生物信息学分析篇1
关键词：生物信息学，信息处理，模式识别
informationprocessingintheBioinformatics
abstract:Bioinformatics，theanagramwhichincorporatesinformationscienceintothebiologyandwithitsconcepttakesshape，isanewlydevelopedmulti-disciplinaryfieldwhichhassprungupvigorouslysincethelate80’s.inthispaper，themainresearchtopicsofbioinformaticswerereviewed，includingthecodingofgeneticinformation，generecognition，complexityofnucleotidesequence，correlationstructureandfractalcharacteristicofnucleotidesequence，andthesimulationandanalysisofgenomicregulationmodel.theinformationanalysisandprocessingscenariosinvolvedarealsoincluded，togetherwiththeirmanysuccessfulapplicationsandopenproblemsappearingintheliterature.itisbelievedthatthecombinationofinformationscienceandlifesciencewillgreatlyacceleratetheprogressofstudyforlifescienceperse.
Keywords:Bioinformatics，informationprocessing，patternrecognition
：10000多字
有参考文献
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生物信息学分析篇2
>>人组蛋白去乙酰化酶11的克隆表达与生物信息学分析FZ6基因及其蛋白的生物信息学分析拟南芥和大白菜YaBBY蛋白家族的生物信息学分析斑马鱼tata结合蛋白的生物信息学分析黄瓜DVR基因的生物信息学分析金铁锁糖基转移酶ptt1的克隆与生物信息学分析黄芩葡萄糖醛酸水解酶基因的克隆、生物信息学分析及表达蓖麻油体固醇蛋白质的鉴定与生物信息学分析结核分枝杆菌38kDa蛋白结构与功能的生物信息学分析新疆细粒棘球绦虫egagB8/3蛋白的生物信息学分析及意义棉铃虫的巧防技术太子参分解代谢关键酶8′羟化酶基因的克隆及生物信息学分析红白忍冬SaBatH甲基转移酶基因克隆及其生物信息学分析希金斯炭疽菌腺苷酸环化酶生物信息学分析丹参类贝壳杉烯氧化酶（SmKoL）基因全长克隆及其生物信息学分析唇形科植物脚6基脚6基焦磷酸合酶编码基因及其氨基酸序列的生物信息学分析人aLK－1近端启动子的生物信息学分析酵母转录因子结合位点保守性的生物信息学分析玉米谷胱甘肽过氧化物酶的生物信息学分析欧文氏杆菌铁代谢相关基因的生物信息学分析常见问题解答当前所在位置：l）分析棉铃虫类胰蛋白酶氨基酸序列的理化性质；运用Dnaman软件比对分析氨基酸序列同源性；运用meGa5.0中的Fhylogenetictree方法构建分子系统发育树；运用在线工具protScale（）进行亲、疏水性的分析；运用psort在线工具（）进行蛋白质二级结构的分析预测；运用nCBi数据库中CDD在线工具（http：//ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行功能结构域的分析。
2结果与分析
2.1棉铃虫类胰蛋白酶氨基酸序列理化性质分析
运用protparam在线软件分析棉铃虫7种类胰蛋白酶氨基酸序列理化性质，结果见表1。由表1可知，棉铃虫7种类胰蛋白酶在理论等电点、脂溶指数以及氨基酸组成等方面均表现出相似性。其相对分子质量约为70000，等电点约为5.00，氨基酸数目为253～256，ala、Cys、Gly和thr残基含量较高。7种类胰蛋白酶的不稳定系数均较高，其中类胰蛋白酶Ⅲ的不稳定指数最低，为52.08，表明类胰蛋白酶在棉铃虫细胞内的稳定性较差，推测类胰蛋白酶代谢较为活跃，代谢周转的速度较快。棉铃虫7种类胰蛋白酶的脂溶指数均较低，属于亲水性蛋白质。
2.2棉铃虫类胰蛋白酶氨基酸序列磷酸化位点预测分析
使用netphosk2.0Server在线工具对棉铃虫7种类胰蛋白酶的氨基酸序列分别进行预测Ser、thr与tyr位点处发生磷酸化的概率结果见表2。从表2可见，在氨基酸磷酸化位点中Ser的预测分值最高，表明Ser发生磷酸化的概率最高，并且发现类胰蛋白酶Ⅲ中不具有thr磷酸化位点；只有类胰蛋白酶Ⅴ具有tyr磷酸化位点。以类胰蛋白酶Ⅲ为例进行说明：其氨基酸序列在第83位、243位、246位、247位这4个Ser位点处都有可能发生磷酸化，但第247位Ser发生磷酸化的概率最大，为m3=0.973。
2.3棉铃虫类胰蛋白酶氨基酸序列分子进化树分析
使用meGa5.0中的Fhylogenetictree方法构建分子系统发育树结果见图1。由图1可知，7种类胰蛋白酶分为两个分支，类胰蛋白酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ与Ⅴ处于一个分支，类胰蛋白酶Ⅳ、Ⅲ与Ⅵ处于另一个分支。其中，类胰蛋白酶Ⅰ和类胰蛋白酶Ⅱ进化关系较近，类胰蛋白酶Ⅲ与类胰蛋白酶Ⅵ进化关系较近。
2.4棉铃虫类胰蛋白酶的氨基酸序列分析
1）使用tmHmm2.0在线工具对7种类胰蛋白酶的氨基酸序列跨膜结构进行预测分析，均不存在跨膜结构域。
2）使用protScale工具对7种蛋白酶的亲、疏水性进行分析。7种类胰蛋白酶的总平均亲水性为0.860～0.960，均表现为亲水性。其中，多肽链靠近n末端区域亲水性最强，最低分值为-0.500到-0.600，而C末端区域疏水性最强，最高分值为2.100到2.300。
3）用Dnaman软件比对分析7种类胰蛋白酶的氨基酸序列同源性（图2）。在这7种蛋白酶氨基酸序列中，有较多保守的区域（如图2中深颜色区域所示）。经过分析发现，7种类胰蛋白酶氨基酸序列结构相似，同源性最高为85.71%。7种类胰蛋白酶中均含有高度保守的必需氨基酸残基，参与维持蛋白酶的空间结构及行使催化功能。比如第10、54、70、179、196、207与231位的Cys残基，它们之间能够形成二硫键以稳定蛋白酶的空间结构。第205位的asp残基与228、238位的Gly残基能够与底物形成离子键、氢键，参与类胰蛋白酶对底物的识别与结合。第69位的His残基、114位的asp残基与211位的Ser残基组成了类胰蛋白酶的催化基团，通过电子的传递，与底物分子中的arg和（或）Lys残基羧基端肽键发生亲核反应，实现催化功能（氨基酸残基位置以类胰蛋白酶Ⅲ为准）。
2.5棉铃虫类胰蛋白酶的功能结构域分析
使用nCBi数据库中CDD在线工具对类胰蛋白酶Ⅲ进行功能结构域分析（图3）。结果表明，类胰蛋白酶Ⅲ属于胰蛋白酶超家族，具有该家族特有的功能区域。类胰蛋白酶Ⅲ的16位（ala）与17位（arg）氨基酸残基之间含有一个自剪切位点（Cleavagesite），该位点与酶翻译后的活化及转运有关；69（His）位、114（asp）位、211（Ser）位氨基酸残基构成酶的催化位点（activesite）；205（asp）位、228（Gly）位、238（Gly）位氨基酸残基形成3个底物结合位点（Substratebindingsites），参与酶对底物的识别与结合，其他类胰蛋白酶的分析也得到相似的结果。
2.6棉铃虫类胰蛋白酶的亚细胞定位分析
亚细胞定位预测结果见表3。由表3可以看出，类胰蛋白酶Ⅰ、Ⅱ主要位于内质网中，类胰蛋白酶Ⅲ主要位于内质网、液泡及细胞外基质中，而类胰白酶Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ与Ⅶ主要位于细胞外基质中。亚细胞定位的多样性体现了类胰蛋白酶在棉铃虫生命活动过程中具有多样性的生物学功能，其中类胰白酶Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ与Ⅶ主要发挥消化作用，因为棉铃虫对食物的消化场所主要位于中肠（细胞外）。而类胰蛋白酶Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ可能主要行使免疫保护作用，参与棉铃虫对外界环境的免疫应答。
2.7棉铃虫类胰蛋白酶的二级结构分析预测
利用npSa在线工具预测类胰蛋白酶的二级结构（表4）。由表4可知，无规卷曲是该类胰蛋白酶整体结构中的主要组成结构元件，β转角出现概率相对较小。α螺旋主要分布于氨基酸序列两侧，而无规卷曲、延伸链则主要分布在多肽链中间区段。
3小结与讨论
本研究以棉铃虫肠道内7种类胰蛋白酶为研究对象，运用在线工具对其进行生物信息学分析。结果表明，7种类胰蛋白酶理化性质较为相似，为亲水性蛋白酶。Ser是类胰蛋白酶序列中磷酸化概率最大的氨基酸残基。分子系统发育树结果显示类胰蛋白酶Ⅲ与类胰蛋白酶Ⅵ进化关系较近，而类胰蛋白酶i和类胰蛋白酶Ⅱ在进化关系上更为接近。类胰蛋白酶不存在跨膜结构域，属于基质类蛋白，这与其亲水性的特点吻合。功能结构域分析发现类胰蛋白酶属于胰蛋白酶超家族，其氨基酸序列中含有自切割位点、若干催化残基与结合残基。类胰蛋白酶的亚细胞定位具有多样性，主要分布在细胞外与内质网中，这体现了类胰蛋白酶在棉铃虫生命活动过程中具有多样性的生物学功能。二级结构分析预测表明无规卷曲在该类胰蛋白酶整体结构中所占比例最大，是其主要的结构元件。氨基酸序列同源性分析，7种类胰蛋白酶氨基酸序列的同源性较高，达到了85.71%，并且含有高度保守的必需残基，参与维持蛋白酶的空间结构及行使催化功能，包括维持高级结构的Cys残基，形成底物结合口袋的结合残基及参与催化作用的催化残基。依据此研究结果，能够设计出与类胰蛋白酶活性中心特异性结合的抑制剂，抑制其活性，从而扰乱棉铃虫的正常消化，实现抗虫目的。
参考文献：
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生物信息学分析篇3
文献标识码：a
文章编号：1007-7847（2015）02-0119-05Bioinformaticanalysisoftata-bindingproteinofZebrafishYanGShao-bin，FenGJing-wen，ZHaowen-cheng，wanGZhao-song，XUShi-lei*（tianjinmedicalUniversityCancerinstituteandHospital，nationalClinicalResearchCenterforCancer，tianjinKeyLaboratoryofCancerpreventionandtherapy，tianjin300060，China）abstract：tata-bindingprotein（tBp）isimportantintheprocessoftranscriptioninitiationinzebrafish.Bymeansofbioinformaticmethods，tBpofzebrafishisillustratedandanalyzedbyphysicochemicalproperty，sequencehomologyamongdifferentspecies，conserveddomains，transmembranestructures，hydrophilicity/hydrophobicity，proteinsecondarystructure，proteintertiarystructure，aswellasprotein-proteininteractions.theresultsshowedthatzebrafishtBpconsistsof302aminoacids，withisoelectricpointof9.8.thisproteinbelongstothetBpsuperfamilywithouttransmembranestructure，anditisahydrophilicprotein.thesecondarystructureanalysisshowedthatitcontained5a.helicesand8f3sheetsandrandomcoilwasthemajorstructureelement.thereliabilityofpredictedthree-dimensionalstructureofzebrafishtBpwasupto98.9%.Furtheranalysisprovedthatthepredictedproteinstructurewasstable.itshowedthatthe10mostrelevantinteractionproteinswiththezebrafishtBpwerealltranscriptionfactorsortFiiDcomplexmembers.therefore，theresultsprovidedgreatinformationaboutzebrafishtBpintranscriptionregulationforfurtherresearch.Keywords：zebrafish；tata-bindingprotein；bioinformatics（LifeScienceResearch，2015，19（2）：119?123）
tata结合蛋白（tata-bindingprotein，tBp）址一种特异性结合Dna序列上tata框的转录因子。tata序列存在于真核细胞基因启动子中转录起始位点上游30个bp左右[1]。tBp与其他一些tBp相关蛋白共同组成厂tFⅡD复合物，tFⅡD是一种常见的转录因子，它是Rna聚合酶Ⅱ起始复合体的组成部分。tBp能够帮助Rna聚合酶Ⅱ跨过转录起始位点。tBp在Dna双链解链（doublestrandseparation）的过程中也起到一定的作用，这是通过其能够使Dna弯曲80°来实现[2-4]。tBp的另一个特点是含有一长串谷氨酰胺氨基酸残基。这个区域调节tBp的C端和Dna的结合能力、转录复合体形成的比率以及转录的起始。斑马鱼属于鲤科，鲤目。由于再生能力强的特性，斑马鱼经常被当作研究脊椎动物的生物模型[5]。分析研究斑马鱼tBp有助于更好地理解斑马鱼基因转录过程。到目前为止，对斑马鱼tBp的生物学研究已经有一定的进展，但是对其生物信息学分析还未见报道。为此，本研究采用生物信息学方法，对斑马鱼tBp的理化性质、保守结构域、跨膜区、亲水性/疏水性、二级结构、三级结构、与其他物种亲缘关系等进行预测和分析，为其后续研究奠定全面的理论基础。1材料与方法1.1材料数据资料来源于Uniprot网站已经注册的tBp氨基酸序列。其中tBp：斑马鱼zebrafish（Q7SXL3）、非洲爪蛙Xenopuslaevis（p27633）、小鼠mouse（p29037）、牛Bostaurus（Q2HJ52）、人Human（p20226）。1.2方法利用protparam分析蛋白质理化性质；蛋白序列同源性、多序列比对及序列系统进化树分别由nCBiproteinblast.ClustalX2.0、njplot等软件实现；利用tmHmm、protScale分析蛋白质的跨膜区和疏水性；nCBiConservedDomains数据库用来分析保守区域；Jpred、Swiss-model和StructuralanalysisandVerificationServer分别预测蛋白质二级、三级结构及其合理性。String则用来预测蛋白质的相互作用。各软件、数据库的相关信息如表1。2结果与分析2.1斑马鱼tBp的理化性质预测和分析使用protparam蛋白质理化性质预测网站对5种tBp进行理化性质预测，得到结果如表2。结果显示，tBp基因在5个不同物种中编码的氨基酸个数在297～339之间；相对分子质量在32702.8～37698.1之间；各物种tBp等电点差异其微，均在9.8附近，说明tBp是碱性蛋白质；tBp在5个物种中的半衰期均达到了30h；5种蛋白的不稳定系数均大于40，表明它们不是稳定蛋白；各tBp的脂肪族系数在76.58～88.65之间；5种蛋白的平均疏水性均为负值，表明它们都是亲水蛋白质。2.2斑马鱼tBp的同源性预测和分析
使用proteinBlast软件对斑马鱼tBp进行同源性分析，数据显示，非洲爪蛙、小鼠、牛、人tBp与斑马鱼tBp进行比较时，比对序列覆盖范围（Querycover）分别是100%、100%、100%、75%；在此基础上的序列相似性（identity）分别为88%、86%、85%、93%，；利用ClustalX2.1程序对斑马鱼tBp与非洲爪蛙、小鼠、牛、人tBp序列进行多重比对，发现各物种问多聚谷氨酰胺区如图1。结果显示，由低等物种到高等物种，tBp多聚谷氨酰胺区谷氨酰胺氨基酸残基数量在进化过程中不断增加，推测谷氨酰胺区的长度与tBp的转录调节能力呈正相关。
生物信息学分析篇4
【摘要】目的：分析肉毒毒素e型重链（Bont/eHC）的抗原表位及空间结构。方法：利用在线生物信息学分析工具以及其它分析软件分析重链蛋白的抗原表位和空间结构。结果：预测并显示了肉毒毒素e型重链的空间结构图，以及9个可能的重链的B细胞抗原表位，静电势图揭示了重链分子结构域的两性特点。结论：抗原表位的预测对于e型肉毒毒素相关诊疗试剂的开发有指导意义，而结构域的极性分析提示其等电点的不同可能在pH介导的穿膜中起了作用。
【关键词】肉毒毒素类；抗原；表位，B淋巴细胞；氨基酸序列；基因重排，B淋巴细胞，重链
BioinformaticanalysisofBotulinumneurotoxin
［abstract］objective:toanalyzebotulinumneurotoxintypeeheavychain(Bont/eHC)antigenepitopesanditsspatialstructure.methods:onlinebioinformaticanalysistoolsandsomeotheranalysissoftwareswereused.Results:tertiarystructureofBont/eHCchainwasanticipatedanddemonstrated.ninepossibleantigenepitopesoftheHCwerepredicted，andelectricalpotentialmaprevealedtheamphotericdomainsoftheHC.Conclusions:thepredictingofantigenepitopesisofimportancetotheexploitingofBont/erelatedagents，anddomainanalysissuggestsdomain′spiisimportanttopHmediatedmembrane-passing.
［Keywords］botulinumtoxins;antigens;epitopes，B-lymphocyte;aminoacidsequence;generearrangement，B-lymphocyte，heavychain
肉毒毒素是肉毒梭菌分泌的外毒素，具有抑制外周神经末梢释放胆碱神经递质，麻痹肌肉的毒性作用，微克量级的毒素可致成人死亡，它被认为是已知的毒性最强的物质。肉毒毒素根据血清型分为a、B、C、D、e、F和G7个类型，对人类常见的致病血清型主要是a、B和e型。对于肉毒毒素的结晶和结构分析的相关研究主要集中在a、B两型，而且各型抗原性差别主要在于重链，尤其是受体结合结构域。2007-2008年，利用生物信息学技术，对e型重链的三级结构以及抗原表位进行了分析，判定其潜在的抗原表位，为e型肉毒毒素相关的诊疗试剂的开发提供理论依据。同时，在肉毒毒素中毒机理的相关研究中，分析了Bont/eHC（heavychain）的不同结构域的等电点，绘制出三维的静电势图像，显示了组成HC的2个结构域的酸碱双极性，提示在pH诱导的穿膜机制中，这种不同亚基的等电点和静电势的差异是重要的分子理化基础。
1材料与方法
1.1Bont/eHC蛋白的氨基酸序列及结构分析
从nCBi网站GenBank获取全长Bont/e型肉毒毒素的氨基酸序列（GenBankaccessionnumberCaa44558）［1］。第一位m翻译后被切去，其全长共1251个aa，近前1/3位置处的G419-R421三肽被蛋白酶切去后，单链蛋白分为轻重2条肽链，其中重链编码830个氨基酸（K422~K1251），轻链编码418个氨基酸（p1~K418）［2］。轻链和重链通过二硫键而连接在一起。重链的氨基酸序列如图1所示。
1.2Bont/eHC的基本理化性质
使用anthewin软件分析Bont/eHC全长，以及2个各约50kD的结构域，即重链n末端的跨膜转运结构域Hn(K1~Y408)和重链C末端的神经细胞特异性结合结构域HC(t409~K830)的等电点。
1.3Bont/eHC的抗原表位预测
使用anthewin软件系统分析，采用其中的GoR算法，预测二级结构，寻找转角易形成区域；采用Hopp&woods算法，进行亲水性预测，预测蛋白质中的亲水区域；采用Boger&al.算法，进行可及性预测，预测蛋白质中的溶剂可及性区域；采用parker方案，进行抗原性指数分析，分析抗原性。对各个参数的结果进行综合分析，最后确定B细胞表位的可能位点［3］。
1.4Bont/eHC的空间结构预测
利用在线的SwiSS-moDeL软件进行3级结构的同源建模，预测蛋白质的空间构象，并通过Vectorntisuite软件显示蛋白质的3D结构图，并将Bont/eHC的抗原表位标记在三维结构图上［4］。利用Swiss-pdbViewer3.7计算Bont/eHC的静电势并显示三维图像。
2结果
2.1Bont/eHC的一般理化性质分析
利用anthewin软件对Bont/eHC和其Hn结构域和HC结构域进行理化性质分析。HC全长分子量为95.7kD，等电点为5.175。Hn结构域的等电点为4.365，HC结构域的等电点为9.145。
2.2Bont/eHC的B细胞抗原表位的预测
本研究从4个方面对Bont/eHC的抗原表位进行预测，即二级结构中形成转角的可能性、亲水性、可及性和抗原性。anthewin软件的具体分析结果见图2和表1。
综合不同的预测方法，发现其共有序列为：18-32、78-83、193-199、274-279、433-441、521-526、574-579、675-682、801-811，即为预测的可能的B细胞抗原表位。其中18-32、78-83、193-199、274-2794个表位位于Hn结构域，433-441、521-526、574-579、675-682、801-8115个表位位于HC结构域。
2.3重链的三维结构图以及预测的线性表位的位置表1Bont/eHC的B细胞抗原表位分析氨基酸序列与蛋白结构数据库中的蛋白质3级结构进行匹配，将结果在vectorntisuite软件中打开，观察Bont/eHC的三维结构和结构域组成。如图2所示，Bont/eHC分子含有2个结构域，分别为Hn跨膜转运结构域和HC神经细胞特异性结合结构域，前者含有2个α螺旋和1个loop结构，后者包含2个亚结构域。
利用vectorntisuite软件将预测的抗原表位标记在结构图中，观察表位所处的空间位置，验证预测的抗原表位的可行性。如图3、图4所示，分析结果为所预测的抗原表位均位于Bont/eHC的蛋白质分子表面，其中Hn结构域中的274-279表位可能会受到loop结构的空间位阻的影响，HC结构域中的574-579表位可能会受到α螺旋的部分影响，其余的7个抗原表位均有较好的空间可及性。注：左侧为HC神经细胞特异性结合结构域，右侧为Hn跨膜转运结构域的2个α螺旋和loop结构，箭头所示为抗原表位的位置
2.4Bont/eHC的静电势
将SwiSS-moDeL的3级结构预测结果在Swiss-pdbViewer中打开，计算静电势并图像显示。如图5所示，该蛋白的Hn结构域的电负性很强，而HC结构域的电正性很强，这与该蛋白质做理化分析时发现的这2个结构域的等电点分别为4.385和9.165相一致。注：图中红色表示电负性，蓝色表示电正性。可见Hn结构域的2个α螺旋和loop为电负性，HC结构域为电正性
3讨论
通过nCBi的GenBank中找到Bont/e全长的氨基酸序列，其中K422~K1251共830个氨基酸为毒素重链，重链HC可以划分为Hn跨膜转运结构域和HC神经细胞特异性结合结构域。
虽然对Bont的a型、B型的全长结晶结构研究较多，但e型仅有对其轻链的结晶结构研究报告。本文利用在线的SwiSS-moDeL软件预测并绘制了Bont/e重链的空间结构图，三维图像显示其n末端为Hn结构域中套索状的的loop结构，中间区域为Hn结构域中的2个长α螺旋为中心形成的圆柱体，C末端为HC结构域中的2个亚结构域，分别是近n端的lectin-likedomain和受体结合域所在的近C端的β-trefoilfold［5，6］。此三维图像显示的结构与文献中描述的a型和B型肉毒毒素的结构相一致。
利用生物信息学软件anthewin中的2级结构分析、抗原性分析、亲水性分析和可及性分析，综合分析Bont/eHC的抗原表位，共在Hn结构域中找到4个抗原表位18-32、78-83、193-199、274-279，在HC结构域中找到5个抗原表位433-441、521-526、574-579、675-682、801-811。将这9个表位利用vectorntisuite软件标在该蛋白的三维立体结构图中，提示表位272-277可能会受到loop结构的空间位阻的影响，表位572-577可能会受到α螺旋的位阻影响，其余的7个抗原表位均有较好的空间可及性，从而验证了抗原表位的可行性，并为合成抗原肽、制备该蛋白的特异性抗体、开发疫苗和检验试剂提供了理论依据。通过肉毒毒素a、B和e3型间的序列比较，分析所得的抗原表位序列的保守性，可以发现78-83、274-279、675-682、801-811的保守性差，可以考虑用作肉毒毒素的型间鉴别。另一方面，通过对这些潜在的抗原位点进行改造，获得低免疫原性的毒素分子，有望解决肉毒毒素在美容抗皱治疗中出现的耐受现象。刘艳华等［7］对e型肉毒毒素重链的抗原表位也做了预测，比较发现与本文预测的274-279、433-441、675-6823个位点与其相同，其他位点均不同，可能与不同的预测方法有关，实际的可行位点还需通过免疫实验进一步验证。
由于肉毒毒素分子亚基的相对独立性和划分的相对明确性的特点，使得我们可以将亚基作为独立的多肽链进行分析。Bont/e重链的Hn、HC的理化性质显示，Hn的pi为4.385，HC的pi为9.165。利用Swiss-pdbViewer软件，计算并显示Bont/eHC的三维结构静电势图，显示Hn结构域有较强的电负性，HC结构域有较强的电正性，这与结构域的等电点预测相一致。众所周知，肉毒毒素可以结合胆碱能神经元末稍，并使其轻链进入胞浆，抑制神经递质囊泡的释放。具体机制的探讨中发现，被吞入内体中的毒素分子在酸性环境中，重链Hn跨膜转运结构域可以穿入内体脂双层膜，形成跨膜通道，并将轻链送入胞浆，而Hn的具体穿膜机制尚不清楚［8，9］。本文对Bont/e分子的不同结构域的等电点分析以及静电势分析中，可以给出以下推测，肉毒毒素通过肠道入血液后，在pH约7.4的中性环境中，Hn和HC结构域分别带较强的负电荷和正电荷，表现为较强的极性，有较好的水溶性，当毒素和神经细胞受体结合并被吞入内体中，进入pH约5的酸性环境中，从而使HC端的极性增强而Hn端的极性减弱，进而有利于Hn的穿膜，至于HC端的极性增强对毒素和受体分子亲和力的影响尚不确定。
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生物信息学分析篇5
关键词：谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase，GpX）；玉米（Zeamays）；生物信息学
中图分类号：Q554+6文献标识码：a文章编号：0439-8114（2013）11-2675-05
1方法
1.1数据来源
数据资料来源于植物基因组数据库（phytozome，http：//）和过氧化物酶数据库（peroxiBase，http：//peroxibase.toulouse.inra.fr/），从中获得ZmGpXs的基因序列和氨基酸序列。
1.2方法
利用Dnaman软件对所获得的氨基酸序列进行序列比对和理化性质分析，其保守结构域、磷酸化修饰、跨膜结构域、亚细胞定位和高级结构分别采用nCBiproteinblast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）、netphos2.0Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/netphos/）、tmHmm2.0Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/tmHmm-2.0）、pSoRt（http：//psort.hgc.jp/form.html）和SwiSS-moDeL（http：///）在线工具分析，利用meGa5.0进行系统进化树分析。
2结果与分析
2.1ZmGpXs检索分析结果
经过检索，在植物基因组数据库（phytozome）中共获得7个编码玉米GpXs的基因序列（ZmGpXs），注册号分别为Zm2G011025、Zm2G013299、Zm2G12479、Zm2G135893、Zm2G144153、Zm2G329144和Zm5G884600。在过氧化物酶数据库（peroxiBase）中也获得了7个ZmGpXs序列，其名称分别为ZmGpX01、ZmGpX02、ZmGpX03、ZmGpX04、ZmGpX01-2、ZmGpX01-3和ZmGpX03-2。采用Dnaman软件和nCBiproteinblast对来源于2个数据库中的玉米GpXs序列进行比对分析，结果表明，在基因组数据库所获得的ZmGpXs序列中的Zm2G144153、Zm2G329144、Zm2G135893、Zm2G12479和Zm2G013299等5个序列编码的氨基酸序列分别与peroxiBase中的ZmGpX01、ZmGpX02、ZmGpX03、ZmGpX04和ZmGpX03-2同源性达到100%，Zm2G013299与ZmGpX01-3同源性为98%，Zm5G884600与ZmGpX01-2同源性为95%。Zm2G011025没有获得较高的同源性分析结果。根据上述比对分析结果，玉米基因组中推测的7个编码ZmGpXs的序列中有6个可以确定，参考peroxiBase的命名，分别为ZmGpX01、ZmGpX02、ZmGpX03、ZmGpX04、ZmGpX03-2和ZmGpX01-2，另外1个（Zm2G011025）尚不能确定。
2.2ZmGpXs的理化性质
对经过比对分析确定的6个ZmGpXs氨基酸序列进行理化性质分析，结果见表1。由表1可知，6个ZmGpXs中氨基酸数量最少为166，最多为246；分子量最小是18.347ku，最大为26.811ku。ZmGpXs的等电点（pi）介于7.04～10.06之间，其中ZmGpX04的等电点为10.06。用tmHmm2.0Server在线软件分别对6个ZmGpXs的氨基酸序列进行分析，所有肽链跨膜结构域的可能性均为0，说明ZmGpXs序列不存在跨膜结构，不是跨膜蛋白。
2.3ZmGpXs磷酸化修饰位点与亚细胞定位预测
用netphos2.0Server分别对6个ZmGpXs的氨基酸序列进行潜在磷酸化位点分析，比较6个ZmGpXs所具有的潜在磷酸化位点总数，可见ZmGpX03的磷酸化位点数最高，为18，其次为ZmGpX01和ZmGpX01-2，分别为15和14，而ZmGpX02具有的磷酸化位点数最少，为7。
GpXs功能的发挥与其亚细胞定位有关，使用pSoRt在线工具对6个ZmGpXs进行亚细胞定位预测分析。结果显示，6个ZmGpXs主要定位于细胞质、线粒体、叶绿体和过氧化物酶体中，除ZmGpX03-2外，其他5个ZmGpXs皆分布于线粒体中；ZmGpX01、ZmGpX02、ZmGpX03和ZmGpX03-2分布于过氧化物酶体中；而ZmGpX01、ZmGpX04、ZmGpX03-2和ZmGpX01-2分布于叶绿体中；此外ZmGpX02还被定位于质膜上。
2.4ZmGpXs结构域特征
采用nCBiproteinblast对6个ZmGpXs进行保守结构域（Conserveddomains）在线分析，结果见图1。从图1可以看出，尽管6个序列的氨基酸数量不同，但具有相同的特征：都属于硫氧还蛋白超家族（thioredoxin-likesuperfamily）以及谷胱甘肽过氧化物酶，都具有3个催化残基位点和二聚体界面。
利用Dnaman对6个ZmGpXs进行多序列比对分析（图2）。结果显示，6个序列都具有3个保守性较高的结构域：KVLLinVaS、FeiLaFpCnQF和KwnFSKFLVD，皆为GpXs的特征基序；具有3个保守的催化残基，即C、Q和w。因此6个序列都属于GpXs家族成员。此外，6个序列都具有3个半胱氨酸残基（C），该位点在动物的pHGpXs中为硒代半胱氨酸残基。
2.5ZmGpXs的外显子和内含子构成
利用植物基因组数据库对编码ZmGpXs的基因序列oRF（openreadingframe）的外显子和内含子的构成进行分析。结果显示ZmGpXs的oRF区均由6个外显子和5个内含子构成，内含子的剪切位点符合真核生物Gt-aG规则，外显子的长度具有高度保守性，内含子的长度差异较大。每个基因的第2个至第5个外显子的长度分别是77bp、62bp左右、119bp、168bp左右。第1个外显子长度差异较大，ZmGpX03和ZmGpX04第1个外显子的长度大于200bp，其他序列的第1个外显子的长度介于39～54bp之间。除ZmGpX01的第6个外显子长度为89bp外，其他5个ZmGpXs的第6个外显子的长度介于30～36bp之间。将ZmGpXs序列的3个保守结构域（即GpXs特征基序）与基因序列比对分析，显示3个保守结构域（KVLLinVaS、FeiLaFpCnQF和KwnFSKFLVD）分别对应在第2和3个、第4个、第5个外显子上，并且位置相对保守（图3）。
2.6系统进化树分析
利用meGa5.0构建ZmGpXs家族的氨基酸序列系统进化树（图4）以及ZmGpXs家族与atGpXs家族的氨基酸序列系统进化树（图5）。图4显示6个ZmGpXs可聚分为两类，一类包括4个（ZmGpX01、ZmGpX01-2、ZmGpX02和ZmGpX03-2），另一类包括2个（ZmGpX03和ZmGpX04）。
比较6个ZmGpXs和8个atGpXs在进化上的关系，除了atGpX4与ZmGpX02、atGpX6与ZmGpX04同源性较高外，总体上ZmGpXs与atGpXs的同源性较低。
2.7高级结构预测
同一段氨基酸序列因为具有不同的高级折叠结构而具有不同的生物功能，因此预测基因的蛋白质高级结构对于研究基因的功能有重要的意义。利用SwiSS-moDeL对ZmGpXs的高级结构进行预测，如图6所示。结合图6以及表2中的统计结果可以看出，除ZmGpX02为单体形式（5个α-螺旋、6个β-折叠片与一些转角和无规则卷曲相互连接而形成）外，其他5个ZmGpXs的三维结构均为二聚体结构，基本由12个α-螺旋、8～12个β-折叠片与一些转角和无规则卷曲相互连接而形成，此外，ZmGpX02的折叠结构与其他ZmGpXs的二聚体中单体的折叠结构也存在明显差异。说明两种结构类型的ZmGpXs发挥功能的方式可能不同。
3小结与讨论
根据两个数据库的比对分析，获得了编码ZmGpXs的6个基因序列，分别位于2号和5号染色体上，其蛋白质分子量为18.347～26.811ku，均不存在跨膜结构域。ZmGpX03、ZmGpX01和ZmGpX01-2的磷酸化位点较多。一般来说，多肽链中的氨基酸潜在的磷酸化位点越多，发挥更多功能的可能性就越大。
对ZmGpXs进行亚细胞定位预测的结果表明，6个ZmGpXs主要定位于线粒体、叶绿体、过氧化物酶体和细胞质中，其中ZmGpX04和ZmGpX01-2均在线粒体和叶绿体中分布，ZmGpX01、ZmGpX03和ZmGpX03-2在线粒体、叶绿体和过氧化物酶体上均有分布。蛋白质的亚细胞定位与其功能相关，上述亚细胞定位预测分析结果提示GpXs发挥作用的位点与产生活性氧的部位有关。
对ZmGpXs结构域的分析结果显示，6个ZmGpXs均具有3个催化残基和二聚体界面。ZmGpX03和ZmGpX04与其他4个ZmGpXs相比多约70个氨基酸，但是催化残基和二聚体界面距离C端较近，说明GpXs功能发挥的位点靠近C端，而n端序列可能主要与蛋白质的亚细胞定位有关。
GpXs的3个标志性基序（KVLLinVaS、FeiLaFpCnQF和KwnFSKFLVD）在6个ZmGpXs中高度保守，且这些特征基序在拟南芥atGpXs中也具有较高的保守性，说明在植物进化过程中，GpXs的特征基序在其执行功能时发挥着重要的作用，保守性很强。
ZmGpXs基因序列具有6个外显子和5个内含子，其中保守结构域所对应的外显子（第2～5个）长度保守性较强，第1个和第6个外显子长度变化较大，内含子的长度差异明显，这种特点也体现在8个atGpXs中。编码GpXs的基因序列在不同物种的基因组中高度保守，原因可能是保守的外显子序列是植物GpXs行使功能必需的序列。差异外显子序列主要表现在第1个和第6个外显子，可能与行使其特有功能有关。内含子的差异可能是不同基因存在的不同调控机制，同时也体现了进化变异的特点。
虽然结构域分析显示6个ZmGpXs都具有二聚体界面，但是ZmGpXs编码的蛋白质高级结构预测结果显示6个ZmGpXs在作用形式上分为两类，一类以单体形式存在（ZmGpX02），一类以二聚体形式存在，说明ZmGpXs可能以二聚体形式发挥功能，也可能以单体的形式发挥作用。
从进化关系上看，ZmGpXs与atGpXs的同源性较低。但是ZmGpXs与atGpXs在结构域上的高度保守性提示植物GpXs进化过程中保留了其基本的催化功能，而ZmGpXs与atGpXs在序列与结构上的差异显示在不同植物物种中GpXs具有一定的差异。
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生物信息学分析篇6
关键词：小菜蛾；p38基因；mapK；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；生物信息学分析
中图分类号：Q785：Q969.42+5.2文献标识号：a文章编号：1001-4942（2013）08-0015-04
小菜蛾（plutellaxylostellaL）属鳞翅目（Lepidoptera）菜蛾科（plutellidae），其分布范围广，繁殖能力强，主要取食十字花科植物，严重危害蔬菜生产[1，2]。由于小菜蛾的抗药性发展十分迅速，因此，寻找新的防治方法已经变得十分迫切[3，4]。为了更好地实现小菜蛾的防治，需要更多地了解小菜蛾的基因尤其是耐药基因及响应外界刺激相关基因的生物学功能[5～7]。2012年福建农林大学的尤民生教授等[7]领导的国际合作小组第一次完成了小菜蛾的全基因组序列图谱的绘制，这为小菜蛾基因功能的研究以及发展新的防治手段揭开了新的篇章，具有重要意义。本研究就是在小菜蛾全基因组测序的基础上完成的。
蛋白质在细胞内发挥生物学功能经常需要磷酸化和去磷酸化修饰，细胞中具有磷酸化修饰功能的酶是蛋白激酶[8]。mapK（mitogen-activatedproteinkinase）是一类典型的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，在真菌、植物和动物等各种真核生物细胞内保守存在。它可以通过三层蛋白激酶级联系统，响应外界环境各种胁迫刺激，起始细胞内多种信号传导途径，具有重要的生物学功能[9，10]。人类细胞中的mapK包括p38、erk1、erk2和JnK等[11，12]。
本研究克隆了小菜蛾的pxp38基因，根据其基因序列推导出蛋白质一级结构，分析预测了该蛋白质的结构域，并研究了该基因与家蚕Bmp38基因、酿酒酵母ScHoG1基因、人类Homosapiensp38基因之间的同源性，为下一步深入研究pxp38基因的功能奠定了基础。
1材料与方法11供试昆虫
本实验所用小菜蛾为天津市植物保护研究所室内饲养的敏感种群，用无虫甘蓝苗继代饲养20代以上，取四龄幼虫供试。
1.2主要试剂
trizol和SuperScriptcDna合成试剂盒购自invitrogen公司；taq酶、dntps、pmD18-t载体和ecoliDH5α感受态细胞购自taKaRa公司；限制性内切酶ecoRⅠ和HindⅢ购自neB公司；Dna纯化回收试剂盒、琼脂糖、蛋白胨、氨苄青霉素、X-gal、iptG、DepC和质粒小提试剂盒等购自北京天根生化科技公司。
1.3引物设计
根据小菜蛾基因组数据库DBm-DB（DiamondbackmothGenomeDatabase）[7]提供的px015291基因序列，在其开放阅读框（oRF）两侧各设计一条引物，由invitrogen公司合成。上游引物pxp38-F：5′-atGCCGaGGtatCaCaaaGtGG-3′，下游引物pxp38-R：5′-CtaCCtataGttCGGGGtCG-3′。
1.4小菜蛾总Rna的提取、cDna第一链合成和pCR条件
取小菜蛾幼虫100mg，液氮冷冻研磨后，用trizol法提取小菜蛾总Rna，具体步骤参照invitrogen公司的trizol试剂说明书，最后溶解于30μlDepC水中，1%琼脂糖凝胶电泳检测总Rna的完整性，将其直接用于Rt-pCR或-80℃保存。
取1μg总Rna，参照invitrogen公司的SuperScriptcDna合成试剂盒说明书，以oligo（dt）18作为逆转录引物合成cDna第一链。逆转录反应设置实验组和对照组，实验组加逆转录酶，对照组不加逆转录酶。
以实验组和对照组逆转录产物为模板，使用引物pxp38-F和pxp38-R进行pCR反应，反应条件为：94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。pCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统拍照。
1.5重组质粒pmD18t-pxp38oRF的构建与鉴定
将上述pCR产物经Dna纯化回收试剂盒回收，取100ng与25ngpmD18-t载体16℃下连接4h。将连接产物转化ecoliDH5α感受态细胞，在LB+amp平板上通过蓝白斑筛选转化子，挑取3个白斑转化子接种到液体LB+amp培养基中扩大培养。使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，利用限制性内切酶ecoRⅠ和HindⅢ对其进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统下拍照。
1.6生物信息学分析
利用Chromas软件分析Dna测序结果；通过Vectornti软件根据p38oRF序列推导蛋白质一级结构；通过SmaRt网站（http：//smartembl-heidelbergde/）分析预测小菜蛾pxp38蛋白结构域；利用Blast软件比较不同物种间p38蛋白一级结构的同源性；小菜蛾基因组数据库DBm-DB的网址是http：//wwwiaefafueducn/dbm/。
2结果与分析
2.1pxp38基因oRF的获得
利用引物pxp38-F和pxp38-R克隆pxp38基因的oRF片段，结果如图1所示，实验组得到了大小约1kb的单一Dna条带，对照组只得到了非特异性杂带，说明成功获得了pxp38基因的oRF片段。
3讨论本研究首次克隆了小菜蛾的pxp38mapK基因，并对其进行了生物信息学分析，揭示出pxp38基因是一个潜在的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，从最简单的真核模式生物酿酒酵母到高等哺乳动物人类的细胞中都保守存在。本研究为进一步深入探讨pxp38mapK基因的功能，揭示小菜蛾响应外界胁迫以及产生药物耐受的分子机制提供了基础，为开辟小菜蛾防治新途径提供参考。
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生物信息学分析篇7
[关键词]太子参；脱落酸；降解；aBa8′羟化酶；表达分析
[abstract]abscisicacid8′-hydroxylasewasoneofkeyenzymesgenesinthemetabolismofabscisicacid（aBa）.Sevenmenbersofabscisicacid8′-hydroxylasewereidentifiedfrompseudostellariaheterophyllatranscriptomesequencingresultsbyusingsequencehomology.theexpressionprofilesofthesegeneswereanalyzedbytranscriptomedata.thecodingsequenceofaBa8ox1wasclonedandanalyzedbyinformationaltechnology.thefull-lengthcDnaofaBa8ox1was1401bp，with480encodedaminoacids.thepredicatedisoelectricpoint（pi）andrelativemolecularmass（mw）were8.55and53kDa，respectively.transmembranestructureanalysisshowedthattherewere21aminoacidsin-sideand445aminoacidsout-side.Highleveloftranscriptscandetectinbarkofrootandfibrousroot.multi-alignmentandphylogeneticanalysisbothshowthataBa8ox1hadahighsimilaritywiththeCYp707asfromotherplants，especiallywithatCYp707a1andatCYp707a3inarabidopsisthaliana.theseresultslayafoundationformolecularmechanismoftuberousrootexpandingandresponsetoadversitystress.
[Keywords]pseudostellariaeRadix；abscisicacid；degradation；abscisicacid8′-hydroxylase；expressionanalysis
doi：10.4268/cjcmm20161305
自然界中许多植物具有膨大的根茎器官，在对不同环境的适应过程中具有重要作用[1]。地黄[2]、麦冬[3]等地下膨大部分为块根，由不定根或侧根膨大形成；马铃薯[4]地下膨大部分为根茎，由匍匐茎顶端膨大形成。植物的生长发育及形态建成受到植物内源激素系统的调控，通过控制不同激素的比例及水平来影响地上部茎叶及地下部根系的发育过程[5-6]。研究表明，植物激素在植物块根（块茎）的发育过程中具有重要作用。细胞分裂素（cytokinin，CtK）[7]、生长素（indole-3-aceticacid，iaa）[8]、乙烯（ethylene）[9]、脱落酸aBa[10]等激素先后被证明能促进植物块根（块茎）的膨大，而赤霉素（Ga）[11]能抑制块根（块茎）的膨大。
脱落酸aBa含量随块根的发育进程呈逐渐上升趋势，可能同时具有促进和抑制作用，影响因素主要取决于aBa的浓度，作用部位与周围环境的相互作用[12]。较高浓度的aBa有利于甘薯、地黄等植物块根的膨大[13-14]。aBa能提高块根中淀粉合成酶的活性，增加淀粉合成，从而增加对蔗糖的需求[15]，调节中酸性磷酸化酶的活性促进蔗糖的吸收和卸载[16]，调节atp酶的活性促进蔗糖的吸收和卸载，进而促进块根中可溶性碳水化合物的积累[17]。
脱落酸（aBa）的生物合成主要由C15直接途径及C40间接途径完成，其分解代谢以aBa8′羟化酶为起始关键酶。植物中脱落酸（aBa）的含量依赖于其合成途径及分解代谢路径共同作用，而且激素水平受到反馈调控机制的影响[18]。王鹏飞等[2]证实了aBa8′羟化酶在aBa大量合成时被激活，在aBa生物合成减弱时被抑制，对aBa的激素水平调控具有重要作用。
太子参pseudostellariaeRadix为传统中药，块根主要含有多糖、环肽、皂苷类化学成分，现代药理研究认为具有抗应激、抗疲劳以及增强免疫力的作用[19]，在临床上得到很好应用。现今，太子参药材以人工栽培为主，在生产种植中块根能否正常膨大发育直接决定药材的品质和产量[20]。袁婧等[21]探索了太子参块根发育的规律，发现块根在生长过程中先膨大后伸长，最后在生长105d时获得最大生物量。但是，在太子参块根细胞中激素（尤其是aBa）的积累及调控的分子机制尚未见报道。为了解析脱落酸（aBa）在太子参块根膨大过程中的作用机制，本研究采用生物信息学的方法从太子参转录组数据库中鉴定aBa8′羟化酶家族成员，分析其在太子参不同组织中的表达模式，以期寻找脱落酸分解代谢的关键基因。
1材料
1.1样品供试材料采自贵州施秉种质圃，鉴定人为贵阳中医学院江维克教授。采集太子参的茎、叶、块根、须根，将块根分为皮部和木质部，分别用液氮处理后置-80℃冰箱中保存，备用。
1.2试剂基因克隆所需taqDna聚合酶、质粒载体pmD19-t、反转录酶m-mLV、Rnaisoplus试剂盒、DnaseⅠ及DL2000Dnamarker购自大连宝生物工程有限公司。凝胶回收试剂盒购自omega公司，大肠杆菌escherichiacoli菌株DH5α购自上海生工生物工程有限公司。其余试剂为进口或国产分析纯。
2方法
2.1太子参总Rna的提取及cDna第一链的合成取适量太子参新鲜组织置于预冷的研钵中，加液氮迅速研磨成粉末状。参照Rnaisoplus抽提试剂盒说明书提取太子参总Rna后，加50μLDepC水溶解Rna，运用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性、微量核酸测定仪检测其浓度和纯度。以Rna为模板、oligot11（50μmol・L-1）为引物，利用m-mLV反转录酶合成cDna第一链。
2.2脱落酸aBa-8′羟化酶基因的检索及全长的克隆从nCBi数据库中下载模式植物拟南芥、水稻等的aBa-8′羟化酶基因家族成员，通过构建本地Blast的方式，从太子参转录组数据库中获得aBa-8′羟化酶基因，e为1e-30，获得的候选基因经nCBi及pfam[22]数据库比对分析后确定为aBa-8′羟化酶基因。利用转录组数据库对aBa-8′羟化酶基因进行转录分析，筛选在太子参块根表达量较高的基因进行克隆及功能验证。
根据太子参转录组数据库中得到的aBa-8′羟化酶基因全长cDna序列信息，设计全长cDna引物，aBa8ox1-F：5′-atGGtGatCatatttGtaGCtttG-3′，aBa8ox1-R：5′-CtattGaCttttGCtaaataattta-3′，下划线标记为起始密码子与终止密码子。以太子参块根cDna为模板，进行pCR扩增，扩增条件为94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，循环30次；72℃10min。目的片段与taKaRa公司的pmD19-t载体相连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，送到南京金斯瑞公司测序。
2.3脱落酸aBa-8′羟化酶基因的生物信息学分析测序结果经Genetyx软件去除载体序列，与预测基因进行序列比对。使用oRFFinder（http：//ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）查找开放阅读框。采用pfam数据库（http：///）进行结构域的预测分析，利用expaSy数据库（http：///compute_pi/）计算蛋白质的相对分子质量与理论等电点，targetp1.1server（http：//cbs.dtu.dk/services/targetp/）分析亚细胞定位，HmmServerV2.0（http：//cbs.dtu.dk/services/tmHmm/）进行跨膜结构域的分析。
2.4聚类分析本研究从nCBi数据库中分别下载拟南芥arabidopsisthaliana的4个aBa8′羟化酶基因，atCYp707a1（aee84162），atCYp707a2（aeC08210），atCYp707a3（aeD95234），atCYp707a4（aee76215）；水稻oryzasativa的3个aBa8′羟化酶基因，os08g36860（BaF23935），os09g28390（BaF25280），os02g47470（BaF34848）；玉米Zeamays的4个aBa8′羟化酶基因，GRmZm2G065928（aCF78881），GRmZm2G179147（aCn25205），GRmZm2G126505（aCn28537），GRmZm2G002142（aCn34951）；蓖麻Ricinuscommunis的4个aBa8′羟化酶基因，RCom_1407690（eeF38770），RCom_0813450（eeF43689），RCom_0814150（eeF43729），RCom_1590410（eeF52401）；杨树populustrichocarpa的5个aBa8′羟化酶基因，poptR_0004s14820（eee73891），poptR_0009s10450（eee77492），poptR_0004s24360（eee87380），ptCYp707a4（eee87808），ptCYp707a5（eeF08493）；菜豆phaseolusvulgarisL.的3个aBa8′羟化酶基因，pvCYp707a1（aBC86558），pvCYp707a2（aBC86559），pvCYp707a3（aBC86560）以及高粱Sorghumbicolor的3个aBa8′羟化酶基因，Sb02g026600（eeR99010），Sb04g030660（eeS05661），Sb07g022990（eeS15128）。采用muscle3.6软件分析aBa8ox1与其他植物中aBa8ox氨基酸序列比对，比对结果通过mega5.0软件采用邻接法（neighbor-joiningmethod，nJ）构建系统发育树。
2.5脱落酸aBa-8′羟化酶基因的表达分析利用软件设计primerpremier5设计定量pCR引物，扩增片段长度为110bp，aBa8ox1-F：5′-atGGtGatCatatttGtaGCtttG-3′；aBa8ox1-R：5′-CtattGaCttttGCtaaataattta-3′，下划线标注为起始密码子与终止密码子。反应体系参照SYBRpremixextaqtmⅡ说明书，以太子参phaCt2作为内参基因，生物学重复3次。反应结束后确认RealtimepCR的扩增曲线和融解曲线，分析方法参考aBi7500Real-timepCRSystem的操作手册，用2-Ct分析aBa8ox1在不同组织中的表达量，并对基于转录组数据的表达分析进行验证。
3结果与分析
3.1太子参8′羟化酶基因的鉴定以拟南芥及水稻等模式植物的aBa8′羟化酶基因作为query序列，应用本地Blast软件检索太子参转录组数据库，获得7个基因家族成员（表1），分别命名为aBa8ox1，aBa8ox2，aBa8ox3，aBa8ox4，aBa8ox5，aBa8ox6和aBa8ox7。通过转录组的数据分析7个基因在不同组织中的表达情况（图1），结果表明aBa8ox1在木质部和韧皮部中均有高量表达，其余6个aBa8′羟化酶基因的RpKm值均低于2.5，其中aBa8ox2呈现组成型表达模式，aBa8ox3仅在木质部、韧皮部及花中有表达，aBa8ox4在木质部、韧皮部和茎中有较高的表达，aBa8ox5在韧皮部和叶中有表达，aBa8ox6仅在叶片中有表达。因此，本研究以aBa8ox1为重点展开。
3.2太子参aBa8′羟化酶基因aBa8ox1全长cDna的获得与序列分析通过太子参转录组数据库得到aBa8′羟化酶基因aBa8ox1的cDna序列，采用oRFFinder分析发现，该基因全长2074bp，其中基因的开放阅读框位于56～1456，编码480个氨基酸，1～55为5′UtR区，1457～2074为3′UtR区。以太子参块根韧皮部cDna为模板，利用全长CDS引物aBa8ox1-F与aBa8ox1-R经pCR扩增得到大小为1401bp的片段，与预测一致（图2）。aBa8ox1蛋白相对分子质量为53kDa，等电点为8.55，该蛋白无分泌信号肽及转运肽，定位于细胞质内。跨膜分析显示该蛋白为膜蛋白（图3），1～21个氨基酸残基位于胞内，22～466个氨基酸残基位于胞外。利用Sopm软件对太子参aBa8ox1蛋白进行二级结构预测分析（图4），结构分析表明该蛋白的组成为α-螺旋（H）为39.70%，β-转角（t）为8.15%，β-转角（e）为19.10%，无规则卷曲（C）为33.05%。三维结构预测以2ve3.1.a为模板（图5），序列相似性为29.88%，由此可见，二级结构预测与三级同源模型一致。
Blast比对结果显示，aBa8ox1与康乃馨（Dianthuscaryophyllus，Ban15742.1）的aBa8ox基因氨基酸相似度84%，与菠菜（SpinaciaoleraceaL.，Kna20889.1）80%相似，与烟草（nicotianatomentosiformis，Xp_009603153.1）77%相似。将太子参aBa8ox1与5个其他植物的aBa8′羟化酶基因进行多序列比对（图6），通过pfam数据库进行结构域分析，发现该基因属于CYp450超家族成员，具有pFG[nSD]G[tVia][HR][Sam]CpG的保守基序。
3.3系统进化分析通过邻接（nJ）法构建进化树（图7），结果表明来源于7个物种的aBa8′羟化酶基因聚类3类。单子叶植物与双子叶植物在GroupⅠ和GroupⅢ中出现了明显的分化，CYpa4s，CYpa5s聚为一类，本研究中克隆得到的aBa8ox1与来源于拟南芥的atCYp707a1，atCYp707a3聚为一类，推测该基因的生物学功能可能与拟南芥中的这2个基因相似。
3.4太子参aBa8ox1的表达模式分析为了进一步验证太子参aBa8ox1基因的表达模式，运用实时荧光定量pCR技术分析了该基因在叶、茎、须根、块根木质部和块根韧皮部5个组织中的表达情况（图8）。结果与转录组数据中的表达模式一致，太子参aBa8ox1在块根的木质部和韧皮部中高量表达，表达量为块根韧皮部>须根>块根木质部，说明该基因可能参与太子参块根中脱落酸aBa的激素水平调控。
4讨论
脱落酸（aBa）在植物的生长发育及环境胁迫的响应等过程中具有重要作用，对植物根系的不同发育时期作用不同，促进或抑制的作用主要取决于aBa的浓度，作用部位及周围环境的相互作用[18]。植物块根与块茎的膨大与脱落酸的含量直接相关。如，地黄块根发育过程中的拉线期及膨大期，aBa的合成相关基因显著上调，在膨大期结束及成熟期时aBa合成减少，代谢关键酶aBa8′羟化酶基因受到aBa含量的反馈调节，当aBa含量较高时，aBa8′羟化酶基因被激活，当aBa含量降低时aBa8′羟化酶基因的表达被抑制[2]。因此，aBa8′羟化酶基因在维持aBa的激素水平具有重要作用。
高等植物中aBa的分解的主要代谢是通过8′位甲基羟基化途径完成的[18，23]。aBa在aBa8′羟化酶催化作用下生产8′-oH-aBa，后者自身不稳定并在酶的作用下易发生亲核反应生成红花菜豆酸（phaseicacid，pa），pa的4′酮基可被还原生成二氢红花菜豆酸（dehydrophaseicacid，Dpa）[24-25]。Saito等[26]发现，干旱胁迫条件下，拟南芥atCYp707a1和atCYp707a3基因表达上调；复水时，随着2个基因的转录产物积累，aBa水平迅速下降。本研究从太子参转录组数据库中检索得到7个aBa8′羟化酶基因，其中aBa8ox1基因在太子参块根的韧皮部高量表达，且聚类分析中aBa8ox1基因与拟南芥中的atCYp707a1和atCYp707a3聚为一类。因此，太子参块根中的aBa分解代谢过程可能主要由aBa8ox1基因完成，主要部位在韧皮部。已有研究发现[21]，在太子参块根发育的膨大和伸长2个周期中aBa含量可能发生转变，合成与降解途径如何协调还有待进一步研究。
目前，太子参脱落酸生物合成及代谢路径的研究尚处于起步阶段，本文首次从太子参中克隆到了aBa代谢的关键基因，为进一步研究aBa对太子参块根的膨大及植物对环境刺激响应的分子机制奠定了基础。
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生物信息学分析篇8
abstract:asaresult43miRnahavebeenpredicted.thesemiRnaswerefurthervalidatedbystatisticalandphylogeneticanalyses.SomemiRnasarefoundtoclusterinscaffoldbygenomelocationanalysis.
关键词:赤拟谷盗;基因组;microRna;生物信息学;进化分析
Keywords:triboliumcastaneum;genome;microRna;bioinformatics;evolutionanalysis
中图分类号:Q752文献标识码:a文章编号:1006-4311(2010)11-0207-02
0引言
昆虫是地球上种类最多,分布最广的动物类群。不但对于生物学基础研究非常重要,而且昆虫对于人类健康和农业经济也有重要意义。然而昆虫microRna的研究却远远落后于哺乳动物、线虫和植物[1]。随着许多昆虫全基因组测序的进行及完成,昆虫microRna研究迎来了一个新的发展阶段。正在从生物信息学预测、高通量克隆、特定microRna的功能研究等几个方面迅速展开。而这也将为揭示microRna在昆虫生长发育中的作用奠定基础。赤拟谷盗作为一个新的模式昆虫,对它们的研究有利于进行农业害虫防治以及人类疾病治疗。本研究工作利用计算机技术以及Rnafold和triple-SVm算法预测赤拟谷盗基因组中的miRna,结果总计预测了43个miRna。在所预测的miRna中,发现其中有14个miRna成簇存在,有些miRna存在于基因间区或内含子中。根据nCBi数据库中提供的编码基因的注释信息,利用计算机编程技术提取了赤拟谷盗基因的3′UtR序列,并构建了本地的UtR数据库,通过miRanda软件预测这些miRna基因作用的靶标。同时进一步对这些预测的miRna基因做了家族进化分析。
1材料和方法
1.1数据来源从UCSC数据库下载了赤拟谷盗的基因组数据(genome.ucsc.edu/)。同时从miRBase数据库(版本11.0)中下载了果蝇中已报导的152条miRna成熟体序列(BDGp5.0)(microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences/browse.pl)。从nCBi的GenBank数据库下载了赤拟谷盗的mRna序列,并利用自编的perl程序根据基因组注释信息提取了mRna的3′UtR序列,并构建本地数据库。
1.2赤拟谷盗基因组中miRna的预测流程总体实验分析流程利用自己编写的perl程序提取已公布的152个果蝇miRna基因的2-8位的种子序列,并利用这些种子序列扫描赤拟谷盗基因组,扫描过程中允许种子序列完全匹配,并向两边延伸截取长度为22个核苷酸的候选序列做下一步分析。接下来利用patScan软件对从赤拟谷盗基因组中截取到的22个核苷酸的候选序列与果蝇中已知的miRna序列做同源比对,参数设置为允许二个错配(mismatch)、一个插入(insertion)、一个缺失(deletion)。将符合条件的22nt同源序列利用perl程序将其完全匹配到基因组上,接下来采用以下方法截取可能的miRna前体序列:分别截取该序列两侧的75个碱基的序列(60+15bp或65+10bp)。然后利用Rnafold软件分别计算其二级结构的自由能[2],这里将自由能界限设为ΔGfolding≤-18kcal/mol,如果每个序列所对应的四个前体都符合条件,保留自由能最低的那条前体做下步分析。接下来进行miRna的初步预测,利用本地版的triplet-SVm软件[3],其原理是根据已公布的miRna的特征,对要分析的miRna进行特征识别,从而确定可能的miRna。最后筛选出43个可能的miRna。
1.3赤拟谷盗基因组定位和成簇分析利用自己编写的perl程序,对miRna在赤拟谷盗每个Scaffold上的分布进行统计。miRna在赤拟谷盗的基因组上并非均匀分布,而是存在很多热点(hotspot),本研究工作对一个miRna分布较多的ChLG3进行分析。结果发现有11个miRna存在于这个Scaffold上,并且发现了三个miRna簇。此外,还对所有miRna在基因组上的成簇进行分析,采用的标准为miRna在基因组上两两之间距离小于500碱基的,认为是同一个簇。
1.4赤拟谷盗miRna的靶标分析利用自己编写的perl程序根据现有的基因的注释信息提取赤拟谷盗已有的mRna的3′UtR序列,并建立本地的UtR序列数据库,利用windows版本的miRanda软件(版本1.0b)预测miRna作用的靶标。将预测的赤拟谷盗的miRna序列和mRna序列作为输入序列采用DoS界面运行程序,参数设置:分数值(Score值)设为80,能量值设为-20kca/mol,其他的参数保持缺省。对预测出来的结果利用自编的perl程序提取结果,其中包括miRna作用的靶标的基因登陆号以及简单的基因描述。
1.5赤拟谷盗同源miRna的分析根据前体序列以及二级结构的相似性,43个miRna可以分为36家族,其中包括29个在Rfam数据库(版本8.1)中已经报道的miRna家族。将其中的部分家族的前体序列利用CLUStaLX软件进行比对,取比对结果中共有的部分利用meGa(版本3.1)构建系统进化树,参数设置:邻接法(neighber-joining)以及Kimura-2参数模型。最后构建的系统进化树利用treeview软件进行可视化显示(版本1.6.6)。
2结果与讨论
2.1赤拟谷盗基因组miRna的预测利用计算机编程的技术以及预测miRna的软件在赤拟谷盗基因组中总计预测出了43个miRna基因。通过跟miRBase数据库(版本11.0)中已注册的赤拟谷盗miRna进行比较发现其中有12个miRna基因是新预测出来的,目前数据中还未报道。首先,提取果蝇已知的152个miRna的2-8位的种子序列,去除冗余后总计得到了126个miRna的种子序列库。然后利用perl程序用这些种子序列去扫描赤拟谷盗基因组,允许完全匹配,并两边延伸总计15个核苷酸长度的碱基,将得到的候选的22个核苷酸序列与果蝇原来的152个miRna利用patScan软件进行同源比对,最后得到了355个潜在的miRna序列,接下来将这些序列匹配到赤拟谷盗基因组上以截取潜在的前体序列,并对这些前体序列进行二级结构预测,以及利用triple-SVm软件进行识别,最后得到了43个真实的miRna序列,其中有21个miRna基因与已发表的数据一致。对这些预测的miRna进行长度分析,发现绝大多数的miRna的长度都在22-23左右,这跟miRna的一般特性还是很吻合的,也进一步说明了预测结果的真实性。
2.2赤拟谷盗miRna在基因组上的位置分布因为目前为止,尚未有整合的赤拟谷盗精细图发表,所以我们将已鉴定的赤拟谷盗miRna与已知的scaffold进行了比对与定位。与其他物种报道的一样,赤拟谷盗的miRna也并非在基因组上均匀分布,一些scaffold上包含多个miRna,而有些scaffold目前未发现miRna存在。这里以一个miRna存在热点以ChLG3为例,在这个scaffold上分布着11个miRna。此外还在赤拟谷盗基因组上寻找可能的成簇的miRna,在这里发现了三个miRna簇,例如已报道的miR-12和miR-304簇也存在于该scaffold上,其中果蝇中miRna-2家族被证实与胚胎发育和细胞凋亡相关,在这里也发现了该家族的部分基因。将miRna与已知的蛋白编码基因在相应scaffold上位置进行分析,发现有10个miRna存在于编码基因的内含子区。随着赤拟谷盗基因组精细图以及基因注释的完成及完善,内含子区域的miRna数目仍有可能继续增加。
2.3赤拟谷盗miRna的家族进化分析根据序列和结构的相似性,预测的43个miRna可以分为36个家族,其中有些家族含有多个成员,比如:mir-iab-4家族由四个miRna组成;mir-2、mir-9、mir-46家族各由两个成员组成,其中mir-46家族的两个成熟体miRna位于同一个前体的两个臂上。绝大多数赤拟谷盗中miRna家族只含有一个成员,而且有些miRna家族目前在Rfam数据库中还未有记载。我们选择了其中mir-46家族做保守性分析,并构建了系统进化树。进化树显示,mir-46家族主要存在于昆虫中,而且在所有果蝇和线虫物种中都存在两个成员,而在家蚕(Bombyxmori)、意大利蜜蜂(apismellifera),冈比亚按蚊(anophelesgambiae)和赤拟谷盗(triboliumcastaneum)中只存在一个该家族的成员,并且发现赤拟谷盗的tca-mir-281与家蚕的bmo-mir-281基因相似性较高,属于同一分支。
2.4预测的miRna的靶标分析miRna可以通过切割信使Rna或抑制其翻译这两种转录后机制,实现下调靶基因表达的作用。利用生物信息学方法预测miRna的靶基因,并通过初步筛选,挑选所要研究的基因是目前研究miRna功能的重要方法。本文中,我们下载了数据库中赤拟谷盗的全长基因,利用perl程序根据基因注释信息,提取了基因的3′非翻译区,利用靶基因预测软件miRanda,预测了miRna作用的靶基因,参数设置Score值为80。结果显示有些miRna可以作用多个基因,或在同一个基因上有多个作用位点,例如:tca-miR-184作用了四个基因,其中在hth基因上有三个作用位点。另外一种情况是,有些基因可以同时被多个miRna作用,例如基因基因abdominal-B同时被七个miRna作用,其中包括tca-bantam基因,在果蝇中发现,Bantam基因对细胞程序性死亡基因是一种负调控。
3讨论
自两个最早的miRna基因Lin-4和Let-7在线虫中发现以来,科学家们通过分子克隆和生物信息学等方法,已在各种动植物、病毒甚至单细胞的衣藻等生物体中鉴定出来8000多种miRnas。研究发现miRna参与生命过程中一系列的重要进程,包括早期发育、细胞增殖,细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢和细胞分化。相对于植物和其他动物,昆虫的miRna研究相对滞后,而且主要集中在果蝇等主要的模式昆虫中。昆虫与农业生产和人类健康息息相关,昆虫不但是地球上最大的动物类群,而且其极强的适应能力以及复杂的发育变态都引起科学家的广泛关注。鉴定昆虫的miRna成为研究昆虫的独特习性和发育变态的重要方面。本文通过生物信息学的方法在赤拟谷盗基因组中预测了43个miRna。这些新预测的赤拟谷盗miRna对于昆虫miRna的鉴定和功能研究打下了良好的基础。
大规模基因组和蛋白质组的研究为我们更好的认识理解昆虫的生长发育、激素调控、行为生理提供了可能。尽管昆虫中miRna的研究刚刚起步,但是相信随着包括家蚕、蚊子、蜜蜂、赤拟谷盗在内众多昆虫基因组测序的完成以及功能研究的深入,昆虫miRna研究必将为基础生物学以及应用昆虫学提供新的动力,研究miRna在昆虫进化、昆虫行为以及昆虫与植物、昆虫与微生物相互关系等也将成为miRna在昆虫学中研究热点。
参考文献:
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生物信息学分析篇9
关键词：谷子；启动子；SiRLK35p；顺式作用元件；抗逆；品种培育
中图分类号：S515：Q781文献标识号：a文章编号：1001-4942（2017）07-0007-05
abstractUsingYugu1asmaterial，a1893bpupstreamregulatorysequenceofSiRLK35gene，whichnamedSiRLK35p，wasidentifiedbydatabasesearching，andwasisolatedbypCRamplificationusinggenomicDnaoffoxtailmilletastemplate.BioinformaticsanalysisofSiRLK35pwascarriedoutwithpLaCedatabase，anditsexpressionpatternwasforecasted.theresultsshowedthatseveralcis-actingelements，suchasaBReLateRD1（aCGt）andGCCCoRe（GCCGCC），existedinSiRLK35p，andpartsofthemwereknowntobeassociatedwithstressresponsiveprocesses，whichindicatedthatSiRLK35pmightparticipateinstressresponseandregulatetheexpressionlevelsofdownstreamgenesunderstressconditions.thisresearchwouldprovideacandidatematerialforstressresistanceimprovementandnewvarietybreedingoffoxtailmillet.
KeywordsFoxtailmillet；promoter；SiRLK35p；Cis-actingelement；Stressresistance；Varietycultivation
启动子是一段位于功能基因上游，能结合Rna聚合酶及其他转录因子，从而决定基因转录起始以及表达量的Dna序列。启动子作为基因上游的调控序列，其中的顺式作用元件在基因的转录及时空表达调控方面发挥重要作用[1]。对基因启动子的研究，尤其对该序列中所包含的不同调控元件的解析，将有助于预测基因的表达调控模式，为进一步解析基因功能奠定基础。
根据启动子所包含的关键调控元件的种类及功能，结合其下游调控基因的生物特性，植物中启动子通常可分为三类：组成型启动子、组织特异性启动子和胁迫诱导型启动子[2]，但同时很多组织特异性启动子和胁迫诱导型启动子也包含组成型启动子[3]。其中，胁迫诱导型启动子可对逆境条件如干旱、高盐等非生物胁迫或病虫害等生物胁迫产生响应，从而对基因的转录及表达进行调控[4]。
谷子在我国北方种植广泛，是我国传统粮食作物兼战略储备作物。但在国际科学界，其遗传学研究相对落后。2012年，谷子测序工作的完成[5]，为解析谷子基因功能及其调控机制提供了新的途径。本项目组在前期研究中发现一个与谷子抗逆相关的类受体蛋白激酶基因SiRLK35[6]。本研究拟结合谷子数据库检索分离得到该基因启动子，并通过启动子区作用元件分析，明确该启动子类型，以期为进一步解析SiRLK35基因的功能奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
本研究以谷子品种“豫谷1”为材料。peaSYBLUnt试剂盒、transStartFastpfuDnapolymerase试剂盒、2×easytaqSupermix均购于transgen公司（山东济南雨同生物科技有限公司）；薄型琼脂糖凝胶Dna回收试剂盒购于GeneRaYBiotechnology；高纯质粒小量制备试剂盒购于Bioteke公司（济南承森贸易有限公司）；引物由上海英潍捷基公司合成；其余试剂为进口或国产分析纯。
1.2基因组Dna提取
将“豫谷1号”培养3周至三叶期，取其幼苗，使用tpS法提取谷子基因组Dna。
1.3启动子SiRLK35p的分离
检索国家谷子数据中心（http：///），得到SiRLK35基因起始密码子上游1893bp序列，作为基因启动子序列，命名为SiRLK35p。使用primerpremier5设计引物SiRLK35pS1：tGCttGtGCGtCtGCGCCGtGtGa、SiRLK35pa1：aaCGGtttatttGCttGGaGtaCCt。以谷子幼苗基因组Dna为模板，pCR反应体系为：基因组Dna1μL、引物SiRLK35pS1、SiRLK35pa1各0.5μL、transStartFastpfuDnapolymerase1μL、5×transStartFastpfuBuffer4μL、dntps2μL，ddH2o补齐到20μL。反应程序设置如下：94℃5min；94℃30s，57.5℃30s，72℃2min，34个循环；72℃10min。
pCR产物经胶回收，与peaSYBLUnt载体连接，转化大肠杆菌trans5α感受态细胞，均匀涂布于含100mg/Lamp抗性的LB平板，37℃倒置培养过夜，经菌落pCR鉴定，挑取阳性的单克隆，提取质粒后送至山东省农业科学院生物技术研究中心测序室测序。
1.4启动子SiRLK35p中顺式作用元件分析
利用pLaCe数据库（http：//dna.affrc.go.jp/pLaCe/）对启动子所含的式作用元件进行分析[7]。
2结果与分析
2.1启动子SiRLK35p的克隆
借助序列特异性引物，应用pCR扩增到一条大约2000bp的条带，测序结果显示条带大小为1893bp，与预测片段大小一致（图1）。
2.2启动子SiRLK35p顺式作用元件分析
使用pLaCe数据库，对SiRLK35基因启动子SiRLK35p中所包含的顺式作用元件进行预测。结果如图2，该启动子中除含有组成型的、序列保守的基本调控元件CaatBoX、tataBoX及组织特异性的胚乳醇溶蛋白元件DoFCoReZm之外[8，9]，还含有多种与植物抗逆相关的顺式作用元件。其中包括参与植物抗逆以及生长发育调节的wBoX元件5个，调控aBa响应的aBReLateRD1元件3个、DpBFCoReDCDC3元件1个，在调控茉莉酸诱导的基因表达中起重要作用的GCCCoRe元件5个，受Sa诱导的Gt1ConSenSUS元件1个，与致病菌盐诱导相关Gt1GmSCam4元件1个，以及赤霉素响应元件pYRimiDineBoXoSRamY1a2个，与氧化反应相关的CUReCoReCR元件6个（表1）。
3讨论与结论
诱导型启动子是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以被外界信号诱导表达，从而启动其对下游基因在转录水平上的调控。诱导型启动子在各物种中都有发现且研究较多，但在谷子中的研究相对较少。rd29a启动子是目前研究最广泛的诱导型启动子之一，杨春霞等[10]通过构建rd29a启动子驱动GUS基因的植物表达载体转化烟草，发现经胁迫处理后，GUS基因表达增强，说明胁迫环境可诱导rd29a启动子活性；Xu等[11]通过构建含有pspR10启动子的载体转入烟草，结果显示，Sa、aBa以及meJa处理均可诱导其活性；丽等[12]通过对大豆中与衰老相关的类受体蛋白激酶基因rlpk2上游启动子区域研究发现，该启动子能够在番茄愈伤组织生长中瞬时表达；Li等[13]从山葡萄叶片中发现在几丁质酶基因VCH3的上游存在两个Sa顺式作用元件，其表达受Sa诱导；彭建令等[14]克隆了3个含有细菌诱导元件的启动子ppp1、ppp2、ppp3，转入烟草植株后均可受青枯菌诱导；姜骁等[15]通过构建ntoRK1启动子驱动的GUS基因表达载体，瞬时转化烟草叶片，结果ntoRK1启动子可被低浓度的naa和高浓度Sa诱导表达。
本研究借助pLaCe数据库对启动子SiRLK35p进行分析，结果显示，该区域中含有大量参与胁迫响应、功能行使的顺式作用元件，其中包括参与植物抗逆响应的wBoX，说明该启动子可能对逆境产生响应，从而调控下游基因表达；另外还含有Ga响应元件pYRimiDineBoXoSRamY1a，调控aBa响应的aBReLateRD1元件、DpBFCoReDCDC3元件，在调控茉莉酸诱导的基因表达中起重要作用的GCCCoRe元件，受Sa诱导的Gt1ConSenSUS元件以及与致病菌盐诱导相关Gt1GmSCam4元件，说明该启动子可能受Ga、aBa等多种激素诱导并调控下游基因表达。因此，启动子SiRLK35p具有多重因子诱导的活性，其下游基因SiRLK35可能在谷子的胁迫及诱导响应中发挥重要作用。
以上结果显示，启动子SiRLK35p为胁迫诱导型启动子，具有被多种胁迫诱导的活性，推测在植物受到干旱、盐等胁迫时，SiRLK35p可以通过调控下游基因的转录和表达水平，从而使植物对逆境胁迫做出响应，减少胁迫对植物的伤害。目前，该启动子下游调控基因SiRLK35的植物双元表达载体已构建成功，拟借助基因工程技术获得转基因植株，从而对该基因的生物学功能及其在植物抗旱抗逆等方面的应用进行研究。
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生物信息学分析篇10
>>镉诱导pC－3细胞金属硫蛋白和锌转运体的基因表达金属硫蛋白对人类电磁辐射的防护作用金属硫蛋白对急性化学性肝损伤的保护作用研究不同诱导方法对赤子爱胜蚓中的金属硫蛋白的影响大鼠体内镉负荷与尿金属硫蛋白关系的实验研究镉对双齿围沙蚕类金属硫蛋白诱导的初步研究金属硫蛋白与肿瘤关系的研究进展金属硫蛋白突变体的烟草植物高效表达载体探讨镉饱和法对大鼠肝脏和血浆金属硫蛋白测定方法研究乳腺癌中金属硫蛋白的表达及与其与配对淋巴结转移的关系非洲斑节对虾亲本促熟及育苗技术表达嵌合体蛋白pacp/CtB的转基因番茄生物学性状的差异分析拟南芥植物硫肽激素-α前体基因atpSK2的克隆及序列分析晚期大肠癌金属硫蛋白的表达及其与奥沙利铂化疗耐药的关系缺血再灌注损伤皮瓣组织中金属硫蛋白的免疫组化研究锌诱导对力竭运动大鼠金属硫蛋白的影响及其对心肌的保护作用原子吸收分光光度法快速检测化妆品中金属硫蛋白含量金属硫蛋白在肺癌细胞系中的表达及其临床意义硫酸锌诱导金属硫蛋白减轻再灌注肺细胞凋亡的实验研究黄芩葡萄糖醛酸水解酶基因的克隆、生物信息学分析及表达常见问题解答当前所在位置：l）、启动子结合位点分析tFSeaRCH（）和alibab2.1（）进行分析。
2结果与分析
2.1斑节对虾基因组Dna的提取
使用海洋动物组织基因组Dna提取试剂盒（tianGen）提取斑节对虾基因组Dna后，取5μL用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。如图1所示，Dn段接近20kb，主带清晰，可以满足后续试验要求。
2.2pm-mt内含子扩增结果
以5′UtR和3′UtR区域的上下游引物Smt（31）和amt（337）进行pCR扩增，结果如图2所示。由图2可知，所得pm-mt内含子条带在2000bp左右。
2.3染色体步移结果
由D3可知，染色体步移pCR中，以amt（623）、ap1-ap4为引物，扩增结果ap1-ap4对应均有明显条带；以amt（341）为引物，扩增后ap1、ap2和ap3对应均有明显条带，而ap4的条带很弱；最后以amt（84）为引物，只有ap2和ap3对应有明显条带，最大的清晰条带在1000bp左右。
2.4pm-mt基因Dna序列及启动子序列分析
选取染色体步移以amt（84）进行pCR的明显条带，经切胶回收、克隆测序后进行序列分析。在测序结果中可找到特异性引物amt（84），将此段序列与pm-mt基因cDna上游序列进行比对，确定两条序列对应部分一致。将克隆测序得到pm-mt基因启动子序列806bp、内含子扩增测序所得序列1730bp和pm-mtcDna序列502bp拼接后获得基因组Dna全长（图4），该基因序列Dna全长为2744bp，由2个内含子和3个外显子组成，其中启动子区域为806bp，2个内含子长度分别为1194、242bp，3个外显子长度分别为22、78、77bp。pm-mt基因的外显子和内含子接头区符合手提拼接点和供体拼接点的Chambon法则（Gt-aG法则）。
利用启动子分析软件BDGp（BerkeleyDrosophilaGenomeproject）可预测到2个启动子序列分别位于-130～-81bp处（tGCataaatatataaaaGattaGtt
tCaGttCaatCGttaaaaGCttaaC）和-38～12bp处（CttaCGtCaatataaaCattGtaCaCGtGGtGt
CCGaCaCaGaaGCtCaa）。
利用启动子结合位点分析软件tFSeaRCH和alibab2.1预测，可得到pm-mt启动子区域包含2个tata盒，分别位于转录起始位点上游-301～-295bp处和-122～-114bp处，无GC盒和Caat盒。该基因启动子区还包含组成型表达转录因子Sp1、基因上游激活因子USF、增强子ap1和oct-1、转录激活因子atF、聚合酶相关蛋白Rap1、转录因子调控元件CRe-Bp1、糖皮质激素应答元件GRe、热休克应答元件转录因子HSF、血清应答元件转录因子SRF、雌激素应答元件eRe，以及C/eBpalp、e4、C/eBpbeta、antp、Ftz、YY1等潜在转录因子结合位点。
3讨论
为进一步探讨pm-mt与卵巢发育调控的关系，利用染色体步移技术和普通pCR技术相结合的方法，获得了pm-mt基因的Dna全长序列，含3个外显子、2个内含子，与其他动物的mt基因基本一致[17]。不过，斑节对虾mt基因第一个内含子为1194bp，比一般动物的要长[17]。此外，斑节对虾mt基因内含子的两侧都具有Rna正确剪接所必须的识别位点（Gt/aG），这与其他基因的内含子识别序列完全一致。
pm-mt基因与斑节对虾的CHH基因[18，19]及中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因[20]Dna组成结构相类似，均含有与其他真核基因相似的启动子元件特征，包括tata盒，camp效应元件结合蛋白CReB、pit-1和ap-1等3个反应原件结合蛋白的结合位点。糖皮质激素应答元件GRe是mt基因内对甾体激素产生应答的元件，斑节对虾mt基因也含有。GRe通过与糖皮质激素受体结合体（glucocorticoidreceptor，GR）结合，由此介导甾体激素对mt的诱导[21]。李文佼[22]利用克隆78bp的人绒毛膜滋养细胞11β-羟基类固醇脱氢酶1型（11β-HSD1）基因启动子构建于含荧光素酶报告基因的质粒中，转染wiSH细胞株，研究糖皮质激素启动子活性的机制。结果表明，皮质醇对wiSH细胞11β-HSD1表达的调节作用是通过其基因启动子区实现的；皮质醇对11β-HSD1基因启动子活性的促进作用可能是通过翻译起始点上游78bp的序列实现的，而且与糖皮质激素受体有关。万顺伦[23]利用大鼠海马11β-HSD1启动子区，构建以Cat酶为报告基因的pBLCat6质粒并转染pC12细胞株，研究结果表明妊娠期糖皮质激素对海马神经元11β-HSD1表达的上调作用是通过mR和GR（以GR为主）和11β-HSD1启动子区实现的。据此可推论，pm-mt的表达受体内甾体激素调控，并可能参与斑节对虾卵巢发育及生殖活动。根据软件alibab2.1预测，pm-mt基因启动子区域还含有雌激素应答元件eRe（estrogenresponsiveelement）。Govind等[24]研究得到，雌激素与核受体eR结合，eR即形成二聚体，并与靶基因启动子序列内的增强子序列――雌激素应答元件eRe结合而诱导靶基因表达。雌激素是甾体激素，且预测中pm-mt启动子区域的糖皮质激素应答元件和雌激素应答元件序列重合，提高了pm-mt的表达受体内甾体激素调控此推测的可信度。而进一步确认pm-mt表达与甾体激素调控的关系，需进行功能性研究。
胰高血糖素、血管紧张素、糖皮质激素均可诱导鼠、兔和家猫肝肾等器官金属硫蛋白的合成[13]。本研究根据pm-mt基因在启动子区域的分析，推测pm-mt在斑节对虾中的表达与CHH家族激素、甾体激素的调控相关。本推测与刘代成等[13]研究结论相似，为今后进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用提供了基础数据。
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