生物途径的有机化学篇1
【关键词】药用植物；环烯醚萜类化合物；生物合成途径；关键酶基因
【中图分类号】R284【文献标志码】a【文章编号】1007-8517（2017）08-0044-05
abstract：iridoidsareaclassofcompoundswidelyfoundindicotyledonousplants，whichhaveawiderangeofbiologicalactivities，suchasneuroprotection，anti-tumor，antioxidant，anti-inflammatoryandothereffects.inthispaper，thebiosyntheticpathwayofiridoidsinmedicinalplantsandthreekeyenzymegeneswerereviewed.inordertolaythefoundationforfurtheranalysisofiridoidbiosynthesispathwayandtheestablishmentoffunctionalgenes.
Keywords：medicinalplants；lridoid；Biosyntheticpathway；KeyenzymeGenes
h烯醚萜类化合物（iridoids）是一类环戊烷结构单元的环状单萜衍生物。具有环戊烷环烯醚萜（iridoid）和环戊烷在C7、C8处开环的裂环环烯醚萜（secoiridoid）两种基本骨架。此类化合物最基本的母核是环烯醚萜醇，具有环状烯醚及醇羟基，由于醇羟基属于半缩醛羟基，性质活泼，故此类化合物多以苷类存在。
虽然环烯醚萜首次从蚂蚁的分泌腺作为防御物质分离到，但目前已知的此类化合物多来自于植物，多见于木犀科、马鞭科、茜草科、龙胆科、玄参科、唇形科、山茱萸科等双子叶植物中，具有广泛的生物活性。如山茱萸科山茱萸环烯醚苷对糖尿病引发的心脏病变、肾功能与结构的改变以及血管并发症等多种并发症具有较好的防治作用[1]；茜草科巴戟天中的水晶兰苷，具有显著的抗炎镇痛作用，与巴戟天的祛风湿作用密切相关[2]；海巴戟中得到的citrifolinoside和citrifolinina对紫外线诱导的、在肿瘤诱发和生长中起重要作用的蛋白活化剂ap-1有显著的抑制作用，是目前为止发现的两个具有此活性的环烯醚萜化合物[3]；海巴戟中的车叶草苷对铜绿假单胞菌、摩氏变形杆菌的抑制作用，与海巴戟用于治疗皮肤病、感冒、发烧等疾病有关[4]。环烯醚萜还是玄参科胡黄连属植物中主要的化学成分，胡黄连属含有二十多种环烯醚萜类成分，胡黄连苷-Ⅰ和胡黄连苷-Ⅱ是胡黄连环烯醚萜苷类成分中的主要活性物质[5]；玄参中桃叶珊瑚苷具有止痛、降血压、抗炎、抑制肿瘤生长、抗病毒、降血糖、抗氧化延缓衰老等多种作用[6]；地黄发挥疗效的主要物质基础如梓醇益母草苷、桃叶珊瑚苷、蜜力特苷、地黄苷a、D、e都属于环烯醚萜类化学成分[7]。龙胆科龙胆属和獐芽菜属中主要的成分也是环烯醚萜，龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷等成分具有保肝、抗胆碱、镇痛镇静等作用，已经开发作为抗肝炎和健胃药等[8]。
环烯醚萜类化合物多种多样的生物活性备受研究者的关注，一直是研究的热点。但研究主要集中在新化合物的分类鉴定、药理活性的研究[6，9-11]。随着对次生代谢成分生物合成以及功能基因的研究的开展，环烯醚萜类化合物的生物合成途径以及功能基因的挖掘研究也积累了很多成果。本文就这一方面的研究进行综述。
1环烯醚萜类成分代谢合成途径
萜类化合物的合成过程可分为3个阶段，即中间体的生成（ipp和Dmapp生成）、萜类化合物的合成（催化ipp和Dmapp生成各种中间体或萜类）和最后的修饰（对萜类终产物进行复杂的结构修饰），环烯醚萜作为特殊的单萜类成分也具有类似的合成途径。
11中间体的生成公认的环烯醚萜中间体生成途径有两条：一条为甲羟戊酸途径（mVapathway），该途径在胞质中进行，由3分子乙酰辅酶a缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a开始，共计6个酶的参与[12]。另一条途径为甲基CDC赤藓醇C4C磷酸途径（meppathway），它在质体中进行，由甘油醛-3-磷酸和丙酮酸缩合开始，共计8个酶的作用，该途径所参与的8个酶已经有6个（除了HDS，HDR）成功结晶并进行了结构鉴定[13]。两个途径最终均合成ipp和其异构体体二甲基丙烯基焦磷Dmapp。这两条途径发生于细胞的不同位置，起始物完全不同，但产物却完全一致，而且存在着ipp和Dmapp在胞质和质体之间的交互使用，有学者认为mep途径合成的ipp和Dmapp主要用于单萜、双萜、四萜的生物合成[13]。
自然界中的萜类化合物虽然种类繁多、结构多样，但都以异戊二烯为基本单位，都起始于共同的前体：ipp或Dmapp[14-15]。
12环烯醚萜的骨架构成ipp和Dmapp以“头-尾”或“头-头”的缩合方式在香叶基焦磷酸合酶（geranyldiphosphatesynthase，GppS）催化下缩合成香叶基焦磷酸（geranylpyrophosphate，Gpp）。Gpp是重要的分界点，不同的萜类合成自Gpp开始通过不同的代谢方向流向单萜、二萜、三萜和生物碱等合成途径。
对于环烯醚萜合成，Gpp先去磷酸基团而成香叶醇（geraniol），继而在香叶醇-10-羟化酶（geraniol10-hydroxylase，Gl0H）的作用下在C-10位置上羟基化而生成10-羟基-香叶醇（10-hydroxygeraniol），接着C1和C10部位被氧化成10-氧香叶醛，至此，以上反应都属于链式的。10-氧香叶醛再经过关键的一步环化，而成环烯醚萜的骨架琉蚁二醛（iridodial），作用于此步的酶直到2012年才发现和获得，即环烯醚萜合酶（iridoidsynthase，iS）[16]。
13后修饰阶段一种植物体内一般存在多种不同形式的环烯醚萜类物质，主要是因为萜类生物合成途径中后修饰酶的存在，这些结构修饰包括羟基化、糖基化、甲基化、环氧化等、酰基化或者结合小分子等修饰多种反应[17]。
环烯醚萜类化合物具有环戊烷环烯醚萜（iridoid）和环戊烷开裂的裂环环烯醚萜（secoiridoid）两种基本骨架。所以环烯醚萜类成分的生源途径主要有两种：从表伊蚁二醛（epi-iridodial）经表去氧番木鳖酸（epi-deoxyloganic）生成桃叶珊瑚苷（aucubin）和类似的脱羧化合物[8]。龙胆科龙胆属和獐牙菜属中的主要成分獐牙菜苦苷、龙胆苦苷以及长春花中多样的吲哚生物碱均来自裂环烯醚萜类合成途径，裂环番木鳖苷是形成獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、吲哚生物碱等的关键中间体。
相比于环烯醚萜而言，裂环环烯醚萜的生物合成途径的研究相对深入，尤其长春花的吲哚生物碱生物合成途径进行了40多年的研究，合成途径得到比较多的解析，因而裂环番木鳖苷之前的生物合成途径的研究有助于其他植物裂环环烯醚萜的生物合成途径的解析。近几年，龙胆、秦艽和獐牙菜属等龙胆科多种植物的研究也积累了不少成果。伊蚁二醛（iridodial）经7-deoxyloganeticacid、去氧番木鳖酸（deoxyloganicacid）、番木鳖酸（loganicacid）、番木鳖苷（loganin）而成裂环番木鳖苷。这里面涉及到的酶分别是（7-Deoxyloganeticacidsynthase，7DLS）、DLGt（7-deoxyloganeticacidglucosyltransferase）、DL7H（7-deoxyloganicacid7-hydroxylase）、Lamt（loganicacido-methyltransferase）、SLS（secologaninsynthase）5n酶[18-19]。
2环烯醚萜类成分三个重要功能基因研究进展
ipp和Dmapp生成之前相关途径中的关键酶已有很多表述，此文重点综述ipp和Dmapp生成之后即萜类化合物的合成和修饰的相关功能基因的研究。
G10H基因香叶醇是环烯醚萜类化合物生物合成途径的重要组分。此反应是生成番木鳖苷的第一个专属步骤，G10H在裂环番木鳖苷的形成过程中起关键性的调控作用，是烯醚萜类化合物合成途径中第一个限速步骤[20-21]。G10H属于膜结合的依赖naDpH细胞色素p450单加氧酶（cytochromep450monooxygenase）家族中CYp76B亚家族的成员[22]。除此之外，G10H还具有较弱的催化3′-羟基柚皮素（3′-hydroxylationofnaringenin）生成圣草酚（eriodictyol）的活性，参与植物黄酮类物质的合成[23]。
G10H基因首次从长春花中被纯化出来[24]。由于植物体内的多种多样的p450基因，克隆G10H基因比较难。第一个基因cDna2001年从长春中克隆出来[25]。目前，G10H酶编码基因已从长春花[26]、川西獐牙菜、秦艽、黑紫獐牙菜[27]等植物中克隆得到，且已证明G10H在长春花中的长春花碱和川西獐牙菜中的獐牙菜苦苷等物质合成过程中起着重要调节作用[28]。G10H基因cDna全长1578-1637bp，开放阅读框为1488-1491，编码495-496个氨基酸。预测G10H无跨膜或者部分跨膜结构域，在植物不同器官中的表达量不同，如主要在秦艽的根和花表达，而在叶、茎总表达量很低，在川西獐牙菜中，主要在叶中表达，茎和根表达微弱。川西獐牙菜中对胚性细胞的愈伤组织进行了过表达研究，验证了G10H对裂环烯醚萜的上调作用[28]。
iS基因环烯醚萜合酶是环烯醚萜生物合成的关键酶，是孕酮5β-还原酶（p5βR）家族的成员，属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）超基因家族成员[29]。其底物为线状单萜10-oxogeranial，首次从长春花中发现和鉴定。该酶与所有已知的利用香叶二磷酸作为底物并产生一种阳离子中间产物的单萜环化酶相反，新的环烯醚萜苷合成酶使单萜在两个主要步骤中环化，前驱10-氧香叶醛（10-oxogerania1）经过一个传统的还原反应形成一种烯醇中间体，然后通过一个Diels-alder环加成反应或迈克尔（michael）加成反应进行环化[30]。环烯醚萜合酶是科学家的一个重大发现，这使得研究人员通过生物技术合成环烯醚萜类化合物整体成为可能。Hu等[31]首次解析了环烯醚萜合酶及其复合体结构，并对iS的催化机理进行了研究，有反式机制与顺式机制两种催化机制。LiliQin等[32]为了进一步揭示iS的催化机制，通过从长春花中克隆、表达、纯化、结晶的方法分析了环烯醚萜合酶载脂蛋白和结合了naDp+/8-oxogeranial的结构，发现活性中心缺少在SDR中经典的结构保守区tyr/Lys/Ser，tyr178具有重要的催化功能，iS具有底物专一性。目前，张成珏[33]已在川西獐牙菜中克隆得到。
SLS基因SLS可以催化番木鳖苷的环戊烯环氧化裂解而成开联番木鳖苷[34]，也是一个细胞色素p450超家族成员，最早是由Vetter等[35]于1993年发现。喂饲实验表明这个反应发生在液泡中[20]，在长春花悬浮细胞中分离并进行了功能分析，它是一种与细胞膜相关的对氧气和naDpH依赖的细胞色素p450单加氧酶[36]。作为直接催化合成开联番木鳖苷的酶，是长春花吲哚生物碱生物合成途径中的一个关键酶，也是裂环烯醚萜类生物合成的一个关键酶。
韩梅等[26]采用两步Gateway-pCR反应法从2周龄长春花幼苗中克隆SLS1481bp的基因片段。Yamamoto等[34]从忍冬的细胞悬浮培养粒体的准备中物中检测到SLS。SLS在反应中的作用依赖于naDpH和分子氧，能被一氧化碳和细胞色素p450抑制剂阻断，表明该反应受细胞色素p450调节。免疫组织化学和原位杂交试验表明SLS定位于长春花叶片的表皮细胞中[36]。目前仅从长春花、喜树[37]、滇龙胆[38]中克隆到SLS基因。喜树中SLS基因cDna长度1706bp，具1575bp完整的开放阅读框，编码524个氨基酸。GrSLS1基因开放阅读框长1560bp，编码519个氨基酸。
3小结与展望
鉴于环烯醚萜类成分的重要生物活性，深入解析生物合成途径和挖掘相关功能基因，可以为将来通过基因工程方法进行酶的体外改造、筛选获得高效生产的环烯醚萜类的工程菌奠定重要基础，或者调控活性成分的积累，提高药材的品质奠定基础。
药用植物中环烯醚萜类化合物的生物合成途径尤其是下游途径的解析以及相关功能基因的研究还处于起步阶段，目前只有对长春花、喜树、獐芽菜属等少数植物进行过研究。虽然目前推测环烯醚萜合酶、开联番木鳖苷合成酶可能是关键酶，但其研究还不够深入，尚需要结合基因组学和转录组学，对这些关键酶基因克隆、表达及功能鉴定、次生代谢途径的影响及调控进行继续深入的研究。参考文献
[1]褚思娟，张兰，刘港，等.山茱黄环烯醚萜苷主要药理作用研究进展[J].中国中药杂志，2013，38（9）：1331-1334.
[2]徐吉银，楚桐丽，丁平.巴戟天属植物环烯醚萜类化学成分和药理活性研究进展[J].广州中医药大学学报，2006，23（3）：268-271.
[3]SangSm，LiuGm.newunusualiridoidsfromtheleavesofnoni（morindacitrifoliaL.）showinhibitoryeffectonUltravioletB-inducedtranscriptionalactivatorprotein-1（ap-1）activity[J].Bioorganic&medicinalChemistry，2003（11）：2499.
[4]atkinsonn，BriceHe.antibacterialsubstancesproducedbyfloweringplants（ii）.theantibacterialactionofessentialoilsfromsomeaustralianplants[J].austJexpBiolmedSci，1955，33（5）：547.
[5]炜伟，，姚仲青，等.胡黄连苷-Ⅰ和胡黄连苷-Ⅱ研究进展[J].中药材，8（38）：1756-1760.
[6]高鑫，董婉茹，陈平平，等.玄参中环烯醚萜苷不同构架的药理学研究[J].哈尔滨商业大学学报，2016，32（6）：656-658.
[7]朱s昊，赵乐，董诚明，等.地黄环烯醚萜合成后修饰相关基因的挖掘与分析[J].现代食品科技，2016，10（32）：84-89.
[8]马丽娜，田成旺，张铁军，等.獐牙菜属植物中环烯醚萜类成分及其药理作用研究进展[J].中草药，2008，39（5）：790-795.
[9]朴金花，张杨，杨郁，等.胡黄连属植物环烯醚萜类化学成分和药理活性研究进展[J].中国实用医药，2007，2（34）：142-144.
[10]曲娜，张继伟，周杨，等.接骨木中莫诺苷的研究进展[J].牡丹江医学院学报，2016，37（1）：106-107.
[11]贾诩，李茂星，陶锐，等.藏药独一味中的主要化学成分环烯醚萜苷化合物在动物的镇痛抗炎作用研究[J].中国临床药理学杂志，2015，31（8）：635-639.
[12]panditS，ShitizK，SoodH.expressionpatternoffifteengenesofnon-mevalonateandmevalonatepathwaysindifferenttissuesofendangeredmedicinalherbpicrorhizakurroawithrespecttopicrosidescontent[J].molecularbiologyreports，2013（40）：1053-1063.
[13]张松涛，陈红丽，崔红，等.植物mep途径的代谢调控机制[J].西北植物学报，2012，32（7）：1500-1504.
[14]ChristiansonDw.Rootsofbiosyntheticdiversity[J].Science，2007，316（5821）：60-61.
[15]岳跃冲，范燕萍.植物萜类合成酶及其代谢调控的研究进展[J].园艺学报，2011，38（2）：379-388
[16]Geu-FloresF.SherdennH，Courdavaultv，etal.analternativeroutetocyclicterpenesbyreductivecyclizationiniridoidbiosynthesis[J].nature，2012，492（6）：138-144.
[17]王凌健，方欣，杨长青，等.植物萜类次生代谢及其调控[J].中国科学：生命科学，2013，12：1030-1046.
[18]何希瑞，李倩摇，张春玲.胡黄连化学成分及单体化合物药理活性研究新进展[J]，环球中医药，2012，5（9）：708-713.
[19]SalimV，wiensB，masadaaS，etal.7-Deoxyloganeticacidsynthasecatalyzesakey3stepoxidationtoform7-deoxyloganeticacidinCatharanthusroseusiridoidbiosynthesis[J].phytochemistry，2014，10（1）：23C31.
[20]oudina，Courtoism，Rideaum.，etal.theiridoidpathwayinCatharanthusroseusalkaloidbiosynthesis[J].phytochemistryReviews，2007，6（2）：259-276.
[21]王俊峰.川西獐牙菜体细胞杂交及其环烯醚萜类化合物合成相关基因香叶醇-10羟化酶的克隆和功能验证[D].济南：山东大学，2010.
[22]化文平，王粗.秦艽香叶醇-10羟化酶（G10H）基因的克隆及序列分析[J].基因组学与应用生物学，2013，32（4）：510-515.
[23]SungpH，HuangFC，DoYY，etal.Functionalexpressionofgeraniol10-hydroxylaserevealsitsdualfunctioninthebiosynthesisofterpenoidandphenylpropanoid[J].Journalofagricultural&FoodChemistry，2011，59（9）：4637-4643
[24]meijeraH，LopezCardosomi，VoskuilenJtH，etal.isolationandcharacterizationofacDnaclonefromCatharanthusroseusencodingnaDpH：cytochromep450reductase，anessentialenzymeforreactionscatalysedbycytochromep450monooxygenasesinplants[J].plantJournal，1993（4）：47-60.
[25]ColluG，Unern，am，etal.Geraniol10-hydroxylase，acytochromep450enzymeinvolvedinterpenoidindolealkaloidbiosynthesis[J].FebsLetters，2001，508（2）：215-220.
[26]韩梅，赵博，安志刚，等.长春花萜类吲哚生物碱生物合成途径中重要酶（DXR、SLS、G10H、StR）基因的克隆与表达[J].植物研究，2007，27（5）：564-568.
[27]熊勇，赵春艳，杨青松，等.藏药黑紫獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因克隆及生物信息学分析[J].生物技术，2016，26（4）：318-324.
[28]wangJF，LiuYL，CaiYF，etal.Cloningandfunctionalanalysisofgeraniol10-hydroxylase，acytochromep450fromSwertiamussotiiFranch[J].BioscienceBiotechnology&Biochemistry，2010，74（8）：1583-1590.
[29]munkertJ，pollierJ，miettinenk，etal.irioidsynthaseactivityiscommonamongtheplantprogesterone5b-Reductasefamily[J].molecularplant，2015（8）：136C152.
[30]Geu-FloresF.SherdennH，Courdavaultv，etal.analternativeroutetocyclicterpenesbyreductivecyclizationiniridoidbiosynthesis.nature，2012，492（6）：138-144.
[31]HuY，Liuw，malwalSR，etal.StructuresofiridoidSynthasefromCantharanthusroseuswithBoundnaD+，naDpH，ornaD+/10-oxogeranial：Reactionmechanisms[J].angewandteChemieinternationaledition，2015，54（51）：15698-15702.
[32]QinLL，ZhuY，DingJQ，etal.StructureofiridoidsynthaseincomplexwithnaDp+/8-oxogeranialrevealsthestructuralbasisofitssubstratespecificity[J].JournalofStructuralBiology，2016，194（2）：224-230.
[33]成钰.獐芽菜环烯醚萜合成酶基因的克隆及其再生体系的建立[D].天津：南开大学，2015.
[34]YamamotoH，Katanon，ooia，etal.Secologaninsynthasewhichcatalyzestheoxidativecleavageofloganinintosecologaninisacytochromep450[J].phytochemistry，2000：537-12.
[35]VetterHp，mangoldU，SchroderG，etal.molecularanalysisandHeterologousexpressionofaninducibleCytochromep-450proteinfromperiwinkle（CatharanthusroseusL.）[J].plantphysiology，1992，100（2）：998-1007.
[36]irmlerS，SchroderG，StpierreB，etal.indolealkaloidbiosynthesisinCatharanthusroseus：newenzymeactivitiesandidentificationofcytochromep450CYp72a1assecologaninsynthase[J].plantJ，2000（24）：797-804.
生物途径的有机化学篇2
1.1表观遗传学基本概念
表观遗传学的概念是1957年由waddington[1]提出的。随着现代生物科学的发展，表观遗传学的定义也在逐渐完善。目前，研究领域对其的定义为：基因功能的改变凡未牵涉到Dna的序列，又可通过细胞的有丝分裂而遗传者，称为“epigenetics”[2]。由此说明，在基因组中，除序列含有遗传信息外，也有一部分遗传信息记载在其修饰上。当前，学者对植物表观遗传学的研究集中在Dna甲基化、组蛋白密码、染色质重塑等方面内容。
1.2Dna甲基化
Dna甲基化（Dnamethylation）普遍存在于动植物细胞以及细菌基因组中，是在Dna甲基转移酶的作用下，使S腺苷甲硫氨酸（Sadomet，Sam）的甲基基团转移到胞嘧啶或腺嘌呤残基上（主要是胞嘧啶，腺嘌呤偶有发现），从而完成Dna的修饰[3]。Dna甲基化能够影响Dna和蛋白质的相互作用，抑制基因的表达。因此，在基因表达、植物细胞分化以及系统发育中起着非常重要的作用。
1.3组蛋白密码
组蛋白在翻译后的共价修饰中会发生改变，如发生甲基化、乙酰化、泛素化等，从而提供一种识别的标志，为其他蛋白与Dna的结合产生协同或拮抗效应，它是一种动态转录调控成分，称为组蛋白密码（histonecode）[4]。这些组蛋白密码可以被一些特定的蛋白质识别，继而将其翻译成一种特定的染色质状态，进而实现对特定基因的调节。因此，组蛋白密码能够显著地扩大Dna密码子对所携带遗传信息的存储量。
1.4染色质重塑
染色质通常通过核小体改变结构。这类伴随着基因表达调节的染色质结构产生的变化被称作染色质重塑（chromatinremodeling），其包括2种类型：一种是依赖共价结合反应的化学修饰，也就是所谓的组蛋白密码[5]；另一种是依赖atp的物理修饰，靠atp水解所释放的能量改变染色质。
2植物开花过程的调控
植物能否开花的重要环节就是植物由营养生长向生殖生长转变的过程。随着分子生物学分子遗传学的发展，对植物开花途径的研究也逐渐明确[6]。
2.1春化作用途径
温度是影响植物开花的重要环境因素之一。对于冬性和二年生植物，如果不经低温诱导处理，其开花过程可以推迟几周甚至几个月。低温对开花的促进作用称为春化作用[7]。目前，十字花科的拟南芥和禾本科的小麦、大麦等应用于春化相关的基因研究[8-9]。在拟南芥中，与春化作用有关的基因有FRi、FLC、VRn1、VRn2和Vin3等[10]。研究表明，单基因FRi控制冬性发育特性的拟南芥[11]，如果其编码的盘绕蛋白发生突变，可导致拟南芥过早开花。FLC属于maDS盒基因[12]，其编码的蛋白转录因子是一个强的开花抑制因子，高水平表达对开花具有抑制作用。FLC对开花的抑制作用由于显性等位基因FRi的存在而加强。促进植物开花的过程中，低温春化抑制FLC的表达是通过FRi转录及蛋白表达水平的负调控来实现的[13]。研究发现，拟南芥的春化作用进程中还有基因VRn1、VRn2和VRn3的参与[14]。
2.2光周期途径
光是植物生长发育的一个重要条件，只有通过光周期的调控影响，植物才能顺利完成整个生长发育进程[15-16]。拟南芥是典型的长日照植物，其光周期途径是由光受体感受光信号开始的，在短日照条件下抑制开花，长日照条件下促进开花。目前，在拟南芥中共发现3种隐花色素（CRY1、CRY2、CRY3）和5类光敏色素（pHYa、pHYB、pHYC、pHYD、pHYe）。隐花色素感受蓝光和紫外光，光敏色素感受红光和远红光。二者感受昼夜长短和光的强弱并产生昼夜节律[17]。其中，远红光、蓝光通过pHYa、CRY1和CRY2促进开花，红光通过pHYB、pHYD和pHYe抑制开花[18-19]。
2.3自主开花途径
自主途径也是通过抑制FLC基因的表达而促进开花。在拟南芥中，相继克隆到FCa、FY、FLD、Fpa、FVe、LD和FLK7个基因。拟南芥开花时间调控中，FCa、Fpa、FLK和FY基因都编码Rna结合蛋白，它们对FLC前体mRna的调节和稳定性在开花控制中是非常关键的，属于转录后的调节[20]。
2.4赤霉素途径
Ga对拟南芥开花有促进作用，其能加速短日照条件下的野生型拟南芥和长日照下的fb、fac、fd、fe、co、fpa、f、tfve和fwa等晚花突变体开花[21]。在Ga途径中，关键基因Gai、RGa和RGL1序列和功能都非常相似。研究表明，可能是由于Ga合成途径的打断，以致Ga生物合成途径突变体减少对Gai、RGa和RGL1的抑制作用，最终导致植物开花推迟。由此可见，通过Ga合成途径影响开花，是通过与Gai、RGa和RGL1基因的作用实现的[8-9]。目前研究认为，Ga启动开花的分子机理是激活花分生组织特异基因LFY的启动子，加强LFY的转录活性，从而启动开花[22]。
3表观遗传对植物开花基因表达的调控
表观遗传在植物开花过程中起重要的调控作用。而在植物开花的多种调节途径中，表观遗传的调节主要是在春化作用途径中实现的。以拟南芥为例，简要阐述在拟南芥的春化作用途径中表观遗传对基因表达的调控。
3.1春化途径相关基因组成的复合体
paF1样复合体，通过自身编码的蛋白质修饰FLC染色体进而实现对其表达的调控。FRi复合体，SUF4与FRi、FeS1和FRL1相互作用共同组成FRi复合体调节的表达。SwR1样复合体，由eSD1、SUF3、aRp6和pie1组成SwR1复合体促进FLC的表达。pRC2样复合体，pRC2复合体具有组蛋白甲基转移酶的活性，可以使靶基因产生组蛋白的甲基化修饰作用[23]。
3.2组蛋白的修饰
组蛋白翻译完成后，其氨基尾巴会发生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化等共价修饰方式，从而共同构成组蛋白密码（histonecode）假说，即在一个或多个组蛋白氨基尾端的多种修饰状态，可以互相联合或依次地被特定的蛋白（酶）或其他复合体等识别、结合而起作用，为发动或阻遏基因转录的染色质相关蛋白提供结合位点[24]。通常认为，FLC组蛋白甲基化有2个功能：一是可作为信号被开花抑制因子组成的paF1、SwR1、FRi复合物识别；二是使FCL的组蛋白结构发生变化，为开花促进因子组成的pRC2-Like复合物更容易靠近FLC[25]。在基因沉默相关的各种组蛋白修饰中，最典型的是组蛋白去乙酰化，自主途径抑制因子FLD和FVe也参与FU染色体的去乙酰化作用[26-27]，且FLD的缺失能够促进拟南芥突变体fri的FLC染色体组蛋白H3的ly4三甲基化。最近有研究表明，FLC组蛋白H3的S10的磷酸化修饰在拟南芥春化作用过程中起重要作用，LHp1对维持FLC稳定的抑制状态起关键作用，有丝分裂过程中FLC组蛋白H3的S10的低水平磷酸化为LHp1与FLC组蛋白H3的ly9甲基化连接提供结合位点；而减数分裂过程中FLC组蛋白H3的S10的高水平磷酸化阻止LHp1与FLC组蛋白H3的ly9甲基化位点的连接，FLC的抑制状态被解除。
3.3春化记忆
多个基因协同控制着拟南芥的春化记忆，基因间相互调节是通过染色质修饰改变的方式来实现对FLC转录活性的抑制，进而实现对下游开花控制基因的调节，最终促使开花的快速转变。完成春化作用，拟南芥FLC的抑制状态可以稳定地保持在有丝分裂过程中，FLC此种表观遗传特征表明产生细胞记忆的分子机制与其他真核生物不同，拟南芥春化的细胞记忆由长时间的低温诱导产生，应用分子遗传学的方法已经鉴定VRn1、VRn2、Vin3和LHpi是目前鉴定参与拟南芥春化记忆的4个关键基因[28]。在春化过程中，最初FLC的表达抑制是通过Vin3对FLC组蛋白去乙酰化作用来实现，随后FLC的乙酰化一方面使FRi、paF1-LiKe、SwR1-LiKe复合体对FLC转录的促进作用受到限制，另一方面为组蛋白H3ly27和ly9的甲基化作用提供基础，从而进一步增强对FLC的抑制作用，最后组蛋白去乙酰化和H3ly27、ly9甲基化为LHp1与FLC染色体的连接提供结合位点，LHp1与FLC染色体的连接对FLC的抑制在温度回暖后维持在稳定的状态[28]。
4展望
通过对模式生物拟南芥的深入研究，对植物开花过程调控机制已经取得一定的研究进展。而表观遗传的研究的也拥有较大的成效。但二者的结合即表观遗传在植物开化过程中的研究还只处于初步阶段，如独立于FLC的春花应答基因aGL19、aGL24应答春花过程的详细机制，拟南芥感知低温刺激时间长短的途径等内容，均还未进行深入的研究。因此，深入研究植物开花过程中的表观遗传调节机制，可以为了解植物开花调控机制以及农业生产提供理论基础。
5参考文献
[1]waDDinGtonCH.theStrategyoftheGenes[m].London：allen&Unwin，1957.
[2]woLFFeap，matZKema.epigenetics：RegulationthroughRep-ression[J].Science，1999，286（5439）：481-486.
[3]王霞，亓宝，胡兰娟.植物表观遗传学相关研究进展[J].生物技术通报，2008（6）：14-16.
[4]孙永健，陈小强，孙宁，等.表观遗传学的分子机制及其研究进展[J].安徽农业科学，2008，36（33）：14450-14452，14510.
[5]易霞，尚永丰.依赖atp的染色质物理修饰[J].中国生物化学与分子生物学报，2003，19（4）：418-422.
[6]BoSSpK，BaStowRm，mYLneJS，etal.multiplepathwaysinthedecisiontoflower：enabling，promoting，andresetting[J].plantCell，2004，16（1）：18-31.
[7]种康，雍伟东，谭克辉.高等植物春化作用研究进展[J].植物学通报，1995（5）：481-487.
[8]徐建斌.二穗短柄草VeRnaLiZation1基因的克隆与表达分析及小麦光周期反应的基因芯片分析[D].泰安：山东农业大学，2010.
[9]袁秀云，张仙云，马杰，等.植物开花的分子调控机理研究[J].安徽农业科学，2010（2）：614-616.
[10]SUnGS，amaSnioRm.Rememberingwinter：towardamolecularunderstandingofvernalization[J].annuRevplantBio，l2005，56（10）：491-508.
[11]JoHanSonU，weStJ，LiSteRC，etal.molecularanalysisofFRiGiDa，amajordeterminantofnaturalvariationinarabidopsisfloweringtime[J].Science，2000，290（5490）：344-347.
[12]SeaRLei，HeY，tURCKF，etal.thetranscriptionfactorFLCconfersafloweringresponsetovernalizationbyrepressingmeristemcompetenceandsystemicsignalinginarabidopsis[J].GenesDev，2006，20（2）：898-912.
[13]miCHaeLSSD，HeY，SCiRteCCiKC，etal.attenuationoffloweringlocuscactivityasamechanismfortheevolutionofsummer-annualfloweringbehaviorinarabidopsis[J].nationalacadSciences，2003（100）：10102-10107.
[14]CHanDLeRJ，wiLSona，DeanC.arabidopsismutantsshowinganalteredresponsetovernalization[J].plantJ，1996，10（4）：637-644.
[15]袁秀云.普通小麦春化基因的克隆及表达特性分析[D].郑州：河南农业大学，2009.
[16]丛倩倩.二穗短柄草的遗传转化及inDeteRminate1基因的克隆[D].泰安：山东农业大学，2010.
[17]袁秀云，张仙云，马杰，等.植物开花的分子调控机理研究[J].安徽农业科学，2010，38（2）：614-616.
[18]QUaiLpH.phytochromephotosensorysignallingnetworks[J].natureReviewsmolecularCellBiology，2002，3（2）：85-93.
[19]pUtteRiLLJ，LaURieR，maCKniGHtR.it'stimetoflower：thegeneticcontroloffloweringtime[J].Bioessays，2004，26（4）：363-373.
[20]曾群赵，仲华，赵淑清.植物开花时间调控的信号途径[J].遗传，2006，28（8）：1031-1036.
[21]CHanDLeRJ，DeanC.Factorsinfluencingthevernalizationresponseandfloweringtimeoflatefloweringmutantsofarabidopsisthaliana（L.）Heynh.[J].JexpBot，1994，45（9）：1279-1288.
[22]BL?魣ZQUeZma，GReenR，niLSSono，etal.GibberellinspromotefloweringofarabidopsisbyactivatingtheLeaFYpromoter[J].theplantCell，1998，10（5）：791-800.
[23]SCHwaRtZYB，piRRottSV.polycombsilencingmechanismsandthemanagementofgenomicprogrammes[J].natureReviewsGenetics，2007，8（1）：9-22.
[24]JenUweint，aLLiSCD.tRanSLatinGtHeHiStoneCoDe[J].Science，2001，293（5532）：1074-1080.
[25]夏志强，何奕昆，鲍时来，等.植物开花的组蛋白甲基化调控分子机理[J].植物学通报，2007，24（3）：275-283.
[26]aUStinCp，BatteYJF，BRaDLeYa，etal.theKnockoutmouseproject[J].naturegenetics，2004，36（1）：162-166.
生物途径的有机化学篇3
1甲羟戊酸途径
甲羟戊酸途径是生物合成类异戊二烯物质的经典途径［15，16］，Shiao通过同位素追踪证实担子菌中存在甲羟戊酸途径，它主要在细胞质和线粒体内发生，以乙酰辅酶a为合成初始物。甲羟戊酸途径（图1）的主要过程就是乙酰辅酶a（乙酰Coa）在乙酰硫解酶的作用下发生克莱森缩合和裂解反应，分别在乙酰Coa的C上缩合生成乙酰乙酰Coa；接着再与一分子乙酰Coa在3羟基3甲基戊二酸单酰辅酶a（HmGCoa）的催化，以及Fe2＋和质体醌（quinone）的辅助下，由乙酰Coa酰基转移酶发生不可逆反应生成HmGCoa；HmGCoa通过HmGCoa还原酶催化接受naDpH的氢，经两步反应生成甲羟戊酸；在此过程中HmGCoa还原酶是整个甲羟戊酸途径的关键控制酶，接着便是甲羟戊酸在三个连续atp依赖酶之一的甲羟戊酸激酶的作用下，生成甲羟戊酸5磷酸；然后生成物再在磷酸甲羟戊酸激酶的催化下生成甲羟戊酸5焦磷酸；之后在甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的作用下发生脱羧反应生成异戊烯焦磷酸，而异戊烯焦磷酸（isopentenypyrophosphate，ipp）和二甲烯丙基焦磷酸（dimethylallylpyrophosphate，Dmapp）是一些萜类、甾醇等类异戊二烯类前体物质［18］。在甲羟戊酸途径中，乙酰Coa是此途径ipp合成的前体物质，对于萜类物质的产量有着重要的作用；而3羟基3甲基戊二酸单酰Coa（HmGCoa）是整个途径的关键限速酶，甲羟戊酸激酶（mVK）则是三个atp依赖酶的第一个，HmGCoa和mVK对于萜类物质的合成起到限制和控制的作用。
2甲羟戊酸途径物质对萜类物质合成的影响
2．1乙酰Coa对萜类化合物的影响在担子菌经由甲羟戊酸途径合成萜类物质中，乙酰Coa是整个途径的起始物，其含量多少直接影响着整个途径中萜类化合物的生成量。生物体内的乙酰Coa主要是一些Coa在酶的作用下接受乙酰基催化生成的，虽然细胞质内乙酰Coa主要参与脂肪酸的合成，但胞质乙酰Coa仍可以经由甲羟戊酸途径合成异戊二烯焦磷酸，并最终合成萜类化合物。在此合成萜类化合物的过程中，乙酰Coa在HmGCoa还原酶的作用下生成HmGCoa（图2）。在萜类物质合成的过程中，乙酰乙酰Coa硫解酶（乙酰Coa乙酰转移酶）催化乙酰Coa合成HmGCoa，首先共价乙酰Coa与CoaS－反应生成乙酰SCoa，随后第二个乙酰Coa基质上去质子化的C2与乙酰乙酰Coa硫解酶上的负碳离子反应，进而生成乙酰乙酰Coa和CoaSH；然后两分子乙酰Coa在HmGCoa合成酶的作用下生成HmGCoa。乙酰Coa是甲羟戊酸途径的前体物质，因此对于合成萜类物质的前体物质起到总量控制的作用，改变乙酰Coa的浓度会直接影响萜类物质的产量。最近几年的研究证实，可以通过调控乙酰Coa的基因表达来增加乙酰Coa的含量，进而增加萜类物质在目标载体中的产量。Shiba等在啤酒酵母中异源表达来自于沙门氏菌的乙酰Coa合成酶基因aCS，在啤酒酵母菌株pDB108中获得高浓度的青藁素前体物amorphadiene，从而提高了萜类物质青藁素的含量；欧阳翔在研究灵芝三萜类化合物时发现，在甲羟戊酸途径中乙酰Coa合成HmGCoa的催化酶GlHmGS启动子中，发现了两个潜在的茉莉酸响应元件，并且参与了茉莉酸甲酯信号调控的灵芝三萜类生物合成途径，同时猜测这种调控机制可能是潜在的茉莉酸甲酯响应元件介导的。而且在萜类物质合成的过程中，还可以通过乙酰Coa的负反馈调节作用来增加萜类物质的产量。陈孚江等在研究酵母乙酰Coa合成基因aCS时，通过增加其胞内乙酰Coa的含量来加大甲羟戊酸途径碳代谢流量，从而达到增加类异戊二烯产物的合成；并且甲羟戊酸途径中，乙酰Coa的水平受到中间关键物甲羟戊酸的负反馈调节［22］。asadollahi等通过删除GDH2来弱化甲羟戊酸代谢途径反馈抑制，从而增加了甲羟戊酸途径的碳代谢流量，使得目标产物的产量提高。由于乙酰Coa在生物体内同时参与许多重要的生化反应，如三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle，tCa）、脂肪酸合成与分解（fattyacidssynthesisanddegradation）和氨基酸代谢（aminoacidmetabolism）等，在这些途径中可以通过控制甲羟戊酸途径来促使乙酰Coa转向不同的代谢途径，从而有利于提高不同途径产物的产量。魏萍等［24］在裂殖壶菌中通过增加乙酰Coa在甲羟戊酸途径中的供应，结果发现二十二碳六烯酸（DHa）的产量比空白对照提高了46．61％。因此在担子菌甲羟戊酸途径中乙酰Coa不仅可以控制萜类物质的合成及其含量，还可以通过调节乙酰Coa来调节担子菌非甲羟戊酸途径的代谢产物（图3）。
2．2HmGCoa还原酶的限制在甲羟戊酸途径中，3羟基3甲基戊二酸单酰Coa（3hydroxy3methylglutarylCoa，HmGR）是各种类异戊二烯物质合成过程中很重要的关键限速酶，同时也是甲羟戊酸途径中调控的重点，它在此途径中能催化乙酰Coa合成甲羟戊酸，而后者在酶的进一步作用下合成异戊二烯焦磷酸（ipp），进而生成类萜类物质的另一前体物二甲烯丙基焦磷酸（Dmapp）。生物界存在两大类HmGCoa还原酶，动物、植物、真菌等真核生物及部分古细菌，如詹氏甲烷球菌（methanococcusjannaschii）、担子菌的HmGCoa还原酶属于i类还原酶，假单胞杆菌、肺炎链球菌、肠道球菌等原核生物及部分古细菌（archaeoglobusfulgidus）的HmGCoa还原酶属于Ⅱ类还原酶。担子菌HmGCoa还原酶是由4个97ku的相同亚基组成的n甘露糖糖蛋白，其中每个亚基有888个氨基酸残基组成，第872个氨基酸磷酸化［25］，其中HmGCoa催化还原为甲羟戊酸的过程中需要2分子的naDpH、2H＋以及HmGCoa还原酶，此过程包括3个连续的反应阶段，甲羟戊酸是第二个反应阶段的中间产物，并且HmGCoa还原酶还能催化该反应的逆向反应，氧化甲羟戊酸为HmGCoa［26］（图4）。在萜类物质的合成过程中，通过HmGCoa还原酶基因的过表达能够增加萜类物质的产量，现阶段HmGCoa还原酶基因已经能够克隆和表达。Rico等在酵母中转录仙女扇沉香醇合酶基因（LiS），在菌株t73中LiS能够解除HmGCoa还原酶对单萜沉香醇含量的抑制作用，并且进一步研究发现，HmGCoa的过表达能够少量的增加沉香醇的含量。Xu等通过运用RtpCR方法来表达HmGCoa还原酶基因，验证了其在灵芝中其与三萜类物质之间存在着重要相关性；随后发现灵芝的同源转录能够增加灵芝酸的基因表达水平；同时通过缩短HmGCoa还原酶基因，并在农杆菌中转录过表达，同时发现其能够增加灵芝酸的含量，从而证明HmGCoa还原酶能够增加灵芝中灵芝酸的含量，这也为研究者在提高灵芝酸含量方面提供了探索途径。HmGCoa还原酶是萜类物质合成的限速酶，在甲羟戊酸途径中宏观调控HmGCoa还原酶的活性主要是通过化学抑制剂，进而降低酶的活性改变反应速率，从而限制萜类物质的合成。HmGCoa还原酶的化学抑制剂主要是他汀类化合物，阿托伐他汀类药物通过氢键作用使其3，5二羟戊酸和蛋白质残基之间连接，而苏伐他汀类药物则除了存在氢键作用外，其上面的氧原子还能和蛋白质残基之间存在极性作用，从而使得这类药物的抑制作用更显著。他汀类抑制剂的结构中侧链部分与HmGCoa结构相似，有些需要水解成β羟酸的活性产物而发挥作用，因抑制剂的开放酸部分可与HmGCoa还原酶活性部位相结合，因此竞争性抑制HmGCoa还原酶活性，从而阻断HmGCoa转变为甲羟戊酸。他汀类药物中憎水性的刚性结构上的β，δ二羟基酸链的邻位引入憎水基团能够增强药物与HmGR的结合，在刚性结构的其他位置引入极性基团能够加强药物对HmGR的抑制作用。但是甲羟戊酸能够逆转HmGCoa还原酶抑制剂产生的抑制作用。徐琳等研究表明甲羟戊酸能够拮抗辛伐他汀对鼠血管成纤维细胞（VFs）胶原合成的抑制作用，陈永清等［33］发现左旋甲羟戊酸能够逆转辛伐他汀对心肌细胞肥大的抑制作用。
2．3甲羟戊酸激酶（mVK）的限制甲羟戊酸激酶（mevalonatekinase，mVK）是甲羟戊酸途径合成萜类化合物的三个连续atp依赖酶的第一个，其与atpγ位上的磷酸基团作用，把磷酸基团转移到甲羟戊酸C5上催化还原形成甲羟戊酸5磷酸，同时产生aDp。甲羟戊酸激酶能够催化形成类异戊二烯衍生物；同时甲羟戊酸激酶能够催化合成某些病原微生物的抑制物质，因此利用酶来抑制微生物可能是未来开发致病微生物抑制剂的重要内容，但在真菌中此方向的研究还很少，大部分集中在动物和植物方面的研究。甲羟戊酸激酶是甲羟戊酸途径的限速酶之一，近几年的研究发现在甲羟戊酸磷酸化的过程中，甲羟戊酸激酶能够有序的对其反应物起作用，首先当所有的底物都与激酶结合后，才释放出第一个产物，也就是甲羟戊酸激酶首先同底物中的甲羟戊酸结合，然后依次顺序结合mgatp，而甲羟戊酸磷酸是第一个被释放的产物，然后才是aDp的释放，其反应机制如图5所示。甲羟戊酸激酶基因表达模式在植物中研究的比较多，在动物和微生物中研究的比较少。通过mVK保守区域氨基酸序列的比较，发现真核生物和原核生物的甲羟戊酸激酶具有高度相似性，并进一步分析其晶体结构，表明所有生物mVK酶活性中心都具有3个保守区域，并且每个保守区域的功能相同，这说明真核和原核生物的mVK酶促反应机制相似，其中保守区1与底物结合及催化反应有关，而保守区2和保守区3则与atp的结合及催化反应有关。甲羟戊酸激酶基因在植物体内的过量表达增加了类异戊二烯衍生物的含量。郭溆等利用实时荧光定量pCR检测三七中mVK扩增基因pnmVK1的组织表达特异性时，检测到该基因在根中的表达量最高，并推测三七根部的三萜皂苷含量最为丰富，为此可以进一步推测三七mVK基因的过表达能够增加三萜皂苷的丰度；Champenoy等在烟草中表达酵母mVK基因时，发现mVK基因的过表达能够使甲羟戊酸激酶活性显著增加，并且使烟草中根尖等部位的细胞分裂素增加。甲羟戊酸激酶的活性大小对萜类物质的合成速率具有重要的影响作用，并对萜类物质的产量有重要影响。甲羟戊酸激酶受代谢产物的反馈抑制调节，其中萜类前体物质栊牛儿基焦磷酸（Gpp）和法尼基焦磷酸（Fpp）是研究最多的抑制剂，两者在不同生物中能显著改变酶的活性。Voynova等对比了人类和金黄色葡萄球菌中Fpp和法尼基硫代焦磷酸（FSpp）对甲羟戊酸激酶的影响，发现细菌FSp／FSpp中的C15链能反馈抑制甲羟戊酸激酶，而在动物中其在C6C15链上能抑制甲羟戊酸激酶，并且都能够显著影响甲羟戊酸激酶的特征值Km，进而改变酶的活性。除此之外Cho［37］研究表明甲羟戊酸二磷酸和苏氨酸相互作用能通过甲羟戊酸来影响甲羟戊酸激酶的Km，在甲羟戊酸途径中，甲羟戊酸磷酸盐在部分双底物反应中能影响甲羟戊酸激酶，其一旦与甲羟戊酸结合，甲羟戊酸激酶的结构发生局部性的变化，其活性位点附近的侧链重新定向，并且链环的变化导致结合的空间变紧。在形成三级结构时，活性位点会变得更紧密，结合的甲羟戊酸和肽链会发生额外的相互作用，从而影响mVK的Km值，根据分子动力学理论，通过Km的改变能够对酶活性及反应速率都会产生影响，进而可以达到影响萜类物质合成速率的目的。
3展望
生物途径的有机化学篇4
关键词:酸王苹果；呼吸途径；关键酶；呼吸代谢
中图分类号：S661．1文献标识码：a文章编号：1009－9980?穴2011?雪06－953－06
Characteristicsofrespiratorymetabolismduringavrolles’imposeddormancy
QinDong1，2，XieFu-chun1，ZHaiHeng2*，HUoJun-wei1
（1CollegeofHorticulture，northeastagriculturalUniversity，Ha’erbin，Heilongjiang150030China；2CollegeofHorticultureScienceandengineering，ShandongagriculturalUniversity・StateKeyLaboratoryofCropBiology，tai’an，Shandong271018China）
abstract:inordertoprovidephysiologicalbasesforselectinglate-germinationcultivarsthatcanavoidlatefrostdamage，theverylate-germinationcultivarmalusdomesticcv.avrollesandthecontrolcultivarm.domesticcv.Judelinewereusedasexperimentalmaterialstoinvestigatethecharacteristicsoftherespiratorymetabolism，thechangesofrespiratorypathway，respiratoryrateandthekeyenzymeactivityduringimposeddormancy.theresultsshowedthat:changesofrespiratorypathwayinbudsofavrollesandJudelinehadthesametrend，buttherunningactivityandtimeprocessingofthechangeweresignificantlydifferentbetweenthetwovarieties.thetotalandemprespirationintensityofavrolleswerelessthanthatofJudeline，thepeakvaluewas84.6％and84.7％respectively.timeforpppaccumulationinavrolleswas21dayslongerthanthatinJudeline，therunningactivitywashigherandtheamplitudewas2.02timesasthatinJudeline.theactivityofkeyenzymesandcontentofrespiratorysubstratesinavrolleswerelowerthanthatinJudeline.theenergyprovidedbyrespiratorymetabolismwasnotsufficient，whichlimitedthegerminationofavrolles.
Keywords：malusdomesticcv.avrolles；Respiratorypathway；Keyenzyme；Respiratorymetabolism
随着气候变暖，晚霜为害越来越频繁，给果树生产造成了巨大损失。选育晚萌发/开花品种是避免晚霜冻害的一个有效途径，山东农业大学抗性砧木研究室1998年利用农业部‘948’农业先进技术引进项目从法国引进了一批加工品种，从中发现了1个比大多数栽培品种晚萌芽3～4周的品种酸王（malusdomesticcv.avrolles），在山东泰安4月下旬萌动，4月底或5月初开花，比其他品种如瑞林（m.domesticcv.Judeline）晚20～27d[1]，能有效避开晚春霜冻。
呼吸代谢是生物氧化和物质转化的枢纽，其强度和途径转变影响并调控植物体器官的生长发育[2]。核果类果树芽呼吸速率在整个休眠期比较稳定，维持较低的代谢水平，休眠后期略有升高[3]。呼吸途径的改变与萌发的关系多以种子为试材[4]，并认为种子解除休眠和萌发有赖于磷酸戊糖途径（ppp）的活化；高东升[3]亦认为ppp途径的增强可能是核果类果树打破休眠的原因之一。
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-pGDH）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-pDH）是ppp途径的2个重要的酶[5]，水稻种子萌发时6-pGDH和G-6-pDH活性及其辅酶naDp含量水平，都是随着种子器官的形成而提高，在萌发过程中表现为emp逐渐被ppp所取代[6]，表明呼吸途径关键酶活性参与了种子的萌发，但有关呼吸途径关键酶活性的变化与芽萌发的关系研究甚少。呼吸代谢离不开呼吸底物（淀粉和可溶性糖）的消耗，淀粉向可溶性糖的快速转化是短时间高温破除桃休眠的部分原因[7]。
目前晚萌发品种在被迫休眠期的呼吸代谢未见研究报道。我们通过测定晚萌发品种酸王和对照品种瑞林芽总呼吸速率、3种呼吸途径呼吸速率的变化、呼吸底物、呼吸途径关键酶活性变化，探讨酸王芽在被迫休眠期的呼吸代谢特征，为揭示酸王晚萌发机理提供生理依据，同时丰富多年生果树休眠与萌发的理论知识，为培育晚萌发苹果品种提供科学依据。
1材料和方法
1.1材料
酸王和瑞林均是引自法国的加工苹果，酸王是原产法国布列塔尼地区的小苹果，在布列塔尼和诺曼底加工苹果产区作为高酸酿酒品种长期栽培[8]，其父母本不详，瑞林亲本为金冠×普利姆。在法国昂热国家苹果资源中心，酸王物候期比对照品种道曼晚30d，引入山东烟台，辽宁兴城及甘肃天水，同样比其他品种晚20d，表现出明显的晚萌动/开花特性。
试验所用试材取自山东泰安小津口加工苹果园酸王和瑞林的成龄树，树势中庸，管理水平一般。
1.2方法
1.2.1芽呼吸速率的测定于2007年12月初至2008年4月从生长势较为一致的树体中部采1a生枝约20条带入实验室立即进行呼吸速率的测定。利用生物氧检测器（YSi-53）和oxytherm液相氧电极自动测定系统（英国Hansatech公司）进行测定，参照王海波[9]的方法，略有改动。枝条取来后用自来水冲洗2遍、去离子水冲洗1遍，吸水纸擦干，取枝条中部芽并剥除鳞片，将芽分切成大小一致的小块后准确称取0.3g芽体，置于内有5mLpH6.8磷酸缓冲液的注射器中，反复抽气至芽子沉到液体底部，将抽提过的芽体置入氧电极反应杯中，准确加入1.5mL磷酸缓冲液，加盖，启动转子以排除缓冲液中气泡并启动测量程序，待反应曲线稳定并达一定长度后，停止反应，记录数据。反应介质为20mmol・L-1、pH6.8磷酸缓冲液，测定温度25℃，重复3次。
呼吸抑制剂用注射器自氧电极上部加入，所用呼吸抑制剂加入顺序及其终浓度分别为（1）naF10mmol・L-1，抑制糖酵解（emp）途径；（2）丙二酸50mmol・L-1，抑制三羧酸循环（tCa）途径；（3）na3po410mmol・L-1，抑制磷酸戊糖（ppp）途径；抑制剂用20mmol・L-1、pH6.8磷酸缓冲液配制。未加入任何呼吸抑制剂的呼吸为总呼吸，总呼吸减去加入呼吸抑制剂的剩余呼吸为抑制剂抑制呼吸途径的呼吸，即被抑呼吸（呼吸途径呼吸）=总呼吸-剩余呼吸。
1.2.2呼吸途径关键酶活性测定酶液提取：准确称取0.3g芽，加入3.0mL预冷pH=7.4的tris-HCl缓冲液，冰浴研磨，4℃下，5000r・min-1离心30min，上清液为酶提取液，4℃下保存待测。
3种呼吸途径关键酶的活性测定参照李霞[10]的方法，磷酸己糖异构酶（pGi）活性测定磷酸己糖异构酶的催化产物6－磷酸果糖的产生量代表磷酸己糖异构酶的活性。苹果酸脱氢酶活性测定以苹果酸脱氢酶的催化产物naD的产生量代表其活性。6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-pGDH）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-pDH）联合活性测定以6－pGDH和G－6－pDH催化产物naDpH的产生量代表6-pGDH和G-6-pDH联合酶活性。
1.2.3呼吸底物的测定可溶性糖和淀粉采用蒽酮比色法[11]测定。
2结果与分析
2.1酸王自然休眠界定及萌发有效积温
在GXY智能型光照培养箱中用清水扦插法确定了瑞林解除自然休眠的日期在12月20―31日，酸王在1月20―30日。以5℃作为苹果自然休眠解除积累有效积温的起始温度，以日均温度超过起始温度的差值总和计算有效积温（∑t，℃）。在被迫休眠期，酸王萌发所需积温（∑t）为355℃，瑞林仅为105℃，酸王是瑞林的3.38倍（图1），2者有效积温符合一元二次方程[12]。
2.2苹果芽总呼吸变化
2个品种自然休眠解除后，芽总呼吸均呈现“升－降－升”的变化趋势，但变化幅度和时间进程有显著差异（图2）。瑞林在解除休眠后呼吸速率持续增加，在32d内增加了66.8%，达到了6.62μL・g-1・h-1，随后稍微下降后再次持续升高，在萌发前达到最高点，为7.88μL・g-1・h-1，是自然休眠解除时的1.98倍。酸王的总呼吸变化相对于瑞林明显滞缓，在自然休眠解除后12d内即达到第1个峰值，增加了1.9μL・g-1・h-1，是瑞林的70％，在下降到峰谷后缓慢反弹，历经30d恢复到第1个峰值的水平，萌发前17d内有一个快速上升过程并达到最高点，为6.60μL・g-1・h-1，是自然解除休眠时的1.76倍，是瑞林的83.8％。相比较而言，酸王自然休眠解除至萌发期间，总呼吸强度弱于瑞林，萌发前上升积累的时间比瑞林长21d。
2.3芽内呼吸途径呼吸与关键酶活性变化
植物体内存在3条基本呼吸代谢途径，即三羧酸循环（tCa），糖酵解途径（emp），磷酸戊糖途径（ppp）。其关键酶分别是苹果酸脱氢酶、磷酸己糖异构酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。酸王自然休眠解除后，其呼吸途径呼吸及呼吸途径关键酶活性发生了显著变化。
2.3.1ppp途径呼吸及关键酶活性变化ppp途径主要生理功能是产生供还原性生物合成需要的naDpH以及可供核酸代谢的磷酸戊糖，一些中间产物则可参与氨基酸合成和脂肪酸合成。在萌发过程中，ppp途径关键酶G-6-pDH和6-pGDH联合酶的活性变化与ppp途径呼吸变化基本一致（图3）。
自然休眠解除后，芽内ppp途径呼吸不断增加，酸王在44d内（3月15日）上升到最高点，为1.88μL・g-1・h-1，是自然休眠解除时的11.8倍，于4月19日迅速下降到峰谷后再次上升，在萌发前达到1.65μL・g-1・h-1，是最高点的88％。G-6-pDH和6-pGDH联合酶的活性与ppp途径呼吸变化相似，也是在44d内达到第1个高峰值，为1.309μmol・g-1・min-1，是解除休眠时的3.0倍，经过一个幅度为0.379的下降过程于4月10日开始上升，萌发前联合酶活性达到最高点，为1.533μmol・g-1・min-1，是解除休眠时的3.52倍。
相对于酸王，瑞林ppp途径呼吸只需22d上升到峰值，为1.26μL・g-1・h-1，是自然休眠解除时的2.85倍，是酸王的67％，但关键酶活性则需要31d才能上升到峰值，峰值为1.261μmol・g-1・min-1，是解除休眠时的2.56倍。随后呼吸途径呼吸持续回落，萌发前的第2个高点仅为1.29μL・g-1・h-1，是酸王的78.6％，而联合酶活性在2月23日下降到谷底后再次上升，萌发前联合酶活性上升到最高点，酶活性为1.453μmol・g-1・min-1，略低于酸王（图3）。
2.3.2emp途径呼吸及关键酶活性变化emp途径是碳水化合物代谢的枢纽，其呼吸在2个品种芽内呈“双峰”变化，磷酸己糖异构酶活性的变化与呼吸速率变化趋势基本一致（图4）。酸王芽内emp呼吸在自然休眠解除第12天上升到第1个高峰后迅速下降，峰值为1.39μL・g-1・h-1，是自然休眠解除时的2倍；于3月3日下降到峰谷后再次持续上升，经26d达到第2个高峰，萌发前3d（4月24日）再次下降，峰谷为1.09μL・g-1・h-1，比第1次峰谷高46.6％，萌发前略有升高。相对于酸王，瑞林在自然休眠解除后22d增加了69％，达到了第1个高峰，比酸王高18.7％，于2月21日下降到峰谷，谷值是酸王的1.65倍，在第55天（2月23日）达到第2次高峰后缓慢下降，高峰值是自然休眠解除时的1.48倍。在整个阶段，瑞林emp呼吸高于同时期的酸王。
酸王芽内pGi活性变化在休眠解除后23d内变化不大，其后迅速升高，经过46d（至4月10日）的上升达到最高点，酶活性为0.134mg・g-1・min-1，是解除休眠时的2.16倍。在萌发前2周内有一个变化较为剧烈的过程。相对于酸王，瑞林芽内pGi酶活性出现较为明显的“双峰”变化，在休眠解除后22d内，pGi活性由解除休眠时的0.068mg・g-1・min-1迅速升高了74.2％，随后有所下降，至3月3日（休眠解除53d）升高到最高点，最高点酶活性为0.153mg・g-1・min-1，此后至萌发前，均保持在一个较高的水平（图4）。
2.3.3tCa途径呼吸的变化tCa是糖代谢的重要途径，也是各类有机物相互转变的枢纽和末端氧化的重要途径。两品种芽内tCa的变化趋势、变化幅度和苹果酸脱氢酶（mDH）活性变化基本一致，只是在时间进程上存在差异（图5）。
酸王和瑞林tCa呼吸分别经过12d（2月11日）和22d（1月21日）达到峰值，酸王略高于瑞林；随后均缓慢下降，酸王在第54天（3月25日）下降到峰谷，为2.43μL・g-1・h-1，然后基本维持在一个恒定的水平，至萌发前3d迅速升高到3.3μL・g-1・h-1；瑞林在自然休眠解除后第43天（2月11日）下降到峰谷后再次升高，在萌发前上升到最高点为3.29μL・g-1・h-1，与酸王几乎一样。在整个测定阶段，2者的变化幅度都在1.0μL・g-1・h-1左右。而mDH无论是酸王还是瑞林在解除自然休眠后30d内均有一个小幅度的升降过程，随着萌发的进行，mDH的活性不断增加，萌发前达到最高点，酸王为12.65μmol・g-1・min-1，瑞林为12.86μmol・g-1・min-1，酸王略低于瑞林。
2.4芽内呼吸底物的变化
碳水化合物是果树生命活动的中心，同时又是呼吸的底物，尤其是糖类，是emp呼吸的直接底物，因此碳水化合物浓度的改变影响着呼吸强度的变化。
自休眠解除后，无论是酸王还是瑞林，芽内可溶性糖含量均呈上升趋势，由于淀粉向可溶性糖的转化，致使淀粉含量变化与可溶性糖含量变化相反，呈下降趋势（图6）。酸王芽内可溶性糖含量由解除休眠时（1月31日）的56.5mg・g-1上升到萌发前的76.1mg・g-1，升高幅度为34.7％，而淀粉含量由59.74mg・g-1下降到32.92mg・g-1，下降幅度为44.8％。瑞林芽内可溶性糖和淀粉含量均高于解除休眠后同期的酸王芽内含量，瑞林在自然休眠解除时（12月31日）可溶性糖含量为72.6mg・g-1，是酸王的1.28倍。淀粉含量为72.4mg・g-1，是酸王的1.21倍；瑞林萌发前可溶性糖含量为89.5mg・g-1，是解除休眠时的1.23倍，是同时期酸王的1.17倍，淀粉含量为44.84mg・g-1，是解除休眠时的62％，是酸王的1.36倍。
3讨论
落叶果树芽休眠是一种相对现象，而非绝对的停止一切生命活动，在整个休眠与萌发期间发生着各种生理生化变化[13]，呼吸代谢为它提供能量。呼吸代谢旺盛，提供的atp和中间代谢产物越多，越利于萌发。本试验结果表明，在自然休眠解除至萌发期间，酸王芽内的总呼吸强度弱于瑞林，在萌发前上升积累的时间比瑞林长21d，这可能是酸王晚萌发的原因之一。
不同的呼吸代谢途径为生物体提供不同的能荷、还原力。emp是碳水化合物代谢的开始阶段，是糖氧化降解的基本代谢途径，tCa将emp途径代谢产物继续氧化，为植物提供丰富的合成原料和atp能量；emp-tCa是呼吸作用底物氧化的主要途径[14]。本试验研究表明，酸王和瑞林芽内底物氧化主要以emp-tCa为主，但2者emp途径代谢有明显差异，在所测定的阶段，酸王芽内的emp途径呼吸速率低于瑞林，这可能与酸王芽内磷酸己糖异构酶活性相对较弱有关；tCa是呼吸代谢提供能量的主要途径，萌发前芽内tCa途径呼吸及关键酶mDH上升，表明萌发需要tCa所提供的atp能量，而酸王芽内tCa呼吸强度及关键酶活性均低于瑞林，表明在休眠解除后的一段时间内，酸王芽内的能量供应和所提供代谢产物要弱于瑞林，也部分限制了芽的萌发。
ppp途径与种子休眠解除和萌发的关系已有诸多研究，多数认为ppp途径是种子萌发所必须的。ppp途径的各种中间物是生物合成过程中必需的原料，特别是5-磷酸-核酮糖，是合成遗传物质Rna和Dna所不可缺少的物质[4]，而这是芽萌发时所必需的。本试验结果表明：ppp途径的高活性对苹果芽的萌发起着非常重要的作用，酸王芽内ppp途径呼吸变化幅度是瑞林的2倍，增加积累的时间比瑞林长22d，其关键酶G-6-pDH和6-pGDH联合酶的活性变化幅度为1.097，高于瑞林的0.961，这都表明酸王的萌发需要较长时间的高活性的ppp途径代谢。
可溶性糖是代谢的中间产物，它是由淀粉降解而产生，同时又作为呼吸底物被消耗，因此，可溶性糖含量的高低既与淀粉降解的速度有关，又与呼吸消耗的速度有关。可溶性糖含量的高低，反映了植株体内可利用形态的物质和能量的供应基础[15]。随着萌发的进行，芽内可溶性糖含量升高，淀粉由于向可溶性糖的转化而含量下降，酸王芽内可溶性糖含量远低于同时期瑞林，表明酸王芽内作为呼吸底物的可溶性糖不充足，致使芽内呼吸强度较弱，由此造成的能量不充足，部分限制了萌发。
酸王芽内总呼吸的相对较弱，emp途径的较低运行，tCa途径的相对较低，较长时间的运行高活性的ppp途径，呼吸底物含量的相对不足，这些是酸王被迫休眠期的呼吸代谢特征，也可能是其晚萌发呼吸代谢方面的原因。有关各呼吸途径在酸王晚萌发过程中所占的比例及作用，以及对呼吸途径和关键酶活性的调控，补充呼吸代谢的能量能否改变酸王的晚萌发还需要进一步研究。
参考文献References:
[1]SonGYe.Studyonbiologicalcharacteristicsofprocessingapple[D].tai’an:ShandongagriculturalUniversity，2006.
宋烨.苹果加工品种生物学特性研究[D].泰安:山东农业大学，2006.
[2]YUShu-wen，tanGZhang-cheng.plantphysiologyandmolecularbiology[m].2ndedition.Beijing:Sciencepress，1998:344-365.
余叔文，汤章城.植物生理与分子生物学[m].第2版.北京:科学出版社，1998:344-365.
[3]GaoDong-sheng.Studiesonendodormancybiologyofdaciduouefruitinprotectedcultivation[D].tai’an:ShandongagriculturalUniversity，2001.
高东升.设施果树自然休眠生物学研究[D].泰安:山东农业大学，2001.
[4]pUXin-chun，HanJian-guo，Limin，DUGuang-pu，niXiao-qin.StudiesonrespiratorypathwayofZoysiagrassseedwhenbreakingdormancy[J].actaprataculturaeSinica，1996，5（3）:56-60.
浦心春，韩建国，李敏，杜光璞，倪小琴.结缕草种子打破休眠过程呼吸途径的研究[J].草业学报，1996，5（3）:56-60.
[5]HUanGJi，wanGJian-fei，ZHanGHong-sheng.advancesonplantpentosephosphatepathwayanditskeyenzymes[J].ChineseBulletinofBotany，2004，21（2）:139-145.
黄骥，王建飞，张红生.植物戊糖磷酸途径及其两个关键酶的研究进展[J].植物学通报，2004，21（2）:139-145.
[6]wanGai-guo，GUanYun-ling，LiUShu-xian，SHaoCong-ben，LUoGuang-hua.therelationbetweenrespiratorypathwayandorgangrowthduringgerminationofrice[J].plantphysiologyCommunications，1981（1）:31-34.
王爱国，关云凌，刘淑娴，邵从本，罗广华.水稻萌发过程的呼吸途径与器官生长关系[J].植物生理学通讯，1981（1）:31-34.
[7]wanGHai-bo，GaoDong-sheng，wanGXiao-di，LiJiang.Relationshipbetweenthecontentofstarchandsolublesugarandthedormancyreleaseinpeachbudtreatedbyshort-temheating[J].JournalofFruitScience，2005，22（6）:615-619.
王海波，高东升，王孝娣，李疆.短时间高温处理下桃芽淀粉和可溶性糖含量变化与自然休眠解除的关系[J].果树学报，2005，22（6）:615-619.
[8]QinDong.Studyonthephysiologicalandbiochemicalchangesinavrolles（malusdomestica）afternaturaldormancyreleasing[D].tai’an:ShandongagriculturalUniversity，2009.
秦栋.酸王（malusdomesticacv.‘avrolles’）自然休眠解除后生理生化变化研究[D].泰安:山东农业大学，2009.
[9]wanGHai-bo.Studyonthemechanismsofendodormancyinductionandshort-termheatingreleasingendodormancyinpeach（prunuspersica）bud[D].wulumuqi:XinjiangagriculturalUniversity，2006.
王海波.桃芽自然休眠诱导与短时间高温破眠机制研究[D].乌鲁木齐:新疆农业大学，2006.
[10]LiXia.Controlofrespiratorymetabolismonsweatcherrydormancyandstudiesontechnicalofdormancyrelease[D].tai’an:ShandongagriculturalUniversity，2004.
李霞.呼吸代谢对甜樱桃自然休眠的调控及破眠技术研究[D].泰安:山东农业大学，2004.
[11]HaoJian-jun，KanGZong-li，YUYang.experimenttechniqueofplantphysiology[m].Beijing:Chemicalindustypress，2007.
郝建军，康宗利，于洋.植物生理学实验技术[m].北京:化学工业出版社，2007.
[12]QinDong，wanGJin-zheng，GUoJian-min，ZHaiHeng.therelationbetweenendogenoushormonesandlate-germinationinbudsofavrollesapple[J].agriculturalSciencesinChina，2009，8（5）:564-571.
[13]GUBLeRF，miLLaRaa，JaCoBSenJV.Dormancyrelease，aBaandpre-harvestsprouting[J].CurrentopinioninplantBiology，2005，8:183-187.
[14]LiHe-sheng.modernplantphysiology[m].Beijing:Highereducationpress，2006.
生物途径的有机化学篇5
《核苷酸代谢》是生物化学课程中非常重要的一个章节，为以后学习药理学、分子生物学等课程奠定基础，本文对《核苷酸代谢》章节的教学设计进行了探讨，并从教学内容，学情分析，教学目的，教学策略，教学设计环节和教学互动环节等八个方面进行了比较深入的分析讨论，探索中药学专业学习生物化学课程的教学过程，致力于提高教学水平。
关键词：
教学内容；教学策略；教学过程设计；教学互动环节；教学反思；核苷酸代谢
1教学内容分析
本章节教学设计内容选自金国琴主编的《生物化学》教材中第十二章《核苷酸代谢》，本教材由人民卫生出版社出版，卫生部“十二五”规划教材，全国高等医药教材建设研究会规划教材[1]，特别适用于中药学，中医学，中西医临床医学等专业学生学习。本章任务共4学时。在此之前学生已学习核酸化学，糖、蛋白质、脂类三大营养物质的代谢和生物氧化等内容，为本章内容的学习奠定了基础，但因本章内容相对抽象，不易理解，如核苷酸的抗代谢物的作用原理等，给本章的学习增加了难度，因此有必要精心设计教学内容。
2学情分析
课程授课对象为中药学专业本科二年级学生，思想比较活跃，课堂气氛较好，大多数学生能在教师的指引下积极参与课堂讨论。学生已具备基本的化学和生物学科的基础知识。已学习了有机化学，无机化学课程，对各类有机化合物的结构，主要理化性质等均有了很好的认识，且在《核酸化学》等章节中已经学习了核酸的分子组成，结构特点，理化性质等内容，对核酸已经有了一个初步的认识，但对核酸的分解、合成代谢缺少基本的认识，需要在本章学习中予以详细讲解。核苷酸从头合成途径中，两种碱基的元素来源比较复杂，参与合成的反应过程比较多，需要记忆比较复杂抽象的结构式和反应过程。另外抗代谢物作用机理多是酶的竞争性抑制，需要和《酶》章节中酶促反应动力学相结合学习，而且抗代谢物种类较多，且与核苷酸代谢过程中的分子结构相似度高，从而增加了学习难度。
3教学目的
3.1知识目标（1）掌握嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的从头合成途径。（2）理解核苷酸的分解代谢和核苷酸的补救合成途径。（3）了解核苷酸的抗代谢物的作用机理。
3.2技能（能力）目标（1）通过学习核苷酸代谢掌握核苷酸合成的主要方式，分解产物和从头合成途径的主要原料来源以及各种抗代谢物的作用原理，为今后学习药理学等课程和相关疾病发生的基本原理等打下坚实的基础。（2）通过了解核苷酸代谢过程相关的一些疾病，将其与临床紧密联系，激发学生的学习兴趣，引导他们看书和查阅相关资料，培养学生自主学习能力。
3.3学习态度与价值观目标（1）通过对核苷酸代谢的学习，要求中药学专业学生掌握核苷酸代谢的从头合成途径，抗代谢物的作用机理等内容，了解嘌呤核苷酸分解代谢有关的疾病如痛风症，并分析其病因和治疗原理；了解哪些临床药物是通过影响核苷酸代谢的过程以达到抗肿瘤生长的疗效等。（2）通过学习与讨论，提高课堂活跃度，提升学生的参与度；通过对教学问题的思考，大大提高学生分析问题和解决问题的能力，增强学生的自主学习能力，激发学生的学习兴趣。
4教学重难点
4.1教学难点核苷酸的合成代谢；包括从头合成途径和补救合成途径；核苷酸的分解代谢。
4.2教学重点核苷酸的合成代谢，包括从头合成途径和补救合成途径；核苷酸抗代谢物的作用机制。
5教学策略
课堂教学采用以ppt多媒体教学为主，板书教学为辅的原则，充分利用ppt图片生动直观，信息量大的优点，同时因板书能突出重点，更加直观，因此两种教学方式的结合能取得更好的教学效果。在教学策略实施过程中主要采用启发式，探究式，对比式，案例导入式等方式进行，提高师生互动，提升学生的参与度，充分调动学生的学习积极性，使他们主动整合原有的知识体系，提取最有联系的旧知识，提高学生发现问题和分析问题的能力，培养学生的自学能力。最后进行提问和分组讨论，既能活跃课堂气氛，又能引发学生的思考，从而激活学生思维，培养学生的团队合作精神，又能提高个人的表达能力。另外对于相似内容进行对比教学，分析其异同点，便于学生理解和记忆[2]。
6教学过程设计
本章节共4个学时，第一节核苷酸的分解代谢1个学时；第二节嘧啶核苷酸的合成代谢1学时；嘌呤核苷酸的合成代谢1学时;核苷酸的抗代谢物1学时。课程开始引入现在比较流行的某核酸营养品广告，并提出问题：人是否有必要补充核酸营养品，核酸营养品是否有效？引起学生对核酸的学习兴趣和关注，然后复习《核酸化学》章节，复习核酸的分子组成，分子结构等内容，引入新课后先简单介绍下核酸的消化吸收过程，核苷酸的生物学功能以及核苷酸代谢异常所引起的相关疾病，通过分析核苷酸的分解途径，讲解嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的分解代谢相关反应和代谢产物，由此引出嘌呤核苷酸分解代谢有关的疾病痛风症，并分析其病因和治疗原理，讨论嘌呤和嘧啶核苷酸分解代谢产物的有何差异；然后讲解嘌呤核苷酸的原料来源，重点分析嘌呤核苷酸从头合成途径的整个代谢过程，嘌呤核苷酸合成三个阶段所需的酶、中间代谢产物和嘌呤核苷酸补救合成途径；接着讲解嘧啶核苷酸合成的原料来源，重点分析嘧啶核苷酸从头合成途径的整个代谢过程，嘧啶核苷酸合成四个阶段所需的酶、中间代谢产物和嘧啶核苷酸补救合成途径，最后讲解核苷酸的抗代谢物及其作用机理。在本章讲解结束后让学生重点讨论核苷酸分解代谢和合成代谢的异同点。通过课堂讲解和讨论让学生更好地回顾课堂知识，加强师生之间的沟通交流，从而更好地激发其学习兴趣，培养学生思考、分析和解决问题的综合能力[3]。
7教学互动环节设计
7.1课堂互动（1）用现在市面上销售的某品牌核酸口服液引出问题，“核酸口服液是营养品吗，有无必要补充核酸营养品？”启发学生分析思考核酸的消化吸收，和分子组成等内容，激发学生的兴趣和探索意识，为导入新内容奠定基础。（2）多种形式的课堂大讨论：①用对比和类比引入课堂讨论：嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸在分解代谢过程有何异同点，可从代谢中间产物，酶等方面进行比较；嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸在合成过程中有何异同点，可从合成原料，合成部位，合成步骤，合成阶段，所需酶类和补救合成途径的异同等内容进行比较记忆，加深对本章重点内容的理解。②启发式提问引起课堂讨论：启发学生分析引起痛风的原因，以及临床多采用别嘌醇治疗痛风症的原理。思考“食用高蛋白的食物为什么更容易引起痛风？”③举例引起课堂讨论：举出治疗抗肿瘤的一些药物如5-氟尿嘧啶，氨甲喋呤，6-巯基嘌呤等，讨论这些核苷酸的抗代谢物是如何治疗肿瘤的，通过讨论进一步加深核苷酸的抗代谢物的作用机制。
7.2课下互动布置作业，运用所学知识计算合成核苷酸所需的能量，如从5-磷酸核糖开始合成一分子amp需要多少能量（用atp表示）？进一步加强学生对核苷酸合成的理解。
8教学反思与改进
尚有部分同学对前期所学内容掌握不牢固，如核糖和脱氧核糖的分子组成，嘌呤碱和嘧啶碱的分子结构等内容，后期应多通过强化练习和课堂提问等环节加强学生对前面所学内容的掌握。部分学生课堂互动环节积极性不高，不能进行认真思考或讨论，或不能利用所学知识解决问题，课下应加强与学生交流和沟通，及时了解学生的学习情况和积极性不高的原因，针对性地指导学生从而增强学生的学习自信心，提高学习的主动性。
参考文献
[1]金国琴.生物化学[m].2版.北京：人民卫生出版社，2013.
[2]秦崇涛.中医院校生物化学“核苷酸代谢”说课设计[J].学园，2014(21):63-65.
生物途径的有机化学篇6
跨境电子商务作为新兴产业在全球范围的异军突起，改变了中国对外贸易的产业链布局，正在成为中国对外贸易新的增长方式。据商务部统计数据显示，2011年，中国跨境电子商务交易额约为1.6万亿元，2012年约为2万亿元，2013年突破3.1万亿元，2014年达到4万亿，到2016年将增至6.5万亿元，年均增速接近30%。
2012年，国家发改委和海关总署开展了跨境电子商务试点工作，确定了上海、重庆、宁波、郑州、杭州5个试点城市；2014年，哈尔滨也成为试点城市；2015年，国务院又批准设立中国（杭州）跨境电子商务综合试验区。虽然试点和试验区正在逐步扩大跨贸进口量，但目前通过这一途径入境的跨境电子商务商品仍只占总量非常小的比例。事实上，通过邮寄、快递途径仍是跨境电子商务最终实现的重要途径。目前入境邮寄物和快件大部分是跨境电商物品，约占总量的70%-80%。由于跨境电子商务的迅猛发展，近几年入境邮寄物数量呈逐年大幅度递增之势。
邮寄途径跨境电子商务作为跨境电子商务形式之一，其贸易内容、物流途径、物品性质等不同于传统国际贸易和个人自用的非贸易物品，与通过保税物流园区途径跨境电子商务也存在区别，主要有以下几方面。
其一，与传统国际贸易区别。传统的国际贸易过程长、流程复杂、风险高，贸易内容多涵盖于大宗商品、精密仪器、稀缺物资等，罕见于小件低值品。而邮寄途径跨境电子贸易内容呈碎片化，订单由大变小、速度由慢到快、交易由线下转为线上。如邮寄的内容多为个人日用品、跨境邮寄物流时间为10-15天，比传统贸易的几个月物流时间缩短很多。
其二，与保税跨境电子商务区别。保税途径跨境电子商务运行模式为B2B或B2B2C，而邮寄途径跨境电子商务应为B2C2C或C2C的模式。两者根本区别在于邮寄途径跨境电子商务信息流、资金流、物流全部在线上完成，而保税途径跨境电子商务部分环节在线下完成。
其三，与非贸易物品区别。传统的国际邮寄物大多属于信件、小包裹等个人自用物品，按商检法规定，应归类为样品、礼品等非贸易性物品。邮寄途径跨境电子商务物品应属于贸易物品，但由于其没有明显异于其他邮寄物的信息特征，很容易在考察论证时被忽视。如个人通过亚马逊等电商平台在美国等地邮购的商品，就属于贸易性质的物品。
二、邮寄途径跨境电子商务存在的风险问题
邮寄途径跨境电子商务在带动电商、物流、金融等企业发展，给消费者带来便利和实惠的同时，也存在着巨大的风险。这其中包括产品质量风险、国门检疫风险、部门职能风险、法律盲区风险等。
（一）产品安全风险
首先，产品本身的质量问题层出不穷。纸尿裤、奶粉、保健品、皮具、服装等大量商品通过邮寄途径进入消费者手中，这其中充斥着大量假冒伪劣商品。以进口婴幼儿奶粉为例，跨境网购打破了传统的海外供货商到中间商，再到国内最终消费者的贸易链条，直接形成对传统的检验检疫监管模式的突破，实现了从海外供货商直接面对国内终端消费者的交易模式。在这一过程中，作为口岸执法把关的检验检疫机构，对网购进口婴幼儿奶粉的质量风险从可控转向了失控，不法分子正是抓住监管真空这一空子，大肆在网上销售假冒伪劣产品。其次，产品售后服务无法保障。由于产品缺乏监管，且物品又来源于国外，一旦产品出现质量问题，消费者往往陷入维修无路、投诉无门的褰。再次，产品运输安全问题。传统海淘模式要经过海外购物网站、转运公司、仓库、快递公司等多个环节，一旦运输途中出现货品被调换或者破损，往往也没法投诉。
（二）国门检疫风险
社会公众对生物安全认知度不高，遵守生物安全法规的自觉度不够，抵制和打击邮寄途径生物安全不法行为的社会氛围不浓。一些个性宠物、植物繁殖材料以及各种新奇物种等禁止进境物不断通过邮寄途径进入我国境内，威胁我国的生态安全和农林业生产安全。检验检疫部门每年从进境邮寄物中截获大量禁止进境物，且随着跨境电子商务的发展，截获的数量呈大幅上升趋势，据统计，2014年，全国各邮政口岸共计截获各类禁止进境物高达2万批，截获数是2007年的5倍之多。截获物品有红豆杉、欧洲松、松柏、多肉植物等植株，香肠、腊肠、火腿、海参、牛奶、奶酪等动物产品，枫树种子、满天星种子、郁金香种球等种苗及玛卡、东哥阿里等中药材。大量违禁物品通过邮寄途径涌入国内，给国门生物安全造成巨大隐患。
（三）部门职能风险
我国邮寄物监管工作起步较晚，发展基础较为薄弱。目前全国59个国际邮件互换局（交换站），有27个直属检验检疫局开展了邮检工作，初步形成了邮寄物监管局面，但是相比全系统海港、空港和陆路口岸机构完善、设施到位、运转有效监管体系而言，邮政口岸还有差距，监管有效性不够，表现在人员不足、硬件设施简陋、查验场地狭小等。邮政、海关、检验检疫等相关部门配合力度也不够，邮寄物监管常常处于有法无为、有责无职、有岗无位、有人无器的尴尬局面。邮政法以及质检总局和国家邮政局联合下发的《进出境邮寄物检疫管理办法》明确检验检疫对入境邮寄物实施监管，邮政机构应提供必要的工作条件，并配合检验检疫机构的工作。但在实际工作中，由于邮政物流为企业化经营，为了最大限度保证物流畅通，总是以各种理由不配合甚至阻止检验检疫机构开展工作，这也是到目前为止部分国际邮寄物互换局检验检疫机构还没有入驻的原因所在。
（四）法律盲区风险
首先，邮寄物的责任主体具有跨国性，实施处罚比较困难。根据《万国邮政公约》第五条关于“邮件的归属”的规定，“任何邮件，除按寄达国法令已被扣留外，在未投给收件人之前，归寄件人所有”。另外，第五十四条关于“寄件人的责任”的规定，“1.由于所寄物品属于不准运输的物品或因不遵守准寄条件，致对其他邮件造成的一切损失，只要不是邮政或运输部门的过失和疏忽，函件的寄件人应承担责任。责任范围和各邮政所承担的相同。2.寄件人不能因原寄局收寄这类函件而卸除责任。3.证实损失系由于寄件人的过失而造成的邮政，应把这项情况通知原寄邮政，由原寄邮政在必要时向寄件人提出诉讼。”可见，依照国际惯例，倘若邮寄物出现违规侵权等情形的，其法律后果由寄件人承担，除非邮政或运输部门存在过失和疏忽。然而，由于寄件人在境外的现实因素，导致监管部门陷入了处罚不能，无法充分行使管辖权的尴尬境地。其次，我国目前的法律对违法违规的邮寄行为处罚力度不够。从入境邮寄物中截获未申报、未办理检疫许可证或虚报品名的禁止进境物，如要处罚，现有的动植物检疫法实施条例中仅仅规定：“未报检或者未依法办理检疫审批手续或者未按检疫审批的规定执行的；报检的动植物、动植物产品和其他检疫物与实际不符的，由口岸动植物检疫机关处5000元以下的罚款”，罚款数额低，法律震慑力远远不够。而同样情况，在发达国家如澳大利亚、新西兰等国，可能面临巨额罚款，甚至追究刑事责任。此外，广大消费者对生态安全认知度不高，对邮寄物相关法律法规的自觉认知和遵守意识还很弱，禁止进境物屡禁不止，虚报品名逃避检验检疫监管的现象严重。
三、邮寄途径跨境电子商务监管做法
邮寄途径跨境电子商务面临着上述诸多问题、困难和挑战。为提高政府职能的有效性，笔者认为可以从完善法律体系、加快电商大数据建设、形成一体化通关平台、建立负面清单制度、建立产品监测体系、扩大公众宣传等六个方面加强邮寄途径跨境电子商务的监管。
（一）变更邮寄途径跨境电子商务收件人法律地位
对于邮寄禁止进境物品行为的处理，《进出境邮寄物检疫管理办法》第十八条规定，“由检验检疫机构作退回或销毁处理”。可见，在《进出境邮寄物检疫管理办法》中，对该类行为的处理，仅限于对邮寄物本身予以“退回或销毁”的处理，对相关责任人并没有采取追责措施。根据《万国邮政公约》的规定，出现上述行为需对寄件人追责，收件人或承运人无需承担责任，这样的追责规定没有实际操作意义。因此在新形势下，对于跨境途径邮寄物所有权的转移应该有新的认识，建议将收件人或电商平台（指国内电商）作为邮寄途径跨境电子商务法律责任主体。此外，目前邮寄物法律法规政策相对滞后，建议尽快修订《进出境邮寄物检疫管理办法》和《出入境快件检验检疫管理办法》。同时，对将新出台的自贸区、物流园区等跨境电子商务检验检疫监管相关政策延伸到邮寄途径跨境电子商务物领域，确保各项工作有法可依、有据可循。
（二）加快邮寄途径跨境电子商务交流信息的大数据建设
邮寄途径跨境电子商务的特点是高度的信息化和碎片化，传统的检验检疫监管模式不适合也不可能对其合理、有效的监管，必须进行监管模式改革，探索行之有效的监管体系。一是加强邮寄途径跨境电子商务交易信息和物流信息大数据建设，将邮寄物的电子信息全方位纳入检验检疫监管体系，经过系统分析、数据对碰，采取针对性措施。二是结合信息化管理，建立诚信管理体系。结合日常查验中发现的问题、违规邮寄禁止进境物等情况，对责任主体进行诚信扣分，根据扣分情况实施监管差别化。
（三）建立一体化邮寄物通关平台
近年来，为了加快通关速度，促进外贸发展，国务院要求全面推行一次申报、一次查验、一次放行的“三个一”通关模式。各地政府出台了各项便利措施扶持跨境电子商务发展，政企都迫切希望有一个快捷便利的通关环境。而以往邮寄物的监管模式是国检与海关拥有有各自的查验场地，根据各自职责对入境邮包进行监管，这给邮寄物通关增加了人力成本和时间成本。对此，国检和海关两部门急需理顺相关职能，由邮政部门开辟统一的查验场地，完成对邮寄物的监管工作。
（四）探索邮寄途径跨境电子商务负面清单制度
针对邮寄途径跨境电子商务物品杂、货量小、需求时效性高的特点，探索制定跨境电子商务邮寄物“负面清单”、实施企业及其产品备案管理制度，形成有效的事前管理。在《中华人民共和国禁止携带、邮寄进境的动物、动物产品和其他检疫物名录》（农业部质检总局联合第1712号公告）的基础上，结合风险分析及产品特点，建立邮寄物负面清单，对负面清单内的物品进行分类分级。列入1712号公告内的，一律作退运或销毁处理。涉及安全、卫生等高风险物品，实施电商、物品备案制度，并采信第三方检测结果，检验检疫机构进行验证管理。负面清单外的物品，直接放行，必要时抽样查验。
（五）建立邮寄途径跨境电子商务物品监控检测体系
在传统检测合格后放行模式不适合也不可能用于邮寄途径跨境电子商务物品监管的现实情况下，迫切需要研究符合电子商务特点的质量管理机制。建议采用目录外商品抽查的监管方法，即检验检疫机构以消费者的身份，对电商平台上的物品进行风险分析，制度抽样监控计划，检测结果不定期向社会通报，以维护消费者的权益，并督促电商平台建立质量自控体系和诚信经营。
（六）加大科普宣传保证邮路安全
通过邮寄途径入境的跨境商品存在诸多风险，而群众普遍对这些商品的风险缺乏认知，遵守生物安全法规的自觉度不够，抵制和打击邮寄途径生物安全不法行为的社会氛围不浓。社会各界急需通力协作，发挥各自平台功能，加大邮寄物入境的科普宣传。邮政部门可以开辟截获物成列窗口，提醒和警示民众勿将违禁物以邮寄形式入境。国检等监管部门可以开展“国门生物进校园”等主题活动，将相关知识向学生普及。媒体可以通过制作违禁物品对生态环境等造成危害的专题片，让广大群众认识到违禁物品入境的风险。
参考文献：
[1]赵志田，杨坚争.产业创新系统理论下中国跨境电子商务发展研究[J].中国发展，2014，14（2）：25-30.
[2]叶华.浅谈中国外贸跨进电子商务的发展.湖北经济学院学报[J].2013，10（11）：50-51.
[3]李向阳.促进跨境电子商务物流发展的路径.中国流通经济[J].2014，10：107-112.
生物途径的有机化学篇7
1莽草酸途径简介
莽草酸途径是存在于植物、细菌和真菌中的一条重要代谢途径，而动物体内的代谢中是不存在此途径的，此途径使糖代谢和次生代谢紧密地联系在一起。该途径有7个酶参与催化反应，并且这7个酶都可以通过真核和原核细胞来源的基因表达获得。第一步反应是磷酸烯醇式丙酮酸（pep）和赤藓糖-4磷酸（e4p）的反应。pep和e4p分别是由糖酵解途径和戊糖磷酸途径产生的物质。最后一步反应是分支酸的生成。分支酸不仅是莽草酸途径的终产物，也是3种芳香族氨基酸和一些次生代谢产物的主要前体。分支酸的去向如图1所示。植物的次生代谢产物合成途径包括苯丙烷代谢途径、异戊二烯代谢途径和生物碱合成途径等。研究表明，许多次生代谢产物的芳香族氨基酸前体都是来自莽草酸途径产生的芳香族氨基酸及其中间产物，因此莽草酸途径在合成有商业价值的天然产物过程中起着非常重要的作用。莽草酸途径在植物中的重要性也得到证实，由莽草酸途径产生的物质大约占植物干重的35%以上。由于莽草酸途径在哺乳动物、鸟类、鱼类、爬行动物和昆虫中是不存在的，近年来它逐渐成为抗菌素、除草剂和活体疫苗的靶标。例如，由恶性疟原虫引起的疟疾，每年大约200多万人死于这种疾病，科学家利用莽草酸途经寻找新型的抗疟疾药，目前草甘膦作为疟疾的疗效药已经在小鼠身上成功试验。
2epSp合酶的分类、细胞中定位及不同组织中的分布
目前epSp合酶被分为两种类型，类型i包括来源于大肠杆菌（escherichiacoli）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）的epSp合酶；类型ii包括来源于覆盆子土壤杆菌（agrobacteriumtumefacienssp.Cp4）、无色杆菌（achromobactersp.LBaa）、假单胞菌（pseudomonassp.pG2982）等。类型ii的epSp合成酶多克隆抗体与类型i的epSp合酶不会发生抗原抗体交叉反应，而且两种类型序列一致性30%左右。i型epSp合酶对除草剂草甘膦敏感。ii型epSp合酶在草甘膦存在时，相对于i型epSp合酶表现出更高的催化效率。研究人员将ii型epSp合酶转入作物中可以对除草剂产生抗性，显著有效的控制了田间杂草。目前已知的ii型epSp合酶都是在微生物中存在的。在今天市场上销售的大多数耐草甘膦产品都含有农杆菌Cp4-epSpS。Della-Cioppa等发现在植物细胞中，前体epSp合酶存在于细胞核中，但是当该酶变为成熟的epSp合酶（matureenzyme）时，是存在于叶绿体内。epSp合酶是通过前体epSp合酶合成的。绝大多数植物的epSp合酶的活性中心存在于叶绿体中。前体epSp合成酶也具有催化活性，并且它的催化活性也受到草甘膦的抑制。前体epSp合酶的n端为信号肽所在的位置。信号肽的主要作用是引导epSp合酶进入叶绿体基质，之后信号肽被水解，前体蛋白就变成成熟的epSp合酶。例如，童旭宏等发现陆地棉epSp合酶基因编码521个氨基酸残基，前74个氨基酸残基为运输肽，当前体epSp合酶进入叶绿体后经加工剪切信号肽，变成成熟epSp合酶。成熟epSp合酶包含447个氨基酸，比前体epSp合酶氨基酸少了74个氨基酸，分子量约为48kD。信号肽对于epSp合酶定位于叶绿体起着决定性的作用。微生物的epSp合酶存在于细胞质中，并且没有一段氨基酸序列在n端，所以微生物epSp合酶无信号肽。我们通过转基因技术把微生物的epSp合酶基因导入植物中虽然能够成功表达epSp合酶，但是不能进入叶绿体，如果加上信号肽序列，就能把表达的epSp合酶定位到叶绿体上。植物中的epSp合酶主要存在叶片、根、顶端分生组织、嫩叶和胚芽鞘中，叶片中合成大量的芳香族氨基酸，而在根、顶端分生组织、嫩叶和胚芽鞘中既能够自身合成，也能吸收叶片中的芳香族氨基酸。
3epSp合酶的三维结构与活性区
Krekel等成功纯化出大肠杆菌的epSp合酶。通过对此酶核磁共振及晶体衍射研究分析发现，其合酶由两个结构域组成，每个结构域包含3个相同的βαβαββ折叠单位，每个折叠单位由两个平行的α螺旋和4个β折叠组成（图2）。研究人员发现大肠杆菌epSp合酶共有427个氨基酸残基，pep结合位点与Lys-22、arg-124、asp-313、arg-344、arg-386和Lys-411这6个氨基酸残基有关，arg-27与莽草酸-3-磷酸（S3p）结合位点有关。epSp合酶蛋白的n端和C端都在同一个结构域中，pep主要与epSp合酶的C端结构域结合，而S3p与epSp合酶主要结合在n端结构域［29-31］。两个平行的α螺旋在两个结构域间形成了可以吸引负电荷基团的正电荷区。epSp合酶存在状态分为两种：一种是开放（open）状态（图3-a），当没有底物与合酶结合，且两个结构域相距较远时存在的状态；当酶与底物S3p结合时，两个结构域相互靠近，并且在两个结构域之间裂缝中出现酶的活性位点，这时合成酶存在的状态为关闭（Closed）状态（图3-b）。
在关闭状态下，采用限制性胰消化酶也很难使其消化，在开放口的90-102位氨基酸及附近的1区（123-134位氨基酸）、2区（140-152位氨基酸）、3区（355-366位氨基酸）与底物结合，从而避免了这些区域被消化，通过这个试验确定了epSp合酶的活性区域。如果将epSp合酶与底物结合区域的某些氨基酸残基替代，如将Gly96改为ala、pro101改为Ser，则草甘膦就很难与合酶结合，这时该酶表现出耐草甘膦的特性。易弋等对盐藻的epSp合酶三级结构进行预测并对氨基酸序列进行多重比对发现，盐藻epSp合酶的氨基酸序列与高等植物、细菌一样，都有开放和关闭两种状态，并且都含有3处氨基酸序列非常保守的区域，这些非常保守的区域就是epSp合酶与酶底物pep、S3p或草甘膦结合的活性位点，如果改变保守区域中的一个位点，那么酶的活性将会改变，草甘膦的抑制作用也会减弱。研究人员发现细菌和植物的epSp合酶是一个单体酶，分子量大约为44-48kD。而真菌的epSp合酶属于aRom蛋白结构域中的其中一个，aRom蛋白通常是以二聚体形式存在的，单体形式下没有催化活性，分子量比较大，最多含有1618个氨基酸，最少含有1563个氨基酸，而且aRom蛋白是一个同时具有脱氢奎尼酸合酶、脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶和epSp合酶活性的5功能多肽，催化真菌中芳香族氨基酸合成途径的第3步到第6步的反应。
4epSp合酶的催化机制
epSp合酶作为莽草酸途径的第6位酶，参与合成芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸）和许多次生代谢产物，如泛醌（Ubinquinone），维生素K（Vitamink），维生素K2类（menaquinone）等。epSp合酶催化烯醇式丙酮酸基团从pep转化到S3p上形成产物epSp，并释放出一分子无机磷，这个化学反应是pep的C-o键裂解而不是经过p-o键的裂解，并且在pep上发生乙烯基质子的交换。之前有研究者认为合酶与底物的结合是随机的，但是通过用动力学优化的底物诱导试验证实了酶与底物结合是有先后顺序的。1988年，wibbenmeyer等将大肠杆菌epSp合酶纯化，当纯度达到97%以上时，通过核磁共振（nmR）和快速淬火动力学（Raidquenchkinetics）方法得到了epSp合酶催化S3p和pep的反应是一个缩合反应，epSp合酶和S3p及pep形成了一个四面体过渡态Ⅰ，并伴随着生成一个epSp缩酮副产物Ⅱ，过渡态Ⅰ随后生成epSp并释放一分子无机磷（图4-a）。1997年，Studelska等利用固体核磁共振（Solid-statenmR）方法对epSp合酶的催化机理重新进行了研究，发现pep首先和epSp合酶形成过渡态a、B，之后与S3p结合形成合酶缩酮过渡态C，而后生成epSp（图4-b），这种催化机理也得到了研究者的证实。
5epSp合酶基因及表达
目前已经从细菌，真菌和植物中分离克隆出许多epSp合酶基因。在原核生物中，许多epSp合酶基因被克隆与分析。1984年，Duncan等［44，47］首次克隆出长度为1284bp，编码427个氨基酸残基的e.coliepSp合酶基因，并且该基因内没有内含子。Comai等对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellavtyphimurium）epSp合酶基因进行克隆发现，基因编码427个氨基酸，合酶蛋白的分子量约为46kD。有研究者对大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌的epSp合酶基因进行了对比发现，二者的核苷酸序列差异为21%，同义密码子有78%在第1位或第二位碱基上发生变化，65%在第3位碱基上变化，氨基酸序列的同源性为93%，并且两种多肽的15个n端氨基酸残基也是相同的，在86-131位氨基酸之间的区域为高度保守区域，而在302-371和381-422位氨基酸之间的区域为C端高度保守区域。脯氨酸分别位于这两种合酶序列中的不同位置，位于鼠伤寒沙门氏菌epSp合酶序列的85位上，而在大肠杆菌中位于合酶序列的81位上，并且在81-85位的氨基酸残基在鼠伤寒沙门氏菌epSp合酶序列中是不存在的，两者其它部位的脯氨酸是完全保守的。在真菌中，许多epSp合酶基因也被克隆与分析。Charles等报道了真菌构巢曲霉（aspergillusnidulans）的epSp合酶基因，其合酶属于aRom蛋白结构域中的其中一个，基因中含有一个单一的阅读框架，长度为5311bp。于海涛等克隆分离得到了假丝酵母tY-Jm和黄曲霉tZ1985的epSp合酶蛋白编码序列。假丝酵母tY-Jm的epSp合酶编码序列长度为1311bp，编码436个氨基酸，理论分子量为46kD，黄曲霉tZ1985的epSp合酶编码序列长度为1353bp，编码450个氨基酸，理论分子量为48kD。通过与其它物种epSp合酶氨基酸序列对比分析，tY-JmepSp合酶基因与杜氏假丝酵母、热带假丝酵母和白假丝酵母等物种的同源性为80%，而与棒曲霉、核盘菌的同源性为66%，tZ1985epSp合酶基因与土曲霉、烟曲霉、白曲霉和黑曲霉的同源性为90%，而与白假丝酵母、杜氏假丝酵母和热带假丝酵母的同源性为68%。在进化关系上，tY-JmepSp合酶和tZ1985epSp合酶与真菌的epSp合酶有很近的亲缘关系，而与植物和细菌的epSp合酶亲缘关系比较远。
在植物中，一些epSp合酶基因也被克隆与分析。wang等发现烟草中有两种epSp合酶基因的cDna，两种cDna的长度分别为2000bp和1300bp，二者编码的氨基酸序列和核苷酸序列的同源性分别为95.9%和89%，但是两种epSp合酶的酶活力相同。刘晓军等从诸葛菜中也克隆出两段epSp合酶基因片段，其中一段长为797bp，另一段长为1157bp，两个片段的外显子序列是完全相同的，内含子相差很大，但是这两段基因编码出相同的epSp合酶，这两个片段所编码氨基酸序列与欧洲油菜、玉米、拟南芥、黑麦草、水稻及矮牵牛的一致性分别为85%、80%、83%、80%、79%和79%。Gasser等通过对比细菌、植物和真菌的epSp合酶编码区，获得了一个比较一致的模式（图5），三者epSp合酶中约有38%的氨基酸残基相同，细菌和植物之间epSp合酶的同源性为54%，真菌和植物之间epSp合酶的同源性为38%，这些数据表明真菌和植物中的epSp合酶的分枝比细菌和植物中此酶的分枝出现的早。
研究者发现epSp合酶基因在生物不同的组织中表达也是有差异的，在矮牵牛中其基因表达量最高的组织是花瓣，在银杏中表达量最高的是在果实和叶子中；其次为茎，最低的是在根中。木本植物喜树epSp合酶基因表达量最高的组织是在叶子，根中表达量最低。薤白epSp合酶基因在幼叶中表达量最高，而在壮叶和茎中表达量最低。出现这种表达差异的原因可能是由于epSp合酶基因在不同的组织中发生转录的起始位点不相同，也有研究者认为黄酮含量也与不同组织中epSp合酶基因的表达量有关。另一方面，有研究者报道，改变高度保守区域的氨基酸残基，可使epSp合酶与草甘膦的结合能力发生改变，从而使生物表现出抗草甘膦特性。
6epSp合酶基因的应用
epSp合酶不仅是除草剂草甘膦作用的靶标，也可以作为抗菌素和抗寄生虫药物的靶标；另一方面，epSp合酶活性大小对生物体内莽草酸的积累有重要影响。
6.1草甘膦及抗草甘膦epSp合酶基因
6.1.1草甘膦及其与epSp合酶作用机制草甘膦作为一种非选择性除草剂，在杀死杂草的同时，也会杀死农作物，从而限制了草甘膦的使用范围和时间，自1974年在美国注册登记以来，已成为当今世界上销售量最大且使用最广的农药品种，问世30多年来经久不衰。草甘膦与epSp合酶的作用机制是：草甘膦与pep在结构上非常相似，在莽草酸途径中草甘膦占据了epSp合酶和pep的连接位点，形成epSp合酶•S3p•glyphosate的复合物，使epSp合酶催化烯醇式丙酮酸基团从pep转化到S3p上形成epSp的过程停止，竞争性抑制epSp合酶的活性导致芳香族氨基酸和一些芳香化合物合成受阻，最终导致一些关键性代谢物和激素如酚类化合物、木质素、代谢失调，使生物体不能进行正常的氮代谢而死亡，而且epSp合酶进入叶绿体的过程也受草甘膦的抑制。
6.1.2抗草甘膦epSp合酶基因来源1983年，Comai等从鼠伤寒沙门菌中分离克隆出了抗草甘膦的突变基因——aroa基因，此后许多研究者对抗草甘膦基因进行了深入广泛的研究。抗草甘膦的epSp合酶基因主要来源于微生物和植物，而且研究者发现植物中的epSp合酶比细菌中epSp合酶对草甘膦的抗性大约低了两个数量级。表1为目前已获得的主要抗草甘膦epSp合酶基因及其来源。目前获得抗草甘膦epSp合酶编码基因的途径主要有两种：第1种是从天然抗草甘膦的物种或突变体中克隆分离出抗草甘膦基因或突变基因。在天然抗草甘膦基因中，土壤农杆菌Cp4-epSp合酶基因是应用最广泛的抗草甘膦epSp合酶基因，并形成商业化生产。除此之外，研究者从一些物种的突变体中克隆分离出抗草甘膦突变基因，如研究者克隆大豆、油菜、马铃薯及拟南芥抗草甘膦的epSp合酶突变基因发现，大豆epSp合酶基因编码的104Gly突变为ala，油菜epSp合酶基因编码的Gly96突变为ala，马铃薯和拟南芥epSp合酶第101位上Gly变为ala。Shah等从筛选出的抗草甘膦矮牵牛mp4——G细胞系中克隆出epSp合酶的cDna，将其cDna导入矮牵牛叶片后，对草甘膦的抗性明显提高。Scott等发现牛筋草的epSp合酶基因发生突变，第101位脯氨突变为色氨酸后，对草甘膦具有很低的敏感度，表现出抗草甘膦。第2种是利用遗传学方法改造epSp合酶编码基因，提高对草甘膦的抗性：定点突变可以减小酶与草甘膦的亲和力或提高酶与底物的亲和力，从而提高对草甘膦的抗性。tian等利用定点突变使苹果的epSp合酶基因编码的thr101变为ala，ala187变为thr，通过动力学分析证实两个氨基酸突变后提高了对草甘膦的抗性；ming等使用易错倾向pCR随机突变技术使来源于大肠杆菌和沙门氏菌的aroa基因发生突变和重组，得到arom1、arom2、arom3和arom44种突变体，通过epSp合酶活性的动力学分析表明，4种突变体的4个突变基因编码的epSp合酶的活性比突变前提高了2-10倍，与烯醇式丙酮酸的亲和性提高了2.5-19倍，与草甘膦的Ki值提高了0.4-8倍；Lebrun等使用定点突变，从玉米中克隆获得了抗草甘膦的Cp4基因，而且先正达公司通过转基因技术开发出了耐草甘膦玉米品种Ga21。研究者发现，通过遗传学方法改造epSp合酶编码基因，虽然提高了生物对草甘膦的抗性，但是也降低了epSp合酶的催化活性，因此，目前改造成功并用于商业化生产的抗草甘膦转基因作物的基因几乎全部是Cp4-epSp合酶基因。
6.2在抗菌素和抗寄生虫药物上的应用epSp合酶可以作为抗菌素的靶标，如研究者通过试验删除肺炎链球菌和支气管炎博德特菌的epSp合酶的基因后，发现二者的毒性减弱。在抗寄生虫药物方面，研究者已经证实草甘膦能够抑制toxoplasmgondii、Cryptosporidium以及plasmodiumfalciparum（malaria）等顶复门寄生虫的生长。
6.3epSp合酶新型抑制剂草甘膦作为epSp合酶的抑制剂是众所周知的，但随着epSp合酶晶体与催化底物机理的深入研究，也推动了epSp合酶新型抑制剂的研发。如研究者根据S3p•glyphosate、epSp合酶的分子模型，设计并合成了与除草剂草甘膦具有类似抑制作用的化合物4，用等温低定量热法测定epSp合酶与化合物4的连接常数值Kd为0.53±0.04μmol/L，而epSp合酶•S3p+glyphosate的Kd值为0.15±0.03μmol/L，前者Kd值仅仅是后者的3.5倍，而且通过动力学、光谱学和微量热法证实了化合物4与epSp合酶的结合位点和S3p与酶的结合位点是相同的，从而抑制epSp合酶的催化活性。研究者报道了莽草酸衍生物、羟基丙二酸衍生物等都可以与epSp合酶形成四面体过渡态，从而使epSp合酶活性受到抑制。目前，草甘膦依然是作用于该靶标的有效抑制剂，还没有新的epSp合酶抑制剂商业化应用，但随着除草剂草甘膦的使用越来越广，抗草甘膦杂草也越来越多，所以epSp合酶新的抑制剂研究必将会成为热点［74］。
6.4epSp合酶对莽草酸代谢的影响莽草酸是生物体内许多物质合成代谢的中间体，也是人工化学合成许多生物碱、芳香氨基酸与吲哚衍生物、手性药物（如抗病毒药）的原料。近年来，禽流感爆发此起彼伏，危害人类健康安全。莽草酸是合成目前在临床上唯一一种有效抗禽流感药物——磷酸奥斯米韦（商品名为达菲，为瑞士Roche制药公司生产）的关键原料，因此生物合成莽草酸的研究是目前的一个研究热点。epSp合酶是莽草酸代谢下游的一个重要酶，研究表明，减弱或切断该酶基因的表达或抑制其酶活性也有利于莽草酸的合成积累。Kramer等报道，敲除epSp合酶基因，使莽草酸和莽草酸-3-磷酸大量累积，后者去磷酸化后就获得目标产物。2011年公布的美国专利“草甘膦在微生物发酵法生产莽草酸中的使用”就是利用草甘膦对epSp合酶的抑制作用来提高微生物发酵生产莽草酸产量。Bresnahan等研究报道，在给小麦施加非选择性除草剂草甘膦后，不仅有助于农作物的丰收，而且草甘膦还可以被吸收并转移到植物的活性生长区内，通过抑制epSp合酶的合成，能够干扰莽草酸的正常代谢途径。在试验中观察到，在小麦乳熟期使用草甘膦会使其内部的莽草酸最多增加24倍，若在蜡熟期使用，其内部的莽草酸能增加3倍。
7结语
生物途径的有机化学篇8
1 灸法的药性作用(化学作用)
1.1 艾是最常用的灸用燃料。它除了具有易得、易燃的特点外，还具有显著的药物效应。
中医学认为艾属温性，其味芳香，善通十二经脉，具有理气血、逐寒湿、温经、止血、安胎的作用。《本草纲目》：“艾叶，生则微苦太辛，熟则微辛太苦，生温熟热，纯阳也。可以取太阳真火，可以回垂绝元阳……灸之则透诸经而治百种病邪，起沉苛之人为康泰，其功亦大矣”。《本草正》也认为“艾叶，能通十二经脉，而尤为肝脾肾之药，善于温中、逐冷、除湿，行血中之气，气中之滞……或生用捣汁，或熟用煎汤，或用灸百病，或炒热熨敷可通经络，或袋盛包裹可温脐膝，表里生熟，俱有所宜”。说明艾具有广泛的治疗作用，虽然在灸治过程中艾叶进行了燃烧，但药性尤存，其药性可通过体表穴位进入体内，渗透诸经，起到治疗作用；又可通过呼吸进入机体，起到扶正驱邪、通经活络、醒脑安神的作用；对位于体表的外邪还可直接杀灭，从而起到治疗皮部病变和预防疾病的作用。
1.2 现代研究结果证实，燃艾时可产生具有治疗作用的化学物质。
艾灸燃烧时是否产生了具有治疗作用的物质呢?日本大西［1］和西谷［2］通过研究认为，艾燃烧后生成一种物质，有抗氧化并清除自由基的作用。艾燃烧生成物的甲醇提取物，有自由基清除作用，并且比未燃烧的艾的甲醇提取物作用更强。施灸局部皮肤中过氧化脂质显著减少，此作用是艾的燃烧生成物所致。艾的燃烧不仅没有破坏其有效药物成分，反而使之有所增强。艾燃烧生成物中的抗氧化物质，附着在穴位处皮肤上，通过灸热渗透进入体内而起作用的。
2 灸法的热作用(物理作用)
2.1 灸法是以燃烧艾绒而治病，燃烧时的热效应也是产生治疗效果的重要因素。
《素问．异法方宜论》：“北方者，天地所闭藏之域也，其地高陵居，风寒冰冽，其民乐野处而乳食，脏寒生满病，其治宜灸焫，故灸焫者也从北方来”。说明灸法燃烧艾绒产生的温热作用可治疗因为寒冷引起的疾病。随着历史的发展，艾灸治疗疾病的范围早已超出了寒证的范围，它具有温经散寒、通络止痛、驱风解表、消瘀散结、拔毒泄热、温中散寒、补中益气、升阳举陷、回阳固脱、预防保健等作用，可广泛用于临床各科多种种疾病，涉及寒、热、虚、实诸证。产生这些治疗效果，均与燃艾时产生的热作用是分不开的。艾灸时产生的热恰到好处，除了使人感到特别舒适外，更是一种良性治疗因子，这种因子作用于腧穴，具有特别的亲和力，艾火的热力不仅影响穴位表层，还特别能通过腧穴深入体内，影响经气，深透筋骨、脏腑以至全身，发挥整体调节作用，而用于治疗多种疾病。
2.2 现代研究证实，艾灸燃烧时产生的热量，是一种十分有效并适应于机体治疗的物理因子红外线。根据物理学的原理，任何物体都可以发射红外线和吸收红外线，人体也不例外。近红外线对人体的穿透深度较远红外线深，最多可达10mm，并被机体吸收。杨氏［3］的研究认为，艾灸在燃烧时产生的辐射能谱是红外线，且近红外线占主要成分。近红外线可激励人体穴位内生物分子的氢键，产生受激相干谐振吸收效应，通过神经—体液系统传递人体细胞所需的能量。艾灸时的红外辐射可为机体细胞的代谢活动、免疫功能提供所必需的能量，也能给缺乏能量的病态细胞提供活化能。而艾灸施于穴位，其近红外辐射具有较高的穿透能力，可通过经络系统，更好地将能量送至病灶而起作用，说明了穴位具有辐射共振吸收功能。
3 经络腧穴与艾灸理化作用的有机结合，产生了灸法的“综合效应”
3.1 经络腧穴是艾灸施术的部位，灸法防治疾病的“综合效应”，是由艾灸理化作用和经穴特殊作用的有机结合而产生的。
艾灸的药性作用和热作用只有作用于经络腧穴，才能起到全身治疗作用。例如，艾灸保健作用的产生是与强壮穴结合的结果。艾灸作用于关元穴有回阳救逆的作用；艾灸作用于百会穴有升阳举陷的作用；艾灸作用于阿是穴可起到消瘀散结、拔毒泄热的作用。因此我们认为，经穴是灸法作用的内因，而艾灸产生的药性和热是灸法作用的外因。内、外因素的有机结合，才能共同发挥灸法防治疾病的“综合效应”。
3.2 经络腧穴是否在灸法治疗中起到特殊作用呢?上述杨氏的研究已经说明了物理因子与经、穴的特殊关系。虽然目前尚无艾灸的药化作用进入经络特殊传递途径的直接研究，但其它类似研究可证明这一特殊途径的存在。刘氏［4］等在穴位注射的研究中发现，在适当选穴的情况下行药物穴位注射，可在短时间内产生与静脉注射同等或更强的药效，并认为穴注下药效的产生并非通过血液循环的途径，而是另有作用途径和机制。这一不同于血循环的途径，就是经络的特殊途径。这一研究证实了经、穴特殊作用途径的存在。由此我们可以认为，艾灸的药化物质，通过穴位皮肤进入腧穴后，也完全可能通过此途径到达病位和全身，并较快地起到治疗作用。
综上所述，艾灸产生治疗作用的机理，虽然传统中医的认识源于临床经验的总结，但他与现代研究的结果是基本一致的，而现代研究结果为传统艾灸理论提供了实验依据。因此我们认为，灸法的作用是由艾灸燃烧时的物理因子和药化因子，与腧穴的特殊作用、经络的特殊途径相结合，而产生的一种“综合效应”。经络腧穴对机体的调节是灸法作用的内因，艾灸时艾的燃烧和所隔药物是灸法作用的外因，两者缺一不可。
灸法是临床常用治法，有很好的应用前景，但人们对灸法的作用原理的认识和研究还不够深入、系统，尚需作更多的深入细致的研究、探讨，使之发挥更大的作用。
参考文献
1.大西基代.艾燃烧生成物的自由基清除作用研究.国外医学*中医中药分册 1992；14(3)：60
2.西谷郁子.关于艾的燃烧生成物中含有的抗氧化作用物质.国外医学.中医中药分册 1989；11(5)：47～48
生物途径的有机化学篇9
关键词：污染土壤；危害；植物修复；技术
植物修复是利用某些植物对土壤重金属的超量吸收挥发以及对土壤中有机污染物降解等特殊功能，并与根际微生物协同作用，进行原位修复污染土壤的方法，这种方法费用低，效果显著，不影响环境，是一种极具发展潜力的“绿色产业”。植物修复的对象是重金属、有机物或放射性元素污染的土壤及水体的一项绿色技术。
一、土壤污染的含义以及危害
土壤污染是指有毒有害污染物的数量和速度超过了土壤的容纳能力和净化速度，而通过多种途径进入土壤。造成土壤的物理、化学和生物学性质、组成及性状等发生变化，使土壤的自然动态平衡遭到破坏，从而导致土壤自然功能失调、土壤质量恶化、严重影响作物的生长发育和产品的质量，从而产生一定的环境效应，并可通过食物链对生物和人类构成危害。土壤污染的危害包括隐蔽性和滞后性、累积性和不可逆性、不易治理性和后果严重性。
二、植物修复技术的含义
植物修复技术包括利用植物超积累或积累的植物吸取修复，利用植物代谢功能的植物降解修复、利用植物根系控制污染扩散和恢复生态功能的植物稳定修复、利用植物转化功能的植物挥发修复、利用植物根系吸附的植物过滤修复等技术；重金属、农药、石油和持久性有机污染物、炸药、放射性核素等是被植物修复的污染物。这种技术的应用关键在于筛选具有高产和高去污能力的植物，摸清植物对土壤条件和生态环境的适应性。
三、植物修复的研究和机理
1.植物修复的研究。植物修复是一项绿色技术，它是利用植物修复有毒重金属、有机物、放射性核素污染土壤、沉积物、地表水和地下水，是一项利用太阳能动力的处理系统。作为早期有机污染植物修复的研究对象是石油烃类，其修复机理已有较清楚的认识。
2.植物修复机理。植物修复技术是一种绿色的修复技术，已经引起人们极大兴趣和关注，植物修复技术是污染土壤修复技术中发展最快的领域。当前进行的土壤污染的植物修复机理包括植物提取作用、根际降解作用、植物挥发等作用。
3.植物修复技术的局限性。植物修复既是一种符合公众心理需求的新技术，是一条绿色的，生态的净化途径，而且也是一种经济有效的净化的方案。该技术对环境扰动少，可以说是真正意义上的“绿色修复技术”。但是植物修复技术也具有其局限性，这种局限性主要表现在：（1）目前发现的超富集植物所能累积的元素大多较单一，而土壤污染通常是多元素的复合污染。（2）超富集植物生产比较缓慢，生物量低，而且生长周期比较长，因此从土壤中提取的污染物的总量有限。（3）目前发现的超富集植物几乎都是野生植物，人们对其农艺性状、病虫害防治、育种潜力以及生理学等方面的了解还不够深刻，所以难以优化栽培和培育。（4）犹豫超富集植物的根系比较浅，只能吸收浅层土壤中的污染物，对较深层土壤中的污染物则无能为力。（5）异地引种对生物多样性的威胁，要引起足够的重视，这是一个不容忽视的问题。（6）植物器官往往会通过腐烂、落叶等途径使重金属污染物重返土壤，因此要将富集重金属的超富集植物进行收割并作为废弃物妥善处理。
4.植物修复技术发展前景
（1）植物修复涉及一系列技术，包括不同的植被类型，其作用对象、修复机理和能力都是不相同的。（2）利用放射性同位素标记技术，加强研究植物体内各种生理生化代谢途径对污染物胁迫下的适应性反应，如光合反应、呼吸代谢、激素应激对污染物胁迫是如何做出适应性改变的，还要加强研究污染物胁迫下植物次生代谢途径反应以及逆境信号传导途径。（3）从分子生物水平加强对植物解毒机理等基础理论的研究。应重点围绕根系来探索解毒机制和污染物在植物体内的运输机制，植物吸收污染物首先要经过根系，因此，要了解植物、土壤、微生物整个体系下各物质之间的相互作用。（4）植物一微生物联合修复技术可以成为一种很有发展前途的新型生物修复技术，需进一步完善其理论体系、修复机制和修复技术。
生物途径的有机化学篇10
[关键词]中药功效成分；合成生物学
RecentadvancesofsyntheticbiologyforproductionoffunctionalingredientsinChinesemateriamedica
SUXinyao1，2，XUeJianping2，wanGCaixia1*
（1.instituteofChinesemateriamedica，ChinaacademyofChinesemedicalSciences，Beijing100700，China；
2.HuaibeinormalUniversity，Huaibei235000，China）
[abstract]thefunctionalingredientsinChinesemateriamedicaarethemainactivesubstancefortraditionalChinesemedicineandmostofthemaresecondarymetabolitesderivatives.Untilnow，themainmethodtoobtainthosefunctionalingredientsisthroughdirectextractionfromtheChinesemateriamedica.However，theincomeisverylowbecauseofthehighextractioncostsandthedecreasedmedicinalplants.Syntheticbiologytechnology，asanewandmicrobialapproach，canbeabletocarryoutlargescaleproductionoffunctionalingredientsandgreatlyeasetheshortageoftraditionalChinesemedicineingredients.thisreviewmainlyfocusedontherecentadvancesinsyntheticbiologyforthefunctionalingredientsproduction.
[Keywords]fuctionalingredients；syntheticbiology
doi：10.4268/cjcmm20162211
中药功效成分是中药发挥防病治病等功能的物质基础，其大多是来自药用植物的次生代谢产物或其衍生物，具有多种药理学活性，如抗癌，抗氧化，提高免疫力等。根据生物活性的起源这些中药功效成分可分为苯丙烷类（phenylpropanoids）、异戊二烯类（isoprenoids）、多聚酮类（polyketides）、生物碱类（alkaloids）以及黄酮类（flavonoids）[1]。不同种类的中药功效成分在药物开发中均有应用，如抗疟疾药物青蒿素，用于治疗阿兹海默症的石杉碱a，用于治疗感冒的麻黄素、抗癌药物喜树碱以及对埃博拉病毒感染具有治疗效果的粉防己碱，在治疗肥胖中有巨大潜力的南蛇藤醇等[24]。这些例子都展示了中药功效成分在疾病治疗与防御以及其他未解决的疾病方面有很大的应用前景。
目前，中药功效成分的获取途径主要有①直接从药源植物中分离提取；②化学及半化学合成途径；③基于作用机制了解清晰的基础上，寻求替代物；④利用植物细胞或组织培养技术；⑤微生物合成法。
直接从中药中分离提取有效活性成分是目前中药功效成分获取的主要途径。但该方法过度依赖于中药资源，据统计，这些活性成分大约2/3来源于野生资源，而药用功效成分多为次级代谢产物，在植物中的积累量极低，如红参中稀有人参皂苷Rh2的质量分数低于0.001%[5]；虽然中药的栽培技术已日渐成熟，但其培养条件要求较高，且耗时耗力，生产成本高；而通过化学合成，无论是化学合成或半化学合成的方法，都会受其特殊的化学结构如手性及不对称中心的限制；利用药用植物细胞或组织培养，能够克服以上多方面问题，目前，以中药功效成分为生产目标的细胞工程数量大约有100多种，研究表明，约40种活性物质经组织培养，其含量甚至高于原植株水平，但大多数中药组培机制研究不甚清楚，而且受基因型以及细胞毒性，生产成本等限制，除了较为典型的例子如人参、紫草外，利用该方法进行工业化生产成功的例子并不多。
中药功效成分的微生物合成生物学法，即在系统生物学基础上，采用工程学的设计思路和方法，通过对相关功能基因的模块化设计及改造，并充分考虑合成过程中适配性的问题，将中药功效成分的合成过程或其前体物质的生物合成途径转移到微生物细胞中，利用微生物的发酵过程完成药用天然活性物质的高效异源的合成。该方法主要是基于目标产物生物合成路径较为清晰的基础上利用微生物易于培养，不受环境影响且生长周期短，生产系统规范化，反应条件温和易于控制，产物成分较为单一，易于分离和提取以及环境友好等特点，解决中药功效成分来源稀缺，化学合成困难，以及造价高的一系列问题，为中药功效成分的工业化生产以及可持续利用提供了一个新的可行的方法。因其在生产中所带来的巨大作用，“合成生物学”被誉为可改变世界的十大新技术之一。本文将介绍中药功效成分合成生物学的应用及研究进展。
1中药功效成分合成生物学进展
随着本草基因组学[6]、高通量测序结合分子生物学工具等的应用，大大加速了中药功效成分合成生物学的研究进展，在不同的底盘生物如大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等，多种中药功效成分尤其是来源于药用植物的单体药物等都取得了巨大的研究进展。
1.1青蒿素
青蒿素的合成，从黄花蒿中提取青蒿素是目前获取青蒿素的主要途径，每年全世界对青蒿素的需求都在增加，而黄花蒿中青蒿素质量分数很低仅为0.01%～0.8%，单一从黄花蒿中提取青蒿素没法满足其巨大的需求。随着参与青蒿素生物合成的各种酶基因不断得到克隆，通过转基因手段在植物体内促进其生物合成、或在微生物中重建其代谢途径的工作取得了较大的进展[717]。
2003年Keasling实验室[7]将优化后的紫槐二烯合成酶基因aDS导入大肠杆菌中，通过结合来自酵母的甲羟戊酸途径（mVa）的相关基因，首次合成了青蒿素的关键前体物质紫穗槐二烯，通过发酵优化，其产量达到了0.5g・L-1。尽管经过不断的优化研究，大肠杆菌工程菌株产紫槐二烯的量达27.4g・L-1[8]，但是因为p450基因在大肠杆菌体内表达的受限，上下游代谢流的不匹配，使得团队将青蒿酸的合成从大肠杆菌转移到酵母菌株上来。2006年，该团队成功鉴定了催化紫穗槐二烯到青蒿酸的关键基因细胞色素p450氧化酶基因（CYp71aV1），基因功能显示该酶催化紫穗槐4，11二烯的三步氧化，生成青蒿酸。团队将aDS基因连同鉴定的CYp71aV1和与其相关的还原伴侣aaCpR基因同时在酵母中进行表达，成功构建了第一株产青蒿酸的酵母菌株，尽管青蒿酸的产量仍旧比较低，但是这一工作具有创新的意义[910]。2008年Covello研究小组[11]发现青蒿醛Δ11（13）双键还原酶基因（DBR2）在青蒿的腺毛组织组织中表达量很大，克隆该基因其功能催化显示这一基因对于青蒿醛这一底物具有很高的活性。研究团队在酵母中将DBR2基因连同aDS，CYp71aV1和CpR基因一起导入后，在酵母菌株中产生二氢青蒿酸。Donald等[12]将截短了的3羟基3甲基戊二酰辅酶a还原酶（HmGR1）基因（tHmGR）导入酿酒酵母中，增加了HmGR1的表达量从而使角鲨烯的合成量大大提高。由于角鲨烯合酶（eRG9）促使法尼基焦磷酸（Fpp）流向角鲨烯，相对的抑制了青蒿素的合成，因此，Ro等[9]通过抑制鲨烯合酶基因（eRG9）的表达减少Fpp流向角鲨烯，使紫穗槐二烯产量提高了2倍。pitera等[13]研究小组通过增加HmGR和法呢酰二磷酸酯合酶基因（eRG20）的拷贝数，提高了紫穗槐二烯的产量。另研究发现萜类调控因子蛋白UpC2是酵母细胞一个重要转录因子，调控固醇生物合成，对其进行过表达，能够提高紫穗槐的产量。
2013年，Keasling团队研究发现，相比UpC5，细胞色素b5基因（CYB5）能有效促进青蒿醇到青蒿醛的反应，而通过对青蒿腺毛转录组数据的分析，鉴定了乙醇脱氢酶基因（aDH1）和乙醛脱氢酶基因（aLDH1）分别是催化青蒿醇形成青蒿醛，青蒿醛形成青蒿酸的基因，这2个基因在酵母体内的表达，大大降低了青蒿酸中间产物青蒿醇和青蒿醛的产量，大幅度提高了终产物青蒿酸的产量，结合超表达上游mVa的所有基因包括乙酰乙酰辅酶a硫解酶基因（eRG10），HmGCoa合酶基因（eRG13），tHmG，甲羟戊酸激酶基因（eRG12），磷酸甲羟戊酸激酶基因（eRG8），二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因（eRG19），异戊烯基二磷酸异构酶基因（iDi）和eRG20同时通过启动子的替换将eRG9基因表达强度进行弱化以减少碳流走向三萜途径，青蒿酸合成途径的下游基因包括aDS，CYp71aV1，CYB5，aDH1，aLDH1等基因在酵母体内进行表达。这些菌株改造结合优化的发酵策略，酵母产青蒿酸的产量达到了25g・L-1，初步达到了工业化水平[17]。除了增加通往青蒿素生物合成的代谢流，提高青蒿素的贮存能力也是解决青蒿素产量问题的一个有效途径[1415]。
青蒿素生物合成的工业化必将带来青蒿素生产方式的彻底变革，也是缓解日益严重的青蒿素短缺局面的根本出路。同时，采用酵母发酵产青蒿素，其最终产物仅有青蒿素，目的产物含量高且单一，大大降低了后期分离纯化的成本。
1.2紫杉醇
紫杉醇是一种紫杉烷二萜类化合物，基本骨架为三环二萜[18]。1971年首次由wani等从短叶红豆杉taxusbrevifolia树皮中提取出来一种次级代谢产物，具有低毒、高效的抗癌效果[19]，自1992年上市以来，一直是治疗卵巢癌、乳腺癌等癌症的首选药物，是目前最好的抗癌药物之一，市场需求巨大。
目前，紫杉醇的生产方法主要包括源植物提取法[20]、化学合成法以及生物合成法。紫杉醇的半合成法，是工业化生产紫杉醇的主要方法[2123]，合成该技术已比较纯熟，但紫杉醇的生产仍受限于有限的红豆杉资源，无法满足市场需要；利用合成生物学技术，通过微生物来合成紫杉醇的前体物质，再运用半合成法合成紫杉醇是目前应用前景最广阔的一种方法，经过多年的研究，已经取得了巨大的进展[5，7，2426]。
Huang等[24]将脱氧木酮糖5磷酸合酶基因（DXS）基因同iDi异构酶基因、脚6基脚6基二磷酸合酶（GGDps）基因以及紫杉醇二烯合酶基因在大肠杆菌BL21（De3）中进行共表达，以异戊二烯焦磷酸为原料进行发酵，合成了紫杉醇合成途径中的重要中间体――紫杉二烯，产量为13mg・L-1。首次成功的在工程菌株中合成紫杉烯，为紫杉醇的微生物合成提供了基础。ajikumar等[25]利用代谢工程多元模块法，以异戊烯焦磷酸（ipp）为节点，将紫杉醇生物合成途径分为2个模块，即：产ipp的内源性2甲基D赤藓糖醇4磷酸（mep）途径的上游模块和合成异源萜类化合物途径的下游模块。上游模块包括mep途径的4个关键酶基因（dxs，idi，ispD和ispF），由操纵子（dxsidiispDF）控制过表达；下游模块包括2个基因焦磷酸牛龙牛儿基牛龙牛儿酯（GGpp）合酶基因（G）和紫杉二烯合成酶基因（t）。将下游模块导入底盘细胞中并过表达上游模块后，虽然紫杉醇二烯的代谢流有所增加，但其合成量极少（不足10mg・L-1），因此，该研究小组采用“多元系统搜索”的方法寻找上下游模块平衡的最优组合，并通过改变质粒拷贝数和启动子强度的方法对下游模块的表达进行调节，使其达到最优化，最后紫杉醇二烯合成量最高达1.02g・L-1，是紫杉醇中间体紫杉醇二烯合成量最高的报道。Zhou等[26]通过大肠酵母共培养技术进行紫杉醇的微生物合成，首先在酿酒酵母BY4700中融合表达5αCYp（p450taxadiene5αhydroxylase）基因和其还原酶基因CpR来催化紫杉醇合成过程中的第一个氧化反应，然后将培养基中的碳源由葡萄糖替换为木糖以解决共培养过程中乙醇对菌体及目的产物的抑制作用；增加酵母接种量，将上述构建的酵母菌株中的融合基因5αCYpCpR启动子替换为UaSGpDp，在大肠杆菌中过表达葡糖胺磷酸乙酰转移酶（pta），乙酸激酶（acka），并敲除atpFH和aCS基因以增加含氧紫杉烷类的合成量；最后将更换了强启动子的tat（taxadien5αolacetyltransferase）基因和融合了一个CYp还原酶的10βCYp（taxane10βhydroxylase）基因在上述构建好的酵母菌株中进行共表达，最终含氧紫杉烷类合成量为33mg・L-1，提高了酵母产紫杉醇前体产物的产量并为无法发在单一微生物中进行生物合成的化合物的合成提供了一种新的解决方法。
1.3人参皂苷
人参皂苷（ginsenoside）是由三萜苷元和糖、糖醛酸以及其他有机酸组成的三萜皂苷类化合物，是人参及西洋参的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化作用[27]。随着人参皂苷的生物合成路径的解析和相关酶的基因的克隆及鉴定，应用发酵菌株合成人参皂苷也取得了巨大的成功。
2013年，中国学者戴住波等[2829]将人参来源的达玛二烯合成酶基因（pgDDS），原人参二醇合成酶基因（CYp716a47）和拟南芥（arabidopsisthaliana）来源的atCpR1基因，导入酵母菌株中，并对相关基因tHmG1，eRG20，eRG9，eRG1等进行了系统调控，同时对相关密码子进行优化成功构建出了产原人参二醇的工程菌株，原人参二醇的产量1.2g・L-1，较原始出发菌株产量提高了262倍。这是首次人参皂苷重要前提物质原人参二醇在酵母中实现从葡萄糖的合成。接着该团队构建了同时可以生产原人参二醇、原人参三醇以及齐墩果酸的酵母菌株，其发酵产量可以生产17.2mg・L-1的原人参二醇，15.9mg・L-1的人参三醇以及21.4mg・L-1的齐墩果酸，实现酵母细胞同时生产多种人参功效成分。
2015年，Zhou等[26]成功克隆出了糖基转移酶（UGt）的UGtpg1基因，该基因可以催化原人参二醇合成人参皂苷CK这一物质，CK被证实是人参皂苷进入血液中起功效的活性成分，在鉴定这一基因后，该团队在酵母细胞中组装了人参皂苷CK合成途径的基因，最终利用酵母细胞成功生产人参皂苷CK。接着，基于人参的转录组数据，该团队在进一步的工作中鉴定了UGtpg45和UGtpg29这2个糖基转移酶的基因，UGtpg45在原人参二醇的3号碳位的羟基上加入葡萄糖，形成人参皂苷Rh2，UGtpg29则是进一步催化人参皂苷Rh2形成人参皂苷Rg3，验证此2个基因的催化功能后，在酵母细胞中组装原人参二醇合成基因以及UGtpg45和UGtpg29，最终成功构建了产人参皂苷Rh2和Rg3的酵母菌株，尽管目标产物的生产浓度还比较低，都在μmol・gDCw-1的水平，但是这些工作为昂贵的单一人参皂苷生物合成提供了坚实的基础。
1.4丹参酮
丹参酮是丹参中一类从唇形科植物丹参中提取得到的具有显著药理活性的脂溶性二萜化合物，包括丹参酮i、丹参酮Ⅱa、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、异隐丹参酮等10余种化合物，具有抑菌，抗炎，抗凝血等作用，是国际上广泛认可的用于治疗心脑血管疾病的天然药物之一[3031]。
二萜类化合物合成来自2个常见的前体物质：ipp和二甲基烯丙基焦磷酸（Dmapp）模块，它们在酵母中通过meV途径合成。而大部分ipp和Dmapp前体物质进入麦角固醇合成路径。在此基础上，研究者们通过多种合成生物学策略来提高酵母中合成丹参酮的量，例如Dai等[32]研究表明过表达tHmGR基因和突变监控因子基因（upc2.1），可以增加Fpp的供给量，但次丹参酮二烯合成量并未增加，反而积累了大量的鲨烯（78mg・L-1）。与此相反，通过过表达融合基因Fpp合酶（eRG20）和内源性的GGpp合酶基因（BtS1）以及来自酸热硫化叶菌的异源性的GGpp合酶基因（SaGGpS），次丹参酮二烯产量增加到了8.8mg・L-1。过表达eRG20BtS1和SaGGpS基因将次丹参酮二烯产量从5.4mg・L-1增加到了28.2mg・L-1。过表达tHmGRupc2.1和eRG20BtS1SaGGpS在产次丹参酮二烯时具有协同作用，次丹参酮二烯产量61.8mg・L-1，最后经流加培养发酵，次丹参酮二烯产量488mg・L-1，为丹参酮的生物合成奠定了基础。丹参生物合成路径中的共同前体物质――次丹参酮二烯是由SmCpS和SmKSL催化合成。高伟等[3334]首次克隆了编码丹参柯巴基焦磷酸合酶（SmCpS）、丹参类贝壳衫烯合酶（SmKSL）的全长基因，随后将这2个基因通过模块组合的方式将SmCpS和SmKSL以及BtS1，eRG20，tHmG等5个基因导入酵母底盘细胞中，次丹参酮二烯产量达到365mg・L-1。Guo等[3536]鉴定了14个与次丹参二烯生物合成相关的CYp450基因，将CYp76aH1及来自于丹参的细胞色素还原酶基因SmCpR1和SmCpR2基因整合到产次丹参酮二烯的工程菌株中，铁锈醇合成量为10.5mg・L-1，同时发现铁锈醇的产量和次丹参酮二烯的积累量呈负相关。随后通过进一步的共表达分析，又发现了丹参酮生物合成分支路径上的2个新的p450还原酶基因CYp76aH3和CYp76aK1，并通过生化方法以及Rna干扰技术表明CYp76aH3在2种不同的碳中心使铁锈醇氧化，CYp76aK1羟化产生的2个生成的中间体的C20，最终将铁锈醇氧化为11，20二羟铁锈醇，11，20二羟柳杉芬，进一步实现了对丹参酮中间产物的发现。
1.5红景天苷
红景天苷（salidroside）是一种多元皂苷，为红景天Rhodiolarosea（也称为“人参”）植物中最为重要的生物活性成分[3738]，具有多种生理调节属性，如抗氧化、抗微波辐射、抗疲劳、抗病毒、抗肿瘤以及抗衰老等[3940]。然而红景天生存环境恶劣（一般生长在高海拔寒冷地区），传粉困难且生长缓慢，加之近年来的过多开发，野生红景天的资源正在枯竭的边缘[41]，此外，红景天中红景天苷的质量分数相对较低，仅为0.5%～0.8%，远不能满足人们日益增长的需求。
研究表明，红景天苷属于酪氨酸代谢产物，其合成路径解析已较为清楚：来自于莽草酸途径的L酪氨酸通过酪氨酸脱羧酶（tDC）转化为酪胺；随后酪胺在酪醇氧化酶（tYo）和乙醇脱氢酶（aDH）的连续催化作用下进一步转换成红景天苷的苷元――酪醇[42]，随后酪醇和尿苷二磷酸葡萄糖（UDpG）在尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UDpglucosyltransferase，UGt）催化作用合成红景天苷。Bai等[43]成功运用酵母丙酮酸脱羧酶（aRo10），内源性aDHs，来自红景天的糖基转移酶UGt73B6，第一次成功地在大肠杆菌中合成了红景天苷。随后经过一系列的基因操作，包括灭火特异性转录调节基因tyrR，删除丙酮酸激酶基因pyka和pykF以及分枝酸变位酶/预苯酸脱水酶基因phea，过表达编码L络氨酸途径中各种酶的基因，包括分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的反馈抑制突变基因tyra（tyra×syn），脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸合酶的反馈抑制突变基因，即aroG（aroG×syn），磷酸烯醇丙酮酸合酶基因（ppsa），转酮醇酶（tkta），莽草酸脱氢酶（aroe），3脱氢奎尼酸脱水酶基因（aroD）和优化后的3脱氢奎尼酸合酶基因（aroBop），有效的提升酪醇生产效率，红景天苷最高产量达56.9mg・L-1，为红景天苷合成提供了一个操作简单，经济效益高的，可用于大规模生产的方法。另外，该研究同时还表明从红景天中提取的糖基转移酶UGt73B6通过将葡萄糖添加到酪醇的酚醛位置来催化淫羊藿次苷D2的形成，这是关于淫羊藿苷的产物生物合成的报道。
2中药合成生物学策略
合成生物学是一门在基因工程、代谢工程等经典学科上发展起来的整合学科，是一门将生物学工程化的学科，其目的在于将复杂的自然生物代谢系统改造为由简单的可控的模块或零件，经计算机辅助设计对其进行模拟预测，从而构建出由天然或非天然的功能元件或模块组成的生物系统，实现生物系统在各领域的模块化应用。其基本思路是：首先，根据目标产物选择合适的底盘细胞，之后将设计好的目标产物合成途径在底盘细胞中进行重建，对所创建的合成途径进行模块式优化，并根据目标产物的产量调整优化策略，以达到合成途径和底盘生物的最优化适配，最终实现目标产物的大量合成。
2.1中药功效成分合成路径的创建
目前，中药功效成分的合成途径构建可以分为2种模式，第一种模式是在充分了解目标天然代谢产物代谢途径的基础上，根据研究目的，将目的产物所在基原物种的生物合成途径转移到微生物中，利用底盘细胞中原有的或者重新构建的代谢途径大量生产目标产物；另一种模式是根据目标产物或其合成过程中的中间体的化学结构，利用已挖掘基因元件的功能，实现对目标产物的合成甚至生产自然界中不存在的化学物质。
2.1.1原代谢途径的直接转移对原代谢途径的直接转移，重构和工程化这种模式对新代谢途径的构建可分为3种方式[44]。
第一种方式是将来源不同的与目标产物合成有关的基因整合到底盘细胞中，利用底盘生物的主要和次要代谢所提供的前体物质，然后通过异源基因的表达将其转化为目标产物。这种基于基因工程基础上的构建方式是目前最为简单的构建方式，被广泛的应用到了不同的底盘细胞中去，但它的目的主要是对所设计的代谢途径在不同底盘细胞中重构的可行性进行检验。
第二种代谢方式也是基于底盘细胞固有的中间体供应机制，在第一种方式的基础上，还导入了中药功效成分生物合成模块和底物调控模块，通过调节底物合成量来达到提高目标产物的合成量。如Dai等[2829]在构建产原人参二醇的工程菌株时，除了导入pgDDS，CYp716a47以及atCpR1基因外，同时通过对相关基因tHmG1，eRG20，eRG9，eRG1等进行了系统调控，原人参二醇的产量1.2g・L-1，较原始出发菌株产量提高了262倍；Donald等[12]将截短了的HmGR1基因（tHmGR）导入酿酒酵母中，增加了HmGR1的表达量从而使青蒿素的前体物质角鲨烯的合成量大大提高。
第三种方式是在前2种方式基础上，同时导入底物合成模块、底物调控模块以及中药功效成分生物合成模块，这种方式可以不依赖于底盘细胞的底物供应，既可以在无底物供应的情况下完成目标产物或其前体物质的合成外，还可以同时利用底盘细胞供应的前体以及新引入的底物供应途径提供的底物进行目标产物及其中间体的合成。最经典的是Keasling实验小组在构建的产紫穗槐4，11二烯的大肠杆菌中，将来自于酿酒酵母的甲羟戊酸合成模块（底物调控模块）、Fpp合成模块（底物合成模块）以及紫穗槐4，11二烯合成模块（中药功效成分生物合成模块）这3个模块同时导入底盘菌株中，成功构建了产青蒿素前体物质紫穗槐4，11二烯的工程菌株，后经优化操作，紫穗槐4，11二烯产量达27.4g・L-1[10]。ajikumar等[25]将紫杉醇生物合成途径分为2个模块，即：产ipp的内源性mep途径的上游模块和合成异源萜类化合物途径的下游模块。将下游模块导入底盘细胞中并过表达上游模块，经最后优化后，紫杉醇二烯合成量最高达1.02g・L-1。
2.1.2产目标中药功效成分的新合成路径的创建这种模式是基于对所需合成的目标产物或其中间体的化学结构了解比较清楚的情况下，在底盘细胞中对中药功效成分或中间体的合成路径进行重新设计，然后根据这条路径从基因数据库中筛选出与目标产物合成有关联的酶基因，将这些酶基因导入受体细胞中，在底盘细胞中进行组装、表达，从而构建出一条全新的、与原植物中的合成路径相差很大的合成路径。采用这种模式构建的代谢途径与原底盘细胞中固有的代谢途径相差比较大，不需要对代谢途径有太深入的了解。上述1.5项中红景天苷和淫羊藿苷的合成都是这一方式的典型案例。
2.2对中药功效成分合成路径计算机模拟设计
当选定要生产的目标产物时，首先要确定该产物的最优合成途径。伴随着新一代的测序技术以及生物信息学分析技术的发展为合成路径的发现提供了一个新的选择，即参考代谢流分布，设计一些启发式的假设（如菌体最大生长量、产物最大合成量等），进行通量平衡分析（FBa），最小代谢调整分析（moma）等insilico分析方法，通过各种各样的依靠大规模的细胞代谢模型其他工作对细胞代谢进行系统的模拟操作，通过计算机模拟出最高的物质产出（流平衡分析），确定最优的合成途径。目前，化学计量的基因组尺度代谢模型是最常用的一种模型，它能够对整体代谢网络进行深入的思考以及对如何将中央路径引入到其他细胞的新陈代谢中[45]。
最早最简单的关于化学计量模型（基因尺度或非基因尺度）是发现产品的最大理论产量和最高产量的中代谢的流量分布。optStrain算法可以搜索反应数据库，找到可以添加到网络提高理论产量额外的反应。这些方法已经取得了巨大的成功，例如二氢青蒿酸的生产[46]。alper等[47]通过应用moma方法，鉴定并通过实验证实了缺失7个基因的e.coliJe660菌株中番茄红素的合成量显著提高（比原菌株高约40%），成功完成了对大肠杆菌中能够改善番茄红素合成量的靶基因位点的预测及鉴定工作；2011年，Song等[48]利用基因组规模代谢网络和流量平衡分析，确定2个氨基酸和4个维生素作为必要化合物补充到培养基中，将改善曼琥珀酸的产量（比原培养基中提高15%）。Sun等[49]提出了一种基于约束条件，通过计算机模拟生物可达到的最佳反应速率，基于模拟结果，确定能够改善萜类物质潜在的敲除位点，结果表明，相比野生型，大多数单突变体产生紫穗槐二烯的产率增加8～10倍。
2.3对所创建的代谢途径的优化调控
将基因导入到底盘细胞后，需要对其所产生的一系列不良反应[5055]，采取一定的应对措施进行优化调控。第一个要解决的障碍是确保导入基因的协调表达，异源合成途径导入过程往往会打破微生物在长期的自然进化过程中所形成的代谢方式，破坏细胞内基因表达的动态平衡，造成上下游途径的不适配性，引起中间代谢物尤其是有毒中间代谢物的大量积累，造成细胞毒性，严重影响细胞的正常生长，致使目标产物无法高效合成[50]，同时也会影响细胞自身的生长繁殖[51]。这可以通过正确选择包括启动子的调节组分和转录终止子，以及核糖体结合位点，分别控制转录和翻译速率；另一方面，由于底盘细胞无法自发的对外源基因的表达进行调控，因此还会诱发一系列的不良反应如严谨反应，热激反应，压力反应等[5254]，而这些不良反应又会造成细胞的多种改变如质粒不稳定，细胞裂解以及遗传信息的改变等[55]。为了避免这些因素对产物合成的影响，必须对所构建的工程菌株进行优化。
2.3.1启动子一般来讲，协调多基因表达最常用的方法就是采用不同的启动子对不同的基因分别进行调控。目前常用的启动子分为2类：组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子是一类可以在保持下游基因持续表达的启动子，并且不需要任何诱导剂，其表达系统最为经济简便，对于比较低廉的化学品以及药物来说，使用组成型启动子可以节约成本。但是过早的表达产物会对细胞造成毒害作用，影响宿主细胞的生长，甚至会导致宿主细胞的死亡。因而，在利用工程菌生产中药功效成分时，大多用的还是诱导型启动子，这也是协调多基因表达最直接，最简单的方法。VanDienSJ等[56]在大肠杆菌中用ptac启动子控制大肠杆菌多聚磷酸盐激酶（ppK）的表达，同时用另一诱导型启动子pBaD对聚磷酸酶（ppX）基因的表达进行调控，通过在菌株的不同生长时期添加不同的诱导剂，对两基因在不同的时期进行表达实行了简单的调控。但在实际运用中，诱导型启动子只能对基因的表达起到粗略的调控，即对所控制的基因实行全部开启或全部关闭，而不能实现对基因表达的精细调控；另一方面，诱导型启动子的数量以及诱导剂之间的相互干扰也极大的限制了这一方法的大规模应用。针对这一问题，科学家们首先想到的是对启动子进行改造，即应用启动子工程，构建出能够满足不同表达强度需求的启动子库。ReddingJohanson等在构建产倍半萜烯紫山槐4，11二烯的大肠杆菌工程菌株时，甲羟戊酸激酶（mK）和磷酸甲羟戊酸激酶（pmK）2种蛋白质的表达水平非常低。为了克服这一瓶颈，对mK和pmK基因进行密码子优化以及替换强启动子，这些变化显著提高了紫山槐4，11二烯的产量（4500mg・L-1）[57]。另外就是通过筛选得到能够响应同一诱导物的具有不同表达强度的诱导型启动子，从而避免不同诱导剂之间的相互干扰，如ajikumar等[25]利用代谢工程多元模块法生产紫杉醇二烯实验中，上游模块就是由trc启动子控制mep途径的4个关键酶基因（dxs，idi，ispD和ispF）。但该方法所能利用的启动子库非常少。
2.3.2建立动态平衡在合成路径的构建往往会增加几个数量级的前体途径的代谢流，即使是细胞本源的代谢路径，也会使酶活性水平的失衡，导致代谢物浓度的巨大波动。例如，在利用酵母中异戊二烯途径产青蒿素过程中，会有2个中间体在这个途径导致细胞生长抑制，一是HmGCoa，它会在脂肪酸生物合成路径中导致反馈抑制，这是由于它和malonylCoa的相似性所导致的；一个是倍半萜的直接前体物质法呢基焦磷酸（Fpp）。而Fpp代谢流需要很大才能满足萜类物质大量合成的要求，当下游途径的表达模块与Fpp供应量不能相协调时，Fpp的积累会造成细胞毒性，对细胞生长造成威胁，同时，目标产物的合成也受到影响。针对这一问题，Dahl等[58]将来源于大肠杆菌的对Fpp压力起负调控的启动子被用来调控上游乙酰辅酶a硫解酶（atoB），而对其起正调控启动子被用来调控下游ads的表达，通过设计紫槐二烯途径以及甲羟戊酸途径的动态回路，成功促进了紫槐二烯的合成；Yuan等[59]利用实时定量pCR对酿酒酵母中基因的表达进行了探究，发现当细胞中麦角固醇积累时，羊毛甾醇14α去甲基化酶（eRG11）、C8甾醇异构酶（eRG2）、C5甾醇去饱和酶（eRG3）这3个基因的表达是下调的，并对调控这些基因的启动子进行了鉴定，利用这些响应启动子对eRG9的表达进行调控，萜类合成量提可高2～5倍。
2.3.3操纵子策略在原核生物中，多个相关基因在表达是往往会被组合成一个操纵子，而操纵子基因之间的序列能够直接影响mRna的加工以及稳定性。合成生物学运用这一特性，用一个启动子对多个基因进行表达进行调控。pfleger等通过改变基因间的区域（tunableintergenicregions，tiGRs）这一方法，成功实现了对同一个操纵子中多个不同基因的精确调控。该方法通过构建包含mRna二级结构、Rna酶切位点以及核糖体结合位点的tiGRs库，对这些调控元件进行适当的组合，得到最优化的Dna序列，pfleger等利用该方法，对大肠杆菌中异源的甲羟戊酸途径中的3个基因的表达量进行了平衡调控，最终，甲羟戊酸产量提高了7倍[60]。
2.3.4支架蛋白支架蛋白是存在于生物信号转导系统中的一种不具备酶活性的蛋白质，能同时将2个或多个功能相关的蛋白质结合在一起，从而保证了信号传递的特异性和高效性。以该理论为基础，通过人工设计支架蛋白，对代谢途径中相关酶进行优化和改造，把功能相关的酶形成可控的复合体，通过对代谢途径中基因表达的精密调控，在提高底物的有效浓度的同时，解决细胞毒性以及代谢压力的问题，最终达到提高底物转化效率的目标。Keasling实验小组[50]根据大肠杆菌工程菌中所构建的甲羟戊酸途径，设计构建了一个由3个不同配基组成的支架蛋白，同时对该途径中的3个合成酶atoB、羟甲基戊二酰Coa合酶（HmGS）、HmGR添加了相应的配体，通过改变支架蛋白上配基的数量来改变着3个酶的化学计量数，从而达到平衡代谢流、减少细胞负荷的目的，同时甲羟戊酸生产浓度提高了77倍。虽此方法可以对代谢流进行精密高效的控制，但自然界中的支架蛋白只存在于其固有的信号途径中，而对其进行设计及改造十分局限，实施起来难度较高，目前成功的例子很少。
3展望
中药功效成分的获取，无论是从中药中提取，还是化学合成、半化学合成以及一些其他方法等，这些方法都有很大的局限性，同时无法满足人类对中药功效成分的需求。合成生物学方法利用微生物易于培养等特点生产中药功效成分，为其可持续利用提供了一个新的可行的方法。虽然合成生物学起步较晚，但发展迅猛，各种高效、简便的生物学技术也相继诞生，如高通量测序技术、不同尺度的Dna组装技术以及一些文库，如启动子文库、核糖开关文库等的建立，都极大的推动了该方法的发展。通过合成生物学技术，利用微生物发酵来进行中药功效成分的异源合成已经取得的一系列成果，如青蒿素、人参皂苷、丹参酮等的生物学合成，尤其是青蒿素的生物合成方面更是显示出了其在中药功效成分合成方面的巨大优势和潜力，为中药领域的开发注入了新的活力。
尽管利用合成生物学生产中药功效成分近几年取得了很大进展，但这一领域同样存在很大的困难和问题，最主要的是目标产物的产量达不到工业化的需求，很多中药功效成分的合成还处于实验室合成阶段，在产量比较低的情况，造成目的产物生产成本比较高，因此目前而言，合成生物学技术生产功效成分适用于那些资源短缺、植物中含量低且比较贵重的中药功效成分。另外，中药功效成分生源合成途径的解析限制了利用合成生物学进行生产这些成分，尽管目前已有青蒿素、人参皂苷等成分的合成途径解析，但是中药大部分功效成分的解析依然存在很大的困难，进展缓慢，这严重限制了合成生物学在合成中药功效成分上的利用，因此实现目标产物产量的提高和更多中药功效成分生物合成途径的解析应是未来合成生物学生产中药功效成分的重点研究方向。
[参考文献]
[1]JulsingmK，Koulmana，woerdenbagHJ，etal.Combinatorialbiosynthesisofmedicinalplantsecondarymetabolites[J].Biomoleng，2006，23（6）：265.
[2]QiuJ.traditionalmedicine：acultureinthebalance[J].nature，2007，448（7150）：126.
[3]SakuraiY，Kolokoltsovaa，ChenCC，etal.twoporechannelscontrolebolavirushostcellentryandaredrugtargetsfordiseasetreatment[J].Science，2015，347（6225）：995.
[4]LiuJ，LeeJ，HernandezmaS，etal.treatmentofobesitywithcelastrol[J].Cell，2015，161（5）：999.
[5]wangp，weiY，FanY，etal.productionofbioactiveginsenosidesRh2andRg3bymetabolicallyengineeredyeasts[J].metabeng，2015，29：97.
[6]陈士林，宋经元.本草基因组学[J].中国中药杂志，2016，41（21）：3381.
[7]martinVJJ，piteraDJ，withersSt，etal.engineeringamevalonatepathwayinescherichiacoliforproductionofterpenoids[J].natBiotechnol，2003，21（7）：796.
[8]tsurutaH，paddonCJ，engD，etal.Highlevelproductionofamorpha4，11diene，aprecursoroftheantimalarialagentartemisinin，inescherichiacoli[J].pLoSone，2009，4（2）：e4489.
[9]RoDK，paradiseem，ouelletm，etal.productionoftheantimalarialdrugprecursorartemisinicacidinengineeredyeast[J].nature，2006，440（7086）：940.
[10]LindahlaL，olssonme，merckep，etal.productionoftheartemisininprecursoramorpha4，11dienebyengineeredSaccharomycescerevisiae[J].BiotechnolLett，2006，28（8）：571.
[11]ZhangY，teohKH，ReedDw，etal.themolecularcloningofartemisinicaldehydeDelta11（13）reductaseanditsroleinglandulartrichomedependentbiosynthesisofartemisinininartemisiaannua[J].JBiolChem，2008，283（31）：21501.
[12]DonaldKa，HamptonRY，FritziB.effectsofoverproductionofthecatalyticdomainof3hydroxy3methylglutarylcoenzymeareductaseonsqualenesynthesisinSaccharomycescerevisiae[J].applenvironmicrobiol，1997，63（9）：3341.
[13]piteraDJ，paddonCJ，newmanJD，etal.Balancingaheterologousmevalonatepathwayforimprovedisoprenoidproductioninescherichiacoli[J].metabeng，2007，9（2）：193.
[14]Grahamia，BesserK，BlumerS，etal.thegeneticmapofartemisiaannuaL.identifieslociaffectingyieldoftheantimalarialdrugartemisinin[J].Science，2010，327（5963）：328.
[15]SinghnD，KumarS，DaniellH.expressionofβglucosidaseincreasestrichomedensityandartemisinincontentintransgenicartemisiaannuaplants[J].plantBiotechnolJ，2015，14（3）：1034.
[16]ZhanY，LiuH，wuY，etal.Biotransformationofartemisininbyaspergillusniger[J].applmicrobiolBiotechnol，2015，99（8）：3443.
[17]paddonCJ，westfallpJ，piteraDJ，etal.Highlevelsemisyntheticproductionofthepotentantimalarialartemisinin[J].nature，2013，496（7446）：528.
[18]phillipsonJD.phytochemistryandpharmacognosy[J].phytochemistry，2007，68（22）：2960.
[19]wanimC，taylorHL，wallme，etal.plantantitumoragents.Vi.isolationandstructureoftaxol，anovelantileukemicandantitumoragentfromtaxusbrevifolia[J].JamChemSoc，1971，93（9）：2325.
[20]ZaiyouJ，Lim，GuifangX，etal.isolationofanendophyticfungusproducingbaccatinⅢfromtaxuswallichianavar.mairei[J].JindmicrobiolBiotechnol，2013，40（11）：1297.
[21]JenneweinS，CroteauR.taxol：biosynthesis，moleculargenetics，andbiotechnologicalapplications[J].applmicrobiolBiotechnol，2001，57（1/2）：13.
[22]altavillaa，iacovelliR，procopioG，etal.medicalstrategiesfortreatmentofcastrationresistantprostatecancer（CRpC）docetaxelresistant[J].CancerBiolther，2012，13（11）：1001.
[23]DenisJn，Greeneae，GuenardD，etal.Highlyefficient，practicalapproachtonaturaltaxol[J].JamChemSoc，1988，110（17）：5917.
[24]HuangQ，RoessnerCa，CroteauR，etal.engineeringescherichiacoliforthesynthesisoftaxadiene，akeyintermediateinthebiosynthesisoftaxol[J].BioorgmedChem，2001，9（9）：2237.
[25]ajikumarpK，XiaowH，tyoKeJ，etal.isoprenoidpathwayoptimizationfortaxolprecursoroverproductioninescherichiacoli[J].Science，2010，330（6000）：70.
[26]ZhouK，QiaoK，edgarS，etal.Distributingametabolicpathwayamongamicrobialconsortiumenhancesproductionofnaturalproducts[J].natBiotechnol，2015，33（4）：377.
[27]何道同，王兵，陈B明.人参皂苷药理作用研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2012，14（7）：118.
[28]DaiZ，YiL，ZhangX，etal.metabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforproductionofginsenosides[J].metabeng，2013，20（5）：146.
[29]DaiZ，wangB，LiuY，etal.producingaglyconsofginsenosidesinbakers′yeast[J].SciRep，2014，4（4）：3698.
[30]RobertsonaL，HolmesGR，Bojarczukan，etal.azebrafishcompoundscreenrevealsmodulationofneutrophilreversemigrationasanantiinflammatorymechanism[J].Scitranslmed，2014，6（225）：225ra29.
[31]DongY，morrisnatschkeSL，LeeKH.Biosynthesis，totalsyntheses，andantitumoractivityoftanshinonesandtheiranalogsaspotentialtherapeuticagents[J].natprodRep，2011，28（3）：529.
[32]DaiZ，LiuY，HuangL，etal.productionofmiltiradienebymetabolicallyengineeredSaccharomycescerevisiae[J].BiotechnolBioeng，2012，109（11）：2845.
[33]高伟.丹参酮类化合物生物合成相关酶基因克隆及功能研究[D].北京：中国中医科学院，2008.
[34]Gaow，HillwigmL，HuangL，etal.afunctionalgenomicsapproachtotanshinonebiosynthesisprovidesstereochemicalinsights[J].orgLett，2009，11（22）：5170.
[35]GuoJ，ZhouYJ，HillwigmL，etal.CYp76aH1catalyzesturnoverofmiltiradieneintanshinonesbiosynthesisandenablesheterologousproductionofferruginolinyeasts[J].procnatlacadSciUSa，2013，110（29）：12108..
[36]GuoJ，maX，CaiY，etal.Cytochromep450promiscuityleadstoabifurcatingbiosyntheticpathwayfortanshinones[J].newphytologist，2016，210（2）；525.
[37]QuZ，ZhouY，ZengY，etal.protectiveeffectsofaRhodiolacrenulataextractandsalidrosideonhippocampalneurogenesisagainststreptozotocininducedneuralinjuryintherat[J].pLoSone，2012，7（1）：e29641.
[38]YangY，LiuZ，FengZ，etal.LignansfromtherootofRhodiolacrenulata[J].JagricFoodChem，2012，60（4）：964.
[39]maoGX，DengHB，YuanLG，etal.protectiveroleofsalidrosideagainstaginginamousemodelinducedbyDgalactose[J].BiomedenvironSci，2010，23（2）：161.
[40]ouyangJF，LouJ，YanC，etal.invitropromoteddifferentiationofmesenchymalstemcellstowardshepatocytesinducedbysalidroside[J].Jpharmpharmacol，2010，62（4）：530.
[41]YanZYt.ecologicalanalysisonsexualreproductiveproduceandendangeredreasonofRhodiolasachalinensis[J].BullBotanRes，1998，18（3）：336.
[42]SatohY，tajimaK，munekatam，etal.engineeringofatyrosolproducingpathway，utilizingsimplesugarandthecentralmetabolictyrosine，inescherichiacoli[J].JagricFoodChem，2012，60（4）：979.
[43]BaiY，BiH，ZhuangY，etal.productionofsalidrosideinmetabolicallyengineeredescherichiacoli[J].SciRep，2014，4：6640.
[44]KongJQ，wangw，ChengKD，etal.Researchprogressesinsyntheticbiologyofartemisinin[J].actapharmSinica，2013，48（2）：193.
[45]KingZa，LloydCJ，Feistam，etal.nextgenerationgenomescalemodelsformetabolicengineering[J].CurropinBiotechnol，2015，35：23.
[46]misraa，ConwaymF，JohnnieJ，etal.metabolicanalyseselucidatenontrivialgenetargetsforamplifyingdihydroartemisinicacidproductioninyeast[J].Frontmicrobiol，2013，4：200.
[47]alperH，JinYS，moxleyJF，etal.identifyinggenetargetsforthemetabolicengineeringoflycopenebiosynthesisinescherichiacoli[J].metabeng，2005，7（3）：155.
[48]SongH，KimtY，ChoiBK，etal.Developmentofchemicallydefinedmediumformannheimiasucciniciproducensbasedonitsgenomesequence[J].applmicrobiolBiotechnol，2008，79（2）：263.
[49]SunZ，mengH，LiJ，etal.identificationofnovelknockouttargetsforimprovingterpenoidsbiosynthesisinSaccharomycescerevisiae[J].pLoSone，2014，9（11）：e112615.
[50]Zhumm，LawmanpD，CameronDC.improving1，3propanediolproductionfromglycerolinametabolicallyengineeredescherichiacolibyreducingaccumulationofsnglycerol3phosphate[J].Biotechnolprog，2002，18（4）：694.
[51]DueberJe，wuGC，malmircheginiGR，etal.Syntheticproteinscaffoldsprovidemodularcontrolovermetabolicflux[J].natBiotechnol，2009，27（8）：753.
[52]wickLm，eglit.molecularcomponentsofphysiologicalstressresponsesinescherichiacoli[J].advBiochemengBiot，2004，89：1.
[53]HarcumSw，Bentleywe.Heatshockandstringentresponseshaveoverlappingproteaseactivityinescherichiacoli[J].applBiochemBiotechnol，1999，80（1）：23.
[54]GillRt，ValdesJJ，Bentleywe.acomparativestudyofglobalstressgeneregulationinresponsetooverexpressionofrecombinantproteinsinescherichiacoli[J].metabeng，2000，2（3）：178.
[55]wangJ，QiQ.Syntheticbiologyformetabolicengineering――areview[J].ChinJBiotechnol，2009，25（9）：1296.
[56]VanDienSJ，KeaslingJD.optimizationofpolyphosphatedegradationandphosphatesecretionusinghybridmetabolicpathwaysandengineeredhoststrains[J].BiotechnolBioeng，1998，59（6）：754.
[57]ReddingJohansonam，BatthtS，ChanR，etal.targetedproteomicsformetabolicpathwayoptimization：applicationtoterpeneproduction[J].metabeng，2011，13（2）：194.
[58]DahlRH，ZhangF，alonsoGutierrezJ，etal.engineeringdynamicpathwayregulationusingstressresponsepromoters[J].natBiotechnol，2013，31（11）：1039.