纤维素酶篇1
关键词白蚁；纤维素酶；纤维素；降解
中图分类号Q556.2文献标识码a文章编号1007-5739（2012）21-0235-02
纤维素是自然界中分布最广、蕴藏最多的一种天然可再生聚合体。自然界年产量纤维素超过1011 t的，按能量换算约等于近7×1011 t石油，而且纤维素无污染可再生，能循环环保使用[1]。白蚁遍布于除南极洲外的六大洲，全世界已知有3 000多种白蚁，初步统计总量超过3.5×1017头，纤维素年均消耗量约7×108 t。目前制约纤维素广泛应用的主要因素是纤维素酶的酶稳定性差、催化效率低、人工提取和表达的酶纯化难度较大、进行工业化大规模经济生产较难。白蚁纤维素酶对纤维素的开发利用具有特别重要的意义，已成为国内外研究的热点。本文就白蚁纤维素酶的研究进展作一简述。
1白蚁纤维素酶简介
纤维素酶是一组能够水解纤维素的葡萄糖苷键并转化成葡萄糖的多组分酶的总称。纤维素酶包括内切酶、葡萄糖苷酶和外切酶。纤维素需要这些酶的共同出现并且协同作用共同催化才能完全被降解。到目前为止，纤维素酶降解纤维素的催化降解机理仍未得到完全阐明。微生物（包括原生动物、细菌、真菌和放线菌等）、植物和节肢动物等都能分泌产生纤维素酶[2]，但白蚁是分泌产生纤维素酶的最大群体。
白蚁纤维素酶主要包括外源纤维素酶和内源纤维素酶。外源纤维素酶由白蚁消化道特别是中、后肠共生的微生物包括原生动物和细菌及高等白蚁巢体真菌分泌产生。目前，还有部分白蚁暂无内源纤维素酶发现的报道。一直以来，人们认为动物自身不含纤维素酶，以纤维素为食的动物是通过体内共生微生物来降解纤维素的。1963年，marshall et al首次检测到动物能分泌产生内源纤维素酶。1998年，watanabe et al在白蚁中克隆到内源纤维素酶，从而证实了白蚁自身也能分泌产生内源性纤维素酶[3]。
到现在，研究发现白蚁内源纤维素酶包括内切酶和糖苷酶，主要在白蚁中肠的上皮细胞和唾液腺分泌产生[4]，暂时还没有关于外切酶的报道。一些研究发现：白蚁纤维素酶的酶学特性、稳定性、含量、组成成分及其分泌部位等与白蚁的品级、产地和种类等相关。白蚁体内的纤维素酶存在着动态的协调平衡。绝大部分白蚁通过内源和外源纤维素酶的协调催化降解作用，在体内形成高效地纤维素酶降解催化体系，在其独特的肠道结构和共生微生物的帮助下，将纤维素转为葡萄糖等营养物质以维持自身和共生微生物的生长。白蚁内源纤维素酶与外源纤维素酶的相互协同降解机制，白蚁与其体内微生物的共生关系现未得到完全阐明。
2白蚁纤维素酶研究进展
至今，纤维素酶的研究已经历酶的提取纯化和克隆表达2个发展阶段。目前，人们主要集中在对纤维素酶的结构功能研究以及纤维素酶的高表达加以经济应用方面，并已在催化机理、生物合成调控及工业生产应方面用取得较大进展。人们对白蚁纤维素酶的研究，首先是从其共生微生物分泌的外源纤维素酶开始的。
1925年，Cleveland et al指出白蚁共生原生动物在白蚁消化降解纤维素中起着重要作用[5]。1932年，trager[6]发现白蚁肠道共生的鞭毛虫能够分泌纤维素酶。1938年，Hungate et al发现内华达古白蚁进食的纤维素1/2以上被其共生原生动物降解[7]。
2005年，inoue et al在家白蚁共生原生动物中克隆到了纤维素酶基因[8]，从分子角度证明白蚁体内存在着原生动物分泌的外源纤维素酶。Knig H、Drge S和tamburini e et al先后分别在白蚁中分离获到具有纤维素酶活性的细菌[9]。
2007年，warneck et al [10]对高等白蚁后肠共生微生物进行研究，发现大量纤维素酶基因，表明白蚁肠道细菌对白蚁纤维素的水解具有重要的作用。高等白蚁则能利用蚁巢共生真菌食取纤维素酶来催化纤维素。martin et al发现撒哈拉大白蚁通过食巢真菌间接获取外切葡聚糖酶[11]。
1998年，watanabe et al通过试验在白蚁的唾液腺中克隆到纤维素酶，从而证实了白蚁内源性纤维素酶的存在。随着研究的不断深入，越来越多的内源纤维素酶基因得以发现，内源纤维素酶在白蚁降解纤维素过程中的作用越来越为重要。
1925年科学家发现了白蚁共生微生物降解纤维素的现象，但纤维素酶基因方面的研究始于20世纪70年代末。1982年，whittle et al [12]首次在微生物中克隆到纤维素酶基因。1998年，watanabe et al首次克隆出白蚁内源纤维素酶基因。1999年，tokuda et al克隆到纤维素酶全长基因并在大肠杆菌中得到表达[13]。
迄今为止，人们已经在白蚁肠道共生微生物中得到外源纤维素酶基因近1 000个，主要分属于糖基水解酶家族第45家族、第7家族和第5家族[14]，并已在大肠杆菌中成功表达近100个。白蚁内源纤维素酶基因已有20余种得到克隆，主要分属于糖基水解酶家族第9家族，目前也有不少在原核表达成功表达的报道。
目前，纤维素酶基因原核表达存在着产量低、活性弱、稳定性差和纯化难等的缺点，不适于工业大规模经济化生产。人们正尝试用真核表达系统来进行纤维素酶基因的表达研究，主要集中在酵母表达系统，并取得了一定的进展。同时，随着动物内源纤维素酶的发现的不断增多，为克服微生物分泌的纤维素酶原核表达的不足，白蚁内源纤维素酶的真核高效表达成为研究的热点。马斯科马公司发明一项白蚁纤维素酶在酵母中的异源表达的专利，能有效提高表达效果。
纤维素酶的最核心问题是酶稳定性差、催化效率低、人工提取和表达的酶纯化难度较大、工业化经济生产较难进行。因此纤维素酶的生物合成调控、降解催化机理和空间结构功能的基础理论研究，以及克隆和筛选出表达高活性纤维素酶的基因和利用分子生物学技术构建改造活性高、耐高/低温、耐酸/碱的纤维素酶生物工程菌的应用研究成为当今的主要研究方向。
近年兴起了基因重排、分子模拟和定点突变等技术，这些技术主要对蛋白质分子结构进行三维模拟，通过同源建模等手段进行理性分子设计，对天然酶蛋白的催化活性、稳定性、底物特异性、耐热性和耐酸碱性等进行合理化改造，具有较强的预见性和可操作性。
2002年，attila nemeth et al [15]对通过突变技术有效提高了纤维素酶的耐热性。2005年，JinFeng ni et al[16]对4种白蚁纤维素酶基因进行改造，酶活性提高了10倍以上。2009年，Kim Y S et al [17]通过定向进化有效提高了纤维素酶的活性，Liu w J et al [18]则提高了纤维素酶的热稳定性。2011年，Liang Chaoning et al [19]将内切葡聚糖酶进行改造，酶活性增加了近2倍。华南理工大学对白蚁 nasutitermes takasagoensis的纤维素酶和来源于thermom-onospora fusca 的纤维素酶进行同源建模，并将重组后的纤维素酶在毕赤酵母中成功表达[20]。广西大学对家白蚁内切葡聚糖酶进行饱和突变，并取得一定结果[21]。
3展望
白蚁是自然界中纤维素的最主要消耗者，白蚁主要通过内源和外源纤维素酶的协同作用分解纤维素，最终转化为葡萄糖，白蚁体内就是一个微型的生物发酵器。若能模拟白蚁的纤维素酶降解系统，工业化纤维素-葡萄糖-酒精-燃料的生产体系，必是解决当前环境问题、能源危机的一条重要途径。纤维素酶的结构与催化机理、白蚁与其共生微生物的协同降解机制以及定向设计并高表达活性高、稳定性强的纤维素酶以便工业应用是当前白蚁纤维素酶研究面临的主要任务。随着研究的不断深入，白蚁纤维素酶将在人类生活中发挥出更大的作用。
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纤维素酶篇2
关键词：纤维素酶；tween80；pH；表面活性剂；缓冲体系
中图分类号：Q935文献标识码：a文章编号：0439-8114（2013）18-4486-03
纤维素是地球上数量最大的可再生资源，也是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物[1]。纤维素是经β-1，4葡萄糖苷键连接而成的直链高分子，具有很强的结晶性，糖苷键能通过酶的催化作用发生水解。可以通过纤维素酶系来分解纤维素，使之转变为可被利用的D-葡萄糖，再进一步发酵为酒精，对开发新能源具有重要的意义[2]。
纤维素酶酶解反应过程主要受到温度和pH[3，4]等多方面因素的影响，同时表面活性剂可以使高分子聚合物变成复杂的亲水性化合物，使纤维素与纤维素酶有效结合，从而提高纤维素酶的酶解效率[5-7]。试验将表面活性剂、缓冲液和pH对纤维素酶酶活的影响进行了研究，以期得到纤维素酶适宜的酶解条件，更高效地转化和利用纤维素。
1材料与方法
1.1材料及仪器
卡那霉素、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（iptG）、羧甲基纤维素钠（CmC）、tween80、3，5-二硝基水杨酸（DnS）、苯酚、CuSo4·5H2o、CaCl2·6H2o、ZnSo4·7H2o、葡萄糖均为分析纯；R2工程细菌由重庆理工大学药学与生物实验室提供[8]。
tGL-16m高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；UV-2450紫外可见光光度计（优尼科仪器有限公司）；C型玻璃仪器气流烘干器（长城科工贸有限公司）；Fe20实验室pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；BS110S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；DZF-6051真空干燥箱（上海越众仪器设备有限公司）。
1.2方法
1.2.1R2工程细菌纤维素酶的分离纯化将R2工程细菌在LB培养液中培养48h后经iptG诱导，将诱导后的培养液于5℃、5000r/min离心30min，收集沉淀，往沉淀中加入10mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH4.8），超声波破碎（功率300w，间歇5s，99次）。取一小滴菌液于载玻片上，草酸铵结晶紫染液染色，显微镜下观察破碎情况，直至无完整细胞。将完全破碎后的菌液装入离心管，5℃，3000r/min离心15min，上清液于-20℃保存[9，10]。
1.2.2纤维素酶的鉴定和酶活的测定CmC培养基鉴定纤维素酶[11]。DnS法测定纤维素酶活[12]。一个酶活力单位（U）定义为45℃、pH4.8的条件下，每分钟催化CmC水解生成1μg葡萄糖所需的酶量。
1.2.3纤维素酶酶活最适缓冲液及pH的确定[12]用醋酸-醋酸钠缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制1%的CmC溶液。在各试管中加入1.5mL对应的1%的CmC溶液，再加入0.5mL“1.2.1”中提取的酶液，用2mL1%的CmC溶液作对照；40℃水浴40min后立即加入3mLDnS试剂，沸水浴7min后加入5mL去离子水，冷却后测定吸光度。
1.2.4纤维素酶最适温度的测定取“1.2.1”中提取的酶液0.5mL，加入CmC底物1.5mL，在不同温度（15、30、35、40、45、50、55、60、70℃）反应30min，加入3mLDnS试剂，沸水浴7min后加入10mL去离子水，冷却后测吸光值。
1.2.5纤维素酶酶活最适tween80浓度的确定[13]取“1.2.1”中提取的酶液0.5mL，加入CmC底物1.5mL，再加入0.1mL不同浓度的tween80溶液，45℃反应30min后加入3mLDnS试剂，沸水浴7min后加入10mL去离子水，冷却后测定吸光值。
2结果与分析
2.1标准曲线的绘制
根据羧甲基纤维素酶活力测定方法测定溶液中还原糖（葡萄糖）的含量，并以吸光值为纵坐标、葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线（图1）。标准曲线决定系数r2=0.9948，可以用于纤维素酶活力的测定。
2.2不同缓冲液及pH对纤维素酶酶活的影响
从图2可以看出，随着pH的升高纤维素酶酶活呈先上升后下降的趋势，合适的pH在4.0～5.5之间，最适pH为4.8，过酸、过碱的环境会影响酶和底物的稳定性，导致纤维素酶活性的降低。醋酸-醋酸钠缓冲液为较适缓冲液。
2.3温度对纤维素酶酶活的影响
从图3可以看出，R2工程细菌纤维素酶的活性先随着温度的升高逐渐增加，当达到35℃时纤维素酶的活力达最大，而后随着温度的升高酶活力下降。故酶活最适温度选择35℃。
2.4不同浓度tween80对纤维素酶酶活的影响
从图4可以看出，R2工程细菌纤维素酶酶活在tween80浓度为1.6%时达到最大，是对照（无tween80和缓冲液体系）的1.47倍。在较低浓度时，随着tween80浓度的增加纤维素酶酶活增强。tween80可以减弱发酵液的表面张力，纤维素被疏水基团包围，使纤维素高分子聚合物变成复杂的亲水性化合物，从而加强纤维素与纤维素酶的有效结合，提高纤维素酶的酶解效率。当酶活达到最大值后，随着tween80浓度的增加，可能使纤维素高分子聚合物被更多的表面活性物质包被，从而减少了纤维素与纤维素酶的接触机会，酶活逐渐降低。
3小结
试验以DnS法测定了R2工程细菌纤维素酶活力，研究了不同温度、不同浓度表面活性剂tween80、不同缓冲液及pH对纤维素酶酶活的影响，结果表明，在35℃tween80浓度为1.6%、醋酸-醋酸钠缓冲液pH4.8的条件下纤维素酶酶活最高，是对照的1.47倍。
表面活性剂能够使大分子聚合物的复杂空间立体结构发生变化，如纤维素是被疏水基团包围，难溶于水，较高的表面活性使纤维素高分子聚合物变成复杂的亲水性化合物，因此，纤维素酶可以方便地吸附底物，从而表现出酶活的增加。但是随着表面活性剂tween80浓度的不断增加，会使表面活性剂与纤维素酶之间的电荷积累而相互排斥，也可能因为表面活性剂与纤维素相互吸附降低了酶与底物的吸附从而使酶活下降。
在当今环境污染严重、能源紧缺的情况下，将纤维素酶反应体系扩大应用于工业化生产，把纤维素转化生成葡萄糖或酒精，能够提供重要的工业原料和能源物质，这对开辟新原料、新能源物质具有重要的理论和实践意义。
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纤维素酶篇3
关键词米曲霉；固态发酵；纤维素酶活
中图分类号S147.4文献标识码a文章编号1007-5739（2016）08-0197-02
abstractthecultureconditionsaffectedtheproductionofcelluloseenzymebyaspergillusoryzae，suchascarbonsource，nitrogensource，initialpH，watercontent，culturetemperature，culturetime，etc.theresultsshowedthatwhenthecarbonsourcewasbran，nitrogensourcewaspowderofbeancake，initialpHvaluewas6.5，moisturecontentwas50%，culturetemperaturewas30℃，trainingtimewas60h，thecelluloseenzymeactivityproducedbyaspergillusoryzaewasthehighest.
Keywordsaspergillusoryzae；solid-statefermentation；celluloseenzymeactivity
我国农作物秸秆的利用率普遍很低，多数作物秸秆都作焚烧处理，对环境的污染很大。作物秸秆中含有丰富的有机质、氮、磷、钾等作物生长所需的营养元素，如果能得到合理的利用，将会为人类带来巨大的收益。作物秸秆的处理方式有物理、化学、生物方法，其中生物降解具有污染少、能耗低等优点[1]。作物秸秆中含有丰富的纤维素，纤维素在纤维素酶的作用下可以水解生成单糖被作物和微生物利用，但纤维素不易被降解，几十年来，人们对于纤维素的预处理及酶水解过程进行了大量研究，其中纤维素酶的使用大大提高了纤维素的降解率[2]。
米曲霉属半知菌亚门丝孢纲丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉（aspergillusoryzae）是纤维素酶的主要生产菌种之一。工业用米曲霉菌种所产的酶系较多、酶系组成较复杂[3]，国内对该菌株的相关研究并不多，对其酶系在工业发酵过程中受到的影响因素及其作用机理并不十分了解，从而导致在工业生产过程中不能够十分精确地控制米曲霉的产酶过程，限制了这一传统的食用菌株在工业应用领域的进一步拓展[4]。本试验对米曲霉m1102产纤维素酶在固体发酵过程中所受的影响及活性变化进行了研究，以期为米曲霉产纤维素酶的工业化生产提供相关的理论依据。
1材料与方法
1.1供试材料
1.1.1菌种。米曲霉菌株m1102，来自中国菌种保藏中心。
1.1.2培养基与主要试剂。斜面培养基：土豆培养基（pDa）；液体种子培养基：豆饼粉5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖10g/L，mgSo40.3g/L，K2Hpo40.3g/L，调节pH值至7.0；营养盐溶液：naCl2g/L、KH2po41.5g/L、CaCo30.5g/L、mgSo40.5g/L，调节pH值至7.0；固体培养基：木质纤维素培养基；主要试剂：麸皮、稻壳粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖、豆饼粉、干酪素、蛋白胨、硫酸铵、尿素。
1.1.3仪器设备。酒精灯、接种环、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、pH测定仪、紫外分光光度计、水浴锅、恒温培养箱、电子天平、控温摇床。
1.2试验方法
1.2.1培养方法。一是米曲霉种子液制备：将米曲霉接种于pDa斜面上进行活化，用接种环挑取一环接种于250mL三角瓶的种子液中，装液量为50mL，30℃，180r/min，培养24h。二是固体培养：在250mL三角瓶中加入10g风干后过筛的木质纤维原料和5mL营养盐溶液，拌匀，121℃灭菌30min，冷却后将种子液以3%的接种量接种于固体培养基中，32℃下培养60h，测定其产纤维素酶活[5]。粗酶液的制备：每1g固态培养物加入磷酸缓冲溶液5.0mL（pH值7.2），室温下浸提1h，10000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。
1.2.2培养条件的优化。一是碳源对纤维素酶活的影响：分别用3%含量的麸皮、稻壳粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖作为培养基的碳源，其他成分同初始培养基，培养结束后测定其纤维素酶含量[6]。二是氮源对纤维素酶活的影响：分别以2%的豆饼粉、干酪素、蛋白胨、硫酸铵、尿素作为培养基的氮源，其他成分同初始培养基，培养结束后测定培养基中纤维素酶含量[6]。三是发酵条件优化：采用优化后的最佳发酵培养基，在固定其他发酵条件的基础上，逐一对发酵培养的初始pH值、培养基含水量、培养时间、发酵温度等培养条件进行优化。
1.2.3纤维素酶活的测定方法。采用GB-羧甲基纤维素法（CmC法）。
2结果与分析
2.1培养基碳源对纤维素酶活力的影响
酶诱导物和酶蛋白质前体同时对纤维素酶的合成有调控作用，酶诱导物一般为可利用的碳源，纤维素作为酶诱导物对纤维素酶的产生有重要作用。从图1可以看出，在培养基其他基础营养成分不变的前提下，改变碳源含量后，米曲霉产纤维素酶活发生显著变化，其中碳源为麸皮时纤维素酶活最高；稻壳粉和玉米芯粉次之，为最高酶活的72%和68%；玉米粉和蔗糖为最高酶活的60%和37%；碳源为葡萄糖时纤维素酶活最低，仅为最高酶活的30%。当碳源中纤维素含量丰富时，米曲霉产纤维素酶活力高，这是由于纤维素作为酶诱导物能刺激纤维素酶的产生，将其分解为可利用的单糖，而葡萄糖和蔗糖作为碳源时，米曲霉能直接利用其作为碳源，所以抑制了纤维素酶的产生。
2.2培养基氮源对纤维素酶活力影响
氮源是酶蛋白质前体的主要来源，因此氮源的类型和性质同样会影响纤维素酶的合成和分泌。选择不同氮源作为单一氮源进行发酵试验，来考察其对米曲霉产酶的影响。
从图2可以看出，在试验选用的5种有机和无机氮源中，以豆饼粉作为氮源时米曲霉所产纤维素酶活性最高；干酪素和蛋白胨次之，纤维素酶活是豆饼粉作为单一氮源时活性的96%和81%；当分别以硫酸铵和尿素为单一氮源时，米曲霉所产纤维素酶活性仅为最高酶活性的70%和68%。由此表明，有机氮源对纤维素酶活的影响大于无机氮源，这可能与有机氮源中营养成分含量多元化有关。
2.3培养基初始pH值对纤维素酶活力的影响
微生物在生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，导致培养基pH值发生变化，而培养基初始pH值不仅影响微生物的生长繁殖，且对其产酶情况有显著的影响。在优化培养基碳氮源基础上，调节初始pH值为4.0～9.0来考察米曲霉产酶活性的变化。从图3可以看出，米曲霉产生纤维素酶的最佳初始pH值为6.0～7.5，当培养基初始pH值为5.5，米曲霉仍能产生相对于最高活性72%的纤维素酶；而当培养基初始pH值调至8.0时，米曲霉产生纤维素酶活性则迅速下降至最高酶活性的34%。试验表明米曲霉产纤维素酶的pH值适应范围较宽，但过酸或过碱的环境不利于纤维素酶的生产。这可能是由于过酸或过碱的环境不利于米曲霉生长或破坏了纤维素酶活力。
2.4培养基含水量对纤维素酶活力的影响
水分是微生物生长代谢的重要物质，在固体发酵中，水分对微生物活性有重要影响。从图4可以看出，随着培养基中含水量的增加，米曲霉产纤维素酶活呈现先增高后降低的趋势，当培养基含水量为50%时，纤维素酶活最高。所以含水量过高或过低都会抑制米曲霉生长，这可能是由于低水分使米曲霉培养基中的营养物质溶解性降低，抑制了米曲霉生长；当水分含量过高时，培养基过于黏稠，破坏了培养基的多孔结构，降低了其透气性，而米曲霉是耗氧微生物，低氧环境不利于其生长。
2.5培养温度对纤维素酶活力的影响
微生物最适宜的温度范围一般为16～30℃，最高温度在37～43℃，温度过高或过低均不利于米曲霉生长。从图5可以看出，在30～35℃时，纤维素酶活最高，温度过低或过高都会降低纤维素酶活。这是由于，当温度过低时，米曲霉生
长缓慢导致产生纤维素酶少，而且低温环境会降低酶活力；当温度过高时，米曲霉会由于高温而出现老化现象，抑制了纤维素酶产生，并且高温容易使纤维素酶失活。
2.6培养时间对纤维素酶活力的影响
微生物处于不同的生长期时，其相应的生长代谢机理也不同。从图6可以看出，随着培养时间的延长，米曲霉产纤维素酶活呈先升高后降低的趋势。当培养至60h时，纤维素
酶活最高。这是由于培养初期米曲霉处于繁殖阶段，产生孢子数量有限，故分泌的纤维素酶少；而在培养后期，由于米曲霉出现老化，导致纤维素酶分泌量减少。
3结论
本试验研究了米曲霉菌株m1102在不同固体发酵条件下产纤维素酶的变化。结果表明：当碳源为麸皮，氮源为豆饼粉，初始pH值为6.5，含水量为50%，培养温度为30℃，培养时间为60h时，米曲霉产纤维素酶活力最高。为了深入了解米曲霉固体发酵产纤维素酶的影响因素，还需要对纤维素酶的生产条件和作用机理做更深一步的研究。
4参考文献
[1]袁喜庆.秸秆生物降解技术的效应[J].现代农业科技，2011（4）：261.
[2]汤鸣强，郑挺，曾小芳，等.酿造酱油米曲霉产中性蛋白酶提取与酶学性质研究[J].中国调味品，2008（348）：38-40.
[3]高晓梅，李杨，刘晓辉，等.固态发酵法生产大豆多肽的初步研究[J].山东农业科学，2014（7）：78-81.
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纤维素酶篇4
纤维素是烟草中主要的细胞壁物质，其含量高低直接影响烟叶的品质。低等级烟叶由于纤维素含量较高，其烟气会产生强烈的刺激性、呛咳、涩口、枯焦气［1］，因此，测定烟草中的纤维素，对于评价烟叶品质具有重要意义。传统的测定方法主要采用稀酸、稀碱与样品依次共煮后用有机溶剂处理，再经烘干后称重［2-4］，这种方法操作繁琐，费力耗时，且由于操作人员的技术差异会带来很大的误差。近年来，近红外（niR）光谱分析技术也被用于烟草中纤维素含量的测定［5］，但是因其数据模型的建立需要大量的数据支撑，其应用受到一定的局限。根据纤维素水解后生成葡萄糖的性质，采用酶解纤维素得到葡萄糖［6-7］，然后利用流动分析仪检测还原糖含量［8］，可计算得到纤维素的含量，而且酶水解具有专一性和高效性［9-10］，流动分析仪在行业内的应用也比较广泛，因此，建立测定烟草中纤维素含量的流动分析法，可为评价烟叶的品质提供技术支持。
1材料与方法
1.1材料、试剂与仪器2009年初烤烟叶样品17个（川渝中烟工业公司提供）。冰醋酸、柠檬酸、柠檬酸三钠（aR，重庆川东化工有限公司化学试剂厂）；葡萄糖、氯化钙、氢氧化钠（aR，重庆北碚化学试剂厂）；纤维素酶（BR，活力>15000DU，国药集团化学试剂有限公司）；聚乙氧基月桂醚、对羟基苯甲酸酰肼（aR，荷兰Skalar公司）。SkalarSan++流动分析仪（荷兰Skalar公司）；aX504分析天平（感量：0.0001g，瑞士mettlertoledo公司）；恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）；循环水真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；G3玻璃砂心漏斗（长春市玻璃仪器厂）。
1.2样品处理和分析准确称取0.25g40目烟粉，置于100mL锥形瓶中，加入25mL5%醋酸溶液，摇床振荡萃取30min，萃取出样品本身含有的水溶性糖［8］，用G3漏斗过滤，滤渣用蒸馏水冲洗3次，每次50mL；将滤渣转移到100mL锥形瓶中，加入60mL含有0.25g纤维素酶的柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲溶液（pH4.7）［7，11］，然后放入37℃恒温摇床水解24h；水解结束后将样品冷却至室温，过滤，用蒸馏水将滤液定容至100mL，利用流动分析仪测定样品液中的葡萄糖，测得葡萄糖含量乘以转换系数0.9（由纤维素水解方程式计算得到）即得纤维素含量。
2结果与讨论
2.1酶解条件的选择
2.1.1缓冲溶液用量对纤维素水解的影响准确称取0.25g烟粉样品5份，按照1.2的方法除水溶性糖，然后分别加入固定纤维素酶量（0.25g纤维素酶）的缓冲溶液40，50，60，70，80mL，在固定温度（37℃）条件下水解24h，纤维素含量的测定结果如图1所示。由图1可知，随着缓冲液体积的增大，纤维素测定量也逐渐升高，当缓冲溶液用量为60mL时，达到最高值，说明此时纤维素水解完全；当缓冲溶液用量大于60mL后，纤维素测定量逐渐降低，这可能是由于缓冲溶液用量过大，导致了酶浓度降低，酶不能与底物充分接触，从而使酶解效果变差。因此，选择缓冲液用量为60mL。
2.1.2酶用量对纤维素水解的影响在缓冲液用量为60mL、其他条件不变的情况下，分别考察酶用量为0.05，0.10，0.15，0.20和0.25g时的酶解效果，结果如图2所示。由图2可知，当酶用量为0.20g时，纤维素测定量最高，考虑到生物酶较容易部分失活，为保证纤维素水解完全，所以确定酶用量为0.25g。
2.1.3温度对纤维素水解的影响在缓冲液用量为60mL和酶用量为0.25g的情况下，分别考察纤维素在30，35，40，45和50℃下的水解效果，结果如图3所示。由图3可知，当温度<35℃时，纤维素水解不完全，测定量较低；当温度>40℃时，纤维素测定量降低，这可能是因为温度过高导致酶失活，使纤维素水解不完全；较适宜的水解温度为35~40℃，实验选择37℃。
2.1.4时间对纤维素水解的影响在缓冲液用量为60mL、酶用量为0.25g和水解温度为37℃的情况下，分别水解20，22，24，26和28h，结果（图4）表明，24h后，纤维素水解完全，所以确定水解时间为24h。
2.2工作曲线与检测限准确称取2.2009g葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL，摇匀，得标准储备液。移取1，2，3，4，5mL标准储备液，分别用蒸馏水稀释并定容至100mL，摇匀，即得葡萄糖系列标准溶液，浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8和1.0mg/mL，相当于纤维素0.18，0.36，0.54，0.72，0.90mg/mL。用流动分析仪测定标准溶液中的葡萄糖含量，并对电信号响应值Y（峰高，DU），与其浓度X（纤维素含量，mg/mL）进行线性回归分析，得其工作曲线回归方程为：Y=15893.3X+2117.5，r=0.9998。可以看出，纤维素在0.18~0.90mg/mL浓度范围内，工作曲线线性良好，适合于定量分析。通过测定空白试样，测得纤维素的检测限［12］为0.11mg/mL。
2.3精密度和回收率采用本方法对烟草样品的纤维素分别测定6次，测定量分别为125.8，120.7，126.9，127.3，126.2和125.1mg/g，相对标准偏差（RSD）为2.40%，说明本方法的重复性较好。在脱糖烟草样品中加入葡萄糖，测定其回收率，结果如表1所示。纤维素的回收率为96.7%~103.8%，说明本方法的准确性较高。
2.4与经典方法［3］比较分别用本方法和经典方法测定16个烟草样品的纤维素含量，结果如表2所示。通过对两组数据进行配对样品t检验，发现二者无显著性差异，说明该方法适合于烟草中纤维素含量的检测。
纤维素酶篇5
关键词:纤维素酶；微波；黄柏根；色素；抗氧化性
中图分类号：S789.4；R284.2文献标识码：a文章编号：0439－8114（2014）08－1888-03
CellulaseassistedmicrowareextractionandantioxidantactivityofpigmentfromtheRootofphellodendron
HUanGXiu-xiang,LaiHong-fang,XUnYuan-kai
(DepartmentofChemistryandLifeSciences，HechiUniversity，Yizhou546300，Guangxi,China)
abstract：theoptimaltechnicalparametersforextractingpigmentfromtherootofphellodendronbycellulaseassistedmicrowareanditsantioxidantactivitywasstudied.theresultsshowedthattheoptimalconditionsweremicrowavepowerof390w,enzymolysistemperatureof50℃,enzymolysispHof4.5,microwavetimeof120s,andusingwaterastheextractingsolvent.theresultsofantioxidationshowedthatpigmentextractedfromtherootofphellodendronhadacertainscavengingeffectonfreeradicalofDppHandhydroxylradical.thereductioncapabilitywasincreasedwiththeincreaseofpigmentconcentrationinexperiment.pigmentfromtherootofphellodendronwasapowerfulnaturalaxtioxidant.
Keywords：cellulose；microwave；therootofphellodendron；pigment；axtioxidantactivity
黄柏为芸香科植物黄皮树或黄檗的干燥树皮，黄柏根可入药，味苦，性寒，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮等功能［1，2］。人们对黄柏根的研究主要集中在生物碱方面，对黄柏根色素研究不多。合成色素虽然着色力强，色泽鲜艳，但已发现部分品种对身体有危害，具有严重的慢毒性和致癌性［3］，为此，天然色素慢慢被人们所青睐［4］。黄柏根有着丰富的黄色素，可以给食品提供鲜美的颜色，增加食品的安全性。本研究首次以水为溶剂，纤维素酶微波法提取黄柏根色素，具有省时、溶剂耗量少、提取率高等优点［5］。纤维素酶能够有效地破坏植物的细胞壁，降低扩散阻力，加快传质速率，从而提高提取率［6］，同时酶解法较为温和、对环境友好［7］。此外，还对所提取的黄柏根色素进行抗氧化性研究，通过对DppH、羟基自由基的清除能力来研究黄柏根色素的抗氧化能力，为黄柏根色素的提取、开发、利用提供了理论依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
黄柏根，购于广西宜州市药材市场。8453型紫外可见分光光度计（美国agilenttechnologies公司），FZ102型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），eG823mF-na型微波炉（广东美的微波炉制造有限公司），HH-6型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），aR224Cn型电子天平（奥豪仪器有限公司），pHS-3B型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）。
1.2试验方法
1.2.1黄柏根的预处理黄柏根去皮粉碎过筛（60目）石油醚浸泡、脱脂抽滤取滤渣晾干，得黄柏根粉末置于小塑封袋中，备用。
1.2.2纤维素酶微波法提取准确称取0.2500g黄柏根粉末于100mL烧杯中，加入25mL水，调节pH为5，放入50℃恒温水浴锅中作用30min，然后煮沸，灭酶，冷却，在微波功率650w条件下辐射（一次20s，共8次，辐射完一次冷却2min），辐射完成后趁热抽滤，定容，测其吸光度。
1.2.3单因素试验设计称取0.2500g粉碎的黄柏根粉末，纤维素酶微波法提取，分别考察酶解温度30、40、50、60、70℃，酶解pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，微波功率130、390、650、1040、1300w，微波时间120、140、160、180、200s各5个水平的单因素试验下，以吸光度为考察指标，确定各因素的取值范围。
1.2.4正交试验设计以酶解温度、酶解pH、微波功率、微波时间设计因素与水平表（表1），以吸光度为考察指标，利用L9（34）正交试验，确定最佳提取工艺。
1.2.5抗氧化能力测定
1）清除DppH能力以黄柏根色素与维生素C（以下简称VC）对DppH的清除能力作对比。将黄柏根溶液和VC配制成0.012、0.024、0.036、0.048、0.060mg/mL5个浓度；准确称取4.0mgDppH样品，用无水乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，DppH浓度为1×10-4mol/L，避光保存。取2mL样品溶液于10mL具塞试管中，加2mLDppH溶液，充分混合，静置30min，在517nm处测定吸光度，平行测定3次，取平均值，按下式计算清除率［8］。
DppH清除率=［1-（ai-aj）/ac］×100%
式中，ai-样液与DppH反应后的吸光度；aj-只加样品未加DppH的吸光度；ac-未加样的DppH的吸光度。
2）清除羟基自由基能力在5个10mL容量瓶中加入1mL9mmol/L的Fe2+，1mL9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，再分别加入0.012、0.024、0.036、0.048、0.060mg/mL的色素溶液1mL，最后加入1mL的8.8mmol/L的H2o2［9］，以去离子水为对照，在510nm处测吸光度，每个浓度测3次，取平均值，测定不同浓度色素对羟基自由基的清除能力。取VC溶液，按照上面的方法进行对照试验。清除率=［1-（aX-aX0）］/a0×100%
式中，a0为不加样品空白液的吸光度；aX为加入样品的吸光度；aX0为不加显色剂H2o2样品溶液的吸光度。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1酶解温度吸光度与酶解温度结果见图1。由图1可知，黄柏根色素吸光度随酶解温度的增大呈现先增大后减小的趋势，当温度太低时，纤维素酶活性低，使酶解不够充分，当酶解温度超过60℃时，过高温度使酶活性降低，达到一定温度，酶完全失去活性，即失活。
2.1.2酶解pH每一种酶催化活性都有一个最适宜的pH，由图2可知，酶解pH过低纤维素酶活性也较低，黄柏根粉末酶解不够充分，随着pH的升高吸光度也增加，当pH超过4.5后，酶活性降低，黄柏根色素吸光度下降。
2.1.3微波功率由图3可知，一定的微波功率对黄柏根色素的提取是有利的，功率太小，辐射能量不够，黄柏根色素析出不充分，而微波功率过大，由于辐射能量过大，会使色素结构遭到破坏，吸光度反而下降。
2.1.4微波时间由图4可知，黄柏根色素吸光度随微波时间延长呈先增大后减小的趋势，当微波时间为120s时，微波时间太短，吸光度较小，在微波时间为140s时吸光度最大，色素提取充分，当微波时间超过140s以后，由于微波时间越长，使提取出来的黄柏根色素结构受到破坏，吸光度下降。
2.2正交试验结果
为探讨纤维素酶法微波提取黄柏根色素的最佳工艺条件，根据单因素试验结果设计因素与水平表（表1），以吸光度为考察指标，利用L9（34）正交试验，确定最佳提取工艺。由表2可知，黄柏根色素的最佳提取条件为酶解温度50℃，酶解pH4.5，微波功率390w，微波时间120s；其中微波功率影响最大，其次是微波时间，而酶解温度和酶解pH对试验影响较小。在正交试验的最佳条件下提取黄柏根色素，5次重复，测得平均吸光度为0.410，大于表2中的任何一项，平均相对标准偏差RSD为0.47%，表明该工艺可行。
2.3抗氧化试验结果
2.3.1黄柏根色素清除DppH从图5可以看出，黄柏根色素、VC在试验浓度范围对DppH的清除能力呈良好的量效关系，随着浓度增加，清除率也逐渐增强。当浓度达0.060mg/mL，黄柏根色素对DppH清除率为62%，VC对DppH清除率为73%，黄柏根色素在试验浓度范围内有较好的还原能力，但比VC稍差。
2.3.2黄柏根色素清除羟基自由基黄柏根色素和VC抗氧化剂均具有清除羟基自由基的能力（图6），当浓度为0.060mg/mL时两者对羟基自由基的清除率分别为39%和45%，且在试验浓度范围，清除能力均随浓度的增大而增强，但黄柏根色素的清除能力比VC稍差。
3结论
试验采取纤维素酶微波法提取黄柏根天然色素，在单因素试验基础上进行正交试验，得出最佳提取工艺条件为酶解温度50℃，酶解pH4.5，微波功率390w，微波时间120s，其中，微波功率对试验影响最大。抗氧化性试验结果表明，黄柏根色素在试验浓度范围对DppH、羟基自由基的清除作用都呈量效关系，有较好的抗氧化能力，是一种天然有效的抗氧化剂。微波辅助纤维素酶提取黄柏根色素，以水作提取剂，具有操作简单、省时、节能、环保提取率高等多种优点。
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纤维素酶篇6
关键词：艾比湖；纤维素降解菌；酶活；Bacillusaquimaris菌株
中图分类号：S182
文献标识码：a文章编号：16749944（2017）10011304
1引言
新疆艾比湖湿地部级自然保护区是中国内陆荒漠物种最为丰富的区域之一，由于其特殊的地理位置，使得该地形成了沼泽、滩涂、盐湖、沙漠、石漠、砾漠、盐漠等多种土壤类型。依此而生的土壤微生物资源经历了长期的进化演变，成为我国干旱区重要的种质基因库，具有典型性和较高的保护价值[1]。纤维素是地球上最丰富的碳质资源之一，由于难以被大量分解利用，而被人们大量堆积或燃烧，从而对环境造成极大的污染和资源浪费。如果能通过纤维素水解酶转化利用，必将产生很好的经济和社会效益[2]。纤维素酶是由一系列酶系组成，滤纸是纯纤维素材料，其聚合度和结晶度都比较适中，降解滤纸的滤纸酶（Fpase）活性所代表的是纤维素酶的总活力，体现了纤维素酶系内的协同能力。滤纸酶活力的测定主要依据纤维素酶水解滤纸产生还原糖的数量[3]。研究中试图通过分离和筛选具有较高纤维素酶活性的菌株，为开发具有应用前景的工业菌种做出贡献。
2材料与方法
2.1供试土壤
试验土壤采自新疆北部艾比湖湿地部级自然保护区内的芦苇地和红柳地。采取距表层0～20cm土壤约200g，去除土壤中可见的动植物残体和石子，用自封袋封装带回实验室，过2mm筛，立即进行筛菌测酶活。
2.2实验方法
2.2.1纤维素降解菌筛选
称取1.0g土样到10mL离心管中，加入无菌水9.0mL和几粒无菌钢珠，经高速振荡混匀后静置，取上清液1mL稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五个浓度梯度。取100μL涂布于培养基上，30℃恒温倒置培养24h后，用牙签挑取形态有差异的单菌落，接种到固体平板培养基上，用于纯化后测序鉴定。
另取上清液1mL加入液体培养基中，恒温摇床120转/min，30℃富集三代后，划线接种在固体培养基上，24h后，用牙签挑取形态有差异的单菌落（产外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的菌落有透明水解圈，产β-葡萄糖苷酶的菌落周围有黑圈），接种到固体平板培养基上，用于纯化后测序鉴定。
注意：液体培养基不加显色剂和琼脂。
2.2.2纤维素酶活测定
（1）滤纸酶（Fpase）。取100±0.5mg滤纸与1mL菌液于10mL比色管中，加入pH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lmL，50℃水浴酶解反应1h后取出，迅速冷却至室温。
（2）内切β-1.4-葡聚糖酶（CmCase）。取2mLCmC-na溶液与1mL菌液于10mL比色管中，50℃水浴酶解反应1h后取出，迅速冷却至室温。
（3）外切β-1.4-葡聚糖酶（avicelase）。取2mL微晶纤维素溶液与1mL菌液于10mL比色管中，50℃水浴酶解反应1h后取出，迅速冷却至室温。
（4）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）。取2mL水杨苷溶液与1mL菌液于10mL比色管中，50℃水浴酶解反应1h后取出，迅速冷却至室温[4]。
酶促反应结束之后，立即加入0.8mLDnS试剂，沸水浴5min之后取出，迅速冷却至室温，用水定容10mL。在530nm波长处测定吸光度oD值，对照葡萄糖标准曲线计算葡萄糖量p。以高温灭活的粗酶液为对照组。
葡萄糖标准曲线绘制：取10mL比色管6支，加入1.0mg/mL的葡萄糖标准溶液0.0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.8mL，加蒸馏水0.8、0.64、0.48、0.32、0.16、0.0mL，加DnS试剂0.8mL，混匀后煮沸5min，取出立即用冷水冷却，用水定容至10mL，摇匀，530nm测吸光度oD值，以oD值为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
酶活定义：底物在一定反应条件（pH值为4.8，50℃，恒温lh）下，与1mL粗酶液反应1min生成1μg葡萄糖为1个酶活单位（U/mL）。
计算：酶活力（U/mL）=p×K×1000/时间*体积，其中K为稀释倍数。
2.3稻荽理
利用excel2003，origin8.0和SpSS17.0对数据进行统计、分析及绘图。重复性实验结果用平均值±标准误表示。
3结果与分析
3.1菌株的筛选结果
采用3种培养基和常规的分离技术对土样中的纤维素降解菌进行初步筛选，分离。然后对分离的细菌进行16SrRna测序，获得序列后，在nCBi进行Blast比对，经过比对的结果如表1。
经过初筛分离纯化后，共得到74株菌，属26个种。筛到的厚壁菌门Firmicutes芽孢杆菌属Bacillus细菌最多有14个种。Bacillus是一类好氧或兼性厌氧、能产生抗逆性孢子的杆状细菌。多数为腐生菌，主要分布于土壤、动植物体表及水体中。由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物，芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体，因此，在工、农业生产上有较高的应用价值[5]。例如枯草芽孢杆菌是工业上生产淀粉酶、蛋白酶的主要菌种，苏云金芽孢杆菌用于生产生物农药，巨大芽孢杆菌能提高土壤有效磷的含量等。Bacillusaquimaris能利用羧甲基纤维素钠，水解淀粉，耐盐[6]。Bacillusaryabhattai可以利用纤维二糖，促进植物生长，具有溶磷作用、产植物激素。Bacilluslitoralis采自海水淤泥，利用纤维二糖和醋酸纤维素，水解淀粉。Bacillusoceanisediminis具有硝酸盐还原作用，还能利用纤维二糖、醋酸纤维素。Bacillusfirmus能富集铬、砷，或用于生物修复[7]。Bacillusvietnamensis中等耐盐、产氧化酶，抗溶菌酶（区别于B.firmus）。可在pH值为4.5和9.0的环境生长，不同于B.aquimaris。altererythrobacterxinjiangensis能水解酪蛋白和纤维素，可利用葡聚糖。arthrobacternicotianae降解尼古丁，脱硫，聚磷。planococcusrifietoensis产纤维素酶、脱氨酶，促进植物生长（固氮，溶磷作用，产吲哚乙酸）[8]。microbacteriumamylolyticum有一定聚乙烯降解作用。Streptomycescoelicoflavus能降解纤维素，还原硝酸盐[9]。
3.2纤维素酶酶活测定
选取其中水解圈较大的8株菌进行纤维素酶活测定（表2）。分别测定了滤纸酶（Fpase）、内切葡聚糖酶（CmCase）、外切葡聚糖酶（avicelase）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）的酶活。
由图1可知，菌株13C12、03C5、05B2的滤纸酶活显著高于其它，其中13C12的酶活最高达21.4U/mL。菌株mZ2、03C9、13C3的酶活次之，约为3.2U/mL。菌株132和13a4的滤纸酶活最低。
4结论与讨论
（1）经过初筛分离纯化后，共得纤维素降解菌到74株菌，属26个种。筛到的厚壁菌门Firmicutes芽孢杆菌属Bacillus细菌最多，有14个种。
（2）菌株13C12的纤维素酶活最高。滤纸酶（Fpase）活为21.4U/mL，内切葡聚糖酶酶活达37.4U/mL，外切葡聚糖酶（avicelase）为19.2U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活为24.6U/mL。
（3）接种量的多少会影响产纤维素酶菌株在发酵液中的生长、代谢和繁殖速度。选择较大的接种量可以缩短发酵液内菌体密度达到高峰的时间，有利于产物的形成以及培养基质的利用，并减小被杂菌污染的概率。然而接种量过大则会导致发酵液中溶氧不足，限制a物的合成，菌体易老化；接种量过小则会延长发酵周期，影响产率。
（4）由于许多土壤细菌生活力较差，样本采集回来后应尽快筛菌，否则，搁置时间过长会严重影响筛菌的效率和成功率。此外，土壤细菌大多数不可培养，通过传统筛菌方法筛到的菌落有限，所以探寻新的实验方法具有重要意义。
致谢：中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室周杰民博士对本实验方案设计过程中的支持；感谢新疆生产建设兵团第五师农科所的工作人员在采样过程中的帮助。
参考文献：
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纤维素酶篇7
关键词：木聚糖酶（DSB）；甘露聚糖酶mana；毕赤酵母（pichiapastoris）；共表达
中图分类号：Q19文献标识码：a文章编号：0439-8114（2017）10-1971-02
Doi：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.10.043
Co-expressionoftwoHemicellulasesinpichiapastoris
YanGQing1，ZHanGLi1，ZHanGHua-shan2，XionGHai-rong1
（1.CollegeofLifeScience，South-centralUniversityfornationalities，wuhan430074，China；2.KeyLaboratoryofFermentationengineering，ministryofeducation，HubeiUniversityoftechnology，wuhan430068，China）
abstract：Basedonthedirectionalmodificationofxylanase（DSB）andmannan（mana）synthasegenesinourlaboratory，theco-expressionofthesetwohemicellulaseswassuccessfullyachievedinapichiacellbydifferentintegrationsitesandresistancemarkers.andtherecombinantstrainGS115/DSB-manawasobtained.thethermalstabilitytestshowedthattheDSBandmanaproducedbytheco-expressedstrainhadhighthermalstability.thesuccessfulexpressionofthetwoenzymesoftherecombinantstrainlaidafoundationfortheresearchandproductionofthecomplexenzymepreparation.
Keywords：xylanase（DSB）；mannanase（mana）；pichiapastoris；co-expression
β-木聚糖酶（eC3.2.1.8）和β-甘露聚糖酶（eC3.2.1.78）均属于半纤维素酶，分别水解半纤维素中的β-1，4-木糖苷键和β-1，4-甘露糖苷键。木聚糖为半纤维素中最丰富的一类[1]，在木聚糖酶的作用下可被降解为国际市场上急需的低聚木糖和木糖。甘露聚糖作为半纤维素第二大组分[2]，广泛存在于木材以及植物的块茎和种子中。
随着对半纤维素酶的深入研究，其应用领域也在不断的扩展，并拥有一个广泛的工业酶应用市场，包括食品和饲料、咖啡萃取、生物乙醇生产、杀黏菌剂、制药、纺织、洗涤、造纸、石油、天然气工业及生物技术等领域[3，4]。工业生产中，不仅需要高活力的酶，还需要酶在酸性环境、碱性环境或高温条件下保持稳定的酶学特性[5]，同时也希望减低生产成本而提高效益。本试验研究了木聚糖酶与甘露聚糖酶的共表达，实现了这两种酶在毕赤酵母中的稳定共表达，使工业生产中有效地减少生产成本及相关处理环节。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌种与质粒大肠杆菌top10细胞、表达载体pao815hr为中南民族大学生命科学学院实验室保藏与构建。毕赤酵母GS115和表达载体ppiCZαa为中国农业科学院饲料研究所惠赠。
1.1.2工具酶及试剂限制性内切酶t4Dna连接酶等工具酶和Dnamarker购自宝生物工程（大连）有限公司；燕麦木聚糖和角豆胶购自Sigma公司；tryptone、Yeastextract购自于oxoid公司；无氨基酵母氮源（YnB）、D-sorbitol、agar购自Biosharp公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。
1.1.3培养基和抗生素毕赤酵母抗性选择平板YpDSZ（含终浓度100μg/mLZeocin），毕赤酵母组氨酸缺陷型选择平板mD，毕赤酵母生长/诱导培养基BmGY/BmmY，大肠杆菌生长培养基LB/LBL，毕赤酵母生长培养基YpD等培养基配方见invitrogen公司毕赤酵母操作手册。氨苄青霉素（ampicillinSodiumSalt）购自Biosharp公司；博来霉素（Zeocin）购自invitrogen公司。
1.2方法
1.2.1木聚糖酶DSB与甘露聚糖酶mana重组表达质粒的构建及筛选采用限制性内切酶ecoRⅠ和notⅠ分别双酶切木聚糖酶DSB基因和表达载体pao815hr，连接后转化，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板上；同样用ecoRⅠ和notⅠ分别双酶切甘露聚糖酶mana基因和表达载体ppiCZαa，连接后转化，涂布于含有博来霉素的LB固体平板上。菌落pCR验证后双酶切鉴定筛选出阳性克隆菌株DSB-pao815hr-top10和mana-ppiCZαa-top10。
1.2.2木聚糖酶与甘露聚糖酶共表达重组菌的构建及筛选
1）GS115/pao815hr-DSB重组菌的构建及筛选。采用SalⅠ线性化重组质粒DSB-pao815hr，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，挑取100个该共表达重组菌的单菌落使用BmGY/BmmY诱导产酶，使用DnS法[6]检测酶活力，依据酶活力高低筛选出酶活力较高的重组菌株GS115/pao815hr-DSB。
2）共表达重组菌GS115/DSB-mana的构建及筛选。采用SacⅠ线性化重组质粒mana-ppiCZαa，电击转化GS115/pao815hr-DSB感受态细胞[7]，按上述方法筛选出共表达重组菌株GS115/DSB-mana。
1.2.3GS115/DSB-mana产甘露聚糖酶与木聚糖酶热稳定性的检测将发酵上清液在不同温度下准确处理30min，迅速置于冰上冷却，分别在DSB最适温度（75℃）与pH（6.5）下与木聚糖底物反应和在mana最适温度（75℃）与pH（6.0）下与角豆胶底物反应，使用分光光度计检测oD540nm，以每种酶最高酶活力为100%，计算各酶在其他温度处理后的相对残余酶活力，每组试验均重复3次，取平均值作为最终结果。
1.2.4SDS-paGe电泳发酵结束后，取GS115/DSB-mana与两种酶单一表达菌株的上清液进行SDS-paGe电泳分析，具体操作方法参考《分子克隆实验指南》第二版。
2结果与分析
2.1木聚糖酶（DSB）与甘露聚糖酶（mana）重组表达质粒的构建
将DSB基因片段连接到pao815hr上，获得表达质粒pao815hr-DSB；将mana基因片段连接到ppiCZαa上，获得表达质粒ppiCZαa-mana，物理图谱如图1所示，双酶切验证以上重组质粒构建成功。
2.2热稳定性分析
如图2所示，GS115/DSB-mana中木聚糖酶在45～70℃下处理30min能够保持85%以上相对酶活力，但经过70℃以上温度处理后，相对酶活力降低较为明显；甘露聚糖酶在45～75℃下处理30min后仍能保持90%以上相对酶活力，但经过75℃以上温度处理后，相对酶活力降低较为显著。
2.3SDS-paGe分析
结果（图3）表明，GS115/DSB-mana发酵上清液中出现两条电泳条带，分别与单一表达DSB和mana发酵上清液对比。GS115/DSB-mana能够同时表达出两种半纤维素酶蛋白，且产物杂、蛋白的分泌量偏低。GS115/DSB-mana分泌木聚糖酶蛋白较分泌甘露聚糖酶蛋白量高。
3讨论
目前木聚糖酶与甘露聚糖酶已成功应用于工业农业生产的诸多领域，且通常是木聚糖酶和甘露聚糖酶联合使用从而达到协同增效。ppiC9K和ppiCZαa质粒同属于毕赤酵母分泌型表达质粒，本试验通过不同的整合位点和抗性标记实现了DSB和mana在同一宿主中的整合与筛选，成功构建了共表达菌株GS115/DSB-mana，实现了目标酶的共同生产，同时检测出其分泌的两种半纤维素酶有较高的热稳定性，为进一步工业化生产复合酶奠定了基础。
参考文献：
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纤维素酶篇8
[关键词]水蛭素；增生性瘢痕；基质金属蛋白酶（mmps）
[中图分类号]R282.74[文献标识码]a[文章编号]1008-6455（2012）02-0247-03
effectofHirudinonmatrixmetalloproteinasesofHumanHypertrophicScarFibroblast
LiKai-tong,LiUDa-en,LiShun-tang,LUHai-qiang,CHenXiao-ting,GaoXing-xin
(DepartmentofBurnsandplasticSurgery,theFirstaffiliatedHospitalofGuangximedicalUniversity,nanning530021,Guangxi,China)
abstract:objectivetoexploretheeffectofhirudinontheexpressionofmatrixmetalloproteinasesofthehumanhypertrophicscarfibroblast.methods10casesofhypertrophicscartissueweretakenfromtheoperatedpatientswhowerewithin6monthsafterinjury.Fibroblastsofhypertrophicscartissuewereculturedbytissueblockmethod.thecellsafter4～7generationswereusedinexperiments,whichwereinterferedwithexposureto0U/ml,1U/ml,10U/mlor50U/mlhirudinfor24and48hours.wedetectedtheeffectofhirudinontheproliferationoffibroblastsbymttmethodandtheexpressionofmmp-2,mmp-9byenzyme-linkedimmunosorbentassay(eLiSa).Results①Hirudincouldinhibittheproliferationofscarfibroblastsinthegroupof1,10,50U/ml(p
Keywords:hirudin;hypertrophicscar;matrixmetalloproteinases
皮肤损伤尤其是深度烧伤愈合后出现的增生性瘢痕（Hypertrophicscar，HS）不但影响美观，严重者还可造成局部畸形或功能障碍。但增生性瘢痕形成机理尚不完全清楚，目前研究多认为是成纤维细胞（Fibroblast，FB）过度增殖与细胞外基质降解不足所致。而基质金属蛋白酶（mmps）是细胞外基质降解的主要酶系，其中mmp-2、mmp-9逐渐成为研究热点。传统中药治疗增生性瘢痕表现出广阔的前景。本实验选取体外培养并传代4～7代的增生性瘢痕成纤维细胞（HSFB），加入0、1、10、50U/ml的水蛭素，通过观察不同时相点细胞形态学变化，mtt法检测细胞增殖活性，eLiSa检测mmp-2,mmp-9表达水平变化研究水蛭素对mmp-2、mmp-9的作用，进而探讨其对增生性瘢痕作用机制，为其临床应用提供实验依据。
1材料和方法
1.1标本收集：标本取自2011年5～7月在广西医科大学第一附属医院烧伤整形外科进行手术切除的10例增生性瘢痕患者组织标本（13块），其中男性6例，女性4例；年龄4～24（14±7.4）岁；面颈部6例，上肢3例，下肢1例。患者均无基础疾病、结缔组织疾病或影响组织代谢的疾病；伤后6月内未使用过类固醇激素类药物、抗肿瘤药物及抑制瘢痕药物；临床表现瘢痕处于增生活跃期，外观充血发红，质硬，瘢痕增生局限于皮损区内，伴有瘙痒或疼痛。所有操作符合医学伦理道德委员会的要求并取得患者同意。
1.2实验试剂及器械：Dmem高糖培养基（Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所），磷酸盐缓冲液（pBS）（北京中杉金桥生物科技公司），四甲基偶氮唑盐（mtt）（北京索莱宝科技有限公司），水蛭素（武汉圣天宇科技有限公司），mmp-2/mmp-9eLiSa检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。超净工作台（苏州净化设备公司），全自动酶标仪（美国伯乐公司）。
1.3实验方法
1.3.1增生性瘢痕成纤维细胞的培养：采用组织块法进行原代培养。将手术切取的瘢痕组织在无菌条件下清洗后剪成1mm3的小块，置入培养瓶中静置培养。待细胞长满平底70%时进行传代培养。本实验所用为第4～7代细胞。
1.3.2实验分组及干预：实验按照水蛭素浓度分为四组：对照组（0U/ml）；1U/ml组；10U/ml组；50U/ml组。每组6孔，对照组每孔加入无血清Dmem培养液200ul，其余各组每孔加入含对应浓度水蛭素的Dmem培养液200ul。各浓度组又分为24h组、48h组。
1.3.3mtt检测细胞增殖活性：加入水蛭素作用24h、48h后加入5mg/ml的mtt溶液，培养4h后加入150ulDmSo（二甲基亚砜），酶联免疫检测仪于490nm处测量oD值，绘制细胞增殖曲线。
1.3.4eLiSa测定mmp-2,mmp-9表达水平变化：采用双抗体夹心eLiSa法测定各组标本mmp-2、mmp-9的表达含量，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。用酶标仪在450nm处测定样品oD值，根据样品吸光度值计算出样品浓度。
1.4统计学分析：采用SpSS13.0软件包进行分析，数据以均数标准差（x±s）表示，组间差异比较采用t检验，p
2结果
2.1增生性瘢痕成纤维细胞形态学观察：组织块培养5～7天后可见细胞从组织块周围爬出并开始贴壁生长，细胞呈梭形，胞体饱满，扁平长突起状，多呈平行排列并有一定弧度。细胞中央可见到圆形或卵圆形细胞核，细胞周围可见到2～3个突起。
2.2水蛭素作用前后细胞形态学变化：水蛭素作用24h，倒置相差显微镜观察见HSFB呈平行极性排列，形态较规则，可见扁平而长的突起，数量开始减少。作用48h部分细胞开始变圆，细胞间隙增大，细胞数量减少明显，细胞间接触减少。
2.3水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞细胞活力及增殖的影响：表1显示水蛭素对HSFB的增殖有抑制作用。随着药物浓度增加，抑制呈增加趋势，50U/ml组抑制作用最明显。
2.4eLiSa法测定水蛭素作用HSFB分泌mmp-2,mmp-9表达变化：水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞分泌mmp-2的影响见表2，水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞分泌mmp-9的影响见表3。由表2可见：水蛭素作用24h后检测到细胞中mmp-2表达水平呈增加趋势，1、10、50（U/ml）组中mmp-2的浓度均高于对照组（1765.5pg/ml）中的浓度，且1U/ml组中表达含量达最高水平（4988pg/ml），与对照组相比差异有统计学意义(p
3讨论
3.1水蛭，俗称蚂蝗，是一味传统中药，始载于《神农本草经》谓其：水蛭味咸平，主逐恶血、瘀血、月闭,中医认为有破血、逐瘀、通经功能。1955年德国人markwardtF[1]首次从医用水蛭中成功分离出水蛭素，1970年被证明为凝血酶的特异性抑制剂。水蛭素是目前已知的高效、特异、活性最强的凝血酶抑制剂,由65个氨基酸残基组成单链多肽，分子量约为7000，能与凝血酶直接结合，抑制凝血酶活性而产生抗凝作用。与肝素[2]相比，水蛭素抗凝活性更强，且用量少不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子，是一类很有应用前景的抗凝药。目前临床上广泛应用于心血管内科，肾内科，烧伤整形外科等领域。近年来研究发现水蛭素有抑制细胞增殖作用，ogiichit等[3]将水蛭素作用于神经胶质瘤细胞证实水蛭素能抑制神经胶质瘤细胞的增生，郑燕林[4]等将水蛭素作用于兔增殖性玻璃体视网膜病变模型后发现水蛭素能够抑制细胞增殖和细胞外基质的产生，杨影等[5]证实其对体外培养的巩膜成纤维细胞及细胞外基质有抑制作用。
3.2增生性瘢痕是皮肤真皮损伤尤其是深度烧伤后创面修复异常所致的病理性结构，目前研究多认为是以成纤维细胞过度增殖为主的细胞外基质大量合成、降解不足及大量细胞因子产生所致[6]。基质金属蛋白酶（mmps）是一族含有九种甚至更多的具有很高同源性的含锌或其他金属离子的内源性多肽酶。在已经了解的mmps中mmp-2（又称明胶酶a）和mmp-9（又称明胶酶B）是胶原及基质降解的关键酶，共同的酶底物主要是iV型胶原，此外mmp-2还可以降解V、Vii型胶原、弹性蛋白、纤维粘连蛋白等。mmp-2和mmp-9分布在瘢痕组织的各层，前者以成纤维细胞周围的染色最明显，与瘢痕组织早期的细胞外基质的分解代谢关系密切；后者主要表达于表皮细胞中，出现在创面愈合的早期。两者与其抑制因子关系的失衡是促进创面过度修复形成瘢痕的关键因素。瘢痕增生早期，mmp-2分泌增加促进基质分解，利于成纤维细胞、肌成纤维细胞迁移能促进创面愈合。章伏生等[7]研究发现3～6月瘢痕组织和6～12月瘢痕组织中mmp-2表达均较正常皮肤增高，而3～6月瘢痕组织的mmp-2又显著高于6～12月瘢痕组织的mmp-2，亦说明在早期瘢痕中表达更明显。随着成纤维细胞迁移、增殖，引起mmp-2等的抑制因子产生增加，超过mmp-2和mmp-9表达含量的增加，导致二者关系失衡引起细胞外基质合成分解代谢失衡，致使细胞外基质大量沉积。
3.3本实验收集增生性瘢痕标本进行原代培养，在体外构建增生性瘢痕成纤维细胞培养模型，通过mtt测定细胞活力发现水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖有抑制作用，作用24h即开始抑制细胞生长。酶联免疫吸附试验发现不同浓度水蛭素作用后细胞培养上清液中mmp-2和mmp-9表达含量较对照组增加，以1U/ml浓度对二者表达含量影响作用最明显，能够促进二者表达含量的升高，说明水蛭素对mmp-2和mmp-9表达有促进作用。我们认为水蛭素对增生性瘢痕的抑制作用机制一方面可能是抑制成纤维细胞的增殖，另一方面是能够促进mmp-2和mmp-9的表达，增加酶含量促进细胞外基质的降解，因而能够减轻瘢痕增生。实验为今后进一步研究水蛭素对增生性瘢痕作用机制提供了思路。
3.4在增生性瘢痕发生和转归过程中mmp-2，mmp-9和其抑制因子起着重要的调节作用。李璇[8]等研究发现水蛭素能够通过减少胶原产生来抑制增生性瘢痕，张奇等[9]通过免疫组化及westernblot检测发现水蛭素能通过增加Bax表达，抑制Bcl-2表达而抑制HSFB。郭睿等[10]研究发现水蛭素通过下调成纤维细胞分泌tGF1，上调碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的分泌而抑制增生性瘢痕的形成。本实验证实了水蛭素能够抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖，对基质金属蛋白酶（mmp-2,mmp-9）有促进表达作用，因此水蛭素应用治疗增生性瘢痕有着广阔的应用前景，其具体机制和剂型有待进一步研究。
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纤维素酶篇9
关键词：豆渣；纤维素酶；水溶性膳食纤维
中国分类号：tS209文献标识码：a文章编号：0439-8114（2015）09-2193-04
豆渣是豆腐、豆腐皮、腐竹等大豆制品加工中的主要副产物，占全豆干重的15%～20%。干的豆渣中含有18.0%～28.4%粗蛋白质，9.3%～10.9%脂肪、40.2%～43.6%不溶性纤维、12.6%～14.6%可溶性纤维和3.8%～5.3%可溶性碳水化合物[1]，豆渣是一种理想的纤维素源。生产膳食纤维的原料多来源于食品生产过程中的下脚料，大部分原料含有大量的水分、灰分、脂肪、淀粉和蛋白质等杂质[2]。因此，分离制备工艺中要进行预处理改变原料中各成分的相对含量，进而增加膳食纤维的相对含量。纤维素酶可分解不溶性膳食纤维中的纤维素成分，生成小分子量的单糖或寡糖，从而增加了水溶性膳食纤维的得率。在豆渣膳食纤维中加入纤维素酶可增加水溶性膳食纤维的百分率，改变膳食纤维的质量和生物活性。
本试验以豆制品加工过程中产生的副产品豆渣为主要原料，通过预处理除去豆渣中的杂质，采用纤维素酶对其不溶性膳食纤维进行部分降解，从而提高水溶性膳食纤维得率。本试验研究了纤维素酶添加量、溶液pH、酶解时间、酶解温度、酶解次数对豆渣中水溶性膳食纤维得率的影响，同时利用均匀试验的优化设计通过DpS分析软件进行分析，最终获得最佳酶解工艺参数，以期为豆渣中水溶性膳食纤维的应用提供参考。
1材料与方法
1.1试验材料
豆渣，购于河南省安阳市内黄县富口豆制品厂；纤维素酶，购于湖北立业生物制品有限公司；盐酸、氢氧化钠、乙醇、醋酸钠等均为分析纯。
1.2主要仪器设备
202-2a型电热恒温鼓风干燥箱、Fw-400a型倾斜式高速万能试样粉碎机、DZwK-4型电热恒温水浴锅，购于北京中兴伟业仪器有限公司；样品筛（60网目），购于浙江上虞市五四仪器筛具厂；Fe20型实验室pH计，购于梅特勒-托利多（上海）有限公司；tDL8o-2B型台式离心机，购于上海安亭科技仪器厂；Fa2104型电子天平，购于上海恒平科技仪器有限公司。
1.3试验方法
1.3.1技术路线
1）预处理。采用碱-酸法去除豆渣中的蛋白质和脂肪。选取新鲜豆渣，在鼓风干燥箱中50～70℃干燥8～10h，每0.5h翻搅一次，以防豆渣褐变。之后在常温下1%naoH溶液中浸泡0.5h，再用37%的HCl溶液调节溶液的pH至中性，再用1%HCl溶液浸泡0.5h，调节溶液至中性，过滤干燥粉碎制成干燥豆渣粉。
2）水浴、离心。取5.0g预处理后的豆渣粉，加75mL蒸馏水，置于60℃水浴30min。将水浴后的溶液分装到离心管中，3500r/min离心10min，收集上清液，未溶解部分待用。
3）酶解、离心。取未溶解部分（即iDF）加75mL去离子水，加入一定量的纤维素酶，于适宜pH、温度、时间内反应后，恒温水浴振荡1.5h，沸水浴10min灭酶。将酶解后的溶液分装到离心管中，3500r/min离心10min。
4）沉淀、干燥。收集上清液，取两部分上清液用4倍体积95%乙醇沉淀1.0h，离心收集沉淀。将所得沉淀干燥，在鼓风干燥箱中50～70℃干燥8～10h，每0.5h翻搅1次。
5）冷却、称重。将干燥好的可溶性膳食纤维即SDF，放入干燥器中30min冷却至室温后称量酶解后的重量并计算得率。
1.3.2评定标准以干燥的水溶性膳食纤维（SDF）的得率为评价指标，分析各单因素对水溶性膳食纤维得率的的影响，并对提取工艺进行优化。计算公式如下：
SDF得率=■×100%
1.3.3单因素对豆渣中水溶性膳食纤维得率的影响
1）纤维素酶添加量。称取预处理的豆渣粉5g，纤维素酶添加量分别为原料的1%、2%、3%、4%、5%，在温度50℃，pH4.5条件下提取1.5h，计算水溶性膳食纤维得率。
2）溶液pH。称取预处理的豆渣粉5g，pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，纤维素酶添加量为原料的2%，温度50℃条件下提取1.5h，计算水溶性膳食纤维得率。
3）酶解时间。称取预处理的豆渣粉5g，提取时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，纤维素酶添加量为原料的2%，温度50℃，pH4.5，计算水溶性膳食纤维得率。
4）酶解温度。称取预处理的豆渣粉5g，提取温度为40、45、50、55、60℃，纤维素酶添加量为原料的2%，pH4.5条件下提取1.5h，计算水溶性膳食纤维得率。
5）酶解次数。称取预处理的豆渣粉5g，酶解次数为1、2、3、4、5，纤维素酶添加量为原料的2%，温度为50℃，pH4.5条件下提取1.5h，计算水溶性膳食纤维得率。
1.3.4豆渣中提取水溶性膳食纤维工艺的优化设计在单因素试验的基础上，以水溶性膳食纤维得率为评价指标，选取纤维素酶添加量、溶液pH、酶解时间、酶解温度4个因素进行均匀设计，确定U6*（64）优化设计方案。
2结果与分析
2.1单因素对豆渣中水溶性膳食纤维得率的影响
2.1.1纤维素酶添加量对豆渣中水溶性膳食纤维得率的影响由图1可以看出，当纤维素酶添加量为1%～4%时，豆渣中水溶性膳食纤维得率随纤维素酶添加量的增加而增加。这是由于纤维素酶可使豆渣中的不溶性膳食纤维发生降解，分子链被切断，使其分子质量降低，溶解度发生改变，一部分不溶性膳食纤维变成水溶性膳食纤维。纤维素酶添加量大于3%后，水溶性膳食纤维得率的增加趋于平缓。根据酶作用底物的原理[3]，酶量的增大使得单位酶作用底物减少，因此水溶性膳食纤维得率增加缓慢。因此，选择纤维素酶添加量为2%～4%进行后续均匀试验。
2.1.2溶液pH对豆渣中水溶性膳食纤维得率的影响由图2可知，当溶液pH4.0～5.0时，豆渣中水溶性膳食纤维得率随溶液pH的增大而增加；pH5.0时，水溶性膳食纤维得率达到最大，为10.92%；当pH5.0～6.0时，水溶性膳食纤维得率逐渐降低。pH对酶活力的影响很大，过酸、过碱都会影响酶蛋白的构象，甚至使酶变性失活[4]。在一定的pH条件下，酶活力最高，酶促反应具有最大速度，高于或低于此值时反应速度下降。所以，选择pH4.5～5.5作为均匀试验的因素水平。
2.1.3酶解时间对豆渣中水溶性膳食纤维得率的影响由图3可知，当酶解时间为1.0～2.0h时，豆渣中水溶性膳食纤维得率随酶解时间的延长而明显提高；酶解时间为2.0～5.0h时，水溶性膳食纤维得率增加变缓，其原因可能是在提取初期，底物即豆渣浓度较高，水溶性多糖浓度较低，对酶反应的抑制作用小，酶促反应迅速进行，随着酶解时间的延长，酶的作用也越充分，水溶性膳食纤维得率迅速提高。但当酶解时间足够长时，底物的浓度不断降低和部分酶在提取过程中失活以及水溶性多糖的不断积累，产物的反馈抑制效应逐渐增强，酶促反应速度逐渐降低，因此豆渣中水溶性膳食纤维得率增加变缓。因此，选用2.0～4.0h作为均匀试验的因素水平。
2.1.4酶解温度对豆渣中水溶性膳食纤维得率的影响由图4可知，随着酶解温度的升高，豆渣中水溶性膳食纤维得率逐渐增加，当酶解温度为50℃时达到最大，为11.38%；酶解温度继续升高，水溶性膳食纤维得率开始下降。根据酶促反应动力学原理，当酶在低于其最适温度时，随着温度升高，反应速度逐步加快；当高于其最适温度时，随着温度升高，酶逐渐变性，反应速度下降。因此，纤维素酶的最适温度为50℃，将45～55℃作为均匀试验的因素水平。
2.1.5酶解次数对豆渣中水溶性膳食纤维得率的影响由图5可知，豆渣中水溶性膳食纤维得率随酶解次数的增加而升高，但在3次循环工艺后水溶性膳食纤维得率趋于稳定，这可能是由于随着酶解次数的增多，不溶性膳食纤维降解成较低分子质量的多糖、低聚糖或单糖，在用乙醇溶液进行沉淀时，因为分子质量较小而不能被沉淀下来，从而使水溶性膳食纤维得率趋于稳定[5]。另外，随工艺步骤的不断增加，水溶性膳食纤维的损失也在增多。因此，选取酶解次数2次为佳。
2.2豆渣中提取水溶性膳食纤维工艺优化的结果
选取纤维素酶添加量（X1）、溶液pH（X2）、酶解时间（X3）、酶解温度（X4）4个因素进行均匀设计，采用DpS分析软件所得的均匀设计方案及试验结果如表1所示。将表1的试验结果用DpS软件进行二次多项式逐步回归分析，在统计分析结果中，得到的回归方程为Y=1.5971-0.6076X2+0.0627X22-0.3171X1X3-0.0007X2X3，相关系数R=0.9998，F=547.97，？琢=0.032，剩余标准差S=0.0006，调整后的相关系数Ra=0.9989。回归方程检验的显著水平取？琢=0.05，判断得到回归方程显著，可以用于豆渣中水溶性膳食纤维提取的预测。
由表2可知，通过比较各变量显著水平的大小，分析得到对豆渣中提取水溶性膳食纤维得率的影响大小顺序为X1X3>X2X2>X2>X2X3。同时也可以表明，X4酶解温度在所取值的范围内对水溶性膳食纤维的影响较小。根据统计分析结果可知，最优的因素水平组合为纤维素酶的添加量为2%，溶液的pH为4.5，酶解温度51℃，酶解时间为2.0h，最优条件下水溶性膳食纤维得率为11.48%。
3小结
本试验分析了酶法在豆渣中提取水溶性膳食纤维的工艺流程以及纤维素酶添加量、溶液pH、酶解时间、酶解温度、酶解次数各单因素对豆渣中水溶性膳食纤维得率的影响。同时通过均匀设计方案的优化确定了最优的因素水平组合。
由因素试验结果可知，在纤维素酶最适温度为50℃，豆渣水溶性膳食纤维得率最大，为11.38%；最适pH5.0，豆渣中水溶性膳食纤维得率最大，为10.92%；纤维素酶添加量为3%、酶解次数为3次、酶解3.0h后水溶性膳食纤维得率的增加趋于稳定。均匀优化设计得到的最优因素水平组合为纤维素酶添加量为2%，溶液pH4.5，酶解温度为51℃，酶解为2.0h，最优条件下水溶性膳食纤维的得率为11.48%。
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纤维素酶篇10
关键词：植物纤维;预处理;降解
收稿日期：20120320
作者简介：刘昌华（1984—），男，江西莲花人,昆明理工大学硕士研究生。
通讯作者：孙可伟（1945—）,男,上海人,教授,博士生导师,主要从事环境材料、固体废弃物资源化的研究与教学工作。中图分类号：tQ314文献标识码：a文章编号：16749944(2012)05005303
1引言
随着社会的进步与发展,对石油的需求量大增,使得能源需求矛盾激化,石油的价格激增,而且由于化石能源的不可再生性,迫切需要开发新的能源来替代。作为生物质能的重要组成部分,植物纤维由于其所拥有的可再生性、来源广泛、价格低廉的特点,使其开发利用成为化石能源的理想替代品原料。
植物纤维中的纤维素等成分是当今世界上最丰富的可再生高聚物,是植物通过光合作用而合成得到的,广泛存在于大自然中,每年植物经光合作用产生的物质达上千亿吨,其中蕴含的能量相当于全世界能源消耗总量的10~20倍,远超每年的石油产量,但目前的利用率还不到3%［1］。当前植物纤维的利用的主要瓶颈在于植物纤维的预处理技术和降解工艺的优化。
2植物纤维的特性
植物纤维是构成天然植物的重要组成部分,植物纤维中蕴含的能量属于生物质能,是一种可再生能源,同时也是唯一一种可再生的碳源。纤维素工业主要的纤维素原料是棉花、木材、禾草类植物和韧皮类植物等［2］。
(1)植物纤维是由细胞壁包裹着的空心腔体。植物纤维是由细胞壁组成,细胞壁上的主要化学成分就是纤维素。植物细胞之间有纹孔对,纹孔是植物把水分、养料以及通过叶绿素进行光合作用后的产物不间断地输送到需要的部位的通道［3］。可以认为一根成熟植物纤维就是一个由细胞壁包裹着由其上的纹孔对与其它纤维连同的空心腔体。
(2)植物纤维的主要成分之间互相缠结在一起。根据纤维素化学的观点可知,植物纤维的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素［3］。由于纤维素、半纤维素和木质素都存在大量氢键,使植物纤维中的纤维素被木质素和半木质素以及果胶等牢固的粘接在一起,木质素和半木质素将纤维素包覆在其编织的复杂网络中,溶剂不能顺利的浸入到植物纤维内部,与纤维素、半纤维素和木质素的有效接触面积有限。
(3)植物纤维的主要成分的反应活性不一。纤维素是由葡萄糖单元通过β-1,4糖苷键连接而成的线性高分子化合物。纤维素分子上含有大量的苷羟基和仲醇羟基,这为纤维素的降解提供了可能;纤维素分子内和纤维素分子之间都存在氢键结合,纤维素分子链中有一部分是以结晶形式存在的,是纤维素Ⅰ型,结晶的存在增加了纤维素降解的难度［4］。
半纤维素是植物纤维中除了纤维素和果胶之外的全部碳水化合物,是在植物细胞壁中与纤维素共生、可溶于碱溶液,在酸性溶剂中的溶解度远大于纤维素的那部分多糖［5］。半纤维素具有亲水性能,容易润胀,可赋予纤维弹性。
木质素是有苯丙烷类结构单元组成的复杂化合物,具有使细胞相连的作用,主要存在于木质化植物的细胞中,具有使细胞相连的作用,在植物组织中具有增强细胞壁及黏合纤维的作用,强化植物组织,在酸性溶剂中难以水解较易溶于碱液的相对分子质量较高的物质。其化学结构中共有3种基本结构,即愈创木基结构、紫丁香基结构和对羟苯基结构［6］。
3植物纤维的分解
通过以上分析可知,细胞壁的存在严重制约了植物纤维的降解效率,因此,为了提高植物纤维的降解效率,有效利用植物纤维,就需要对植物纤维进行预处理。植物纤维的分解主要可以分为预处理和降解两个过程。
3.1植物纤维预处理方法
植物纤维的预处理主要作用就是对细胞壁包覆结构的破坏,同时降低纤维素、半纤维素以及木质素之间的结合力,增加其与降解过程中的化学试剂或者微生物以及酶的接触面积,从而达到增大其降解效率的目的。根据不同的预处理手段,可以将预处理方法分为化学法、物理法和生物法。
3.1.1化学法
(1)臭氧法。臭氧法是利用臭氧将植物纤维原料中的木质素和半纤维素氧化分解成小分子。小分子产物有利于生物降解中的微生物繁殖,处理剩余产物相对较纯,便于利用;不过臭氧的能耗较高,需防止泄露。
（2）酸处理。酸处理就是将纤维素原料用稀酸在106~110℃条件下处理几个小时,处理后半纤维素水解成单糖进入水溶液,木质素量不变,纤维素聚合度下降。由于半纤维素的主要组成是木糖,因此稀酸处理所得产物主要含有木糖。
(3)碱处理。碱处理是指用热的或者冷的碱液(naoH或液氨)对纤维素原料的处理。通过对植物纤维的特点分析可知,碱处理可以有效降低植物纤维中的半纤维素和木质素,并部分降解纤维素。
化学法能较为明显地提高植物纤维的反应活性,提高降解效率;但由于其处理过程中使用化学试剂,对设备防腐要求较高,并且脱除了植物纤维中的一部分组成,不利于材料的充分利用,酸碱的加入使其预处理产物的进一步降解方法受到了限制,只适合于化学法降解。
3.1.2物理法
物理预处理法包括机械粉碎、微波、超声波、高能辐射、汽爆等方法。
机械粉碎是指通过机械方法(如球磨、振动磨等)将植物纤维原料进行粉碎处理。通过机械能使植物纤维发生断裂,并使纤维素与木质素之间的结合变弱,乃至分离。
超声波、高能辐射等方法是通过超声波或者高能射线辐射对植物纤维进行处理,使纤维素分子中的氢键得到破坏,有效降低纤维素的结晶度,同时使纤维素、半纤维素以及木质素之间的结合力下降,变成松散的结构。
微波法、汽爆法等是指在微波或者高温高压的条件下使植物纤维细胞壁内的水分汽化［7］,并与细胞壁内的空气形成高压冲出细胞壁上的纹孔对,由于纹孔对的微细,来不及瞬间完全释放,造成细胞壁的爆裂,使纤维素、半纤维素以及木质素之间的连结变得疏松,降低纤维素的结晶度。
物理处理方法处理过程中不会造成原料损失,通常不用添加其他化学试剂,对环境没有污染,处理后产物能适用于各种降解方法;但物理处理方法也存在能耗高、设备费用高等缺点。
3.1.3生物法
生物法是通过白腐菌等微生物对植物纤维进行预处理,经过处理后,通常植物纤维中的木质素得到有效降解,同时纤维素和半纤维素也得到不同程度的降解［8］。纤维素酶水解工艺中几个关键的问题包括酶的解吸附、不同酶的协同作用、酶的产物抑制的消除、高产纤维素酶的菌种选育和高活力与热稳定性酶的生产及酶水解工艺,这些都是未来的研究重点。
生物处理法具有能耗低、条件温和等优点;但由于微生物的作用周期长,造成生产周期长,不利于实现工业化生产。
3.2植物纤维的降解方法
植物纤维降解的方法主要有生物降解、化学降解等。
3.2.1生物降解
植物纤维的生物降解主要是微生物在酶的作用下的降解［7］。产物可用作燃料以替代传统燃料,植物纤维的生物降解主要包括微生物种类和相应酶的筛选。
植物纤维中纤维素的生物降解大部分都是微生物作用的结果,主要降解途径为基于水解酶的作用,大多为内葡聚糖酶或外葡聚糖酶或类似的酶,主要有外切酶、内切酶和β-糖苷酶,有些酶可能也会裂解成不同种类的多聚碳氢化合物。降解纤维素的主要参与者是纤维素酶类型的水解酶复合物。这些酶主要由真菌形成。半纤维素的降解酶的种类主要有木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯半乳糖酶和木葡聚糖酶等多种酶,参与木质素降解有关的酶主要有木植物过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶等。
生物法即酶水解由于其降解过程中不产生任何污染物,具有绿色环保的特点,被认为是很有前景的降解工艺。生物法水解中催化水解纤维素生成葡萄糖需要多种水解酶。酶解糖化工艺中酶的消耗量大,而纤维素酶的合成需要不溶性纤维素诱导,生产周期长,生产效率低。
3.2.2化学降解
植物纤维化学降解是指植物纤维在化学溶剂、催化剂等的存在下在一定温度、压力下降解为液态材料的降解方法,植物纤维的降解主要分为高压降解和常压降解两种。
(1)植物纤维高压降解技术是指在溶剂的存在下,反应条件为:温度200~400℃、压力为5~25mpa的条件下降解2min至数小时的工艺［9］。其中包括超临界降解,超临界降解技术是用超临界流体(苯酚、水、酒精等)降解植物纤维,使其降解成低分子化合物的工艺。高压降解具有反应迅速,反应容易控制等优点;但对设备要求较高,而且能耗高,限制了其工业应用。
(2)植物纤维常压降解是在降解剂(通常包括溶剂和催化剂)中,在常压条件下使植物纤维降低分子量,使之与降解剂反应转化为分子量分布广泛的液态混合物的过程。常压降解具有反应条件温和、设备简单的特点。
影响植物纤维常压降解效率的因素包括反应条件(温度、时间)、降解剂的选择(种类以及用量)［10~15］。目前各种实验常用的降解溶剂主要有苯酚、环碳酸盐和多元醇等,但各自存在不同的问题,如环碳酸盐具有成本高、回收困难等缺点,苯酚具有毒气大、回收困难等缺点。相对而言多元醇是较为可靠的降解溶剂。常压降解过程通常使用的催化剂是强酸,对生产设备的腐蚀性较高,增加了生产成本。
4结语
目前世界各国对植物纤维的降解做了大量研究,其降解机理已经研究得较为成熟。通过分析植物纤维的特点,根据需要以及用途采用合适的降解方法,并相对应的选择适合的预处理方法,有助于改变当前植物纤维低利用率的现状,有利于提高植物纤维的高附加值利用。
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