控制，可观察红细胞稍着淡黄色即终止显色，时间不宜过长，以免导致泛染。
[参考文献]
免疫组化染色篇2
【关键词】细胞学；薄层液基涂片；染色；方法
【abstract】objective:tostudythin-layerliquid-basedcytologysmeartechniqueanditsapplicationinimmunohistochemistry.method:theuseofcomparativesignificanceoftwogroupsofcases.therewere74casesofadenocarcinomainpleuralfluid-basedsmear.40casesofsmallcell,resolvingphlegmandsmear.Secondgenerationusingimmunohistochemicaltwo-stepdye.Results:adenocarcinomainpleuraleffusionandascitesinathinlayerofliquidbasedsmearsadenocarcinomacellsonCeaantibody-negative,mesothelialcellstomesothelin(mesothelin)antibody-positivesmallsmallcellundifferentiatedcarcinomacellandresolvingphlegmsmearonCHaantibody-positive.onLCaantibody-positivelymphocytes.Conclusion:immunohistochemicalantigen-antibodyreactionisahighdegreeofspecificityandsensitivityofbiochemicalreactions,toaspecificantigenrecognitionandstrong.incells,subcellularleveldetectionantigenmoleculeisdifficultforotherbiotechnologyandalternative.onthecytologyhasbroadapplicationprospects.
【Keywords】Cytology;thinlayerliquidbasedsmears;dyeing;method.
【中图分类号】R156.3【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)12-0308-02
免疫组化是用特异性抗体对细胞或组织内的抗原进行定性、定位或定量检测。凡能作为抗原半抗原的物质，都可用免疫组化方法检测，近年免疫组化技术在病理组织学上广泛应用，但少见于细胞学薄层液基涂片的报道。本文总结细胞学薄层液基涂片的免疫组化染色实验，探讨免疫组化技术在细胞学上的应用。
1材料与方法
1.1材料：选用有对比意义的细胞学检材，记有腺癌性胸腹水薄层液基涂片74例，小细胞未分化癌涂片40例，试剂选用迈新公司elivsionplus免疫组化试剂盒。
1.2方法：免疫组化二代二步染色法：1）胸腹水、痰薄层液基涂片、固定、潮干、pBS液洗涤。2）胰酶消化修复抗原，胶酶浓缩剂与稀释液按1:3滴加，37℃孵育15分钟，pBS液洗涤。3）阻断：滴加3%过氧化氢液，37℃孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，pBS液洗涤。4）免疫反应，抗体依需要自选，滴加后37℃孵育1小时，pBS液洗涤。5增强反应，滴加增强剂，37℃孵育30分钟，pBS液洗涤.6）标记：滴加酶标抗鼠/兔聚合物，37℃孵育30分钟，pBS液洗涤。7）显色，滴加新制DaB液，镜下观察，显色适当后放入蒸馏水中终止反应。8）苏木素复染，中性树胶封固。
2结果
经反复实验总结出以上染色方法，可使阳性细胞液基涂片中的阳性细胞呈黄棕色或棕褐色。74例腺癌性胸腹水离心涂片中，变形未圆形、卵圆形，聚集成团的深染的腺癌细胞，与增生间皮细胞在镜下难以区别；通过免疫组化染色，腺癌细胞对Cea抗体显阳性，间皮细胞对mesothelin（间皮素）抗体显阴性。40例小细胞未分化癌痰涂片中，小细胞未分化癌细胞略大于淋巴细胞，圆形、卵形、短小梭形，核深染，与大淋巴细胞难以鉴别。通过免疫组化染色，小细胞未分化癌细胞对CHa抗体显阳性，淋巴细胞对LCa抗体显阴性，这样可以鉴别开来。
免疫组化染色篇3
[关键词]脱落细胞学；He染色；细胞免疫染色；免疫组化
[中图分类号]R446.8[文献标识码]B[文章编号]1673-7210（2007）08（a）-124-02
在临床细胞病理诊断中，常遇到难以诊断或难以分型的特殊细胞或细胞组合，需要做免疫染色进一步确定。但有时又难以重新获得标本制片，或重新制成的涂片又没有原涂片中的特殊细胞或细胞组合。因此，在原涂片上进行免疫染色成为关键。本研究探讨了细胞涂片He染色褪色后免疫染色的效果。
1材料与方法
1.1材料
选取我院2006~2007年间收治的具有组织学对照的细胞涂片并被诊断为恶性肿瘤的21例病例。
1.2方法
He染色细胞涂片均潮干固定于95%酒精中[1]15min。显微镜观察后，在原切片上选定要进行免疫染色的目标，分别在目标背面载玻片上用钻石笔圈上记号，将目标圈入当中，并标记好要染色的抗体。然后将细胞涂片按顺序经过二甲苯、梯度酒精和水，将涂片上的盖玻片和树胶完全脱掉（没用树胶封片的可以省略此步），放入0.5%盐酸-酒精中脱掉苏木颜色后入水冲洗，再入稀氨水中脱掉伊红颜色，直到颜色明显变浅或成无色，提出载玻片放入水中，充分冲洗，待做免疫染色。做免疫染色时，首先按各种抗体的要求进行预处理并使用细胞通透剂（X-100），以充分暴露抗原和增加细胞的通透性，有利于抗原抗体的结合。相应组织学免疫染色（免疫组化）按常规进行。免疫染色过程中设立阴、阳性对照，以便正确判断染色结果。选择的单克隆抗体分别为：Cea、Highmw、Lowmw、Vimentin、CR、CD68、LCa、Coa、Ca125、CD20。所用单克隆抗体和其他相关试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司，单克隆抗体为工作液，免疫染色方法采用maxVision一步法。
1.3结果判定
He染色结果：主要根据细胞形态、排列方式及细胞与细胞之间的关系并结合临床进行初步诊断。21例细胞涂片中，均有恶性肿瘤细胞。免疫染色结果的判定：要求着色部位必须正确，背景清晰，染色鲜明，即使有个别典型着色的细胞也视为阳性[2]。21例涂片做免疫染色同时设立阴、阳性对照，并有同一肿瘤相同抗体的免疫组化对照。
1.4统计学分析
采用χ2检验。
2结果
21例肿瘤免疫组化染色结果与相应的细胞涂片He染色褪色后免疫染色没有显著性差异（p＞0.05）（表1）。但就免疫染色强度来说，细胞涂片不如组织学切片。
3讨论
在细胞涂片中，通过观察组成细胞的形态特点、排列方式和细胞之间的关系来诊断，不像组织学既有细胞形态又有组织结构。所以经常遇到一些特殊的细胞或细胞组合，难于单凭He染色来确定诊断和/或进一步分类分型，借鉴组织学和细胞学免疫染色方法，选择合适的抗体[3]，可以在一定程度上提高诊断的准确率。细胞涂片的另一个缺点就是获取的标本重复性不如组织切片相对一致，因此，在免疫染色中往往受到一定限制。在He染色涂片上发现的“异常细胞”，有时重新涂片时就消失了，解决这一问题的唯一办法就是在发现的“异常细胞”He染色涂片上原位进行免疫染色，通过以上的实验可知，细胞涂片He染色褪色后做免疫染色的效果较好。以往有人将液体标本离心沉淀制成石蜡切片，然后做免疫染色[4]，其优点是可以得到足够用于免疫染色的相同切片，但不足的是在涂片中发现的“异常细胞”，在切片中很可能看不到；也有人重新取材制片并先染苏木后在湿片情况下镜下观察、标记，不褪色直接做免疫染色[5]，这样可以寻找目标，但不如常规He染色目标更加明确，且会影响细胞核的免疫染色。若是全片染色，又浪费抗体，不可取。本研究方法弥补了以往其他方法的不足，使细胞学诊断方法又多一条路，唯一不足的是细胞核和细胞浆的染色强度不如相应组织学切片的强，但细胞膜着色较强，可能是因为细胞脱落，或多或少地有些退变，再者细胞是完整细胞，有完整的细胞膜，尽管使用了细胞通透剂，其通透性也不如切片好，这一点需要进一步改进，但二者结果无显著性差异（p＞0.05）（表1），为了使染色强度得到提高，可以适当延长抗体与抗原的孵育时间。
[参考文献]
[1]刘树范.临床细胞学[m].北京：人民卫生出版社，1990.14-22.
[2]范娣.王德延肿瘤病理诊断学[m].第2版.天津：天津科学技术出版社，1999.106.
[3]夏同礼.肿瘤实验诊断学[m].北京：北京科学技术出版社，2005.223-227.
[4]刘梦海,袁昌隆,梁忠泉.胸、腹水沉积物切片结合涂片诊断间皮瘤[J].诊断病理学杂志,2006,13(1):66-68.
[5]李红民,韩凤艳,刘宏霞,等.胸（腹）水免疫细胞化学方法改进[J].中华病理学杂志,2001,30(5):386.
免疫组化染色篇4
【论文摘要】近年来分子生物学技术以及其它高、新技术在病理领域得到广泛的应用，同样作为体育界的基础研究学科运动人体科学的发展已经不能满足简单的宏观的研究，越来越多的医学检验以及病理学实验技术在运动人体科学广泛应用，尤其是组织病理学技术中定位技术，例如免疫组化、原位杂交等。本文就以上三种病理学常用的定位技术的方法进行综述。
1免疫组织化学实验技术
随着免疫组织化学染色技术的广泛应用，病理学研究产生了划时代的飞跃。免疫组织化学是病理学实验中常用的方法，是在蛋白质水平用各种特异性抗体检测细胞内各种抗原物质。根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术、免疫酶细胞化学技术、免疫铁蛋白技术、免疫金-银细胞化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
1.1免疫组织化学实验步骤免疫组化技术是在组织化学的方法上结合免疫学的理论和技术发展起来的一门新技术。其原理是利用免疫学的核心——抗原体特异性结合的原理，用标记抗体追踪抗原，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等显示一定的颜色，并借助显微镜、荧光显微镜、电镜对其颜色进行观察，以达到检测抗原物的目的[1]。
1.2免疫组化技术的优点免疫组化技术的优点：①特异性强，免疫组化中抗体与组织细胞中的抗原的结合是特异的。如白细胞共同抗原（LCa）显示淋巴细胞成分。②敏感性高，而今，由于抗生物素—生物素（aBC）法和链酶素—过氧化物酶连接（Sp）法的出现，使抗体的稀释度(代表敏感度)达到了上千、上万，甚至上亿倍，使免疫组化技术更加可靠。③定位准确，由于抗原抗体的结合是特异的，因而免疫组化技术可在组织和细胞内准确定位，对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，将形态与功能相结合，对疾病进行深入的研究。
2原位杂交实验技术
原位杂交是将组织化学与分子生物学技术结合来检测合定位核酸的技术。它是用一段已知序列的核苷酸片断来检测细胞内是否存在欲检测物质的Dna或Rna，是比免疫组化更加灵敏而深入一个层次的检验方法。根据所选探针和待测靶序列的不同，核酸原位杂交有Dna-Dna杂交、Dna-Rna杂交、Rna-Rna杂交等。
2.1原位杂交技术的应用原位杂交由于不需要从待测组织中提取核酸，可完好的保存组织、细胞的形态结构，将形态学与基因功能活动的变化相结合进行多层面的研究。主要应用：①细胞特异性mRna转录的定位可用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究；②感染组织病毒Dna/Rna的检测和定位；③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的监测；④基因在染色体上的定位；⑤检测染色体的变化；⑥间期细胞遗传学的研究。
2.2原位杂交技术与免疫组化的比较
2.2.1两者的区别原位杂交与免疫组化染色技术相比较，这两种方法的共同之处均具有定位检测的功能，且均有较高的敏感性和特异性，所不同的是免疫组化染色是用的是抗体，其检测对象是抗原，机制是抗原-抗体的特异性结合，是蛋白质表达水平的检测；原位杂交使用的是探针，遵循碱基互补配对的原则与待测靶序列结合，是Dna或mRna水平的检测。从实验方法来看，免疫组化染色操作相对简单，成本相对较低，受外界因素的影响相对小；原位杂交技术无论从实验设计上，还是从实际操作上均较免疫组化染色复杂，成本的高低与试剂的种类和来源密切相关。一般而言，直接选用商品化的标记探测和检测试剂盒的实验成本较高；荧光标记探针较非荧光标记探针的成本高，对样本及实验条件的要求较高，也更容易受到外界因素的影响。
2.2.2免疫组化与原位杂交双标技术双标技术是在同一张组织切片上标记两种不同的抗体或同时应用两种不同的检测手段，如免疫组化和原位杂交技术，在不同层次来检测同一细胞上某些物质的表达是否有相关性的一种实验方法。与传统的单项检测相比，双标记具有无可比拟的优越性，可以克服由于切片间各种差异而引起的时间或空间的样本误差。实验方法上先进行原位杂交会减少免疫组化过程中对待测Dna或Rna的破坏或影响，一般目前均推荐先进行原位杂交后进行免疫组化标记[2，3]。具体的操作跟单纯的免疫组化和原位杂交各自的方法一致。需要注意的问题就是：①所用的实验设备必须经DepC水浸泡或200℃烤箱过夜，操作时须带口罩及手套；②当杂交步骤完成后，切片必须认真浸泡及长时间洗涤至少超过30min。③作免疫组化的各步骤时间均须适当延长，以增加抗原抗体间的结合，杨青春等人研究发现每个步骤均延长2～3倍时间。④免疫组化显色后不需要用苏木精复染，以免遮盖核信号。
参考文献
[1]纪小龙，施作霖.诊断免疫组织化学[m].北京：军事医学科学出版社，1997.5.
免疫组化染色篇5
【关键词】，大鼠；神经前体细胞；神经节，脊；细胞培养技术；免疫荧光组织化学
observationofneuralprecursorcellsinratdorsalrootganglia
【abstract】aim:toinvestigateneuralprecursorcellsinratdorsalrootganglia(DRG).metHoDS:DRGfromembryonicandadultratswerefrozenandslicedforBrdu，nestin，p75immunofluorescencehistochemicaltest.additionally，thecellsofgangliawererespectivelyculturedandobservedintheirproliferationanddifferentiation.thecellswereidentifiedbyBrdu，nestin，p75，nFandGFapimmunofluorescencehistochemicaltest.ReSULtS:inthefrozenDRGsectionsfromadultandembryonicrats，Brdu/nestinandnestin/p75positivecellswerefound.theculturedcellscouldpideandproliferateandshowednestin，Brdu，p75positive.thethirdpassagecellscoulddifferentiateinthepresenceoffetalbovineserum.thedifferentiatingcellsshowednFandGFappositive.ConCLUSion:thereareneuralprecursorcellsthatcanpideandproliferateinratDRG.theycandifferentiateintoneuronandglialcells.
【Keywords】rats;neuralprecursorcells;ganglia，spinal;cellculturetechniques;immunofluorescencehistochemistry
【摘要】目的：探讨大鼠脊髓背根神经节(DRG)内是否存在神经前体细胞.方法：取成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片，进行Brdu，nestin，p75免疫荧光组织化学检测，分别取成年和胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养，观察其增殖与分化情况，并行nestin免疫组织化学和Brdu，p75，nF，GFap免疫荧光组织化学鉴定.结果：在成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片上均见有Brdu/nestin和nestin/p75免疫荧光双标细胞.细胞培养观察到取自DRG的细胞有分裂增殖，呈nestin免疫组织化学阳性反应和Brdu，p75免疫荧光组织化学阳性反应；培养第三代细胞加入胎牛血清后出现分化，分化细胞呈nF和GFap免疫荧光组织化学阳性反应.结论：大鼠DRG内存在有分裂增殖的神经前体细胞，这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞.
【关键词】大鼠；神经前体细胞；神经节，脊；细胞培养技术；免疫荧光组织化学
0引言
成年动物的中枢神经系统内存在有神经干细胞（neuralstemcells，nSCs）已成为公认的事实，这些细胞可以自我更新，分裂增殖，并且向神经元与神经胶质细胞分化［1-2］.nSCs的发现给神经系统损伤的修复带来了希望.随着研究的深入，人们认识到干细胞广泛存在于体内.但外周神经系统是否存在nSCs的研究报道甚少.我们用免疫组织化学和细胞培养的方法观察了成年和胚胎大鼠脊髓背根神经节（dorsalrootganglia，DRG）内神经前体细胞.对哺乳动物外用内神经前体细胞进行了有益的探索.
1材料和方法
1.1材料健康孕14d和成年SD大鼠，东南大学医学院实验动物中心提供；细胞培养主要试剂：Dmem/F12(1∶1)，n2，无血清培养液添加剂B27，表皮生长因子（epidermalgrowthfactor，eGF），碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF），胎牛血清（Gibco公司）；小鼠抗大鼠nestinmab，小鼠抗大鼠nFmab，小鼠抗大鼠BrdUmab，兔抗大鼠GFap多克隆抗体（Sigma公司）;羊抗小鼠Sap试剂盒，BCip/nBt染色试剂盒（北京中杉公司）;兔抗大鼠p75多克隆抗体，山羊抗小鼠igG:FitC，山羊抗小鼠igG:tRitC，山羊抗兔igG:tRitC（武汉博士德公司）.
1.2方法
1.2.1切片制备与染色取孕14d和成年大鼠于处死前3d，分别给予BrdUmab腹腔注射2次(每次50mg/kg).于深麻下，打开胸腔，先后用生理盐水和40g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液进行升主动脉灌注.取出DRG，置于40g/L多聚甲醛内后固定，次日行冰冻切片，片厚15μm.将切片分为三套，分别行He染色和BrdU/nestin，p75/nestin双标免疫荧光组织化学染色.
He染色：DRG切片入苏木精染液染色，水洗玻片上多余染液，10mL/L盐酸乙醇分色.流水冲洗，反蓝.蒸馏水冲洗；1～5g/L伊红染液染色，依次经700，850，1000mL/L乙醇脱水；二甲苯透明，封片.
BrdU/nestin双标免疫荧光组织化学染色：依次加入500mL/L甲酰胺，2×SSC，1mol/L盐酸，1g/L胰蛋白酶及封闭羊血清后，再加入小鼠抗大鼠BrdU抗体（1∶200），4℃过夜，加入山羊抗小鼠igG:tRitC（1∶300），加封闭羊血清，加小鼠抗大鼠nestin抗体（1∶200），4℃8h，加山羊抗小鼠igG:FitC（1∶300），甘油缓冲液封片.
p75/nestin双标免疫荧光组织化学染色：依次加封闭羊血清，兔抗大鼠p75抗体（1∶200），4℃过夜，加入山羊抗兔igG:tRitC（1∶300），小鼠抗大鼠nestin抗体（1∶200），4℃8h，山羊抗小鼠igG:FitC（1∶300），甘油缓冲液封片.
1.2.2背根神经节细胞原代培养取孕14d大鼠于麻醉后取出胚鼠，分离出DRG，Dmem液冲洗，剪碎，放在300目的滤网研磨过滤.收集过滤液，离心5min，1000r/min.弃去上清.再次离心后，所得细胞用含有eGF，bFGF的Dmem重悬.将细胞以1×108/L浓度接种于10mL培养瓶内.置于培养箱中培养（37℃，50mL/LCo2）.
取成年大鼠麻醉后，脱颈处死消毒，解剖分离出DRG.将收集到的神经节组织进行原代细胞培养（方法同前）.
1.2.3细胞传代培养在细胞培养到7d时，用2.5g/L的胰酶消化5min，加入100mL/L胎牛血清终止消化，再用吸管吹打成单细胞悬液，离心弃上清，反复两次.所得细胞用前述培养液重悬.将一部分细胞悬液调整成密度为1×108/L，种入新的培养瓶中，继续按照先前条件，置于培养箱培养.另取一部分细胞悬液，用培养液稀释到2×103/L，接种入96孔培养板中，每孔100μL.2h后在倒置显微镜下观察，对只有一个细胞的培养孔做标记.以后每天动态观察标记孔中单细胞的分裂和克隆形成情况.在细胞分裂增殖到一定程度后，按照同样的方法进行第二次传代.
1.2.4培养细胞的鉴定选择第二次传代后有细胞增殖的培养孔，分为三组，前两组分别加入5μmol/L的BrdU，100mL/L胎牛血清，第三组不加任何物质.继续培养3d后，对加入BrdU的培养孔中的细胞进行抗BrdU的免疫荧光组织化学染色（tRitC标记）.对加入胎牛血清的培养孔的细胞分别进行GFap，nF的免疫荧光组织化学染色（GFap用tRitC标记，nF用FitC标记）.第三组进行nestin免疫组织化学染色（Sap法），苏木素复染.
上述切片和培养细胞分别在普通和荧光显微镜、倒置显微镜下观察，并照相记录.
2结果
2.1He染色在低倍光镜下可见，整个DRG呈梨形，其外膜的结缔组织伸入节内，把节内细胞分成多群.在高倍光镜下，节内细胞多数呈圆形，体积较大，胞质嗜酸性，胞核大而圆，嗜碱性，染色浅，核仁清楚.围绕胞体外周有一层扁平或立方形细胞即卫星细胞.在细胞群之间可见到大量神经纤维（图1）.
图1成年大鼠背根节He染色×100（略）
2.2免疫荧光组织化学检测tRitC和FitC分别标记的BrdU，nestin免疫荧光抗体检测显示，在胚胎鼠和成年大鼠的神经节内均可见BrdU，nestin和BrdU/nestin免疫荧光单标和双标细胞.BrdU单标细胞核圆形，较大，呈红色，散在分布于节内；nestin单标细胞圆形或椭圆形，呈绿色；BrdU/nestin双标细胞显示为红色的核和绿色的胞体，核质比高（图2）.用同样方法也可以检测p75/nestin双标细胞，p75单标细胞呈红色，大小不等，圆形；nestin单标细胞为绿色；双标细胞呈棕黄色，散在分布于各细胞群之间，多呈圆形，胞体中等大小，有的可见突起，胞核较大（图3）.
图2成年大鼠背根节BrdU/nestin免疫组织荧光化学染色×400（略）
图3胚鼠背根节p75/nestin免疫组织荧光化学染色×400（略）
2.3原代细胞培养DRG细胞悬液原代培养后第2日即可见圆形、折光性较强的细胞，细胞小而透明.随着培养天数的增加，细胞数量逐渐增多，可见呈分裂相的细胞和细胞团.继之细胞形态变大，有的细胞呈悬浮状态.到7~10d时，可见到大部分呈葡萄串状或桑椹状的细胞团，体积较小，细胞团内的细胞呈圆形，大小不一；少部分呈散在成群分布，细胞多数为梭形，伸出2~3个突起.培养到20d时，可见到一种单个巨大的圆形或椭圆形细胞，有的文献上称之谓“o细胞”［3］.细胞传代后生长速度变慢，有一部分细胞会停止生长.成年鼠与胚胎鼠DRG培养的细胞形态上未见有明显差异，但胚鼠生长速度快于成年鼠.
2.4培养细胞的鉴定对传代两次后的培养细胞行免疫组织化学染色显示，这些细胞呈nestin阳性，细胞呈梭形或多角形，有突起，核大而深染(图4).免疫荧光组织化学检测，在加入BrdU的培养孔内可见BrdU阳性细胞，细胞核圆，较大，在荧光显微镜下发出红光.在加入胎牛血清的培养孔内，可见GFap和nF阳性细胞，GFap阳性细胞呈红色，形态不规则，突起较多且长；nF阳性细胞呈绿色，胞体较大，圆形或多角形，突起少并且短（图5，6）. 3讨论
从起源上来说，DRG来自神经嵴.神经嵴细胞是一种多能干细胞，其衍化物具有3个经典胚层衍化物的性质.据报道［4-5］，在成年动物的胃肠道和皮肤组织中仍然存在着神经嵴细胞.在生后15d大鼠的胃肠中存在的神经嵴细胞仍然具有向tH阳性神经元分化的能力.表皮内存在的神经嵴细胞也具有比较高的可塑性，可以分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞和黑色素细胞.本实验通过免疫组织化学和细胞培养的方法发现在大鼠的DRG内亦存在有分裂增殖能力，并可以向神经元和神经胶质细胞分化的神经前体细胞.说明神经前体细胞不但存在于中枢神经系统，也存在于周围神经系统.
图4成年大鼠背根节传代培养细胞nestin免疫组织化学染色，苏木素复染×200（略）
图5成年大鼠背根节传代培养细胞分化后GFap免疫荧光组织化学染色×400（略）
图6成年大鼠背根节传代培养细胞分化后nF免疫荧光组织化学染色×400（略）
p75是低亲和力神经营养因子受体，有文献报道把它作为神经嵴细胞的标志物［6］.在大鼠的神经节内检测到Brdu/nestin和p75/nestin双标细胞，说明在神经节内可能存在着具有原始特性的神经前体细胞.这些前体细胞培养后为球形，梭形或多角形.单个细胞不断分裂后可以形成克隆.其子代细胞可以在一定条件下发生分化.决定nSCs定向分化的机制有两种:一是细胞自身基因调控;另一种是外来信号调控和nSCs所处的内环境［7-9］.在向培养细胞中加入胎牛血清后，对其进行的GFap和nF的免疫荧光组织化学染色表明，培养细胞当中出现了较多的具有神经胶质样和神经元样细胞.
与中枢的nSCs培养相比，DRG内细胞培养有两个不同：①不形成典型的“神经球”，克隆的形态呈较小的桑椹状，葡萄串状或散在成群状.②细胞之间连接松散.在DRG培养的细胞传代时，用胰酶消化法和机械分离法分离细胞都比分离中枢的神经干细胞球容易.
对胚鼠和成年鼠的背根节细胞培养进行比较，也存在有差异.①胚鼠的原代培养细胞生长得更快.②胚鼠的原代细胞形成的克隆数多于成年鼠.③胚鼠o细胞产生的数目往往更多.这种体积巨大的细胞很可能发育为非神经细胞，如黑色素细胞等.在有关神经组织标志物免疫组织化学检测时o细胞表现为阴性结果［3］.o细胞的出现以及其在发育不同阶段的数量变化有何意义，目前尚不清楚.但无论是胚鼠还是成年鼠的培养细胞，传代以后其生长速度都会减慢，传代后两者生长速度基本相同.另外随着培养时间的延长，细胞的增殖能力也逐渐减弱.神经嵴细胞的发育是具有时间性和空间性的［10］，那么作为其后代的神经节内神经前体细胞，其增殖能力和分化的潜能有多大，受哪些因素的调控，能否作为神经系统疾病细胞替代治疗的供体等，尚须做大量的研究.
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免疫组化染色篇6
关键词：胸腔积液;冰冻切片;免疫组化
1资料与方法
1.1临床资料2006年5月—2008年12月我们共收集胸水标本64例，其中男性28例、女性36例，年龄32～82岁，平均年龄51.6岁。经组织学或结合临床资料证实腺癌12例，鳞癌8例，恶性上皮型间皮瘤4例，间皮增生40例。
1.2方法①将送检的胸水直接用一次性吸管吸取下面沉淀的部分30ml于试管内，2500r/min，离心10min。将上清液去掉，离心沉淀物涂片1张、He染色。沉淀的部分放在冰冻切片机上冷冻头上，然后加入oCt包埋剂进行切片。②胸水离心沉淀物少就直接倒去上清液，先在冰冻切片机的冷冻头上加入oCt包埋剂，然后将胸水离心沉淀物放在上面进行切片。③胸水离心沉淀物常规切片6张：1张He染色，5张免疫组化染色。④制作免疫组化染色的冷冻切片必须冷藏保存，然后根据需要进行免疫组化染色。⑤免疫组化染色标记细胞角蛋白(cytokeratin，CK)、上皮膜抗原(ema)、肺癌相关抗原(LCa)、间皮细胞、波形蛋白(vimentin)。免疫组化染色方法：采用即用型快捷免疫组化maxvislontm试剂盒，试剂及抗体和免疫组化阳性片均由福建迈新生物技术公司提供，阴性对照采用pBS作为一抗。
染色步骤：①切片室温干燥后，入4℃丙酮固定10min，用pBS(pH7.4)冲洗3次，每次3min。②根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复，除细胞角蛋白用胰酶消化外，间皮细胞、vimentin、LCa、ema都要柠檬酸高温修复(按说明操作)。③每张切片加1滴3%过氧化氢，室温下孵育10min，pBS冲洗3次，每次3min。④每张切片加1滴自选1抗体，室温下孵育60min。⑤pBS冲洗3次，每次3min。⑥除去pBS液，每张切片加2滴新配制的DaB溶液10min。⑦自来水洗，苏木素复染直至中性树胶封固。
1.3统计学处理采用χ2检验，检验水准α=0.01，p<0.01认为差异有统计学意义。所有统计均由SpSS10.0软件完成。
2结果
送检的64例胸水直接离心涂片He染色诊断阳性细胞7例，阴性39例，可疑18例。应用冰冻切片技术联合免疫组化检查结果阳性细胞24例，阴性38例，可疑阳性仅2例;χ2=22.13，p<0.01，见表1。冰冻切片免疫组化标记结果见表2。表164例胸水单纯涂片与冰冻切片诊断结果表2冰冻切片免疫组化标记结果
3讨论
胸腔积液是多种胸部疾病特别是恶性肿瘤的常见伴发体征，甚至为患者首发症状。通过胸腔积液对明确病变性质及类型有重要意义，对疾病的治疗也有重要指导意义。一般的胸水病理检查仅仅行单纯离心、涂片、He染色，光镜下观察，但由于细胞分散、染色效果不理想，又因细胞容易堆积成团，其诊断的阳性率较低，特别是小细胞肿瘤难以和间皮瘤、淋巴瘤、未分化肿瘤细胞区别。
免疫组化染色篇7
关键词：南美白对虾；桃拉病毒；血细胞；免疫指标
中图分类号：S945.4文献标识码：a
对虾桃拉病毒（tSV）是对虾养殖中危害严重的疾病之一，引起较高得到对虾死亡率，可造成对虾养殖业巨大的经济损失[1，2]。对虾感染该病后，可造成皮下、造血和淋巴等组织器官损伤，已有研究表明血细胞是tSV侵染的主要靶细胞，并在病毒对各组织器官的感染中起重要作用[3]。
南美白对虾血淋巴细胞既是细胞免疫的承担者，又是体液免疫的提供者，可将血淋巴细胞分为：颗粒细胞（Granularcells，GCs）、半颗粒细胞（Semi-granularcells，GCs）和透明细胞（Hyalinecell，HCs）3类[4，5]。这3类血细胞担负着不同的免疫功能，透明细胞具有吞噬作用；半颗粒细胞含有数目可变的小细胞质颗粒和少量的酚氧化酶原，在受到异物刺激时，胞内颗粒容易脱落并发生细胞溶解，参与机体的防御反应；大颗粒细胞细胞内含大的颗粒以及大量的酚氧化酶原，在受到异物刺激时，通畅观察不到颗粒脱落，但有活性的酚氧化酶存在时，可进行胞吐作用，起到机体防御反应的作用。因此，对虾在防御反应中，3种血细胞是相互协作的。在健康对虾体内这3类血细胞的数量和比例是相对恒定的，当发生疾病时，其数量和比例将会发生变化。
体液免疫反应是由几种免疫反应组成的，如超氧化物歧化酶（SoD）系统、磷酸酶作用系统，及酚氧化酶（po）作用系统等。这些免疫反应系统与细胞免疫反应协同共同发挥抗病和抗逆作用[3，6]。虽然体液免疫因子主要是在防御反应中发挥作用的分子，但是这些分子最初是由血细胞合成并储存在内的。
本实验研究了对虾桃拉病毒tSV粗提液对南美白对虾总血淋巴细胞数，不同种类血细胞的比例组成变化及对SoD和po表达活性的影响，为进一步探讨血淋巴细胞的防御作用和功能提供资料，对提出有效防止tSV方法上有着积极意义。
1材料与方法
1.1材料与试剂
健康的南美白对虾（Litopenaeusvannamei）购自绍兴海涂对虾养殖场。对虾购回后在1000L的桶中暂养1周，暂养期间观察对虾活力及死亡情况。实验期间水温控制在28～31℃，盐度为30.0～50.0，pH为8.0～8.5；溶氧量为6.6～7.0mg/L；亚硝酸盐含量低于0.1mg/L。tSV自然感染的病虾由广西水产研究所提供，于-70℃保存。
1.2对虾感染实验
实验选取体长7～10cm，外观健康的南美白对虾，经Rt-pCR检测确定未被tSV感染。取症状明显的南美白对虾病原（pCR检测阳性）。病毒感染组直接投喂桃拉病毒（tSV）感染的病虾组织，对照组投喂新鲜虾肉，每天投喂3次，投喂30～45min后将残饵清除。
1.3桃拉病毒Rt-pCR
对疑似tSV感染的虾只进行Rt-pCR检测，Rna提取和cDna合成分别依照Rnapure超纯总Rna快速提取试剂盒和cDna合成试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）操作方法；得到cDna保存于-70℃。1μLtSV模板分别加入pCR反应体系12.5?L（2×taqpCRmastermix，北京艾德莱生物科技有限公司），再分别加入tSV和wSSV引物正向及反向各0.5?L，加重蒸馏水至终体积25μL。引物为：5'-GCttGCGtGGtGGGaCtta-3'，5'-tCaatGaGaGCttGGtCCtGG-3'；tSVpCR反应条件为94℃1min，1个循环；51℃1min，72℃1min，94℃30s，35个循环；51℃1min，72℃5min，1个循环，pCR结果预计条带长度200bp。
1.4血涂片的制作及染色
用1mL一次性注射器吸取体积分数为10%甲醛的pBS0.1mL，再从正常对虾或tSV感染后2～3d虾只围心腔或尾静脉抽取血样0.1mL，每只虾制作3～5张血涂片，血涂片自然晾干后染色。染色方法采用瑞氏-Giemsa染色法：加数滴染料滴于载破片直至覆盖整个血涂片，1min后加1.5倍蒸馏水，吹匀后继续染色10min，用蒸馏水清洗干净并晾干，中性树胶封片，置于显微镜（nikon）下观察。
1.5总血淋巴细胞数和种类组成
总血淋巴细胞数：用血细胞计数板计数总血淋巴细胞数；每尾虾血样计数3～5次，取平均值。血淋巴细胞种类组成：每张血涂片在显微镜下随机选取200个细胞，依据观察血细胞的形态特征，包括细胞颗粒大小及密度、细胞的核质比，及细胞质的着色情况，对血细胞进行分类统计。
1.6超氧化物歧化酶（SoD）活性测定
抽取感染后2～3d对虾血液，离心去除血淋巴细胞。使用BCa法蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术研究所）测定各样品蛋白浓度。按照超氧化物歧化酶（SoD）（南京建成科技有限公司）活性测定试剂盒操作说明书，通过酶标仪分析计算SoD酶活力。以上各项指标均严格按照试剂盒操作。
1.7酚氧化酶（po）活力测定
酚氧化酶活力测定，以L-多巴（Dopa）为底物，将3mL0.1mol/L的磷酸钾盐缓冲液（pH6.0）与100μL的0.01mol/L的L-多巴和100μL血浆上清液样品置于室温下混匀，立即在490nm波长处测定光密度值（oD490nm），每隔2min读取1次，共测定30min。以oD490nm对反应时间作图，以实验条件下每分钟oD490nm增加0.001定义为一个酶活力单位。
1.8数据统计
实验数据采用Student’st-test进行差异显著性分析，结果显示为平均值标准差，（p
2结果
2.1南美白对虾感染tSV后的发病及死亡率
感染4～6d内，tSV造成总共50%～80%的死亡率，对照组对虾活动正常，仅出现少量死亡（2/36）。垂死的虾只呈现典型的tSV感染症状：活动能力明显减弱，出现厌食症状；呈现失调性游泳，虾体肌肉透明性下降；虾壳变软，病虾体须，尾发红，边缘上皮细胞坏死（结果未显示）；Rt-pCR结果显示在200bp处有一明显条带，与预期结果符合（见图1）；这些结果显示，tSV感染导致南美白对虾发病死亡；而对照组死亡的虾只中并未出现上述症状，推测可能是由于环境或其他原因引起的。
图1Rt-pCR扩增tSV条带，在210bp处可见一明显条带
2.2正常南美白对虾血细胞数量和分类
将对虾血涂片在显微镜下观察，依据细胞形态及大小、核质比和颗粒的有无及颗粒的多少，可将血细胞分为3种类型：颗粒细胞、半颗粒细胞和透明细胞。
2.2.1颗粒细胞
细胞核深蓝色，椭圆形，细胞质红色，核质比低；细胞质中含有数量较多的紫色大颗粒（见图2a）。
2.2.2半颗粒细胞
细胞核蓝色，细胞质呈红色，核质比较高；细胞质中含有少量大小不等的红色颗粒和紫色大颗粒（见图2B）。
2.2.3透明细胞
细胞核深蓝色，细胞质无色，核质比高，细胞质中几乎不见颗粒物（见图2C）。
图2对虾血细胞瑞氏-Giemsa染色400×
2.3tSV感染后对虾血细胞数量和组成变化
感染2～3d后，以未感染组为对照，血细胞计数板统计感染组对虾血细胞数量。结果显示：对照组每毫升血液血细胞数量约为1.897×107个，而tSV处理组约为0.625×107个；与对照组相比，tSV处理组血淋巴细胞总数下降了约69%，两者差异显著（见表1）。血细胞各组分结果显示：透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞分别下降了76%、60%及70%，各组分内相比差异显著（见表1）。
表1桃拉病毒tSV对血液学参数的影响
血液学参数正常组tSV感染组
血细胞参数分析
（107/mL）
血细胞总数1.897±0.875a0.625±0.192b
透明细胞数0.398±0.098a0.097±0.016b
半颗粒细胞数0.823±0.232a0.329±0.096b
颗粒细胞数0.711±0.214a0.211±0.096b
血浆参数分析
SoD活性（U/mgprot）
108.5±11.23a
81.31±8.346b
po活性（U/mgprot）12.78±3.217a4.085±5.517b
注：同行数据右上角注字母不同表示差异显著（p
2.4血浆中SoD和po活力测定结果
接下来我们以SoD和po作为参数，研究tSV感染对血浆体液免疫的影响。从表1可以看到南美白对虾在感染tSV病毒2～3d后，感染组中血浆SoD活力下降了约25%；与此同时，po活力下降了约68%，与对照组相比均有显著（见表1）。
3讨论
桃拉综合症是由tSV引起的对虾最常见，危害最严重的急性传染病之一，被国际兽医局（oie）列为必须申报的对虾急性传染病。在我国一些对虾养殖区，随着养殖规模的不断扩大，不合理的养殖环境和追求过高的养殖密度，同时打破了对虾体内的免疫平衡系统，降低了虾只对生活环境的适应性，及对外来病原体和病毒感染的抵抗力，增加了包括tSV在内的病毒感染概率。与已有的研究结果相类似，本研究结果显示tSV感染后可导致南美白对虾快速死亡，但由于缺少对虾或者甲壳动物易感的细胞株，因此很难对其感染的病毒数量进行量化，因此在实验中采用tSV发病虾只粗提物进行人工感染。在整个tSV感染周期中（4～6d）导致了50%～80%的对虾死亡率，而感染中期（2～3d）可导致20%～30%的对虾死亡率，我们收集发病感染比较典型的时期即感染后2～3d的对虾血淋巴组织作为研究对象。在实验中还发现，对照组有少量虾只出现死亡（2/36），但这些死亡的虾只并未出现典型的tSV感染症状，Rt-pCR结果也为阴性，因此推测是由于环境或者其他因素造成的死亡。
包括tSV在内的病毒可通过多种途径作用于虾体，其中较为重要的靶器官是血液免疫系统，同时血液免疫系统也是抵御病毒入侵的主要场所。但与脊椎动物不同，甲壳类动物的免疫系统并不发达，机体主要依赖于非获得性机制防御外来细菌和病毒的入侵；与脊椎动物相似，免疫系统由细胞免疫反应和体液免疫反应组成，其中细胞免疫反应是其主要手段；但同时病毒的入侵也会导致免疫系统能力的降低，为阐明两者的关系，本实验评估了桃拉病毒（tSV）对对虾生存和血液免疫反应的影响。
对虾血液免疫系统包括3类血细胞，即透明细胞，半颗粒细胞和颗粒细胞，以及存在于血浆中的免疫分子。3种血细胞在免疫防御过程中各自担当不同的功能，透明细胞细胞质内缺少颗粒，其主要作用是吞噬外来物的功能。小颗粒细胞起包裹、吞噬以及储存和释放酚氧化酶原系统的作用；而颗粒细胞细胞质内含有大量颗粒，酚氧化酶原（po）及SoD等组分，不具有吞噬功能，但异物刺激可使这些功能颗粒释放到细胞外，从而实现细胞的免疫反应。Song等人利用注射方式使南美白对虾感染tSV病毒，2～3d后检测发现感染组血淋巴细胞总量，透明细胞以及颗粒细胞（半颗粒细胞和颗粒细胞）呈现显著性下降[3]。本研究采用瑞氏-Giemsa染色方法，对南美白对虾进行血细胞统计和分类，与Song等的研究结果相似，我们的研究结果显示tSV感染可导致对虾血淋巴细胞总数，透明细胞数以及颗粒细胞数（半颗粒细胞和颗粒细胞）呈现显著性下降，表明tSV可损伤免疫细胞，从而降低虾只的免疫力，导致其死亡。
已有文献显示，tSV感染可导致病虾体内氧自由的浓度升高[3]，自由基对生物膜和组织细胞的损伤作用会导致一系列病理过程。此外，机体内存在一系列的抗氧化系统，包括SoD、过氧化氢酶（Cat）和谷胱甘肽过氧化物酶（GpX）等，以中和体内的自由基。生理条件下体内氧自由基处于低浓度动态平衡，不会引起损伤，当某种因素使氧自由基生成过多超出清除能力或清除能力减弱，则氧自由基过多，以致损伤生物大分子，破坏细胞的结构和功能，促使疾病发生发展[8，9]。本实验结果表明，感染tSV的对虾血浆，在感染后的2～3d，SoD活性明显下降，提示tSV引起的细胞应激反应损害SoD活性酶的表达，体内还原氧自由基的能力在减弱，导致自由基对组织细胞的损伤。由于颗粒细胞是SoD的存储单元，因此可以解释颗粒细胞数量的降低是SoD活性减弱的其中一个原因。此外，体内过多的氧自由基本身也可损伤SoD酶活性。
在虾、蟹和昆虫等节肢动物中，po系统是一种重要的多级酶联反应系统，具有调节免疫、识别异物等生理功能[7，10]。po系统是一种非常有效的进行非己识别的免疫系统，当遭受病原体入侵时，可以迅速通过识别真菌的β-1，3葡聚糖、G-细菌的脂多糖等微生物壁成分及病毒的某些组分而激活，在伤口附近和病原体周围产生黑色素，促进伤口愈合，并抑制甚至杀死病原体。本实验的结果指出，经tSV感染的虾只，po活力显著降低，鉴于血细胞数量的下降，po活力下降也是合理的。
综上所述，tSV感染可以在细胞水平或体液分子水平降低南美白对虾血液学免疫指标，此研究为今后提高tSV感染的防御，以及切实可行的tSV治疗策略提供了新的思路。
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免疫组化染色篇8
【关键词】:小鼠组织;免疫组化技术
【中图分类号】R392.33【文献标识码】a【文章编号】1007-8517(2010)06-034-1
医学研究和科研领域经常会应用动物模型来进行研究,以此来探索人类疾病的模拟反应。在过去一个世纪的研究中,小鼠已经成为建立人类疾病的动物模型的最佳实验材料。当科研人员应用小鼠做为研究对象时,往往采用免疫组织化学的方法对小鼠组织进行鉴定和分析。但是由于免疫组化操作的影响因素诸多,免疫组化效果不稳定等因素常常困扰着免疫组化操作者。本文就以上相关问题进行了简单的总结和分析。
1小鼠组织的应用
小鼠经常被用作动物模型进行科学研究,因为现在小鼠的基因改造技术越来越成熟,并且它的生理生化及发育过程类似于人类,基因组也和人类有90%同源,所以小鼠模型可以基本上真实模拟人类的功能活动和反应;小鼠作为遗传学研究材料的另一优势还在于其基因组计划已基本完成[1]。基因组序列的大量信息为研究基因功能及其表达调控、胚胎发育和人类疾病的分子机制提供了条件基础和技术手段。
2免疫组化的原理及优点
免疫组化技术是在组织化学的方法上结合免疫学的理论和技术发展起来的一门新技术,能将形态、代谢和功能密切结合起来。简单地说,用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体,其结合后经一系列方法的处理,出现呈色反应,这样在光镜下就可以确定组织的来源属性和部位。免疫组化技术还有着以下的优点。(1)特异性强,抗原抗体的结合具有高度特异性;(2)敏感性高。由于aBC发或Sp法的出现时抗原抗体的结合更敏感;(3)定位准确,免疫组化技术可在组织和细胞内准确定位。
3实验中存在的问题及注意事项
3.1组织的预处理
因为小鼠模型都十分珍贵,所以我们在试验中应尽量减少失败的几率。首先,小鼠组织的剥离要迅速,固定要及时,否则很多组织比如脑组织很容易被破坏。其次,固定时间要适当。固定时间以常温下6-12小时为宜。过度固定可能导致组织抗原的损失,影响实验效果[2,3]。最后,组织的脱水时间要适当。拿裸鼠为例,因为其组织比较柔嫩,所以脱水时应该从低浓度乙醇开始,比如50%乙醇梯度开始,并且适当缩短脱水,透明的时间,防止小鼠组织变形,变脆变硬,影响后面的切片和形态观察。
3.2免疫组化实验步骤
免疫组织化学技术是多步骤、多因素决定的实验方法,任何一个环节稍有不慎,都直接影响免疫组化的结果。下面从以下几个方面进行阐述:(1)抗原修复。由于小鼠组织在福尔马林或其他固定液中会引起蛋白内或蛋白间亚甲基桥的桥连,导致许多抗原簇被封闭。所以,需要先进行抗原修复或暴露。试验中应该根据具体组织和抗体选择最佳的修复方法。(2)减少或消除非特异染色。一般小鼠组织中免疫组化的非特异染色较深,常常干扰实验结果的观察。我们应该从以下方面尽量避免:①抗体浓度要适合。试验中通过设计梯度稀释抗体来确定最佳抗体稀释浓度。抗体浓度过高也会产生非特异染色。②pBS洗涤要充分。试验中尽量使用新鲜的pBS,每次的洗涤时间也要严格按照说明书进行。③实验用的封阻血清要确保与一抗同源,封阻时间也要足够。④实验的整个过程中都要确保组织不能干掉。(3)DaB显色:对二甲胺基偶氮苯(DaB)显色的时间也不同程度影响免疫组化的最终效果。最好显微镜下控制显色,所以操作者应具备一定的常用抗体定位的知识,不要显色时间太长,如果无阳性物质,显色时间过长无益,只能使假阳性的机率倍增。
3.3结果的判断和分析
免疫组化染色结果的判断应该是阳性染色强而非特异染色很淡或无,两者形成鲜明的对比,阳性标记物的位置准确(核、质、膜、血管壁或间质等),细胞边界清楚。判断根据:根据阳性细胞的染色强度:(无着色细胞)(一),(+),(++),(卅)。免疫组化染色结果还要结合组织形态学判断是真正的阳性染色而非其他着色。另外实验的进行还必须设有对照,比如阳性对照,阴性对照,自身对照等,这对结果的分析很重要。
4总结
总之免疫组化是一项很精确的实验技术。它在小鼠组织研究上的应用有着很重要的科研价值和潜力。近年来,由于检测技术敏感性的不断增强;单克隆抗体的制备;基因库的建立;以及修复抗原性的各种措施、特别是热预处理法的出现与发展,使得免疫组化技术的使用迈出了崭新的一步。虽然该技术也同时存在很多困难,但是只要我们认真操作每一个步骤,一定能做出高质量的小鼠的免疫组化切片并且得到有用的实验结果。
参考文献
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免疫组化染色篇9
目的 制备人原发性胆囊癌单克隆抗体，对其特异性进行研究。方法 以胆囊癌细胞系SGC-996免疫Balb/c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术，获得稳定分泌抗SGC-996单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。结果 杂交瘤细胞符合融合细胞核型特点，有较强的成瘤性。抗体亚类为igG1。相对应的抗原主要表达在胞质和胞核中，分子量约为67kD。抗体对胆囊癌有较强的免疫反应，其他癌组织、癌旁组织及间质、正常胆囊上皮和成纤维细胞均呈阴性。结论 建立一株杂交瘤细胞系，能稳定分泌单克隆抗体，该抗体具有较高特异性。
【关键词】胆囊癌；杂交瘤；单克隆抗体；免疫组织化学/免疫细胞化学
abstract：objectivetopreparemonoclonalantibody(mcab)againsthumangallbladdercarcinomaantigenandtolayafoundationforfurtherstudyofthetumour，clinicaldiagnosisanddrug-guidedtreatment.methodsBalb/cmicewereimmunizedwithSGC-996humangallbladdercarcinomacells.thelymphocyteshybridomatechniquewasusedformcabpreparation.thecharacterofmcabassociatedantigenwastestedthroughtheimmunohistochemistry(iHC)，immunocytochemistry（iCC）andwesternblott.ResultstheanalysisofchromosomeshowedthatthehybridomacellshadthecharacterizationofbothSp2/0andmicespleencell.thecelllineinoculatedinabdominalcavitiesofBalb/ccoulddeveloptotumouronmesentery.themcabwasfoundtobetheigG1isotype.theantigenrecognizedbymcabwasaproteinwithamolecularweightof67kDandlocatedincytoplasmandkaryonofSGC-996.theiCCresultsshowedthatthemcab4e6reactedstronglytogallbladdercarcinomaandnegativetogastriccarcinoma，colorectalcarcinoma，hepatocellularcarcinoma，esophagealcarcinomaandnon-digestivetracttumor.Conclusionthehybridomacelllinecanbepreparedtosecretestablymonoclonalantibodyagainsthumangallbladdercarcinoma.itcouldreactspecificiallywithgallladdercarcinoma.
Keywords：HumangallbladderCarcinoma;Hybridoma;monoclonalantibody;immunohistochemistry;immunocytochemistry
原发性胆囊癌(primarycarcinomaofthegallbladder，pCG)是胆道系统常见的恶性肿瘤，早期无特殊症状，给胆囊癌的诊断，尤其是早期诊断，带来很大困难。寻找原发性胆囊癌特异性肿瘤标志物，为胆囊癌的早期诊断及预后提供可靠、准确的判断指标，已成为研究原发性胆囊癌生物学行为的重要环节。本研究以人原发性胆囊腺癌细胞株为免疫原，制备该细胞株单克隆抗体，并对其特异性进行了研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物
Balb/c小鼠，雌性，9～12周龄，购自第二军医大学实验动物中心。
1.2 组织与细胞株
胆囊癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、肺成纤维细胞，由同济大学肿瘤研究中心提供；Sp2/0骨髓瘤细胞，购自中科院上海细胞所。病理组织切片取自同济大学附属同济医院。
1.3 主要试剂
peG1500、Hat、Ht购自SiGma公司；SaBC免疫组化试剂盒购自华美公司；小鼠单抗免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒购自晶美公司。
1.4 方法成
1.4.1 单克隆抗体制备
采用9～12周龄雌性Balb／c小鼠，以5×105SGC-996胆囊癌细胞免疫3次，每次间隔2周，前两次为腹腔注射，末次为尾静脉注射［1］。末次免疫后3天取脾细胞；与小鼠骨髓瘤细胞Sp2／0以5∶1比例在50％peG1500作用下进行融合。用含Hat的Dmem培养液在96孔板中选择培养，当杂交瘤细胞长满孔底2/3，取上清液用aBS-eLiSa法进行克隆筛选，选择对SGC-996细胞呈强阳性反应的克隆，扩大培养于含20％小牛血清的Dmem培养基和5％Co2的孵箱中，部分冻存［2］。1×105杂交瘤细胞接种于注射过石蜡的Balb／c小鼠腹腔中，7天后获得富含单抗的腹水。
1.4.2 单克隆抗体鉴定
杂交瘤细胞核型分析、腹水型mcab效价测定按文献报道［3，4］的方法进行。mcab免疫球蛋白类型及亚类鉴定参照试剂盒说明书操作。
1.4.3 免疫细胞化学和免疫组织化学染色
参照常规SaBC法进行。切片抗原修复，放于0.01m枸橼酸钠缓冲液中，煮沸10min。本实验共检测细胞株7种，肿瘤组织切片47例。
1.4.4 单抗识别抗原的提取和分析
以膀胱癌细胞为对照，取对数生长期SGC-996细胞及eJ膀胱癌细胞，用pBS冲洗细胞后，加入细胞裂解液，置冰上放置20min后，用刮匙将细胞从瓶壁上刮下；在4℃条件下，10000r离心20min；取含蛋白质的上清液，常规方法行SDS-paGe和westem-blot，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠igG（1∶500），BCip/nBt显色。
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2 结果
2.1 杂交瘤细胞株建立
融合细胞生长情况良好（图1），采用aBS-eLiSa法筛选，选取oD值较高而细胞数量较少的孔进行亚克隆，经4次亚克隆筛选抗体阳性率逐次图1 融合后7天杂交瘤细胞 ×400
Fig.1 hybridomacells×400(sevendaysaftercombination)提高，达100％。选一株持续分泌单抗并且滴度最高的杂交瘤，命名为4e6。核型分析显示（图2），
图2 杂交瘤细胞染色体 ×400
Fig.2 theChromosomalmorphologyofhybridomacell×400杂交瘤细胞核内既有中间着丝、亚中部着丝点等骨髓瘤细胞染色体标记，又有小鼠脾细胞顶端着丝点染色体标记，染色体数目达100条以上，符合小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞的核型特点。杂交瘤细胞接种小鼠腹腔一周后，肠系膜上密布粟粒大小的肿瘤，有较强的成瘤性，(图3)。冻
图3 杂交瘤细胞成瘤性
Fig.3 tumorigenicityofhybridomacellline存半年后复苏的杂交瘤细胞，仍能分泌抗体，具有较高的活性。
2.2 单克隆抗体的生物学特性
小鼠单抗免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型为igG1，轻链类型为κ链（图4）。aBS
图4 抗体免疫球蛋白亚型
Fig.4 isotypeofthemcab4e6
-eLiSa法测定培养上清液及腹水的效价均大于1∶128000，效价较高。免疫组织化学、免疫细胞化学及westem-blotting发现（图7）该抗体对应抗原蛋白在胞质和胞核中均有表达，分子量约为67kD。
2.3 单克隆抗体与肿瘤组织的反应性
细胞系免疫细胞化学的半定量测定（图5a，B），结果见表1。胆囊癌免疫组织化学染色（图6）及各类癌组织免疫组织化学染色的半定量检测见表2。表1 免疫细胞化学的半定量结果表2 免疫组织化学染色结果
3 讨论
本研究以人胆囊癌细胞为免疫原，用淋巴细胞杂交瘤技术获得了一株能持续稳定分泌抗人胆囊癌单抗的杂交瘤细胞，命名为4e6。阳性克隆筛选中，普通eLiSa检测的灵敏度多数报道为20ng/ml～100ng/ml，且间接法eLiSa抗原包被浓度需达到1μg／ml～10μg／ml［5］。我们用胆囊癌细胞SGC-996包被96孔板作为抗原对抗体进行检测，并依据文献［6］进行实验方法改进，采用aBS-eLiSa法，取得了较好结果。
免疫细胞化学染色结果显示，SGC-996、GBC-SD胆囊癌细胞均呈强阳性反应，而胃癌细胞BGC-803、BGC-823，mCF-7乳腺癌细胞、eJ膀胱癌细胞和wi38人肺成纤维细胞则均为阴性反应。免疫组织化学染色结果，胆囊癌均呈强阳性反应；食管癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等癌组织和正常胆囊上皮，癌旁组织及间质均为阴性。这些结果说明，该单克隆抗体对胆囊癌有高度特异性，而正常组织则阴性反应，提示其识别的抗原极有可能是一种肿瘤标志物。另外，western-blot实验中，将膀胱癌作为对照，抽提了胆囊癌和膀胱癌细胞总蛋白，杂交的结果显示，4e6单抗所针对的抗原在胆囊癌中有较高的表达，而在膀胱癌中无表达。进一步验证了免疫细胞化学的结果。
4e6单抗显示出了较高的胆囊癌特异性，有望用于胆囊癌及消化道肿瘤的免疫诊断及相关研究。然而，由于目前检测的病例数尚有限，肿瘤类型也不够齐全，该单抗的组织特异性还需要通过积累更多的病理材料才能作出更全面、准确的结论。
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免疫组化染色篇10
关键词：免疫组化技术 病理组织切片制作应用价值
在疾病临床诊断中，病理组织检查是十分常见的手段且涉及范围广泛。目前阶段，现代医学技术取得了理想发展成就，而免疫组化技术在病理组织检查中也得到了普遍应用，使得病理组织诊断水平显著提高[1]。所谓免疫组化技术也被称作免疫细胞化学技术，经常被应用在现代生物学与医学中，于组织细胞原位中用标记特异性抗体或抗原在免疫反应与组织化学呈色反应的作用下，可定性定量地测定相对应的抗体与抗原。而且，免疫组化技术各环节紧密相连，即便任一环节发生问题都会影响制片质量，不利于临床病理组织诊断结果准确性的提高，所以需在制片中对制片质量进行合理化控制。基于此，文章将免疫组化技术作为主要研究对象，重点阐述其在病理组织切片制作中的应用价值，希望有所帮助。
资料与方法选取2019年9月-2020年9月病理组织标本60例，随机分成两组，各30例。对照组乳腺组织标本14例，宫颈组织标本16例；患者平均年龄(42.93±5.54)岁。试验组乳腺组织标本15例，宫颈组织标本15例；患者平均年龄(42.75±5.62)岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义(p>0.05)，具有可比性。
方法：在材料与设备方面，将试剂选择为甲醛、硫酸铝、二甲苯、苏木精、无水乙醇、石蜡、碘酸钠和免疫组化试剂[2]。而在仪器选用方面则选择包埋机、全自动脱水机、轮转式半自动组织切片机与组织摊片机等等。科室根据具体程序完成设备的招标购买，通过图像分析仪器与电热鼓风干燥恒温烤箱的应用完成制作任务。⑴对照组应用传统方法制作：(1)在组织标本离体以后的0.5h之内固定处理，在固定液内部放置组织标本，或在低温条件下储存。随后，在浓度为10%的中性缓冲甲醛溶液内放置组织标本，将时间控制在8～24h并进行固定处理；(2)借助热修复方法抗原修复固定处理后的标本，通过热效应引导抗原。抗原修复的温度不允许低于100℃，而修复液的pH值在7.5～8.5，修复时间在3～15min[3];(3)根据基本操作步骤对病理组织切片进行制作，确保脱蜡时间、使用试剂充足，且试剂均匀增加，其面积应超过切片组织的0.05～0.35cm，以免产生边缘效应。⑵试验组应用免疫组化技术制作：(1)在室温条件下进行常规脱蜡切片，并在浓度3%的双氧水中放入组织标本浸泡20min，并使用磷酸盐缓冲液冲洗组织切片，次数是3次，每次冲洗时间5min;(2)在高压锅内盛入1000mL的柠檬酸缓冲液，加热到沸腾，将做好标记的切片放入溶液，加盖加压修复，切片主要包括雌激素受体、人表皮生长因子受体、p16、Ki-67以及孕激素受体抗体，随后对溶液继续加热3min，各切片需滴加一抗，放置在温度为4℃的冰箱内过夜孵育[4];(3)使用磷酸盐缓冲液冲洗切片三次，pH数值为7.4，每次冲洗5min;(4)在室温条件下，于组织切片上滴加二抗，孵育时间15min，随后使用磷酸盐缓冲剂冲洗三次组织切片，每次冲洗时间5min;(5)在显色剂内放入组织切片，将显色时间控制在5～10min，使用苏木精染色和水洗处理，借助脱水透明中型树胶对组织切片进行封固处理[5]。
评价指标：比较两组制片效果及确诊率。
统计学方法：数据采用spss23.0软件分析；计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验；计量资料以(±s)表示，采用t检验；p<0.05为差异有统计学意义。
结果两组组织标本制片效果比较：试验组制片优良率高于对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。见表1。
表1两组组织标本制片效果比较(例)
两组确诊率比较：试验组确诊29例，确诊率96.67%，对照组22确诊73.33%，试验组确诊率高于对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。
讨论所谓免疫组化技术具体指的就是在酶和底物相互作用下形成有色反应物，对组织或是细胞内抗原进行定位的技术，定位的准确性较高且可长时间保存标本，实际操作相对简单。在选择酶的时候，一定要保证其容易被检出且使用电镜或光镜进行观察[6]。与此同时，酶的反应物要稳定且不容易扩散，具有理想的定位效果。病理检查工作开展的过程中，因标本的固定时间缺乏规范性且组织脱水不达标，很容易影响试剂的浓度，不利于制片质量的提高，使得临床诊断难度显著增加。而利用免疫组化染色的主要原理就是酶的聚合物与二抗有效结合并形成多聚螯合物，通过与一抗的结合，使得抗原抗体信号显著增加，而且多聚物内部并不会产生链霉菌抗生素蛋白，也不存在背景染色的情况，直接提高了切片制作的效果[7]。
根据以上研究结果可以了解到，试验组应用免疫组化技术后，在制片效果与确诊率方面的效果远高于对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。可以说，较之于传统的病理组织切片制作方法，免疫组化技术所制作的病理组织切片质量更高，有利于确诊率的提高。究其原因，采用此技术制片期间会对质量加以控制，为病理组织学检查工作的开展提供了必要帮助。
但仍需注意的是，在病理组织切片制作过程中始终存在一定的缺陷：(1)取材方面：病理组织切片制作的基础性环节就是取材，最常见的问题就是标本为病变组织，且组织厚度不均匀，会对制片质量产生影响。若描述病变组织部位不合理或记载有误同样会对制片效果带来不利影响。为此，在取材过程中一定要对组织标本体积加以确定并及时处理，以免因存储不合理而对标本造成污染，进而影响制片的质量[8]。(2)新鲜的组织标本要固定处理才可确保原有细胞具备固有形态，以免组织自溶，为此，在标本离体后应及时放入固定液并接受固定处理。染色试剂会对染色的效果产生直接影响，所以在制作期间应结合临床需求做出选择。(3)病理组织切片染色期间，要强调染色工作路径，使得组织切片的染色效果达标，尽可能避免假阳性片或无色片情况的发生。而在抗原修复期间，染色剂的显色效果要理想，保证染色的效果与着色质量达标，增强组织切片的着色能力，制作质量达标的病理组织切片。而在比较抗原阳性和阴性试验中，还要对切片染色的时间给予关注，检验工作人员需遵循操作标准程序对制片加以规范，以免污染病理组织切片，以增强制片的质量。实际制作期间，还要管控免疫组化技术质量，以优化制片的质量，改善病理组织学检查诊断效果，进一步推动疾病诊断工作的顺利开展。由此可见，开展临床检验期间，通过质量管控免疫组化病理技术，能够增强组织切片制作效果，且提高了免疫分析工作的准确性，利于病理检验工作的有效落实。
总体来讲，在制作病理组织切片的过程中应用免疫组化病理技术，临床价值突出。在实际应用期间，通过质量管控方式的运用，使得制片质量提升，推进了病理检验诊断工作水平的改善，进而为临床诊断工作的开展提供了必要的帮助。
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