生物细胞的培养篇1
[关键词]CiK细胞；细胞毒活性；增殖率；表型
[中图分类号]R-331[文献标识码]a[文章编号]1673-7210（2013）01（a）-0012-03
肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段日益受到重视[1]。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkillercell，CiK）是肿瘤生物免疫治疗的主力军[2]。其主要的效应细胞为CD3+、CD56+表型t淋巴细胞，因此，培养高纯度CD3+、CD56+细胞是提高CiK细胞毒活性，增强对肿瘤细胞杀伤的关键[3]。本研究通过体外的CiK细胞毒实验及流式细胞仪分析检测CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率，观察不同培养时间CiK细胞的增殖能力、杀伤活性，以探讨CiK细胞培养时间与细胞毒活性的关系。
1资料与方法
1.1主要试剂
人淋巴细胞分离液Ficollpaqueplus，基因重组人iL-2、iL-1、iFn-γ和CD3单抗（Sigma公司），Rpmi1640培养基（美国GiBCo），小牛血清（nCS）（美国GiBCo），四甲基偶氮唑盐mtt（华美公司），二甲基亚砜（DmSo）（Sigma公司，美国）。流式试剂CD3FitC/CD56pe（BD公司，美国），肺癌细胞株a549均为本实验室保存和传代培养。
1.2实验方法
1.2.1CiK细胞的培养抽取恶性肿瘤患者的外周血，Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞（pBmC），用Rpmi1640调整至2×106个/mL进行培养，培养基中含10%小牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素和50μmol/L、巯基乙醇、iFn-γ1000U/mL，于当日加入iFn-γ（1000μ/mL），置于37℃和体积分数为5%的Co2培养箱中培养24h，第1天加入iL-2（1000U/mL）、iL-1α（100μ/mL）、mcab（50μg/mL），以后每3天换液1次，培养42d，于培养第0、7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CiK细胞。
1.2.2CiK细胞扩增分析在培养扩增后第7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CiK细胞制成细胞悬液，用台盼蓝排除法计数活细胞，并除以初始细胞数，求出实际扩增倍数。
1.2.3CiK细胞的表型分析分别收取培养第0、7、14、21、28、35、42天CiK细胞，用pBS洗2遍，重悬后分别加入1.5mL管中，每管106个细胞，离心后，加FitC标记的抗CD3mab和pe标记的抗CD56mab各50μL，于4℃孵育30min。pBS洗2遍，离心后，每管加1mLFaCS保存液。用流式细胞仪分析CiK细胞的表型。
1.2.4CiK细胞体外细胞毒活性检测采用96孔培养板用mtt法测定CiK细胞的杀伤活性，收取第0、7、14、21、28、35、42天培养的CiK作为效应细胞，肺癌细胞株a549细胞作为靶细胞，取对数生长期a549细胞调整浓度为1×105个/mL，CiK细胞浓度分别调整为1×106/mL、2×106/mL、4×106个/mL，效靶比依次为10∶1、20∶1、40∶1，分为实验组、效应细胞组、靶细胞组，每组3个复孔，实验组每孔加效应细胞、靶细胞各100μL，靶细胞组每孔加入靶细胞、1640培养液各100μL，效应细胞组每孔加入效应细胞、1640培养液各100μL，置37℃，5%Co2培养箱中培养40h，加入mtt试剂每孔100μL，37℃孵育4h，弃去上清，每孔加入DmSo溶液100μL，震荡溶解沉淀后于全自动酶标检测仪（波长571nm）检测吸光度值（a值）计算杀伤率，杀伤率=[1-（实验孔a值-效应孔a值/靶细胞孔a值]×100%。
1.3统计学方法
应用SpSS17.0软件包进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。以p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1采用直接计数活细胞
观察培养第7、14、21、28、35、42天的CiK细胞扩增倍数的变化，结果见表1，培养第21天细胞扩增倍数为（372±1.87），培养第28天细胞扩增倍数为（410.00±6.52）倍，两者比较差异有统计学意义（p<0.05）；培养第35天CiK细胞扩增倍数为（414.00±5.16）倍，与培养第28天细胞扩增倍数比较差异无统计学意义（p??0.05）。
2.2用流式细胞仪分析不同培养时间CiK细胞的表型变化
结果培养第0天CD3+、CD56+双阳性细胞仅占（6.20±1.12）%，第14天达（18.60±4.50）%，第28天为（35.60±2.30）%，达最高峰，其后逐渐降低。见表1。
2.3mtt法检验培养
第0、7、14、21、28、35、42天的CiK细胞对肺癌细胞系a549效靶比10∶1时杀瘤率分别是14%、51%、86%、95%、68%、50%、27%效靶比20∶1时杀瘤率为15%、88%、98%、100%、81%、67%、53%；效靶比40∶1时杀瘤率为17%、98%、100%、100%、95%、75%、70%。见图1。结果显示，当效靶比为10∶1时，培养21d的CiK细胞杀瘤率是95%，达最高峰；当效靶比为20∶1时，培养21d的CiK细胞杀瘤率已达100%；当效靶比为40∶1时，培养14d的CiK细胞杀瘤率即可达到100%。
3讨论
CiK细胞是在体外条件下通过加入不同的细胞因子（iFn-γ、iL-1、iL-2、CD3mcab）刺激外周血单个核细胞培养诱导而成，同时表达CD3、CD56两种膜蛋白分子。与既往临床使用的过继免疫疗法相比，CiK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前体细胞细胞毒性小等特点[4]，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合临床应用的一种理想的效应细胞[5]，其主要效应细胞为CD3+、CD56+t淋巴细胞，且细胞毒作用几乎唯一存在于CD3+、CD56+表型中。CD3+、CD56+细胞可释放大量的具有细胞毒性的胞浆颗粒而对靶细胞发挥溶细胞作用[6]。这种效应细胞在正常外周血中极其少见，仅为1%～5%。已经证实培养过程中CiK细胞毒作用的增加源于单个细胞基础上的细胞毒作用的提高和非活性细胞被激活，成为有细胞毒作用的细胞，即共表达CD56+和CD3+的细胞数量的显著增加[7]。由此可见，就免疫治疗来说，足够数量的、高免疫毒性的免疫效应细胞是保证治疗效果的必备条件。李文等[8]报道，CiK细胞总数应>5×109才具有治疗作用。李香丹等[9-11]根据实验研究，认为每杀伤1个肿瘤细胞需要40个淋巴细胞，所以在肿瘤生物治疗中，输注细胞数量与疗效呈正相关，应重点研究如何培养出高数量、高杀瘤活性的CiK细胞。从实验结果可以看出，培养时间可能是影响CiK细胞总数、CiK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率和CiK细胞杀伤活性的重要因素。因此笔者对不同培养时间的CiK进行了分析，期望寻找CiK细胞最佳培养时间区间。结果显示：培养第21天细胞扩增倍数为（372.00±1.87）倍，培养第28天细胞扩增倍数为（410.00±6.52）倍，两者比较差异有统计学意义（p<0.05）。培养第35天CiK细胞扩增倍数为（414.00±5.16）倍，与培养第28天细胞扩增倍数比较差异无统计学意义（p??0.05）。通过流式细胞仪检测不同培养时间CiK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率，结果显示培养至第28天CiK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率为（35.60±2.30）%，达最高峰，其后逐渐降低。故此可以认为，培养时间的延长有利于增强CiK细胞的细胞毒活性，但不是培养时间越长细胞质量越好，综合上述实验结果，笔者认为CiK细胞的最佳培养时间应为28d左右。笔者用mtt法测定CiK细胞对肺癌细胞株a549的杀伤活性，结果显示：效靶比为10∶1时，培养21d的CiK细胞杀瘤率是95%，达最高峰；当效靶比为20∶1时，培养21d的CiK细胞杀瘤率已达100%；当效靶比为40∶1时，培养14d的CiK细胞杀瘤率即可达到100%。由此可见增加效应细胞的数量，会大大提升对肿瘤细胞的杀伤力。至于在培养过程中什么因素导致CiK细胞数量上显著的增加，有人认为是抗CD3单抗对CD3+t细胞的刺激导致了CD56+细胞群通过细胞与细胞接触或分泌某种细胞因子而得以表达和扩增，但确切的机制尚待进一步研究。
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生物细胞的培养篇2
1当代大学生的生物科学素养现状及其存在问题
生物相关专业的学生对生物科学技术具有浓厚的兴趣,生物科学技术基础知识扎实,对生物技术发展持积极的肯定态度,具备良好的科技强国的信念。但是,他们对高新生物科学技术知识和先进实验技术了解较少,生物科学实验实践技能较差,对生物科学科研精神的理解和研究方法的掌握不足。有调查表明,当代大学生对于当前的一些生物热点问题有一定的了解,但是对于高新技术的应用和新的科学研究领域的认识不足。在理性上,有43%的学生是盲目的怀疑,或者是盲从专家和他人的观点,对事物较少有自己的看法;在探索求知精神上,“科学功利主义”对学生的影响最大,使得学生视野狭窄、目光短浅;在实证精神上,有62%的学生缺乏实验实证精神,偏重抽象思维,缺乏科学实验的精神和价值眼光。②此外,许多高校只注重生物专业课的常规教学,很少举办专门的科研活动,且科学技能培养与锻炼的途径缺乏,这使得大学缺乏浓郁的科学素养氛围,学生较难形成一定的科学技能,由此科学实践能力也较差。
2细胞生物学教学中培养科学素养的意义
细胞生物学是生物学类及农林医药类本科生一门必修的专业基础课,是现代生命科学的前沿分支学科之一,它是以细胞为研究对象,从细胞的整体水平、亚显微水平、分子水平等三个层研究细胞和细胞器的结构和功能、细胞的生活史和各种生命活动规律的学科。细胞生物学是一门承上启下的学科,和分子生物学一起同是现代生命科学的基础,并广泛渗透到遗传学、发育生物学、生殖生物学、神经生物学和免疫生物学等的研究中,和农业、医学、生物高新技术的发展有密切的关系,是生命科学的重要支柱之一,在解决人类面临的重大问题、促进经济和社会发展中发挥重要的基础作用。同时,细胞生物学又是一门实践性很强的学科,重要理论与实践密切地联系着。随着生命科学自身和生物产业的快速发展,对生命科学相关领域创新型人才的需求也在不断增加。由此可见,细胞生物学课程中科学素养的培养对于建立与其专业层次、研究方向相符合的细胞生物学知识构架体系,培养和锻炼学生的科学思维能力具有非常重要的作用。
3细胞生物学教学中如何培养学生的科学素养
细胞生物学作为生物学类及农林医药类的一门专业基础课程,在培养学生的科学素养方面,具有举足轻的重要作用。然而,科学素养的提高不是一朝一夕之功,教师应始终将其贯穿于自己的教学之中。如何在细胞生物学教学中培养和提高学生的科学素养,以下是笔者的一些想法和体会。
3.1加强课堂教学中的“生活化”融合
细胞生物学的知识理论性强,内容抽象深奥、难于理解,教师可以试将抽象的内容与日常生活相联系,使学生有此联想起有趣的、熟悉的生活场景或事物,这不仅使抽象的内容具体化和动态化,使其容易理解,而且激发了学生的探究欲望和学习兴趣。例如讲解“蛋白质的分选”时,引导学生由细胞社会联想到人类社会。细胞中的各种蛋白质发挥结构或功能作用的部位几乎遍布细胞的各种膜区和组分,只有当蛋白质各就各位并组装成结构和功能复合体,才能参与细胞的各种生命活动。这就好比在人类社会中,各专业的毕业生只有找到适合其自身特点的工作岗位才能发挥所长。总之,运用发散性思维,尽可能地将细胞生物学抽象的理论知识与生活实际联系起来,并配合以多媒体辅助手段,使抽象的内容变得形象生动,易于理解掌握。
3.2侧重教学内容的前沿性和新颖性
细胞生物学发展极为迅速,随着科学家们研究成果的不断涌现,其内容处在不断更新的动态过程中。因此,教师在教学过程中,要注重联系学科的前沿和热点,讲述较先进的科学结论,跟踪国际上最新进展。此外,教师在注重教学的同时,宜以科研并举,以科研引导和促进教学;教学与培养科学研究型人才紧密结合;教学内容与最新科研进展同步,使学生在正确掌握细胞生物学基础上学会解决与之相关的科学研究问题。如将教师的主要科研成果与基础理论教学有机结合,结合教学内容介绍自己的科研成果,这样既生动又贴切,学生又很熟悉,使学生获得学习的兴趣和动力,亦可以启发学生的创新思维能力,培养学生的科研钻研精神。
3.3增加细胞生物学实验综合性和设计性实验的比例
综合性实验注重知识的综合运用,实验原理和方法步骤较为复杂,可以使学生更好地理解实验原理,正确使用仪器设备,锻炼学生综合分析问题的能力;设计性实验是指学生根据实验项目,自主设计实验方案,自主准备实验材料,自主配制实验所需试剂,根据自己的时间自主安排实验进程,设计性实验可以充分调动学生的实验积极性,培养学生的创新思维和勇于探索的精神。由此可见,综合性和设计性实验可以锻炼学生综合分析问题和解决问题的能力。③然而目前许多高校由于实验条件和课时安排的限制,细胞生物学实验主要以基本操作和验证性实验为主,综合性和设计性实验较少甚至没有,这在一定程度上限制了学生综合素质和创新思维的培养。④因此,教师应根据科学性、可行性和实用性原则增大综合性和设计性实验的比例。如我们精选了真核生物基因组的提取、纯化、鉴定、扩增、酶切、重组、转化、筛选的大实验,膜蛋白的分离与鉴定等综合设计型大实验,这些实验中的每个实验都构成了一个综合性整体,同时,在实验材料的选择上尽量做到由学生自主选择。通过每一次的综合设计实验,使学生进一步巩固了已学习的知识和已掌握的技术,并能够对实验结果进行合理的正确的资料采集、整理、分析和归纳,有效地培养了学生的科学素质、科学精神、创新思维及分析问题和解决问题的能力。
3.4组织各种“科学小组”,布置学科发展前沿的讨论,与全程科研训练对接,以培养学生的科学态度和科学精神
生物细胞的培养篇3
[关键词]细胞培养技术高职高专教学改革
[中图分类号]G642.3[文献标识码]a[文章编号]2095-3437（2013）20-0085-02
细胞培养技术是以动植物细胞为研究对象，借助生物学、化学、工程学等技术对细胞进行体外培养的一门专业学科，是当前生命科学中发展较快且与其它学科交叉，并有重要实用价值的科学。[1]随着生物技术渗透到人们生活的方方面面，市场也需要大量这样的应用型人才。2004年呼和浩特职业学院在内蒙古率先在专科学校开设了生物技术专业，细胞培养技术是其专业课程之一，为内蒙古生物技术高新企业培养了一定数量的专业应用型人才。
细胞培养技术内容较多而且抽象，如何在有限的学时内让学生掌握知识，达到好的教学效果，并且能让学生运用于实践，本人根据这几年的教学体验，结合教学中存在的问题，查阅大量专业书籍，并和其它院校相关专业的老师切磋，对如何改善细胞培养技术的教学效果，培养学生学习的积极性，提高学生的素质和能力做初步探讨。
一、细胞培养技术的教学方式的改革
呼和浩特职业学院自开设细胞培养技术这门课程以来，教学方式也在不断改变。最初是传统的板书讲授。每节课向学生灌输大量的知识，完全是“填鸭式”教育。授课中像一些原理和操作步骤板书无法将其形象化，学生很难在脑海对其具体化，光凭死记硬背。这种教学方法单调，学生难理解，学过的内容也很模糊，师生互动也较差，不能达到非常好的教学效果。
为了提高教学效果，教学方式转变为多媒体课件结合板书讲授。通过这种授课方式，将细胞培养技术中的抽象内容变得形象、生动、直观。[2]如用于大规模培养细胞的生物反应器，板书无法展示其工作过程，但通过ppt的动漫效果变得具体化，模拟了常规教学方法无法完成的演示、变复杂为简单，[3]能吸引学生的注意力，充分调动学生学习热情。用传统教学手段讲解费时费力、效率不高的教学重点和难点内容，采用多媒体技术制作的教学课件，可以为学生提供大量的、直观的例证材料，使学生多角度深入了解事物的变化过程，[3]培养他们创新思维能力。如讲到动物细胞生物反应器，学生可从多媒体课件的图片上直观地看到不同类型的反应罐，像搅拌罐式生物反应器、气升式生物反应器和中空纤维反应器，这样学生也能理解课堂讲授的操作原理和方式，加深印象，便于理解。
教师在授课过程中还应做到理论联系实际，这样可大大提高学生的学习积极性。如讲到植物细胞培养时先介绍人参皂苷的提取，人参是大家熟悉的珍贵保健品，通过细胞培养提取人参皂苷用于医药或保健品方面。通过这样的实物举例，同学们强烈地想知道如何进行植物细胞培养，从而提高学生的求知欲。
但是，在多媒体课件的使用中，课件制作的水平直接影响教学效果。教师不能按部就班把课本的文字完全复制上去，使得教学重点不突出，学生学习无动力；同时也不能制造噱头，过多的引入动画效果分散学生的注意力；在多媒体课件的制作设计中，应注意重点和难点突出，条理清晰，才可提高教学质量。在课件的讲授中，借助板书教学，可起到事半功倍的效果。
二、以培养应用型人才为目的，优化教学内容
在高职高专教学中要提高教学质量和效率，合理安排教学内容是途径之一；授课教师应从专业的角度选择和组织教学内容、提高教学内容强度并注重应用。[3]
（一）教材的慎重选择
目前，细胞培养技术的教材多数是针对本科或研究生，专门针对高职学生学习能力编写的教材不多，不同教材在内容的侧重点、章节的编排、实验实训项目的例证等方面各有特点。如何选择一本适合本院高职生物技术专业学生的教材，也经历了几年的尝试。最初我们选用了高等教育出版社全国高职高专教育“十一五”规划教材“细胞工程”，但随着学校学分制教学计划的执行，同时根据当地生物企业对人才的要求特点，我们又选择了兰蓉主编的细胞培养技术。
教材不是教学大纲，只是学生在学校获得系统知识、进行学习的主要材料。它可以帮助学生掌握教师讲授的内容，同时也便于学生预习、复习和做作业。教研室应根据学生就业市场的需要适当调整教学内容，讲出适合高职生物技术专业的内容。
（二）积极引起前沿知识
世界瞬息万变，细胞培养技术发展突飞猛进，教材内容往往跟不上社会发展的要求。[2]因此，教师需经常查阅专业学术资料，关注细胞培养技术方面最新发展动态，收集与课程相关的最新资料，对教学内容进行补充与完善，让学生及时了解前沿知识，拓宽他们的视野，为以后从事本专业工作奠定基础。讲课中结合大家熟悉的实例进行讲解，保持了教学内容的实用性，同时也激发了学生的学习热情。[2]如利用细胞培养技术进行作物育种，我国在这一领域已达到世界先进水平，以花药单倍体育种途径，培育出的水稻品种或品系有近百个，小麦有30个左右。在教学过程中，我们及时将相关先进研究成果传授给学生，使课程始终保持可持续发展的高水平，保持了教学内容的高质量。
（三）加强实践教学
细胞培养技术是一门实践性很强的课程，它的所有理论都是建立在实验的基础上。高职高专的教育目的就是培养理论与实践结合，全面发展的高级应用型人才，为了学生能适应生物高新技术产业对人才的要求，全面掌握细胞培养技术，实践操作训练十分重要。在实践操作过程中，进一步强化实验技术和技能的培养，加大实践环节的学时，所有实验要求学生独立进行，[1]增强学生的实验意识；教师随时纠正学生出现的问题，并在每次实验结束后及时给出评价结果，可增强学生的操作积极性；另外实验课的开设时间应该灵活，不能等到理论课结束再开始，课堂理论知识讲到哪部分就应该让学生亲力亲为，这样学生可及时理解理论知识，加强印象，同时也培养他们的学习兴趣和独立思考的能力。如讲到动物细胞培养常用液时，很多同学对消化液不理解，但当他们动手做小鼠胚胎细胞原代培养时，才深刻体会课堂讲授的消化液的作用。细胞培养技术实验课是严格要求在无菌条件下操作的，学生刚进入实验室，无菌操作意识淡薄，不经意就会忘掉，造成培养细胞被污染甚至死亡。为了改变这种状况，教师可将教材内容适当调整，先讲植物细胞培养技术。由于植物细胞培养材料来源广泛，并且先进行组织培养，再分离细胞培养，让学生熟悉了无菌操作基本技术后，再讲解动物细胞培养技术并进行实验操作，学生对无菌操作不再陌生，并且培养了无菌操作意识，培养细胞的成功率也高。
三、改革考核方式，注重学生整体素质的提高
课程考核的目的不外乎是检测学生对知识或技能的掌握程度。细胞培养技术是一门理论与实践并重的课程，在几年的教学过程中，我们不断地完善考核方式，力求全面考核学生的整体能力；改变以往单纯以期末理论考试为主，造成某些学生不注重平时的学习，期末突击来应付考试。目前，根据该门课程特点，考核内容由3部分构成：期末理论考试（50%）、课堂出勤及课堂作业（10%）、实验操作过程及实验报告（40%）。理论考试主要考查学生对细胞培养技术中的基本知识、基本理论的掌握程度，同时也考查学生综合运用该门知识的能力；课堂出勤及课堂作业考核学生的课堂表现和纪律，课堂作业是检查教学效果和获得信息反馈的一个重要手段，既考查了学生对这节内容的掌握程度，也为授课教师调整教学方式和内容提供了直接的信息；实验操作过程考核改变了以往只注重结果，而忽视了实际操作过程的考核，而学生是否真正掌握了细胞培养技术往往体现在实验操作过程中。
四、结语
目前高职细胞培养技术教学改革还处于完善的阶段，如何利用有限学时将细胞培养技术中的基础理论、实验技术、前沿进展传授给学生，是一项复杂的系统工程，需要长期努力才能达到真正提高教学质量的目的。在教学中积极探索，打破传统的教学模式，[4]探索适应时展的教学方法；通过不断的探索改革，力求为学生构建一个脉络清晰、系统性强的细胞培养技术结构体系，[4]培养更多优秀的高级应用型人才，为促进地区经济发展添砖加瓦。
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生物细胞的培养篇4
植物组织培养在农业生产中的应用、动物细胞培养的过程及影响因素一直是高考命题的热点。命题会利用信息材料为背景以图解的形式考查有关植物组织培养的相关知识，或结合植物育种、动物细胞培养等知识进行综合考查。
二、复习建议
本部分题目中常出现操作流程图或装置图，如植物组织培养的操作流程图、动物细胞培养过程图等，复习过程中要注意运用列表比较的方法分析不同技术手段的异同点，注意掌握各种技术手段中的特殊点和关键环节；要善于识别这些图解，要知道图中所表示的物质、结构和过程，知道每个环节的操作要点，并对一些现象进行正确分析。
三、知识梳理
（一）植物组织培养
1.原理：植物细胞具有全能性。
2.过程。
3.植物组织培养过程的几点说明。
（1）外植体的选择与制备。
①选择外植体时，由于外植体的脱分化难易因植物种类、器官来源及生理状况的不同而有很大差异，因此，选择哪些作为外植体应注意。一般来讲，烟草、胡萝卜、植物的花和幼嫩的组织脱分化相对较易，而植物的茎、叶和成熟的老组织则较难。
②制备外植体首先要消毒，其次要选取有形成层（形成层细胞易脱分化）的部分。
（2）严格的无菌条件。
植物组织培养用的培养基含有植物生长发育所需要的各种营养物质，这些营养物质同样为细菌等微小的生物提供了适合的营养。在这种培养基上，细菌等微小的生物比植物细胞具有更强的新陈代谢能力，它们比植物细胞生长、繁殖得更快，而且它们会产生毒素，使培养的植物细胞很快中毒死亡。因此，植物组织培养要想取得成功，必须有效地防止细菌等的污染，保证培养材料、培养基、培养用具严格无菌。
（3）完全的营养条件。
离体的植物细胞失去了植物的自养能力，所以需要为其提供包括水、有机营养、矿质营养、维生素等营养物质。
（4）光照条件。
离体的植物细胞、组织和器官脱分化形成愈伤组织时，需避光处理；而愈伤组织再分化形成植物幼苗时，需光照处理。
（5）激素调控。
①生长素类含量＞细胞分裂素类含量：诱导植物组织脱分化和根原基形成。
②生长素类含量＜细胞分裂素类含量：诱导愈伤组织再分化和芽原基形成。
③赤霉素类：促进分化的丛芽和小植株快速生长。
【易混警示】分化、脱分化、再分化。
比较内容脱分化再分化分化过程外植体愈伤组织愈伤组织幼苗形成体
特点排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞有根、芽需要条件a.离体；b.适宜的营养；c.生长素/细胞分裂素的比例适中；d.不需光a.离体；b.适宜的营养；c.生长素/细胞分裂素的比例高（或低）诱导生根（或生芽）；d.光照在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构和生理功能上发生差异的过程，具有普遍性、持久性、稳定性和不可逆性；分化的结果是形成不同的组织器官，帮助个体完成正常的生长发育4.植物组织培养技术的应用。
（1）植物繁殖的新途径。
①微型繁殖。
实质植物组织培养原理植物细胞的全能性条件培养基中加入细胞生命活动所需的水、矿质元素和小分子有机物，还有激素，更重要的是所有加入的物质必须是无菌的，操作过程必须是在无菌条件下操作，这样繁殖的幼苗才是无毒的微型繁殖
技术的
优点a.能保持亲本的一切优良性状，子代个体具有的遗传物质与亲本一样
b.选材少，培养周期短，繁殖率高
c.不受自然生长季节的限制，便于自动化管理，有利于进行工厂化培养范围作物脱毒，人工种子中的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽的获得采用的技术均是微型繁殖②作物脱毒：a.解决方法：切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。b.理论基础：植物分生区附近病毒极少，甚至无病毒。c.特点：繁殖速度快；幼苗遗传背景均一；不受季节和地区限制。
③人工种子（如下图）。
人工种子主要由三部分组成:
a.胚状体(分生组织),它相当于天然种子的胚,是有生命的物质结构；
b.供胚状体维持生命力和保证其在适宜的环境条件下生长发育的“人工胚乳”；
c.具有保护作用的“人工种皮”。
【特别提醒】人工种皮是保证包裹在其中的胚状体顺利生长发育成小植株的关键部分，针对植物种类和土壤等条件，在人工种子的包裹剂中还可以加入适量的养分、无机盐、有机碳源以及农药、抗生素、有益菌等。为了促进胚状体的生长发育，还可以向人工种皮中加入一些植物生长调节剂。
（2）作物新品种的培育。
①单倍体育种：花药离体培养过程就是植物组织培养过程。
a.原理：整个单倍体育种过程的原理是染色体变异，其中的花药离体培养是利用细胞的全能性。
b.过程：通过花药离体培养获得单倍体植株，染色体加倍后当年可得到稳定遗传的优良品种，极大地缩短了育种年限。如下图：
花药离体培养单倍体幼苗种水仙素诱导染色体数目加倍纯合子
②突变体的利用。
a.来源：植物组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断分生状态，容易受到培养条件和外界压力的影响而产生突变，从这些突变的个体中可以筛选出对人们有用的个体，培育新品种。如下图：
b.实质：植物组织培养。
c.形成原因:培养细胞一直处于不断分生的状态，容易受外界一些条件的影响而发生突变。
③细胞产物的工厂化生产：可以利用植物组织培养技术大量生产某些细胞产物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱等。
【易混警示】单倍体育种和突变体利用的比较。
项目原理优点成果单倍体
育种染色体变异明显缩短育种年限单育1号烟草品种，11号水稻和京花1号小麦品种等突变体
利用基因突变产生新基因，大幅度改良某些性状抗花叶病毒的甘蔗；抗盐碱的野生烟草等（二）动物细胞培养
1．概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
2．操作流程。
3.过程解读。
（1）原理：细胞增殖。
(2)动物细胞培养的条件。
①充足的营养供给――微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。
②适宜的温度、适宜的pH。
③气体环境：o2、Co2。
④无菌、无毒环境培养液和培养用具杀菌消毒
培养过程加抗生素杀菌
定期更换培养液，清除代谢产物
（3）动物细胞要分散成单个细胞培养的原因：分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。
（4）选取幼龄动物的组织、器官作为材料的原因：动物细胞培养时，一般选取幼龄动物的组织、器官，其细胞的分化程度较低,增殖能力强,有丝分裂旺盛，容易培养。
（5）胰蛋白酶在培养过程中的作用及与原代培养和传代培养的联系。
原代培养和传代培养一般均需对细胞进行胰蛋白酶细胞分散处理，区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象。
①第一次：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，分散后培养，即为原代培养。
②第二次：细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，分散到多个培养瓶中继续培养，即为传代培养。
（6）细胞贴壁和接触抑制。
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
4.植物组织培养与动物细胞培养的比较。
比较项目植物组织培养动物细胞培养培养基的物
理性质固体培养基液体培养基(合成培养基)原理细胞的全能性细胞的增殖培养的成分水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、琼脂等葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等结果新的植株或组织新的细胞系或细胞株目的①苗木的快速繁殖；②培养无病毒植株；③生产药物、香料等；④制备人工种子；⑤单倍体育种获得细胞或细胞的产物（如单克隆抗体）取材植物细嫩的部位或花药等动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织其他条件均为无菌操作，需要适宜的温度、pH、o2等条件【特别提醒】①两种技术手段培养过程中都进行了有丝分裂，都是无性繁殖，都可称克隆，都不涉及减数分裂。
②植物组织培养最终产生新个体，体现了细胞的全能性；动物细胞培养产生大量细胞，不形成新个体，故不能体现细胞的全能性。
【易混警示】原代培养和传代培养的辨析。
原代培养传代培养可有两种表述：a.细胞悬液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养；b.第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养同样有两种表述：a.细胞悬液培养一段时间后，分瓶再进行的细胞培养；b.传10代以后的细胞培养四、典例展示
例1.通过植物组织培养技术可以快速繁殖、生产药物及培育无病毒的植物等。据图甲、表乙回答问题。
离体的植物器官、组织或细胞①愈伤组织②胚状体培养植物体
图甲植物组织培养过程
表乙：植物的花芽分别在含有不同比例的生长素和细胞分裂素的培养基中的生长状况
a组B组C组D组e组生长素03ppm3ppm0.03ppm0细胞分裂素00.2ppm0.002ppm1.0ppm0.2ppm花芽生
长状况仍是组
织切块形成愈
伤组织愈伤组织
分化出根愈伤组织分
化出嫩芽稍生长(1)离体的植物器官、组织或细胞能够被培养成新的植物体的原因是。
(2)用植物组织培养方法诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状体结构，若包裹上人造种皮，制成人工种子，可能解决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。胚状体来源于离体的植物体细胞，其形成过程中要经过的生理变化大体上是图甲中［］和［］过程，在此过程中被培养的细胞始终受的调节(［］内填序号)。
(3)应用植物组织培养技术培养茎尖或根尖组织可获得无病毒植株，其原因是。
(4)从表乙的实验结果可看出：生长素和细胞分裂素是实验中的两种重要物质。其中，新芽形成必需的条件是；而在培养形成完整新个体过程中，对它们的调控关键是。
解析：(1)植物组织培养的原理是细胞的全能性。(2)①是脱分化，得到愈伤组织，②是再分化，得到胚状体。(3)植物的根尖或茎尖分裂快，病毒尚未来得及侵染。培养茎尖或根尖组织可获得无病毒植株。(4)由表乙D组看出，细胞分裂素的浓度大于生长素的浓度，脱分化出嫩芽。在不同培养期，细胞分裂素与生长素的浓度和比例不同，分化的器官就不同，在组织培养过程中，其浓度和比例非常关键。
答案：(1)植物细胞的全能性(2)①脱分化②再分化植物激素(3)植物的茎尖或根尖很少被病毒感染，甚至无病毒(4)细胞分裂素的浓度大于生长素的浓度适当调控好不同培养期的培养基中细胞分裂素与生长素的浓度和它们的比例
例2.（2014・甘肃秦安一中第一次检测卷）某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞（甲）和正常肝细胞（乙）进行细胞培养。下列说法不正确的是（）
a．在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理
B．为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的抗生素
C．细胞培养应在含5%Co2的恒温培养箱中进行，Co2的作用是维持培养液的pH
D．将数量相等的甲、乙细胞分别置于相同适宜条件下培养，一段时间后，会观察到甲细胞的数量比乙细胞的数量多
解析：胃蛋白酶最适pH是1.5，而一般细胞培养在pH是6.5~8.0，所以不能用胃蛋白酶处理，a项错误。抗生素可以有效抑制细菌的繁殖，所以可以加入适量抗生素，B项正确。细胞培养过程中，5%Co2的作用是调节细胞培养液的pH值，故C项正确。因为肝肿瘤细胞在适宜条件下具有无限增殖的能力，而普通细胞没有此特性，所以D项正确。
答案：a
例3.回答下列有关动物细胞培养的问题。
(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的。此时，瓶壁上形成的细胞层数是。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是。
(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成细胞，该种细胞的黏着性，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量。
(3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不被染色，原因是。
(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选细胞分裂到期的细胞用显微镜进行观察。
(5)在细胞培养过程中，通常在条件下保存细胞。
解析：（1）在动物细胞培养过程中，细胞会表现出接触抑制现象，此时是单层细胞。用胰蛋白酶可以使贴壁细胞从瓶壁上分离开来。（2）随着细胞传代培养代数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现衰老甚至死亡的现象，但极少数细胞可以连续增殖，有些细胞会因遗传物质改变而变成不死性细胞。（3）由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，而死细胞的细胞膜丧失选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色。（4）由于细胞分裂中期染色体形态固定、数目清晰，因此可作为显微镜观察染色体数目的最佳时期。（5）冷冻或超低温、液氮条件下，细胞中酶的活性降低，细胞新陈代谢的速率降低，故适宜保存细胞。
答案：(1)相互接触接触抑制单层(或一层)胰蛋白酶(2)衰老甚至死亡不死性（大大）降低减少(3)由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不被染色(或由于死细胞的细胞膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内)(4)中(5)冷冻(或超低温、液氮)
五、巩固训练
1.（2013・北京市东城区期末卷）右图表示一定条件下将胡萝卜的离体组织培育形成试管苗的过程。下列有关叙述不正确的是（）
a．需在无菌条件下将离体组织接种到培养基中
B．图中①②过程分别表示脱分化和再分化
C．利用此过程获得的试管苗均为纯合子
D．此实验说明分化的植物细胞仍具有全部的遗传信息
2.植物组织培养依据的原理、培养过程的顺序及诱导的植物激素分别是（）
①体细胞全能性②离体植物器官、组织或细胞③根、芽④生长素和细胞分裂素⑤生长素和乙烯⑥愈伤组织⑦再分化⑧脱分化⑨植物体
a．①、②⑦⑥⑧③⑨、④
B．①、②⑧⑥⑦③⑨、④
C．①、⑥②⑨⑧③⑦、⑤
D．①、②⑨⑧⑥⑦③、⑤
3.下列关于动物细胞培养的叙述中，错误的是（）
a．用于培养的细胞多取自动物胚胎或幼龄动物
B．培养过程中需要使用胰蛋白酶等获得细胞悬液
C．动物细胞培养时要保证氧气供应，不能通二氧化碳
D．动物细胞培养时的培养基是液体培养基，并要加入血清
4.下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（）
a.动物细胞培养需要无菌、营养、适宜的温度和pH等条件
B.用胰蛋白酶作用于离体的动物组织，使其分散成单个细胞
C.放入Co2培养箱中培养动物细胞的主要目的是为了满足细胞对Co2的需求
D.细胞株一般具有恒定的染色体组型、生化特性等
5.（2013・吉林省吉林一中高三第二次摸底考试卷）植物组织培养是克隆植物的一种方法，过程如下图所示，请回答相应的问题。
(1)为了获得脱毒植株，外植体往往取自植物的花芽、叶芽等处的分生组织，其原因是。
(2)培养皿中的培养基除添加营养物质外，还需要添加植物激素，其目的是诱导外植体。
(3)在生产实践中为获得大量的细胞产物，如紫杉醇，可将①放入液体培养基中，经机械作用分散成单个细胞，制备成细胞浮液，再经过即可获得大量细胞。
(4)组织培养过程需要植物生长和繁殖的最适条件，否则在光学显微镜下可能观察到发生异常，进而使植物出现遗传不稳定甚至不育。
(5)植物组织培养技术不仅应用于花卉和果树的快速大量繁殖以及脱毒植株的获取，还广泛用于、、等育种过程中。
6.制造人工种子的原理是在组织培养得到的“胚状体”的最外面用一层有机膜包裹，并在薄膜以内放入一些营养物质，这层膜和这些营养物质分别具有种皮和胚乳的功能（如下图所示）。在制造过程中还可以加入某些农药、菌肥等。据此材料回答下列问题：
（1）胚状体来源于离体的植物体细胞，其形成过程中要经过的生理变化大体上是和。在这一过程中被培养的细胞始终受的调节。
（2）从保证人造种子正常生命力及生态系统物质循环上来看，其外部薄膜应具有等的特点。
7.（2013・福建福州期中卷）下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：
（1）容器a取材于动物胚胎或幼龄动物的原因是。
（2）容器B中一般先用酶处理，消化组织中的胶原纤维，这利用了酶的性，这样做是为了使细胞分散开来，便于细胞与充分接触。
（3）C瓶内的培养为，这一时期的细胞具有恒定的、和生化特性等。
（4）为了把C瓶中的细胞分散到D瓶中，用处理，然后配制成，再分装。
（5）在D瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡。原因是。
参考答案
1.C2.B3.C4.C
5.（1）这些部位很少受到病毒等病原体的侵害
（2）脱分化和再分化
（3）愈伤组织细胞分裂
（4）染色体结构和数目
（5）植物体细胞杂交育种基因工程育种单倍体育种
6.（1）脱分化再分化植物激素
（2）半透性（透水、透气性）和能被微生物降解
7.（1）细胞分裂旺盛
（2）胰蛋白专一培养液
（3）原代培养染色体组型病毒敏感性
生物细胞的培养篇5
【关键词】植物细胞培养技术研究发展
一、植物细胞培养发展简介
十九世纪九十年代，Haberlandt首先进行了植物细胞的培养；1939年，white，nobecourt，Gautheret分别，提出非分化的植物细胞可以无限期地进行培养，为植物细胞培养的发展奠定了基础。1942年，Gautheret发现植物细胞培养可产生次级代谢产物；1954年，muir等第一次进行了植物细胞悬浮培养；自从1956年，Routine和nickel首次提出用植物细胞培养技术生产有用次级代谢产物以来，据不完全统计应用于植物细胞培养技术生产次生代谢产物的植物已达百种以上。
二、植物细胞培养技术
植物细胞的培养方法较复杂，根据培养对象可分为原生质体培养和单细胞培养；根据培养基的类型可分为固体培养和液体培养两大类；根据培养方式分为悬浮培养、平板培养、看护培养及固定化细胞培养等；根据培养规模大小可分为小规模培养和大批量培养。
（一）植物细胞培养的基本技术。
1.固体培养
固体培养是加入一定量凝固剂的液体培养基作为培养基的培养方式，其优点是简便，对实验设备要求简单，缺点是外植体或愈伤组织只有一部分表面能接触培养基，容易产生浓度差，影响其生长速度；同时固体培养基不利于气体交换和物质排泄，造成毒害；另外还有光线分布不均匀等缺点。
2.液体培养
液体培养是以配置的营养液作为培养基的培养方式，液体培养静止液体培养和震荡液体培养。液体培养弥补了固体培养的不足，但要求技术较高，成本较贵。
（二）单细胞培养技术。
1.看护培养技术
用一块愈伤组织来看护单细胞使之生长和增殖的方法称为看护培养。这种从单细胞起源的愈伤组织连同它衍生的培养物一起叫做一个单细胞无性系。此系统提供了一个单细胞系，它的生长因子是由愈伤组织和培养基提供的。
2.平板培养技术
平板培养是将一定密度的悬浮培养细胞接种到一薄层的固体培养基上进行培养的技术。由于平板培养具有筛选效率高、筛选量大、操作简单等优点，被广泛用于遗传变异、细胞分裂分化和细胞次生代谢物合成的种细胞筛选等各种需要获得单细胞克隆的研究。
3.微室培养技术
微室培养是将细胞培养在微量容器的少量培养基中，如凹穴载玻片上或多室培养盘内。优点是在培养过程中可连续进行显微观察以及多因子大量组合实验。但由于培养量少，水分难以保持，培养基的养分及p等也易于变动，细胞短期培养后往往不能再生长。
（三）植物细胞的大规模培养。
1.固定化培养技术
植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的技术。是由Brodelius等人于1979年首次生产植物次生代谢物应用成功的。与悬浮培养相比，它具有提高反应效率、延续反应时间及保持产物生产的稳定性等特点。
2.两相培养技术
在培养体系中加入水溶性或脂溶性有机物或者具有吸附作用的多聚物使培养体系分为上下两相，细胞或组织在水中生长和合成次生代谢物质，次生代谢物质分泌出后再转移到有机相中，然后再从有机相分离植物次生代谢物的技术，称为两相培养技术。其优点是由于产物的不断释放与回收，有可能真正实现植物细胞的连续培养，从而降低生产成本。
3.反义技术
根据碱基互补原理，人工合成或生物体合成特定互补Dna或Rn段，抑制或封闭某些基因表达的技术，通过此技术，可以将反义Dna或Rn段导入植物细胞，使催化某一分支代谢的关键酶活性受抑制或加强，从而提高目的物的含量，同时抑制其他化合物合成。
4.冠瘿培养技术
利用根癌农杆菌感染植物可以将ti质粒的t-Dn段（含有诱导冠瘿组织发生的tms基因和tmr基因）整合进入植物细胞的基因组，诱导细胞冠瘿组织的发生。冠瘿组织离体培养具有激素自主性、增殖速率较快等特点，另外，次生代谢产物合成稳定性和能力较强，用来生产有用的次生代谢产物有良好的开发前景。
5.毛状根培养技术
毛状根是双子叶植物各器官受发根土壤杆菌（agrobacteriumrhizogenes）感染后产生的病态组织。感染过程中，发根农杆菌ti质粒t-Dna转移并整合到植物基因组中。具有激素自养，增殖速度快，次级代谢产物含量高且稳定等特点。
6.添加诱导子或引导物技术
诱导子是一种能引起植物过敏反应的物质，当它在与植物的相互作用时，能快速、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达，进而活化特定次生代谢途径，积累特定地目的次生代谢物，从而提高植物次生代谢产物的产量。
7.两步培养技术
植物细胞生物量增长与代谢产物积累之间是不同步的，用同一种培养基同时达到细胞的最佳生长和最佳次级代谢产物的积累是不现实的，因此采用两步培养技术，即在不同阶段使用不同的培养基。在细胞的生长阶段使用生长培养基，促进生物量的增长，生产培养阶段使用生产培养基，促进产物的生成，从而达到提高产物产率的目的。
8.植物细胞悬浮培养生物反应器技术
植物细胞悬浮培养生物反应器技术是发酵技术在植物细胞大规模培养的应用。植物细胞培养对反应器的要求简单、坚固、价廉、多用途、操作稳定、维修更换附件方便之外，要求反应器在满足供氧的前提下，能为细胞的生长、次生代谢产物的合成提供一最佳的外部条件，即均一的反应体系、温和的流场、合适的细胞团太小以及分布。生物反应器技术具有很多优点：工作体积大、单位体积生产能力高、物理和化学条件控制方便等。
9.三维细胞培养技术
三维细胞培养技术是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间中迁移、生长、构成三维的细胞一载体复合物。目前该技术主要应用在哺乳动物细胞培养研究中，涉及到植物细胞培养中的研究报道甚少，但这种多学科的交叉融合和互相渗透无疑将成为今后研究植物细胞培养技术发展趋势。
三、植物细胞培养存在的问题
（一）适用范围较窄。
许多的植物类型或基因型还不能按照人们的目的用现有的技术培养成功。甚至一些重要农作物的基本技术如棉花花药培养研究，至今尚未取得突破。
（二）所建的技术体系稳定性差。
同一技术在不同实验室、不同的人操作，甚至不同的批次之间都有差异，难以推广应用。
（三）随机性太强。
由于组织细胞培养过程中一些作用机制还不太清楚，当无性繁殖扩增保存材料时，对无性系变异现象无法控制，长期培养的材料往往会失去分化能力。而进行无性变异筛选时希望的变异个体又因变异率低而选不出。
参考文献：
[1]王海波，程奇.植物细胞工程的回顾与展望[J]，科技导报，1993，3.
[2]刘书志.植物细胞培养和植物细胞培养装置[J]，工业技术，2011，31.
[3]李晓惠，陈蕾.植物细胞培养技术的发展与应用[J]，安徽农学通报，2006，12.
生物细胞的培养篇6
【摘要】
目的在骨组织工程的载体外包裹多糖生物膜(psbm)，减少种子细胞在复合载体时的外溢逃出，验证其在组织工程中应用的可行性。方法用全骨髓法获得骨髓基质干细胞，体外扩增后，取第三代细胞种植于支架材料载体多孔纳米磷灰石－硅灰石生物活性玻璃陶瓷/壳聚糖复合支架材料（a-w-mgc/cs）上，分2组，实验组载体外用多糖生物膜物理包裹，对照组不包裹多糖生物膜，观察载体外培养皿上的细胞生长数量；mtt检测细胞活力；电镜观察载体上细胞粘附生长情况。结果实验组培养板上载体外漏细胞较少，对照外漏细胞较多：mtt检测两组细胞活力差别无显著性（p＞0.05）；电镜观察实验组载体上细胞粘附生长较对照组稍优。结论多糖生物膜在骨组织工程中具有应用前景。
【关键词】多糖生物膜骨髓基质干细胞（bmscs）支架材料组织工程
abstract:objectivetopackbonetissueengineeringcarrierwithpolysaccharidebiomembranetodecreaseseed-cells?leaking,andtoauthenticatethefeasibilityofapplyingpolysaccharidebiomembraneinbonetissueengineering.methodsbonemarrowstromalcellswerederivedthroughwhole-bone-marrowmethod,and,afteramplificationinvitro,thecellsofthethirdgenerationwereimplantedina-w-mgc/cs.thenthecellsweredividedintotwogroups-anexperimentalgroupwithcarrierpackedwithpsbmandacontrolgroupwithcarrierun-packed.thenumberofcellgrowinginculturedishoutofthecarrierwasobserved，thestateofcellvigorwasdetectedwithmtt,andthestateofcelladhesionwasobservedwithelectronmicroscope.resultsthenumberofleakingcellintheexperimentalgroupwaslessthanthatinthecontrolgroup.theresultofmttdetectionshowedthatdifferenceofcellvigorbetweentwogroupswasun-significant(p＜0.05).thegrowingstateofcellintheexperimentalgroupwasbetterthanthatinthecontrolgroupunderelectronmicroscope.conclusionspolysaccharidebiomembranehasanappliedprospectinbonetissueengineering.
keywords：polysaccharidebiomembrane;bonemarrowstromalstemcell;bracketmaterial;tissueengineering
骨组织工程的核心是在体外培养细胞，然后将细胞种植到具有一定结构的三维支架上，再将这种细胞生物材料复合体植入骨缺损部位，通过生物过程使细胞长入多孔支架中，即经过细胞间相互粘附、增殖、分化，分泌细胞外基质最终形成具有一定结构和功能的组织或器官，从而达到骨修复的目的。细胞和支架材料的相互作用又起到关键的作用，减少细胞复合材料又未贴附在支架材料这段时间的外漏，可以有效的减少种子细胞的损失，增加细胞与支架材料之间的作用时间，更利于细胞粘附。由中国海洋大学生命学院研制的多糖生物膜（polysaccharidebiomembrane,psbm）是一种安全无毒，具有很好生物相容性的细胞培养移植载体。多糖生物膜是由壳聚糖衍生物（羧甲基壳聚糖）、透明质酸及明胶按特定比例混合制成的膜型制剂。其分子量约为2000da，透水率为10μl/（min·cm2）。为了提高载体内外液体中大分子物质的流通，我们用显微穿刺的方法在多糖生物膜上增加孔隙（直径约为20μm、孔间距为100～150μm）。耿燕、王晓莉［1，2］等将其应用于眼科的研究。本实验研究将多糖生物膜应用于骨组织工程的可行性。
1材料与方法
1.1实验动物
2～3月龄清洁级日本大耳白兔1只，体重1.5kg，由辽宁医学院实验动物中心提供。
1.2实验材料
多孔纳米磷灰石－硅灰石生物活性璃玻陶瓷/壳聚糖复合支架材料（a-w-mgc/cs）（由四川大学无机非金属材料系周大利教授课题组提供），多糖生物膜（中国海洋大学生命学院提供），高糖dmem（gibco），胎牛血清(北京华美)，hepes（北京华美）,0.25％胰酶，mtt，二甲基亚砜，96孔一次性培养板，co2培养箱，倒置相差显微镜，jsm-5900lv扫描电镜。
1.3实验方法
1.3.1bmscs的分离培养
取1.5～2月龄的日本大耳白兔，雌雄不限，速眠新ii(0.2ml/kg)肌注麻醉，无菌条件下于胫骨上端抽取约4ml骨髓，在超净工作台上将骨髓加入无菌培养瓶中，再加入4ml含10%胎牛血清的dmem培养液(以下称生长培养基)充分吹打，按每瓶2ml加入到30cm2的培养瓶中，补充2ml的生长培养液，放入37℃、5%co2恒温细胞培养箱中培养。5天后首次换液，以后每3天换液1次，在倒置显微镜下观察细胞生长情况。待贴壁细胞接近80%融合后，结束原代培养。吸去生长培养基，用无血清dmem洗1次，加入0.25%胰蛋白酶1.5ml/瓶消化3～5分钟，并在倒置显微镜下观察消化效果。当有部分细胞脱壁、大部分细胞间隙变大时加入生长培养基3.0ml/瓶终止消化。细胞沉淀用生长培养基吹打成单细胞悬液并按1∶3比例分装传代，以后每3d换液1次。
1.3.2bmscs复合a-w-mgc/cs及包裹多糖生物膜
将制作好的a-w-mgc/cs（12mm×5mm×5mm），孔径在100～500μm，孔隙率为80%～90%，经环氧乙烷消毒后放置1个月，用前pbs冲洗3遍，用不含胎牛血清的dmem培养液浸泡置于37℃、5%co2恒温细胞培养箱中7天，去掉培养液，在培养箱中自然晾干待用。将多糖生物膜修剪成5cm×3cm大小（见图1），浸泡于0.05m的磷酸盐缓冲液24小时（中间换液1次），121℃高压湿热灭菌。手工将多糖生物膜从底面及侧壁包裹晾干的a-w-mgc/cs复合支架材料可吸收线系好备用（见图2）。取第三代bmscs消化离心制成1×106的细胞悬液种植于实验组包裹有经穿刺过的多糖生物膜的a-w-mgc/cs上，另一组细胞直接种植a-w-mgc/cs上，每组6块，放入24孔培养板上，在37℃，5％co2饱和湿度的孵箱中孵育。2h后翻面，4h后加入20％fbs的基础培养液，每孔1.5ml，培养7d，隔天更换培养液。
1.4检测项目
1.4.1mtt值测定增值曲线的绘制
取第三代生长细胞种植于96孔培养板上，分2组，实验组为浸泡有多糖生物膜的生长培养液，对照组为正常生长培养液。每板种植21个孔，每孔接种2×103个细胞，200μl培养液，每48小时换液。每日取3孔细胞，观察细胞生长情况，加入20μlmtt，4h后尽量吸弃孔内培养液，加入150μl二甲基亚砜，振荡10min，以490nm为测量波长，以空白孔为对照，用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度值【d（490）】，根据mtt值绘制细胞增殖曲线。
1.4.2倒置显微镜观察培养板上细胞外漏情况
24小时后取24孔培养板，在倒置显微镜下观察支架材料外，培养板底外漏的细胞贴壁生长情况并细胞计数，细胞实际种植数=细胞种植总数-培养板底部外漏细胞数。种植率=细胞实际种植数／细胞种植总数×100%。
1.4.3电镜观察支架材料上细胞贴附生长情况
将联合培养7d的细胞与支架复合体标本分别取出后，pbs洗3次后，2.5%戊二醛常温下固定，60%～100%的乙醇梯度脱水，乙酸异戊酯置换。临界点干燥，表面喷金，jsm-5900lv扫描电镜分析。
1.4.4统计学处理
采用spss14.0软件对数据进行分析，数据用±s表示，采用t检验进行组间比较，p＜0.05时差异有统计学意义。
2结果
2.1mtt实验结果
根据每日不同d（490）均值为数据，绘制细胞增殖曲线(见图3)。结果显示：浸泡有多糖生物膜的实验组与对照组比较差异无统计学意义。（p＞0.05）说明细胞在浸泡有多糖生物膜的生长培养基的生长增殖不受影响。
2.2倒置显微镜观察培养板上细胞外漏结果并计数细胞数
24小时后倒置显微镜下观察放有支架材料的24孔培养板的底面并细胞计数（见表1），如图4，图5所示，可见实验组外漏细胞较少，而对照则较多。
表124孔培养板的底面细胞计数（略）
注：p＜0.05,实验组和对照组差异有统计学意义
实验组细胞实际种植数为8.8×105，种植率为88%；对照组细胞实际种植数为5.3×105，种植率为53%。
2.3电镜观察支架材料上细胞贴附生长情况
如图6，图7所示，可见细胞在支架材料上贴附生长良好，实验组细胞呈不则球形，分布均匀，密度较大；对照组细胞分布不均匀，密度较少。
3讨论
骨组织工程骨的体外构建要求最大限度的保证使用的种子细胞参与成骨,减少种子细胞的流失。在实验中我们发现在细胞与载体复合时，细胞在载体内的滞留与粘附是至关重要的两个方面。细胞与支架材料表面的接触、黏附及相互作用是组织工程学的第一步。细胞必须与材料黏附［3］,才能进行迁移、分化和增殖。这种黏附作用在材料方面与材料的组成,亲/疏水性,表面能拓扑结构及其表面的生物特异性活集团等因素有关。为了提高细胞与支架材料间的黏附能力,对支架材料进行必要的改性是非常必要的。近年来，对各种支架材料表面的亲和力，粘附作用的研究较多，大多数解决的都是细胞在载体上粘附的问题［4-6］。而细胞在载体上的滞留时间，不仅影响到种子细胞的流失和数量，更间接影响细胞与支架材料的粘附，因此增加细胞在载体上的滞留时间，可以有效的解决这个问题。
细胞在细胞接种至载体表面时，由于重力作用，细胞在载体中下沉从孔隙中溜出而不能有效的贴附。另外支架材料的侧壁有较多的空隙，细胞可以从这些空隙中溜出。因此我们用多糖生物膜采用物理包裹的方法，将支架材料从底面及侧壁包裹好，可以有效减少细胞的损失。
多糖生物膜有三个特性：其一是具有可通透性，即它具有半透膜性质（透）水率10μl/min·cm2、分子量在2000da的物质可自由通过）；其二，此膜对细胞有良好的粘着力，非常适合细胞的贴壁生长；其三，此膜可吸收。为了提高载体内外液体中大分子物质的流通，我们用显微穿刺的方法在膜上增加孔隙（直径约为20μm、孔间距为100～150μm）。实验中，我们用mtt法，检测多糖生物膜对bmscs的增殖及活性的影响，发现此膜有很好的生物相容性，不影响细胞的生长增殖，无细胞毒性。mtt比色法［7，8］，是一种检测细胞存活和生长的方法，可间接反映活细胞数量,也是接触法检测材料细胞毒性的最常用的一种方法。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
实验中，支架材料所在的培养板底外漏细胞的减少，实验组细胞实际种植数较没有包裹多糖生物膜的对照组高出35%，有效的减少种子细胞的损失；电镜照片载体上细胞粘附情况，均反映了经过多糖生物膜包裹的支架材料上，细胞较长时间的滞留，可以增加细胞与支架材料的粘附，及其在上面生长增殖，并验证了多糖生物膜在骨组织工程领域的作用。（此文图1-7见附页3-4）
【参考文献】
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生物细胞的培养篇7
【关键词】红毛毡提取物;mtt;广谱;ic50
红毛毡(ardisiamamillata),又名佛光江、老虎舌、红毛走马胎、红地毡、虎舌红，属紫金牛科植物,是一种广泛分布于中国南方地区的草本植物，具有清热利湿，活血和瘀的功效,常用于治疗痢疾，肝炎，胆囊炎，风湿，跌打劳伤，咳血，吐血，妇女痛经，血崩，小儿疳积，疮疖痈肿疼痛[1]。其叶和茎的皮层和髓部有分泌组织，内含红棕色树脂类物质、岩白菜内酯、挥发油、黄酮类、甙类、鞣质和苯醌等[2],使其具有广泛的生物学活性,为考察红毛毡提取物的体外抗肿瘤作用，我们采用mtt法检测红毛毡提取物对13种肿瘤细胞株体外生长的抑制作用，以筛选出敏感肿瘤类型，了解其作用强度，为体内试验提供参考。www.133229.com
1材料和方法
1.1试剂及设备
红毛毡提取物由本公司工艺室提供，顺铂注射液购自由云南个旧生物药业有限公司，pmi1640、dmem、l15、胰蛋白酶均为gibco产品，mtt、台盼蓝为sigma产品，dmso为成都科龙化工试剂厂产品，小牛血清购自成都哈里生物工程有限公司，胎牛血清购自hyclone公司，酶联检测仪，biorad550型，biorad公司产品，co2培养箱，thermo371型，美国热电公司产品，倒置显微镜，ck40f200型，日本olmpus产品。
1.2细胞培养
sgc7901，人胃癌细胞;qgy7703，人肝癌细胞;a549，人肺癌细胞;k562，人慢性髓质白血病细胞;pc3，人前列腺癌细胞;ht29，人结肠癌细胞;osrc2，人肾癌细胞;mdamb435s，人乳腺导管癌细胞;ho8910，人卵巢癌细胞;a375，人黑色素瘤细胞;panc1，人胰腺癌细胞;jurkat，急性t细胞白血病细胞;eca109，人食管癌细胞;购于中科院上海生命科学研究院细胞库。分别培养于rpmi1640+10%小牛血清，rpmi1640+10%胎牛血清，dmem+10%胎牛血清，l15+10%胎牛血清，1%lglutamine，1×105u·l-1青霉素和100mg·l-1链霉素的各培养液中,在37℃，5%co2培养箱培养。
1.3体外抗癌试验
1.3.1贴壁细胞
贴壁细胞经常规传代培养至对数生长期，弃旧培养液，加入0.25%胰酶+0.02%edta消化，待细胞变圆成单个时，加入完全培养液，轻轻吹打，使其形成单细胞悬液。收集细胞至离心管中。1000rpm·min-1离心5min。弃去上清，沉淀加入培养基悬浮混匀。台盼蓝排斥法进行细胞计数，调整细胞浓度至1×105细胞·ml-1的细胞悬液。取96孔板，每孔用移液器加入细胞悬液200μl，使每孔细胞数为2.0×104个。置37℃、5%co2培养箱中培养24h后取出96孔板，移液器小心吸去上清液，每孔分别加入用完全培养液配制的药物溶液200μl，每个浓度设三个复孔。细胞对照组加200μl的完全培养液，阳性对照加入顺铂药液200μl，每个浓度三个复孔。置37℃、5%co2培养箱中培养48h后取96孔板，直接加20μlmtt溶液，37℃、5%co2培养箱继续培养4h，吸去上清液，每孔加入二甲亚砜150μl，充分振荡5min溶解，酶标仪490nm处测定去空白od值，参比波长655nm。
1.3.2悬浮细胞
悬浮细胞经常规传代培养至对数生长期，直接用吸管轻轻吹打，使其形成单细胞悬液。收集细胞至离心管中，1000rpm·min-1离心5min。台盼蓝排斥法进行细胞计数，调整细胞浓度至2×105细胞·ml-1的细胞悬液。取96孔板，每孔用移液器加入细胞悬液100μl，每孔细胞数为2.0×104，每孔分别加入用完全培养液配制的药液100μl，每个浓度设三个复孔。细胞对照加100μl培养液，阳性对照加入顺铂药液100μl，每个浓度三个复孔。置37℃、5%co2培养箱中培养48h后，每孔加入5mg·ml-1mtt溶液20μl，37℃、5%co2培养箱继续培养4h后，1000～1500rpm·min-1离心10～15min，小心吸去上清液，每孔加入二甲亚砜150μl，充分振荡5min溶解，酶标仪490nm处测定去空白od值，参比波长655nm。
1.4数据处理
由od值计算抑制率，公式为：细胞生长抑制率ir=(对照组od值-实验组od值)/对照组od值×100%。半数抑制浓度ic50=细胞生长抑制率为50%的药物浓度，并ic50软件求得ic50值。
2结果
表1红毛毡提取物以及顺铂注射液对13株人肿瘤细胞株的体外生长抑制作用红毛毡提取物体外具有强抗肿瘤活性，对其敏感的肿瘤细胞有急性t细胞白血病细胞jurkat、人肾癌细胞osrc2、人慢性髓质白血病细胞k562、人肺癌细胞a549和人乳腺导管癌细胞mdamb435s，ic50值分别为9.25±3.68、10.75±2.40、10.90±3.74、11.21±3.07和12.66±1.19μg·ml-1，其中红毛毡提取物对mdamb435s的活性约为顺铂注射液的4倍。对所试肿瘤细胞中最不敏感的细胞是人卵巢癌细胞ho8910，但红毛毡提取物对其ic50值也低至32.42±12.47μg·ml-1。红毛毡提取物对人结肠癌细胞ht29的ic50值虽然不是最低的，其ic50值低于顺铂注射液对该细胞的ic50值，分别为25.51±0.83μg·ml-1和51.79±0.98μg·ml-1。见表1。
3讨论
紫金牛科紫金牛属(ardisiasw)植物全世界约有300种，其主要提取物有苯酚类、皂苷类、香豆素类和苯醌类，其中苯酚类、皂苷类有较强的抗肿瘤活性，岩白菜素有良好的抗hiv病毒作用[3-5]。虎舌红中也含有丰富的生物碱[6]，jinghuang等[7]从其中提取到两种新的三帖烯皂甙，提示红毛毡有潜在的抗肿瘤活性，但国内目前无相关抗肿瘤作用的实验研究。本文的检测结果表明了红毛毡提取物体外具有强抗肿瘤活性，ic50低至10μg·ml-1，而且其抗癌谱广，对其敏感的肿瘤细胞有急性t细胞白血病细胞、人肾癌细胞、人慢性髓质白血病细胞、人肺癌细胞和人乳腺导管癌细胞等，这为临床抗肿瘤治疗提供了新的选择。不过，红毛毡提取物的体内抗肿瘤作用效果如何，其作用机制怎样都还有待进一步研究。
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生物细胞的培养篇8
【关键词】听囊细胞；干细胞；细胞增殖；细胞分化；胎鼠
【abstract】aim:tofindtheoriginofauditorycellsinmammalsandtostudytheproliferationanddifferentiationofauditorycellprogenitors.metHoDS:otocystepitheliasurgicallyisolatedfromfetalratswereculturedandpassaged.proliferationanddifferentiationofculturedcellswereobservedusingBrdUlabelingtofindtheprogenitors.immunocytochemistry(Factin,cytokeratinandcalretinin)wasusedtodetectcellpropertiesofculturedcells.ReSULtS:otocystcellsdifferentiatedandproliferatedandshowedseveralmorphotypes,mainlyincludingepitheliallikecells,fibroblastlikeandneuronlikecells.allofcellswerelabeledpositivetoFactinandcytokeratin.asubsetofcellswerelabeledstrongpositivebycalretinininprimaryculture.Butfewpassagedcellswerepositivetocalretinin.BrdUlabelingshowedculturedcellscouldproliferatesignificantly.themorphologicalphenotypewasretainedthroughout8passagesduring4monthculture.ConCLUSion:innaturalcultureconditioninvitro,otocystcellsoffetalratscandifferentiateorproliferatetoimmaturehaircells.thestudywillprovidesomeideasandmethodsforfurtherresearchabouthaircellregeneration.
【Keywords】otocystcells;stemcells;cellproliferation;differentiation;fetalrats
【摘要】目的：了解哺乳动物听觉细胞的来源，探索听觉细胞前体细胞体外增殖和分化.方法：取孕鼠胚胎听囊细胞进行体外培养，用免疫细胞化学方法，分别对培养的细胞进行细胞角蛋白、F肌动蛋白和calretinin染色观察细胞特征；BrdU染色观察细胞增殖.结果：培养的细胞在体外进行分化和增殖，细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态3种.对细胞角蛋白和F肌动蛋白这两种上皮细胞的标志染色呈阳性.在原代培养就出现calretinin染色明显阳性的细胞.传代后结果仍为阳性着染，但强度减弱.BrdU染色显示培养细胞具有明显的增殖活性.本研究共传8代，历时4mo，细胞形态维持稳定.结论：胎鼠听囊细胞在体外自然培养条件下可以分化或者增殖为未成熟毛细胞.本研究为探索刺激听觉毛细胞再生的治疗方法提供研究思路和方法.
【关键词】听囊细胞；干细胞；细胞增殖；细胞分化；胎鼠
由噪声、耳毒性药物等引起的耳蜗毛细胞损害而致的感音神经性耳聋是耳鼻咽喉科难治之症.如果能够建立一种细胞系，而这种细胞系又具有分化为听觉毛细胞的潜能，不但有利于听力学研究，也有利于进行药物的发展及毛细胞生物学方面的研究.我们对胎鼠听囊细胞用自然培养方法进行体外培养，并应用免疫细胞化学方法，对培养细胞进行了染色标记和观察.
1材料和方法
1.1材料选用怀孕14d成年健康小鼠1只，灰色，体质量0.15kg.耳廓反射正常，鼓膜正常.细胞培养基Dmem（Gibco公司）；100mL/L胎牛血清（FBS）（Sigma,USa）；2.5g/L胰酶（Sigma,USa）；抗calretininmab(1∶100Chemicon28820SingleoakDrive.temecula,Ca92590，USa）；鼠抗兔细胞角蛋白单克隆抗体（1∶200），抗F肌动蛋白单克隆抗体phalloidinFitC（1∶200）和鼠抗体Cy3均购自Sigma公司；BrdU试剂盒（Germany）.
1.2方法
1.2.1听囊制备引颈法杀死实验孕鼠，取出子宫，置入放有Dmem培养液的培养皿中.用两只无菌镊撕开子宫，使胚胎与子宫内膜和胎盘游离，放入有新鲜培养液的培养皿中.在解剖显微镜下仔细分离听囊，放入准备好的培养液中进行培养.本次实验共取出胎龄为14d的小鼠胚胎9只.
1.2.2听囊细胞培养14个胚胎听囊上皮组织（7胚）置入pBS液中清洗2次，在显微镜下用小剪刀剪碎组织，放入含有2.5g/L胰酶的pBS液中37℃消化8min，吸液管上下吹打20次，然后加入含100mL/L胎牛血清（FBS）的Dmem液中终止消化；细胞悬液经离心后弃上清，加入培养液观察.培养液包括Dmem；L谷氨酰胺，100mg/L氨卞青霉素和100mL/L胎牛血清（FBS）.细胞悬液加入24孔培养板中在37℃,50mL/LCo2孵箱中孵育（部分培养孔放置有盖玻片），每3~4d更换培养液.相差显微镜下（nikon，日本）观察.
当细胞汇合贴壁，细胞融合达80%以上时，应用2.5g/L胰酶eDta法消化5min，进行传代.将分离的细胞用含100mL/L胎牛血清（FBS）的Dmem液进行倍数递增稀释，直至细胞浓度稀释至20×103/L，然后进行传代培养.
1.2.3免疫细胞化学染色①抗细胞角蛋白染色:载有培养细胞的盖玻片在40g/L多聚甲醛中（0.1moL/L磷酸盐缓冲液，pH7.4）固定30min，用含100mL/L山羊血清，1mL/LtritonX100的pBS液阻断20min后，抗细胞角蛋白（cytokeratin）mab(1∶200)进行孵育，4℃过夜.DpBS液洗3次，加入二抗(1∶200)，黑暗中孵育2h，洗3次，100g/L甘油封片.在荧光显微镜下观察.②F肌动蛋白的染色观察:室温下培养物中加入0.5mg/LphalloidinFitC(1∶200)孵育45min.立即在荧光显微镜下观察.③抗calretinin染色:载有培养细胞的盖玻片在40g/L多聚甲醛中（0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4）固定30min，用含100mL/L山羊血清，1mL/LtritonX100的pBS液阻断20min后，抗calretininmab(1∶100)进行孵育，4℃过夜.DpBS液洗3次，加入二抗(1∶200)，黑暗中孵育2h，洗3次，100g/L甘油封片.在荧光显微镜下观察.④BrdU标记:培养的细胞中加入BrdU（1∶1000;5BrdUlabelinganddetectionkitiiBoehringermannheimGmbHBiochemicaD68298mannheimGermany），其浓度为10μmol/L.37℃,50mL/LCo2孵育12h后，用700mL/L乙醇在-20℃固定30min，加入1∶10抗BrdUmab(克隆BmC9318,igG1)，在37℃孵育30min.培养物置入含1∶200羊抗鼠抗体Cy3的pBS液中90min（避光状态）.100g/L甘油封片，显微镜下观察.
2结果
2.1听囊细胞培养14孔细胞中有11孔细胞生长良好，大部分细胞在培养8h后贴壁，细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态3种（图1）.
图1胎鼠听囊细胞原代培养8h，视野中可见到上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态×100
2.2听囊细胞传代培养本研究共传8代，历时4mo，细胞形态仍主要为上皮细胞形态和成纤维细胞形态（图2）.细胞形态和结构比较稳定.
图2胎鼠听囊细胞培养1代第6日，细胞形态仍主要为上皮细胞形态和成纤维细胞形态×200
2.3免疫细胞化学染色观察虽然培养的听囊细胞形态有多种变化，但对细胞角蛋白和F肌动蛋白这两种上皮细胞的标志染色均呈阳性.本研究可见到培养第4日细胞就增殖形成细胞克隆，细胞角蛋白（图3a）染色呈阳性；传代细胞中，进行细胞角蛋白（图3B）染色，结果仍表现为阳性，说明传代后上皮细胞特征维持稳定.研究中也可见到在传代后的细胞中，F肌动蛋白染色呈阳性（图3C）.
Calretinin是一种钙联蛋白，是早期毛细胞的标志［1］.对培养的听囊细胞进行calretinin染色，在原代培养就出现明显阳性的细胞（图3D）.这些细胞在传代后进行calretinin染色，结果仍为阳性着染，但强度减弱（图3e）.为了证实细胞培养过程中有丝分裂的存在，本研究应用了BrdU进行细胞核标记（图3F），显示细胞具有明显的增殖活性.
a：胎鼠听囊细胞原代培养第4日，形成了细胞克隆，细胞角蛋白的免疫荧光染色×100；B：胎鼠听囊细胞5代，细胞角蛋白的免疫荧光染色×200；C：胎鼠听囊细胞1代第14日，F肌动蛋白的免疫荧光染色×100；D：胎鼠听囊细胞原代培养第7日，calretinin的免疫荧光染色×200；e：胎鼠听囊细胞培养1代第3日，calretinin的免疫荧光染色×200；F：胎鼠听囊细胞培养6代，细胞BrdU染色显示几乎所有培养细胞标记阳性×100.
图3免疫细胞化学染色观察
3讨论
有关毛细胞再生的研究已经进行了10余年.目前，普遍的观点认为，鱼类和两栖类动物耳内终生都有毛细胞的产生，尤其是鸟类的前庭器官，有损伤后自我修复的功能.哺乳动物毛细胞在出生后就已经停止增殖，不可能再产生.近年来的许多研究成果令人鼓舞，已证实哺乳动物毛细胞的再生能力，但这些现象大部分是在自然恢复的过程中观察，急需探明毛细胞增殖和分化的来源.大部分小鼠胚胎期听囊细胞进行终末有丝分裂是在胚胎15d左右，经过终末有丝分裂后分化为毛细胞.本研究的目标为在胚胎期听囊细胞进行终末有丝分裂之前，取出听囊（胚胎14d），观察并培养听囊细胞，即毛细胞的前体细胞，从而了解这些前体细胞在体外自然培养条件下的增殖和分化情况.
以往许多研究者应用H2kbtsa58转基因动物进行永生化细胞系建立的研究，但是由这种转基因动物建立的永生化毛细胞前体细胞系有一定的缺陷：首先，这种动物的基因发生了变化，很容易发生进一步的突变，从而限制了它们在分子基因和细胞再生方面的研究；其次，这种转基因动物建立的永生化细胞系不可避免的改变了细胞本身的一些特点.正是基于以上原因，本实验选取胚胎14d的鼠胚听囊上皮细胞进行体外自然培养，不带有任何转化基因.细胞形态主要有上皮细胞形态、成纤维细胞形态和神经细胞形态，而且这种形态在细胞传代后基本维持稳定.部分细胞在培养过程中形成了细胞克隆.用免疫细胞化学方法进行细胞染色后发现，原代和传代细胞对上皮细胞标志F肌动蛋白和细胞角蛋白均表达阳性.而早期毛细胞的标志calretinin在原代培养中表达强阳性，说明胚胎听囊细胞离体后可以直接分化为有具有毛细胞特征的细胞.这一结果与新生鼠和成年鼠的毛细胞前体细胞研究中有相似的发现［2-4］.
干细胞的研究一直是近年研究的热点，在对哺乳动物毛细胞前体细胞的研究中，研究者也发现了一些干细胞存在的证据［5］.尤其是Li等［6-7］的研究发现成年小鼠的前庭上皮中有一些表达干细胞标志的细胞，这些细胞可以分化为毛细胞样的细胞，具有替代丢失的毛细胞的潜能.ito等［8］的研究也证实神经干细胞可以适应耳蜗的内环境，表现出毛细胞的形态.本研究在进行终末有丝分裂之前得到的前体细胞在体外的表现也有几个干细胞的特点：①可以增殖分裂，BrdU染色阳性也说明这些细胞处于有丝分裂过程中；②有类似的细胞克隆出现；③细胞可以分化为具有毛细胞特征的细胞.虽然传代细胞仍然具有上皮细胞的特征，在对这些细胞进行calretinin染色后发现，细胞的阳性程度减弱.所以，需要进一步的实验证实毛细胞干细胞的存在.研究中培养的毛细胞前体细胞不但可以进行耳蜗基因方面的功能研究，也将为探索刺激听觉毛细胞再生的治疗方法提供研究思路和方法.
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生物细胞的培养篇9
关键词：心肌细胞；细胞培养；三维培养
abstract：Cellcultureisoneofthemostcommonlyusedandthemostimportanttechniquesinthebiomedicalresearch.inthispaper，theclassicalcardiomyocyteculturemethodsandthelatestprogressinthisfieldarereviewed.
Keywords：Cardiomyocyte；Cellculture；three-dimensionalcultivation
细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是疾病发生和转归的基础。因此，细胞是生物医学研究中最重要的环节。在体细胞研究存在诸多局限性，如成本高、影响因素复杂、可重复性差等，为解决这些困难，离体细胞培养技术应运而生。细胞培养（cellculture）是细胞在离体条件下的克隆性增殖过程，具有成本低、周期短、数量多、单克隆性、条件可控等诸多优势。可以说，细胞培养技术是生物医学研究中最基础最重要的技术之一。本文仅就心肌细胞培养技术及其进展作一浅述。
1经典心肌细胞培养模型
鼠心肌细胞是心肌细胞培养最常用的材料，包括未成熟心肌细胞（immaturecardiomyocyte，iCm）和成熟心肌细胞（adultcardiomyocyte，aCm）两种。iCm培养技术是由Harary等在1960年建立的[1]，经过后人改进形成了经典的Simpson培养法[2]。iCm主要来源于胚胎鼠和乳鼠，以出生3d内的乳鼠心室肌细胞最常用。aCm相互间有大量闰盘和外基质紧密相连，又没有分裂增殖能力，其分离和培养比iCm要困难得多，直到上世纪60年代才通过逆行主动脉生物酶灌注法分离出单个aCm[3]，但是当时aCm因置于生理浓度钙溶液中而迅速死亡，这个现象被称为"钙反常（calciumparadox）"[4]。1976年，powell首次报道了分离活性的钙耐受成熟心室肌细胞的技术[5]。Jacobson则在1977年首次成功培养出aCm。
经典的心肌细胞培养技术包括细胞分离、纯化、接种、培养和传代培养等步骤。
1.1心肌细胞的分离iCm的分离一般采用组织块消化法，即将心肌组织剪成小碎块，然后加入消化分离液将心肌细胞和非心肌细胞分开。消化分离液的主要成分是生物酶，常用的有胰蛋白酶、胶原酶和透明质酸酶[6]，其中胰蛋白酶作用最强，但也最容易损伤心肌细胞；胶原酶作用温和；透明质酸酶作用弱，不宜单用。目前多采用两种或三种消化酶联合，以胰蛋白酶和胶原酶Ⅰ联合最常用。消化分离液中可加入牛血清白蛋白以保护心肌细胞，提高细胞质量[7]；也可加入脱氧核糖核酸酶，防止Dna聚积在心肌组织表面而影响分离效率[6，8]；乙二胺四乙酸（eDta）是一种常用的螯合剂，能吸附溶液中的Ca2+、mg2+等金属离子而促进细胞分离（细胞间粘附因子发挥作用需有上述金属离子存在），而且对细胞功能影响极小[9]，故加入eDta可进一步提高分离效率，但是eDta不能被血清中和，后续必须洗净，以免影响细胞贴壁。心肌细胞分离后加入含胎牛血清的培养液以终止消化，即得到初步的心肌细胞悬液[10]。在实际操作中，消化分离液的酶类、酶浓度、温度、搅拌转速及时间长短等因素相互影响、相互制约，需要反复摸索才能得到最佳方案。
aCm的分离方法相对更复杂，主要有组织浸泡法、贴块培养法和离体心脏生物酶灌注法。效果最好和最常用的是离体心脏生物酶灌注法，又称为Langendorff离体心脏灌注法，是oscarLangendorff在1895年发明的[11]，经过预热、消毒、洗涤、经升主动脉逆灌消化酶溶液循环灌流、震荡释放心肌细胞和梯度复钙等步骤，最终得到活性的单个aCm[12，13]。
1.2心肌细胞的纯化心肌组织由多种细胞构成，以心肌细胞和成纤维细胞样细胞数量最多。在体外培养的特殊环境中，非心肌细胞对心肌细胞的影响是巨大的，主要表现在：①非心肌细胞贴壁和生长增殖能力更强，容易成为优势细胞，通过空间竞争、分泌抑制因子等机制影响心肌细胞的生长增殖和功能[14，15]；②非心肌细胞对干预因素的反应与心肌细胞不同，影响实验结果。因此，细胞分离后的纯化是必要的。常用的纯化方法有差速贴壁法和化学试剂法，主要是除去成纤维细胞样细胞：①差速贴壁法利用不同细胞贴壁速度的不同（心肌细胞贴壁较慢）进行分离和纯化。通过差速贴壁法纯化的心肌细胞纯度可达到90%以上[16，17]，且操作简单、成本低、对心肌细胞影响小，但缺点是作用时间短，不能单独用于长时间培养的实验；②化学试剂法利用某些化学试剂对不同细胞的抑制强度不同来达到纯化目的。5-溴脱氧尿嘧啶核苷可明显抑制成纤维细胞样细胞增殖，而对心肌细胞影响小，是心肌细胞纯化常用的试剂[18，19]。化学试剂能够持续起作用，但缺点是对心肌细胞可能具有潜在影响。在实际操作中，差速贴壁法和化学试剂法常联用。
1.3心肌细胞接种和培养细胞培养基分天然培养基和合成培养基两种，后者更常用。心肌细胞常用的培养基有Dmem、m199、mem、emem等。为了促进细胞贴壁，培养基中可加入促吸附因子（Ⅰ型胶原、Ⅵ型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白等）；为了预防细菌污染，有时加入抗生素[20]。细胞密度是影响细胞生长、增殖、分化表型、生存时间等的重要因素，接种密度需根据实验目的而定，如果是为了观察单个细胞的行为，密度宜较低，一般为1～2×105/mL；如果是为了获取细胞产物，密度则宜较高，一般为5～6×105/mL[21]。接种在多孔培养板时，应放弃周边孔并加入空白培养基以避免"边缘效应"。
aCm的培养比较复杂，分为去分化法和快速吸附法两种[22]。去分化法使用含血清培养基培养，研究表明[23]，通过该法培养的aCm在超微结构、分子水平和电生理水平表型上都发生了"去分化（dedifferentiation）（向胎儿表型的逆转）"，因此被称为"去分化法"。去分化法的优点是细胞存活时间较长，达数周到数月，缺点是发生了表型逆转而且逆转程度尚不明确[24]，也正因为如此，现在多采用快速吸附法。快速吸附法是将aCm接种在经促吸附因子预处理过的基质上，使用无血清培养基培养。aCm可在接种3h内吸附到培养基质上，并且始终保持急性分离时的柱形、纹状形态，也不会自发性收缩，尤其适用于分子生物学和电生理试验[25]。快速吸附法的缺点是细胞存活时间较短，只有1～2w。
1.4iCm的传代培养iCm具有分裂能力，为了调节细胞密度，有时需要传代培养。传代培养实质上是将原代细胞收集起来稀释后重新接种和培养的过程。由于心肌细胞是贴壁生长的，传代培养的关键是使细胞脱壁、分离成细胞悬液，分离方法主要有两种：①生物酶法：加入低浓度（0.01%～0.05%）胰蛋白酶溶液使细胞分离；②机械法：通过吸管的刮吹使细胞分离。
2心肌细胞三维培养技术
经典的心肌细胞培养模型，细胞接种在二维基质中，与在体的三维环境完全不同，势必导致细胞在结构和功能上发生一系列适应性改变，影响科学研究的效果。所以，人们迫切需要一种既能尽量保留在体细胞的结构和功能特点、又具有体外培养优势的技术。随着生物、材料、纳米、组织工程等学科的快速发展，细胞三维培养技术应运而生了[26]。
刘霞等用三维的pLGa泡沫支架材料培养乳鼠心肌细胞，观察到心肌细胞形成了心肌组织样结构，超微结构保持良好，代谢活性也较二维培养更高[27]。刘兴茂等将乳鼠心肌细胞接种于鼠尾胶原膜三维支架中培养，并与二维培养作横向比较，发现三维培养的心肌细胞保持了良好的形态和功能[28]。eschenhagen等将鸡胚心肌细胞接种到胶原凝胶上，观察到心肌细胞形成了可收缩的网络结构[29]。Hussain等将乳鼠心肌细胞与成纤维细胞共同接种于经层粘连蛋白处理过的生物活性壳聚糖纳米纤维三维支架中，发现心肌细胞能长期维持在体的形态和功能，形成同步化收缩[30]。
总之，心肌细胞三维培养技术还方兴未艾，是未来的发展方向之一。
3结论
心肌细胞培养技术已走过半个多世纪的历史，广泛应用于电生理、信号通路、细胞凋亡以及药物安全性评价和新药筛选等领域，为生物医学的发展作出了巨大贡献。同时，随着三维培养、反义寡核苷酸和基因转染等新技术手段的涌现，心肌细胞培养技术又是历久弥新、蒸蒸日上，必将为人类的健康事业更立新功。
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生物细胞的培养篇10
【关键词】组织工程真皮细胞外基质生长因子
中图分类号：R318.08文献标识码：B文章编号：1005-0515（2011）10-356-02
随着生活水平提高，糖尿病发病率逐年增高，糖尿病皮肤溃疡为糖尿病常见并发症之一，具有创面难愈合性，严重的影响病人的生存质量，目前常规的治疗并不能取得令人满意的治疗效果[1]。近年来，组织工程学取得了长足发展，使糖尿病皮肤溃疡的治疗方法有了新的选择。创面愈合过程是一系列连续但相重叠的阶段，愈合过程是通过不同类型的细胞有序的迁移入创面来完成的。糖尿病患者皮肤创面炎性细胞分泌细胞因子减少，成纤维细胞发生凋亡病变，抑制创面愈合过程[2]。本实验中，应用真皮成纤维细胞作为组织工程种子细胞，应用pGa支架材料作为组织工程支架材料，构建成真皮替代物，进行检测细胞材料复合物分泌细胞外基质情况和分泌生长因子情况。
1材料与方法
1.1主要实验仪器和试剂扫描电子显微镜（Hitachi，日本）。中性蛋白酶（electrophoresisGmbH公司，德国)；nB4胶原酶（electrophoresisGmbH公司，德国)；eLiSa试剂盒（R&D公司，美国）；全波长荧光／比色扫描读数仪(thermo公司，美国)。
1.2细胞分离、培养和扩增将儿童包皮环切术术后包皮剪刀剪去皮下脂肪组织，表皮面朝下浸于中性蛋白酶液中，37℃下消化2～4小时。用眼科镊将表皮与真皮分离开。将分离的真皮组织充分剪碎，加入0.2％nB4胶原酶溶液30ml，在37℃恒温摇床消化3小时。以5×104/cm2细胞密度接种于培养皿内，加入培养液10ml。每3天换一次液，细胞融合至80％即传代。
1.3总胶原含量的测定
取25块10mg、5×10mm2大小、8mm厚度的pGa材料接种20million/ml的成纤维细胞悬液，接种液体量为50μl。细胞材料复合物在高糖Dmem培养液中培养。第5、9、13、17和21天分别取5块材料进行检测。用羟脯氨酸测试法检测。根据羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4％，进一步计算样本中胶原的含量。
1.4葡糖胺基聚糖（Glycosaminoglycan，GaG）含量的测定
取25块10mg、5×10mm2大小、8mm厚度的pGa材料接种20million/ml的成纤维细胞悬液，接种液体量为50μl。细胞材料复合物在高糖Dmem培养液中培养。在第5、9、13、17和21天分别取5块材料进行检测。用阿利新蓝染色法计算样本内GaG的含量。
1.4分泌生长因子含量的测定
取4块20mg、10×10mm2大小、8mm厚度的pGa材料接种20million/ml的成纤维细胞悬液，接种液体量为160μl。细胞材料复合物在高糖Dmem培养液中培养。放入24孔板中，加入Dmem培养液中1.5ml。每隔2天换一次液。分别于第5天、第9天、第13天、第17天和第21天取上清液，放置于ep管中，置于－80℃中保存。用eLiSa方法检测VeGF、tGF-β1和bFGF分泌量。
2结果
2.1总胶原含量的检测
成纤维细胞/pGa支架材料复合物在培养液中培养，成纤维细胞合成分泌细胞外基质。对其总胶原含量的检测表明，细胞材料复合物随时间增加，总胶原含量逐渐增加。见图1：
2.2GaG定量检测
成纤维细胞/pGa支架材料复合物在培养液中培养，成纤维细胞合成分泌细胞外基质。对其GaG含量的检测表明，细胞材料复合物随时间增加，GaG含量逐渐增加。见图2：
2.3泌生长因子含量的测定
成纤维细胞/pGa支架材料复合物在培养液中培养，成纤维细胞合成分泌生长因子VeGF和tGF-β1。应用eLiSa方法检测，VeGF生长因子分泌量以13天分泌量最高，对照组培养液中并不含VeGF。tGF-β1生长因子分泌从第5日到第9日下降，然后又逐渐增高，第17日为峰值。而对照组培养液tGF-β1中含量保持稳定。与此相对应的，应用eLiSa检测方法，我们发现在实验组和对照组中培养液中，均未能检测出有分泌bFGF。见图3，图4：
附图：
图1：
图2：
图3：
图4：
tGF-β1分泌量
图1：细胞材料复合物在体外培养进行总胶原含量测定
图2：fibroblasts/pGa细胞材料复合物在体外培养进行GaG含量测定
图3：fibroblasts/pGa细胞材料复合物在体外培养进行分泌VeGF含量测定。
图4：fibroblasts/pGa细胞材料复合物在体外培养进行分泌tGF-β1含量测定。
3讨论
在真皮脱细胞基质中，主要成分为胶原和GaG，胶原占了细胞外基质的大部分成分，而GaG占细胞外基质的相对小部分，但是在创面愈合中GaG其具有促进细胞外基质形成和胶原有序沉积作用[3]。因此我们对成纤维细胞/pGa复合物进行测量总胶原含量及GaG含量。定量测试结果表明，细胞材料复合物在培养过程中，随时间增长，总胶原含量呈上升趋势，GaG含量亦呈上升趋势，但合成的细胞外基质中总胶原含量比GaG含量要高。实验表明，成纤维细胞在pGa材料上生长具有合成胶原及GaG等细胞外基质能力。
各种生长因子在创面愈合过程中起到了一个关键的核心作用[4]。其中tGF-β1在创面愈合中起到了一个中心环节的作用[5]。我们对培养中的细胞材料复合物进行检测分泌生长因子，VeGF和tGF－β1。其中VeGF在第13天时分泌量最高，且细胞培养液中不含有VeGF。而含10％胎牛血清的高糖Dmem的细胞培养液中虽含有一定量的tGF－β1，但我们检测发现其含量值始终保持稳定，tGF－β1测定稳定在700pg/ml。我们对其检测观察，实验组tGF－β1在第17天达到峰值。其中VeGF和tGF－β1均存在第5天到第9天分泌量下降，然后逐渐增高趋势，其中VeGF在第13天达峰值，而tGF－β1在第17天达到峰值，然后都出现逐渐下降趋势，可以看出VeGF和tGF－β1分泌曲线有一定的相似性。
我们通过检测细胞材料复合物分泌细胞外基质和分泌生长因子证实，成纤维细胞在pGa材料上生长具有合成细胞外基质、分泌生长因子能力。尤其分泌生长因子（如VeGF和tGF－β1）使我们构建的真皮替代物进一步应用于治疗慢性皮肤溃疡创面提供可能。
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