光学显微技术篇1
【摘要】
目的探讨应用激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection,LCm)技术获取高同质性肺癌组织细胞及正常对照肺泡上皮细胞的方法及可行性。方法将新鲜肺癌组织标本及其配对正常组织常规制备8μm冰冻切片，采用改良的He方法染色；应用LCm技术大宗切割肺鳞癌、腺癌及正常对照肺泡上皮细胞；选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞。结果通过LCm技术可以准确、快速地分离癌细胞、间质及其他坏死组织，得到同质性不低于95%的肿瘤细胞和正常细胞。按照Duration15.5s的激光脉冲频率和平均8000shots条件，既可保证每个帽子的细胞收集数量，也能够有效地缩短实验时间，提高实验可控性，从而使操作过程标准化。结论应用LCm技术可以成功获取同质肺癌细胞和正常细胞。其所需标本量少、组织同质性高、操作过程稳定、可控性好，是肺癌分子生物学及蛋白质组学研究有价值的样品制备方法。
【关键词】激光捕获显微切割；肺癌组织；蛋白质组学
applicationoflasercapturemicrodissectiontocapturepurecells inlungcancerandtheirpairednormallungtissues
aBStRaCt:objectivemicroheterogeneityisanimportantprobleminmolecularlybiologicalandproteomicresearchonmalignancies.thegoalofthisstudywastoinvestigatethemethodtopurifytargetedcellsinlungcanceranditspairednormaltissuesforproteomicstudyonlungcancerapplyinglasercapturemicrodissection(LCm).methodsLCmtechniquewasemplogedtoobtainthecellsoflungcancertissuesandtheirpairednormaltissuesfromfrozensections.ResultsLCmcanbeappliedtoquicklyandpreciselyobtainpuretargetedcellssubgrouporsinglecellwithoutinterstitiumunderthemicroscope.ConclusionLCmcantackletheproblemoftissueheterogeneityinmolecularanalysissuccessfully.theseresultsindicatethatLCmhasapotentialasatoolinlungcancerproteomicresearch.
KeYwoRDS:lasercapturemicrodissection;lungcancertissue;proteomics
蛋白质组学是当今肿瘤学研究领域中的一个热点，而“差异”蛋白质组学又是蛋白质组学研究的一个突破口。在有关“差异”的研究中，若原始样品不是分别来自同一类型，或样品存在着杂质蛋白的污染，那么所得实验数据的准确性和说服力必然会受到影响[1]。众所周知，人体组织器官是多种细胞的复合，肿瘤组织的不均一性是肿瘤细胞的重要特征。因此，如何从复杂、不均一的样品中获得理想的高同质性的组分成为实验中亟需解决的主要问题之一。激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection,LCm)技术的出现为上述问题提供很好的解决方案。该方法的突出特点是能在目视下从样品异挑选同类细胞乃至单一细胞；从而剔除间质细胞和坏死组织及其他可能影响结果分析的杂质成分[2]。本研究应用LCm针对不同类型组织标本，选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞，以期探讨该方法在肺癌研究中的技术参数和操作流程。
1材料与方法
1.1标本的收集及制备收集西安交通大学医学院第二附属医院胸外科、陕西省人民医院胸心外科及陕西省肿瘤医院胸外科2005-2006年经病理诊断证实的手术切除肿瘤标本12例，其中肺鳞癌6例，肺腺癌6例。正常对照组织为同一患者正常肺组织。12例患者中男性8例，女性4例；有吸烟史者5人，平均吸烟指数1900支/年；肿瘤分期：Ⅰ期2例、Ⅱ期7例(Ⅱa3例，ⅡB4例)、Ⅲ期3例。所有病例标本均在手术室采集，具体操作如下：待组织标本离体后立即切取肿瘤组织，同时切取正常对照组织；4℃冰盐水冲洗3-5次，将血液冲净，均匀分割成0.2cm×0.2cm×0.2cm组织块，分装于标志清楚的0.5mL离心管中；先置液氮中速冻，后置于-80℃冰箱保存备用。整个标本采集过程耗时控制于30min内。
1.2试剂和仪器苏木精、伊红、无水乙醇、二甲苯、尿素等均为国产分析纯。组织包埋剂(otC)，冰冻切片机(microm，Hm500)，超低温冰箱(thermoForma-86℃)，pixcell显微激光切割系统(arcturus,USa)及乙烯乙酸乙烯酯膜帽子细胞收集器(eVaLCmCaps)。
1.3方法
1.3.1冰冻切片的制备及染色预处理载玻片(将普通载玻片清洗干净，流水冲洗后泡酸过夜，双蒸水冲洗干净，60℃烘干备用)。取0.2cm×0.2cm×0.2cm大小组织两块，otC包埋，待组织包埋固定完全，将切片机箱内温度设置为-25℃进行切片，切片厚度8μm，每次连续制作15张切片，-80℃保存备用。两组肿瘤组织和对照各6例，每例患者制作切片15张，进行He染色，方法如下：苏木精10s，捞片置于冰水冲洗10s，伊红15s，85%、95%(体积分数)乙醇各20s，无水乙醇2min，2次，二甲苯Ⅰ2min，二甲苯Ⅱ2min。上述染色过程在冰盒中进行，染液温度控制于4-10℃，总时间控制在10min以内。完毕后进行激光捕获。
1.3.2激光捕获将染色完好切片置于pixcell显微激光切割系统10×10倍目镜直视观察，重点观察细胞形态和染色情况。找到细胞密集、形态较好、染色满意区域，装载细胞收集器；在10×20倍目镜下调节监视器，按照如下条件：power100mV、Duration15.5s、Spotssize15.5μm、Current8.0ma，每张切片平均8000shots条件进行捕获。总捕获时间不超过40min。
2结果
切片按照改良的He方法染色后，均能获得细胞形态完整、对比度好、肿瘤细胞和间质可清楚区分的合格切片。在设定捕获条件下，每张切片捕获后能够将90%以上的细胞收集，细胞同质性高(图1)。按照理论测算，每个shots可以捕获4-6个细胞，即每个帽子收集装置可以获得25000-30000个细胞数。总体捕获结果见表1。
表1不同组织标本显微切割结果（略）
table1effectsofmicrodissectionineachgroup(n=6)
图1激光捕获不同组织细胞及捕获细胞同质性显示（略）
Fig.1examplesoflasercapturemicrodissectedindifferenttissuesHe×100
a:heterogeneityofcellsaftermicrodissection;B:matchednormaltissuesaftermicrodissection;C:squamouscellcarcinomatissuesaftermicrodissection;D:adenocarcinomatissuesaftermicrodissection
3讨论
肺脏是一个开放器官，容易受到外界污染，加之肺癌组织含有较多间质细胞而且容易坏死，因此，按照传统方法进行组织块研磨提取总蛋白进行分析，结果难免会受到杂质蛋白的影响。LCm技术现已成为蛋白质组学研究中获得纯化的目的细胞的理想工具，其在实体瘤研究中应用较多，技术方法亦日臻成熟[3?5]。但据文献报道，该方法主要用于核酸分子以及染色体研究，在肺癌组织蛋白组学研究领域鲜见[6]。本研究应用LCm技术切割不同类型肺癌组织，获得250个帽子收集装置和8.7×106个细胞数。从捕获操作过程中我们发现，捕获细胞的同质性、细胞收集率以及操作过程所耗费时间是影响激光捕获及后续蛋白质组学实验结果的关键因素。由于LCm是在直视下操作，细胞纯度可以保证。经随机抽取3组、45个帽子收集装置，使用pixcellii显微激光切割系统内标记尺划分观察视野，抽样估算收集装置内细胞同质性可达到95%以上，该结果与文献报道一致[7]。当然，文献报道最多的是关于基因和分子水平的研究，但其中的切片制作和LCm切割部分是相同的。pixcellii显微激光切割系统是新一代系统，该系统的优点是使用的是乙烯乙酸乙烯酯膜的塑料帽(ethylenevinylacetatecaps,eVacaps)细胞收集装置，可避免操作者手接触所收集到的细胞，减少污染机会。eVa膜需要和细胞紧密接触才能够被激光束融化而将目标细胞收集，因而LCm过程受很多因素影响而不能保证将每个捕获细胞均能收集。激光捕获仪主要参数有：power、Duration、Spotsize、Repeat及Current等。一般在打开系统进行切割之前，应先在帽子空白区空打5-6次，观察激光能量，光点大小是否合适，以光点能够完全覆盖目标细胞为宜。本实验中所选择条件是：power100mw、Duration15.5ms、Spotsize7.5-15μm、Repeat0.2s、Current8.0ma。Zhukov等[8]应用LCm切割肺癌组织时认为，鳞癌可选择7.5μm激光束，腺癌中用15μm，可获得较好效果。在本实验中，我们发现激光束的大小与鳞癌和腺癌组织类型关系不明显，但与切片的制作和捕获操作过程关系较大，切片的厚度、脱水时间和eVa膜是否和细胞紧密接触是重要影响因素。制作切片时应将切片厚度控制于8-9μm，以8μm效果最佳，超过10μm因切片过厚则细胞发生重叠从而使细胞收集困难，同时要注意不能使切片产生褶皱，造成切片表面与eVa膜之间存在缝隙，影响捕获效果。在He染色步骤中，二甲苯疏松时间、组织含水量及环境湿度等均可影响捕获结果。二甲苯疏松时间不足细胞较难从周围组织分离。对环境湿度和组织含水较多者应及时更换染液，适当延长乙醇的脱水时间。但过分延长脱水时间则使组织变的干燥松脆，出现帽子与切片不能紧密接触而无法捕获。在实验过程中梯度乙醇的最长脱水时间为2min。乙烯乙酸乙烯酯膜的塑料帽(eVacaps)应置于4-10℃、干燥环境妥善保存。如帽子受潮，则激光激发能量可被乙烯乙酸乙烯酯膜大部分吸收而非穿透，致使帽子与组织接触局部温度升高，产生组织和捕获细胞灼伤。从肿瘤组织类型看，腺癌的捕获收集成功率最高，可以达到91%；鳞癌相对较差，可能与鳞癌多有癌巢及角化珠形成、癌细胞与间质结合较为致密有关。考虑到正常肺泡及支气管上皮细胞体积相对较小、细胞分布相对稀疏，故正常对照组应多捕获约10个帽子，以保证病例和对照之间可溶性蛋白总量的均衡性。在所有蛋白质组学实验中，标本处理时间都是有严格要求的[9]。一般认为，组织标本超过30-40min常温暴露往往造成细胞内蛋白质大量降解而影响检测结果。在本实验中，我们使用改良的He染色方法，较标准方法时间缩短14min，明显减少组织暴露时间。但从染色效果看，该方法对细胞核染色效果不佳、核浆的对比度较差；而且在腺癌染色效果与鳞癌和正常组织有所不同，其原因有待深入研究。有学者在乳腺癌等实体瘤标本中使用苏木精单染，其染色时间在30s[10]。我们在预实验中使用该方法发现，尽管用苏木精染色后时间可缩短，避免蛋白质降解，但随着捕获时间的延长，切片染色加深，导致细胞和间质不能很好区分，影响捕获效果。在LCm操作过程中将捕获时间控制在40min内，按照统一标准：Duration15.5s的激光脉冲频率和平均8000shots计算，既可保证每个帽子的细胞收集数量，也能够将实验时间尽可能缩短，从而使实验可控性提高使操作过程标准化。当然，从质谱分析的角度出发，通过LCm获取细胞的数量较小是该方法不可避免的缺陷[11]。因此，在后续实验中，选择适当的质谱方法应当慎重考虑。
【参考文献】
[1]posadasem,SimpkinsF,LiottaLa,etal.proteomicanalysisfortheearlydetectionandrationaltreatmentofcancer?realistichope?[J].annoncol,2005,16:16?22.
[2]emmert?BuckmR,BonnerRF,SmithpD,etal.Lasercapturemicrodissection[J].Science,1996,274(5289):998?1001.
[3]阎峰,李宗芳.激光捕获显微切割技术应用研究新进展[J].癌症,2004,23(7):860?864.
[4]ChenJZ,Gokdenn,GreeneGF,etal.extensivesomaticmitochondrialmutationsinprimaryprostatecancerusinglasercapturemicrodissection[J].CancerRes,2002,62(1):6470?6474.
[5]田英芳,刘勇,张蓬勃.激光捕获显微切割技术及其在脑研究中的应用[J].解剖科学进展,2005,11(2):170?173.
[6]CravenRa,tottyn,Hamdenp,etalLasercapturemicrodissectionandtow?dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis[J].amJpathol,2002,160(3):815?822.
[7]SegalJp,StallingsnR,LeeCe,etal.Useoflaser?capturemicrodissectionfortheidentificationofmarkergenesfortheventromedialhypothalamicnucleus[J].Jneurosci,2005,25(16):4181?4188.
[8]Zhukovat,JohansonRa,alanB,etal.Discoveryofdistinctproteinprofilesspecificforlungtumorsandpre?malignantlunglesionsbySeLDimassspectrometry[J].LungCancer,2003,40:267?279.
[9]CravenRa,BanksRe.Lasercapturemicrodissectionandproteomics:possibilitiesandlimitation[J].proteomics,2001,1:1200?1204.
光学显微技术篇2
1、公司拥有微纳光学制造完整产业链；
2、净利润年均复合增长率达到23.71%；
3、技术研发与制造领域位居国内领先地位。
苏大维格（300331）是我国微纳光学技术应用的开拓者，国内领先的微纳光学产品制造和技术服务商。依靠强大的研发实力和丰富的成果转化经验，公司应用微纳光学制造技术不断开发新产品，扩大新领域，实现了快速发展。从2001年成立至今，公司经过了创业孵化期——产品导入期——快速成长期。
净利润年均复合增长率23%
公司主要从事微纳光学产品的设计、开发与制造，关键制造设备的研制和相关技术研发服务。公司的微纳光学产品包括公共安全防伪材料、镭射包装材料、新型显示光学材料三类；设备主要是微纳光学产品制造用光刻设备。产品主要应用于公共安全防伪、镭射包装材料和新型显示及照明等领域。报告期内公司微纳光学产品销售收入（不含销售设备、技术服务收入）占公司主营业务收入的比例分别为95.02%、97.48%和98.23%。
与传统型制造业企业不同，公司并非固守现有产品应用范围，而是充分发挥微纳光学技术基础性、通用性强的特点，不断寻找新的应用领域，形成新的利润增长点。2007年公司成立维旺科技专注于新型显示及照明光学膜的研发与制造；自二代身份证开始，公司将微纳光学技术应用于公共安全防伪领域，2008年公司研发的DmD技术与双通道光变色膜在国内新版机动车驾驶证、行驶证上全面应用，成为公司新的利润增长点；在镭射包装材料领域，公司以镭射膜为起点，向下游镭射纸延伸，产品用途也从烟标扩展到酒标，销售规模快速扩大。
公司是国内少数拥有微纳光学制造完整产业链的企业之一。微纳光学制造产业链主要包括装备制造、微纳结构设计、原版开发、规模化生产四个环节，公司凭借自身技术研发、应用创新等方面的实力，取得并巩固了产业链优势。
借助我国内需市场快速发展的契机，公司生产的公共安全防伪材料、镭射包装材料产品应用范围快速扩大，并且积极开发新型显示与照明市场，全力提高公司在微纳光学行业内的地位，使公司收入规模持续扩大，盈利能力快速提升，2009-2011年公司实现的归属于母公司所有者的净利润分别为2660.80万元、3,441.92万元和4,072.32万元，年均复合增长率达到了23.71%。公司的盈利质量也较高，近三年经营活动产生的现金流量净额分别为3126.44万元、1687.71万元和4832.80万元，较高的盈利能力和良好的盈利质量为公司持续、稳定的向股东提供分红回报奠定了坚实的基础。
技术领先优势明显
公司在微纳光学产品技术研发与制造领域位居国内领先地位，行业领先地位的取得源于公司持续的自主创新。公司积聚了光学理论、工程应用、光学检测、微纳米结构制造、电子通讯、软件与控制、数字图像处理、精密机械设计等专业优秀人才。公司在微纳光学制造领域经过多年的研究与开发，积累了多项拥有自主知识产权的核心技术。目前，公司已取得29项专利，其中25项发明专利，4项实用新型专利。基于光刻设备控制软件的研究，公司设计开发了系列专业光刻与图像处理软件，取得5项计算机软件著作权。
光学显微技术篇3
（1）微型投影光学引擎
微型投影机因体积小、影像画面大而应用在便携式移动产品中，例如嵌入到手机、数字相机、pDa中，让使用者可以随时随地欣赏清晰的全彩色影像，用途涵盖个人使用、影像分享和小型会议。本项目开发了全球最小的嵌入式微型投影模块和独立式微型投影模块，光学引擎的体积分别仅为
可供转移的技术为嵌入式投影模块设计、低功耗独立式投影模块、高亮度独立式投影模块、投影影像及屏幕补充算法，定制化设计嵌入式、独立式和微型口袋式投影机。
（2）三维立体微型投影机
有了基于硅基液晶微显示平板的偏振技术开发的双模三维微型投影机，用户无需去影院也能欣赏三维影片。投影机可以实现二维/三维切换，且同样适合于主动式/被动式偏振模式。整合的超微型设计让用户随时随地欣赏高分辨率、高亮度的三维影片。本项目开发了全球第一台双模式的三维微投影机。
（3）互动式投影系统
互动式微型投影光机系统具有一个或多个投影画面，将光源和图像感应器整合为独特的光学引擎设计，采用专有的环境自适应感测方案和识别算法模拟人眼。互动式微型投影机将成为下一代移动互动式输入/输出设备（键盘、手写板、触控屏、数字相机等）中的主流技术之一。
可供转移的技术为互动式微型投影机模块和自适应的人眼感测/识别方案。
（4）微型投影机用扫描镜
光学显微技术篇4
1化学分析方法
化学分析方法目的为充分了解尿路结石的复杂组成成分，从估计结石中含量最多的成分开始，逐步分析。尿路结石的化学成分化学分析方法可分为定性分析和定量分析。
1.1化学定性分析：是结合对结石外观表现的判断，对结石标本进行处理，通过尿结石与相应试剂的化学反应所产生特定的化学反应物，来判断结石标本成分构成。经典的化学定性分析法包括winer的点滴反应法及Beren的微量分析法，以及1978国内李永岚采用的重结晶法［2］。
1.2化学定量分析：是在化学定性分析的基础上，测定结石标本中特定的某一种物质的含量。较为常用的分析方法有eDta滴定分析法、比色法、重量法、分光光度计法、火焰发射和原子吸收光谱法、气液色谱法、离子交换法等［3］。草酸钙在尿路结石的形成中有重要的作用，因此测定尿液中的草酸对尿路结石的防治方面具有指导价值。国内李瑛等采用错一偶氮肿褪色光度法测定尿样中草酸，该方法简便快速，在条件一般的实验室也能开展［4］。
化学分析法分析尿路结石成分优点在于快速、简便、费用低廉，但是均需要较多的结石样本量、需破坏结石体、只能测定少数几种成分，不能准确确定结石的晶体结构，仅适合实验室条件较差的基层医院开展。
2物理分析方法
尿路结石成分物理分析方法不仅可以测定结石的晶体成分来获知结石晶体形态和结构，还能通过定量或半定量的方法测定每种成分的具体含量［5］。常见的分析方法有红外光谱分析法、发射光谱分析法、X射线衍射分析法、热分析法等。
2.1红外光谱分析是通过应用红外分光技术检测结石分子的红外吸收光谱从而测定结石成分和含量的方法。目前国内应用的主要是傅里叶变换红外光谱法(FtiR)［6］。国内武警湖南总队医院宋光庆等［7］采用红外光谱法对516例尿路结石行定性及定量分析：定性分析时将所得样品红外光谱图与尿石成分谱库中标准谱图对照，根据特征峰频率、强度及峰宽等判断结石成分；定量分析采用校准曲线法，建立校准曲线回归方程后，根据定性分析结果选择适当的曲线行定量分析。得出结论红外光谱分析法对尿路结石中多种成分混合物的定性和定量分析是一种较理想的方法。红外光谱分析法有诸多优点：准确、快捷、方便；既可分析晶体成分，又可分析非晶体成分；既可分析有机化合物，又可分析无机化合物，而且使用样品少，已成为当今分析结石成分的主要手段。
2.2发射光谱分析是根据处于激发态的待测元素原子回到基态时发射的特征谱线对待测元素进行分析的方法.利用元素原子自发发射过程中产生的发射光谱具有各向同性，发射光谱分析法可以直接分析尿路结石等固体试样。采用一个以上的光学监测系统来接受同一发光源产生的发射光谱，进而测量各元素特征光谱线的波长和强度，实现对结石的定性和定量分析［8］。2.3X射线衍射分析是利用晶体形成的X射线衍射，对物质进行内部原子在空间分布状况的结构分析方法。X射线衍射分析灵敏度及精确度均较高，而且操作简便，能够快速完成结石成分分析。X射线衍射仪在当前已成为尿石结构研究的常用设备。在各种X射线衍射实验方法中，基本方法有单晶法、多晶法和双晶法，尿路结石成分分析常用多晶X射线衍射方法中的粉末照相法和衍射仪法。衍射仪法能够测定连续相转变的试样，并允许在高温或低湿情况下操作，为目前晶体结构分析工作的主要方法。X射线衍射技术与红外光谱技术联合分析，能够更好发挥各自技术的优势，使分析结果更加准确［9］。
2.4热分析是指用热力学参数或物理参数随温度变化的关系进行分析的方法。通过研究分析结石在加热过程中发生的化学变化及吸热和放热的热效应可以测定尿路结石中的成分并精确定量。最常用的热分析方法有差热分析、热重量法、导数热重量法。Strates于1996年实验了热重法可用于泌尿系结石的定量分析。热分析法灵敏度较高，能准确测出1％～5％的含量，既能定性又能定量，且具有设备简单、经济、所需样品量少等优点，适合于一般实验室分析尿路结石使用［10］。
3微观构造分析
许多研究机构已开展显微镜技术对尿路结石细微结构进行观测，进而分析尿路结石成分。目前主要的微观分析技术有扫描电子显微镜技术、偏光显微镜技术、原子力显微镜技术。
3.1扫描电子显微镜扫描电镜是在加速电压的作用下，以电子射线代替光波，通过电磁透镜汇聚成一个细小的电子探针束，在试样表面做光栅状扫描，因而其分辨能力和放大倍数大为提高。它能产生样品表面的高分辨率图像，且图像呈三维，扫描电子显微镜能被用来鉴定样品的表面结构。扫描电镜与光学显微镜、偏光显微结合使用，还可实现对尿路结石成分和尿路结石超微结构进行连续观察［11］。
光学显微技术篇5
生物芯片技术涉及分子生物学、生物材料学、微加工技术学、化学、物理、计算机等多学科和领域。它针对Dna、Rna、蛋白质及其他生物分子,将不连续的、离散的分析过程集成在一起,完成样品预处理、亲和结合反应以及信号检测等过程,实现对成千上万种生物分子的高通量检测分析[1],在蛋白质组学及基因组学科研、疾病诊断和预警、药物或手术疗效判断以及新药开发、司法鉴定和食品安全等领域,均有广阔的应用前景[2]。
1生物芯片分类
按生物芯片材料和支持物类型可分为固态生物芯片和液态生物芯片等。固态生物芯片按待测物质种类,又可分为蛋白质芯片和基因芯片。液态生物芯片技术,又称Luminex技术[3],是以微球表面为支持物,最早的微球荧光颜色编码液态生物芯片由美国Luminex公司生产开发。按生物芯片结构和制作特征,可分为微点阵(阵列)生物芯片、微流路生物芯片和芯片实验室(lab-on-a-chip)。按照生物芯片编码原理可分为固态平面坐标编码生物芯片、微球颜色编码液态生物芯片和微球阻抗编码液态生物芯片。
2生物芯片研究现状
2•1固态生物芯片研究现状
固态生物芯片原理简单,技术相对成熟,国内外的研究主要集中在应用领域的产品开发方面,并取得了一定的社会效益[2]。由中国博奥生物有限公司研发的多重等位基因特异性pCR通用芯片(allele-specificpCR-baseduni-versalarray,aSpUa),可在5h内完成与遗传性耳聋相关的4种基因的检测[4]。美国Sandia国家实验室正在利用微流控芯片研制生化战剂检测仪器,已进入试验阶段[5]。
2•2液态生物芯片研究现状
传统液态生物芯片技术(微球荧光颜色编码的液态生物芯片技术)将流式技术、荧光颜色编码微球、激光、数字信号处理和传统化学技术融合在一起,获得了“2005年国际临床诊断技术革新大奖”。基于此项技术平台的美国Luminex公司制造的Luminex系列产品和由荷兰控股Qia-Gen跨国公司生产的BioRobotLiquichip系列产品,已经通过该国的食品药品管理局(FDa)认证。随着近年来全世界科学家的不断深入研究,微球荧光颜色编码液态生物芯片技术性能越来越成熟,应用范围越来越广[6-7],是国内外研究的重点和热点。2004年微球阻抗编码液态生物芯片技术方法申请专利,2007年获得中国发明专利[8],但其研究和开发目前几乎是空白[9-10]。
3微球荧光颜色编码液态生物芯片
3•1微球荧光颜色编码液态生物芯片工作原理
微球荧光颜色编码液态生物芯片包括诊断芯片试剂盒和芯片检测设备两部分[11],其工作原理为不同荧光颜色微球编码不同待测物质,不同荧光颜色的微球表面携带的探针荧光强度代表不同待测物质的含量,通过颜色判读和探针荧光强度检测装置以及软件分析系统,自动分析同一份样品中的不同待测物质含量。
3•2微球荧光颜色编码液态生物芯片在生物医学中的应用
3•2•1抗原类物质定量检测各种微生物体、激素、肿瘤标记物、细胞因子等都属于抗原类物质,Bellisario等[12]用液相芯片技术对新生儿血游离甲状腺素4(t4)和促甲状腺素(tSH)同时进行检测,取得满意效果。deJager等[13]基于液相芯片技术,检测刺激后的人类外周血单核细胞分泌的15种细胞因子,显示与eLiSa法有较好的相关性。
3•2•2抗体类物质检测检测某些自身抗体对诊断自身免疫性疾病具有重要意义。wong等[14]用液相芯片技术检测人血清和脑积液中的抗西尼罗河病毒囊膜糖蛋白e的igG和igm抗体,血清和脑脊液用量明显比eLiSa法少,且测定速度明显加快。avaniss-aghajani等[15]将液态生物芯片用于检测984份标本的抗SSa、SSB、Sm、Rnp、Scl270、dsDna和抗着丝粒蛋白B(centromereproteinB,Cenp-B)抗体,结果显示与免疫荧光技术(immunofluores-cenceassay,iFa)和eLiSa技术具有可比性。
3•2•3核酸类物质检测检测某种微生物特异的Dna或Rna,可以提示机体感染了某种微生物。此外,检测机体某些基因(如Snp位点)改变以及这些基因的表达情况,可以对人体某种疾病进行预警和诊断。Diaz等[16]设计了16种针对马拉色菌不同种属的特异性捕获Dna探针,分别共价结合在16种荧光颜色微球上,制作液态生物芯片用于马拉色菌属的准确鉴定。Lud等[17]将液态生物芯片技术用于不同分类癌症的微小Rna(microRna)表达谱检测,结果表明在准确性、抗交叉反应性、线性范围等方面均明显优于固相芯片。
3•3微球荧光颜色编码液态生物芯片的性能评价
微球荧光颜色编码液态生物芯片具有重复性好,线性范围宽,高通量,速度快,灵敏度高,特异性强,适用范围广,灵活性好等优点,其缺点包括:①检测人血清特异性抗体时,检测背景信号过高;②检测通量尚无法满足临床诊断和科研需要;③检测设备技术要求高;④不同荧光颜色微球不能永久保存;⑤价格昂贵。
光学显微技术篇6
关键词：微电子机械系统（memS）；各向异性；刻蚀；搅拌；周期槽
中图分类号：tn29文献标志码：adoi：10.3969/j.issn.1005-5630.2016.03.016
文章编号：1005-5630（2016）03-0272-06
abstract：Duetotheimportanceofmicro-electro-mechanicalsystem（memS）wetetchingtechnique，thefabricationofperiodicgroovestructurebasedonanisotropicetchingareproposedinthispaper.andtheoptimallithographyparametersareobtainedbyseveralexperiments.onthebasisofthis，weobservethatthestirringplaysanimportantroleinthewetetchingtechnique.Stirringcanincreasetheliquidityofthecorrosionsolutionsothatthesiliconsurfaceisnoteasytogeneratebubblestoform"falsemask"，whichcanstopthereactionofthesiliconandthesolution.thenthesurfaceoftheperiodicgroovestructureisverysmooth.Furthermore，therelationshipbetweenthegroovedepthandtheetchingtimeisalsoanalyzedinthispaper.thisresearchisofgreatsignificanceforsiliconmicromechanicalprocessingtechnology.
Keywords：micro-electro-mechanicalsystem（memS）；anisotropic；etching；stirring；periodicgroove
引言
微电子机械系统（micro-electro-mechanicalsystem，memS）是在成熟的微电子设计和加工技术的基础上发展起来的一项新兴技术，它是以微电子、微机械及材料科学为基础，研究并制造具有特定功能的微型装置，并将机械构件、光学系统、驱动部件、电控系统、数字处理系统集成为一个整体单元的微型系统[1]。它结合了可动机械结构和大规模、低成本、微电子加工的优点，在微小尺度上实现与外界电、热、光、声、磁等信号的相互作用。memS主要是用微电子技术和微加工技术（包括硅体微加工、硅表面微加工、光刻电铸注塑和晶片键合等技术）相结合的制造工艺，制造出各种性能优异、价格低廉、微型化的传感器、执行器、驱动器和微系统[2-5]。memS是各种设备小型化的发展方向，是近年来发展起来的一种新型多学科交叉技术，它涉及机械、电子、化学、物理、光学、生物、材料等学科。它将像二十世纪的微电子技术一样，对人们的生活和工作产生革命性的影响。
硅腐蚀技术是硅微机械加工中最基础、最关键的技术，它通常有两种：干法腐蚀和湿法腐蚀。根据腐蚀剂的不同，硅的湿法腐蚀又可以分为各向同性腐蚀和各向异性腐蚀[6-9]。各向异性腐蚀则是指根据硅的不同晶向具有不同的腐蚀速率从而刻蚀出特定的槽结构[10-15]，同时硅的各向异性腐蚀速率还与腐蚀剂类型、配比、反应温度等各参数有关。与干法刻蚀相比，湿法腐蚀工序在成本、速度、性能等方面更有优势。本文针对硅基槽刻蚀技术，对硅基周期槽刻蚀的工艺进行详细的研究。
1实验原理
本文是在硅的各向异性腐蚀的基础上研究周期槽机构的刻蚀工艺以及腐蚀过程中搅拌所起的重要作用。硅的各向异性腐蚀是指腐蚀剂对硅的不同晶面具有不同腐蚀速率的一种硅加工工艺，这种腐蚀速率的各向异性是由硅的晶体学特性决定的。KoH、naoH等这类刻蚀剂在（100）面方向的刻蚀速率比（111）面方向要快100倍，当（100）面上的硅被二氧化硅覆盖时，在腐蚀完全的条件下，这种有方向性的刻蚀剂会使硅表面产生精确的V形槽，槽的边缘是（111）面，与（100）面的夹角为54.7°，而在腐蚀不完全的条件下，硅表面则会产生梯形槽。图1为各向异性腐蚀示意图。
由上述反应方程式可以得知，KoH首先将硅氧化成含水的硅化合物，然后与异丙醇反应，形成可溶性的硅络合物，这种络合物不断离开硅的表面，此过程中水的作用是为氧化过程提供oH-。
2实验步骤
本实验采用2cm×2cmp型（100）单晶硅单面抛光硅片作为基片，其电阻率为0.001～0.005Ω・cm，在基片表面生长1.5μm的Sio2作为掩膜层，因为在KoH腐蚀溶液中，Sio2的刻蚀速率远远小于Si。实验前为了保证样品具有较高的清洁度，首先将硅基片进行超声波清洗：去离子水10min――甲醇15min――丙酮30min――甲醇10min――去离子水5min――去离子水5min。
接下来在硅片表面涂光刻胶，实验中采用的光刻胶为正胶aZp4620。硅片表面的水分会使光刻胶产生针孔和气泡，导致光刻图形飘移，因此在涂胶前必须先将硅片置于2100℃的烘箱中30min。同时，刚烘完的硅片不应立即涂胶，应放置一段时间，等基片的温度与室温相差不大时再进行静态滴胶，否则会出现光刻胶收缩现象。然后进行软烘焙、对准曝光、显影、后烘等步骤。刻蚀工艺流程示意图如图2所示。
（1）软烘焙（前烘）
此烘焙的主要作用是促进胶膜内溶剂充分挥发，使胶膜干燥，增加胶膜的粘附性及耐磨性。此过程中主要影响因素为时间和温度。若烘焙不足（温度太低或时间太短），则显影时易浮胶，图形变形；烘焙时间过长，增感剂挥发，导致曝光时间增长，甚至显示不出图形；烘焙温度过高，光刻胶粘附性降低，光刻胶中的感光剂发生反应（胶膜硬化），不易溶于显影液，导致显影不干净。
（2）对准和曝光
这一步骤主要是保证光刻胶上形成精确的图形尺寸，从而所制作的器件具有更好的性能。所以，涂好光刻胶后，第一步是把所需图形在光刻胶表面上准确定位或对准。第二步是通过曝光将图形转移到光刻胶涂层上。
（3）显影
显影就是将未感光的负胶或感光的正胶去除，显示出所需要的图形。若显影时间过短，可能有少量光刻胶残留，不能得到完整的光刻图形；若显影时间过长，引起光刻胶软化、膨胀、浮胶，可能导致图形边缘破坏。影响显影效果的因素还有前烘的温度和时间、胶膜的厚度、显影液的浓度、显影液的温度。
（4）后烘
后烘能使软化、膨胀的胶膜与硅片粘附更牢，增加胶膜的抗刻蚀能力。若后烘不足，则腐蚀时易浮胶，易侧蚀；若后烘过度，胶膜热膨胀，导致翘起脱落，腐蚀时也会浮胶。
通过多次实验探究，得到最佳的光刻参数为前烘100℃3min，曝光时间为71s，显影时间为2min，后烘120℃3min。在光学显微镜下的周期槽光刻效果图如图3所示。
光刻完成后将进行工艺流程中最关键的一步，即腐蚀。本实验采用的腐蚀溶液配比KoH∶H2o∶ipa（异丙醇）=3∶6∶1，腐蚀温度80℃。
在各向异性腐蚀前，对样品进行预处理是至关重要的，即利用HF缓冲液（HF∶H2o=1∶6）去除腐蚀窗口表面的Sio2氧化层，使硅能充分而快速接触腐蚀液，预处理时间为6min。然后将预处理的硅片放置于已完成配比的腐蚀液中进行腐蚀，并且腐蚀装置置于水浴锅中，便于腐蚀过程中温度的控制。为了观察搅拌对腐蚀结果的影响，选用相同的两个样品进行实验。对于样品1，在腐蚀过程中不给予搅拌；对于样品2，在腐蚀过程中给予充分的搅拌。两个样品的腐蚀时间相同，都为75min，腐蚀装置为塑料量筒。腐蚀完成后分别将样品1和样品2放置于干净烧杯中，用去离子水超声清洗10min，去除表面残留的腐蚀液。然后在电子扫描电镜下观察样品1和样品2的表面特征。
如图4所示，（a）和（b）分别是在电子扫描电镜（Sem）下观察到的腐蚀过程中给予未搅拌、搅拌的样品表面特征图。可以从图中观察到经过搅拌的腐蚀样品比未搅拌的样品表面平整光滑，未经过搅拌的实验样品表面较为粗糙，出现了大小不一、分布不均的锥状物，而经过搅拌的实验样品表面平整光滑。
为了进一步说明搅拌在腐蚀过程中起到的重要作用，我们增加了样品图案复杂程度，通过增大搅拌速率来观察所得样品的表面特征。如图5所示，在腐蚀过程中增加搅拌速率，周期谐振环结构表面极度光滑平整、几乎没有锥状小丘的生成。这是由于在刻蚀过程中，生成的氢气气泡吸附在硅片表面，形成“伪掩膜”面而产生锥形小丘，致使表面粗糙。然而，在腐蚀过程中采用搅拌步骤，可以增加腐蚀溶液的流通性，从而带走部分生成的气泡，减少“小丘”的产生。
与此同时，我们还研究了在搅拌的条件下硅腐蚀深度与腐蚀时间的关系，如图6所示。随着反应时间的增加，槽的深度增加，二者几乎呈线性增加，这是由于在搅拌的条件下，腐蚀各部分的溶液浓度比较均匀，反应过程中的气体不易生成气泡附着在硅表面，使得腐蚀反应较为稳定地进行。由图6（a）可以观察到硅在该实验条件下的腐蚀速度约为0.26μm/min，当反应时间增加到75min时，样品刻蚀至底部，形成V型槽，图6（b）为电子扫描电镜下观察到的样品横截面图。
3结论
本文在硅的各向异性腐蚀的基础上，研究了硅基周期结构槽的湿法刻蚀工艺流程，观察到搅拌在硅基周期槽制备中的重要作用。通过搅拌，腐蚀溶液的流通性增强，呈“伪掩膜”的气泡不易残留在样品表面，从而硅能更好地与腐蚀溶液反应，进而制备出的周期槽结构样品表面光滑平整，几乎无锥状的“小丘”生成。与此同时，总结出了在搅拌的条件下槽深与反应时间的关系。这一工艺研究解决了湿法腐蚀工艺中样品表面粗糙度的问题，可为memS元器件的制作提供参考。
参考文献：
[1]牛君，刘云桥.memS技术的发展与应用[J].科技资讯，2007（23）：1-2.
[2]洪永强，蒋红霞.微电子机械系统及硅微机械加工工艺[J].电子工艺技术，2003，24（5）：185-188.
[3]黄庆安.硅微机械加工技术[m].北京：科学出版社，1996.
[4]林星，赵冬伟，王波，等.基于LiGa技术的光热驱动微开关研究[J].光学仪器，2011，33（2）：33-37.
[5]郭利，刘超，章海军.基于准分子激光的微结构与微器件加工制作研究[J].光学仪器，2009，31（1）：69-72.
[6]张正元，徐世六，刘玉奎，等.用于memS的硅湿法深槽刻蚀技术研究[J].微电子学，2004，34（5）：519-521.
[7]邓俊泳，冯勇建.tmaH单晶硅腐蚀特性研究[J].微纳电子技术，2003，40（12）：32-34.
[8]张凯，顾豪爽，胡光，等.memS中硅的深度湿法刻蚀研究[J].湖北大学学报（自然科学版），2007，29（3）：255-257.
[9]SRiRamS.novelV-groovestructuresonsilicon[C]//proceedingsofSpie0578，integratedopticalcircuitengineeringii.Cambridge：Spie，1985：88-94.
[10]姜岩峰，黄庆安，吴文刚，等.硅在KoH中各向异性腐蚀的物理模型[J].半导体学报，2002，23（4）：434-439.
[11]杨恒，鲍敏杭，沈绍群，等.测定硅各向异性腐蚀速率分布的新方法[J].半导体学报，2000，21（5）：504-508.
[12]张佩君，黄庆安.硅各向异性腐蚀速率图的模拟[J].固体电子学研究与进展，2002，22（1）：89-92.
[13]李倩，崔鑫，李湘君.硅各向异性腐蚀技术研究[J].微处理机，2012，33（6）：12-13.
光学显微技术篇7
关键词：显微；共聚焦显微技术；激光扫描共聚焦；碟片共聚焦；结构光
中图分类号：tH742文献标识码：adoi：10.3969/j.issn.10055630.2013.01.009
引言普通的显微镜在获得聚焦处信息的同时也获得离焦处的信息，该离焦信息会影响观察到的图像，其效果犹如在聚焦处铺上了一层“薄纱”，大大降低了图像的对比度。所谓的共聚焦显微镜，可以尽量多地抑制聚焦处之外的杂散光，以保证获得的图像仅仅来自样品聚焦处的信息，即像面和观察面是完全“共轭”的，去除了“薄纱”的影响，对比度更高，且可分层获得样品的信息，也就是光学共聚焦图像，获得样品多幅连续的共聚焦图像，即在不破坏样品的情况下可用这些二维共聚焦图像重建出样品的三维图像，非常适合于活体观察，并已成为生物医学、材料科学和半导体等领域的重要研究工具。目前除了传统的激光扫描共聚焦显微镜（laserscanningconfocalmicroscopy，LSCm）之外，还有碟片共聚焦显微镜（spinningdiskconfocalmicroscopy，SDCm）和结构光显微镜（structuredilluminationmicroscopy，Sim）。1激光扫描共聚焦技术原理及其特点[1]激光扫描共聚焦显微镜，是在普通显微镜的基础上增加了“共聚焦技术”和“激光扫描技术”。共聚焦技术，就是在共聚焦显微镜图1LSCm的原理
Fig.1principleofLSCm的光路中设置了两个共聚焦针孔，即照明针孔和探测器针孔，并与样品上的聚焦点共轭。具体原理如图1所示，激光光源发出的激光束，通过照明针孔后成为点光源，经物镜成像在样品上为一个聚焦点，从聚焦点发出（或反射）的光反方向经物镜成像在探测器针孔处，也就是说，放置在探测器针孔后面的探测器只能接收来自聚焦点的光，减少了非聚焦处杂散光的干扰，从而提高获得图像的对比度。这就是一个点物体的共聚焦成像原理，需要配合对样品的逐点扫描才能实现样品的二维共聚焦成像。一般采用激光扫描技术实现对样品的二维扫描成像，即在光路中安装两个检流镜，其转动角度可控制，分别用于控制光束对样品进行X和Y方向的逐点扫描成像，以获得样品某个深度的共聚焦图像，改变载物台的轴向（Z方向）位置，并获得一系列样品不同深度的共聚焦图像，即可在不破坏样品的情况下对样品进行三维重建，实现样品的三维观察。LSCm的横向分辨率接近于普通显微镜的2倍，轴向分辨率可达到几百纳米。虽然如此，但由于存在共聚焦针孔，抑制了绝大部分的杂散光，使得探测器接收到信号很微弱，需要高灵敏度的光电倍增管pmt作为探测器，但其量子效率低，获得的图像信噪比低；另外，由于采用逐点扫描成像，成像时间长，结构也比较复杂，还需要高成本的激光作为光源。光学仪器第35卷
第1期陈木旺：浅谈共聚焦显微技术
光学显微技术篇8
【关键词】信息技术；数码生物显微镜；实验教学
随着社会经济迅速发展，各级政府对教育的投入也在不断增加，办学条件有了明显改善。目前，许多中学实验室里都添置了一些现代化的实验仪器，然而这些仪器大多数是长期摆放在橱窗里，只是在有人参观、考察时才得以体现其“价值”。这些价值不菲的仪器有着强大的功能，如果利用的好，能很好地弥补传统实验教学的不足，提高实验教学的效果。本文以数码生物显微镜在高中生物实验教学中的运用为例，谈谈在信息技术环境下，如何最大限度地发挥现代化实验仪器的作用，从而实现信息技术与中学实验课程的有效整合。
一、数码生物显微镜简介
数码生物显微镜是由生物显微镜主机+显微镜摄像头+数码显微镜接口+计算机组合而成的。数码生物显微镜主要用来观察生物切片、生物细胞、细菌以及活体组织培养等的观察和研究，同时可以观察其他透明或者半透明物体以及粉末、细小颗粒等物体。在显微镜中看到的实物图像通过数模转换，使其成像在计算机上。数码生物显微镜是将精锐的光学显微镜技术、先进的光电转换技术、液晶屏幕技术完美地结合在一起而开发研制成功的一种高科技产品。
二、数码生物显微镜在高中生物实验教学中的运用
1.观察多种多样的细胞
用显微镜观察细胞的结构是中学阶段需要掌握的重要实验操作技能。在实际教学中，学生的积极性很高，但由于动手能力较差，再加上普通的光学显微镜成像质量不高，最终学生观察的图像往往是模糊不清。数码生物显微镜通过“光电图像转换装置”获得的图像可达到35万/130万/300万像素，图像清晰、线条细腻、色彩逼真，更便于学生观察。
数码生物显微镜不仅能更清楚地观察物体，还具有十字定位测量功能。十字线还可随观察物体颜色的变换而更改线条的颜色，这不仅便于教师对学生的指导，还可对微观物体大小进行测量，进而实现微观物体量化呈现。
2.探究培养液中酵母菌种群数量的变化
高中生物学课程标准“稳态与环境”模块将“探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化”列为活动建议。人教版和苏教版教材都安排了这一活动，但是在一些细节问题上，如酵母菌的抽样检测中的观察和计数，两个版本教材中的描述都不太具体，且缺乏直观的图解。如果利用好数码生物显微镜，就可以为学生增加一些直观的素材。教师可以在班级同学分组做这个实验前，亲自带领几位实验技能较好的同学先做一下。实验过程中每隔24小时利用血球计数板和数码生物显微镜进行抽样检测，调查酵母菌的种群数量。每次调查时在显微镜下找到一个理想的目标位置后进行拍摄，并对拍摄图片进行储存及处理，这不仅可以作为实验的数据进行对比，还能永久的保存下来作为一份有价值的教学资源，将来需要时可很方便地实现再现与共享。
3.观察黑藻细胞的细胞质流动
活细胞中的细胞质处于不断流动的状态，观察这一生命现象，可让学生认识到生命是运动的。观察细胞质的流动常以新鲜的黑藻为材料，用细胞质基质中的叶绿体的运动作为标志。在实验课上，我们可以用普通的光学显微镜观察黑藻的细胞质流动。然而，实际教学中发现，效果往往不太理想，很多同学观察不到细胞质流动，特别是阴天、低温时做实验。针对这种情况，教师可以事先准备典型的示范装片，使用数码生物显微镜的录像功能来弥补。这种教师演示的视频资源可以重复使用，既可以让学生能看到细胞质快速流动的真实状况，也减轻了教师在不同教学班重复演示的负担。教师还可以增加录制不同条件下黑藻细胞质流动视频让学生观看、比较。这一做法，可以让学生认识到细胞质流动不仅是客观存在的，流动速度还是可变的。
4.构建互动式实验教学系统
传统生物实验教学中存在的一些问题，大致有以下几点：师生之间、同学之间缺乏交流与互动；现有的光学显微镜功能单一，教学内容局限性大；教师的指导都是个别的，也无法同时观察到全班同学的实验进展与现象等。
将普通生物实验室（或机房、语音室）重新改造，进行网络布线，把计算机、数码生物显微镜、光电图像转换装置等设备进行组网。然后，在教师机、学生机上安装各种应用软件（显微图像处理分析软件、互动网络教学软件等）即可构建起互动式实验教学系统。教师只需通过自己的教师电脑就可以查看全班学生的显微镜画面，学生也可以通过自己的学生电脑观察老师的演示操作，这使教学更直观、更方便。师生之间借助多向多媒体互动系统进行随意交流，教师与学生实现全面互动，使沟通更快捷、有效。如配上投影机，增加一些多媒体中控设备，就可以实现多媒体教学。
光学显微技术篇9
关键词：中药鉴定技术Dna条形码技术
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2014.02.510
【中图分类号】R2【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2014）02-0343-01
中药材是我国的文化瑰宝，自古以来我国人民就有用中药治病养生的传统，所以中药的鉴定就显得尤为重要。随着技术的进步，中药材的鉴定方法也是越来越多，越来越准确。下面本文就目前主流的中药鉴定技术和方法作简要介绍。
1分子鉴定技术
1.1Dna分子鉴定。Dna分子鉴定技术是依靠生物的Dn段来鉴定的，每个生物的Dn段都不同，所以该方法不受环境饰变影响，该方法中最常用的是Dna条形码鉴定技术，Dna条形码是指用于标记的一段标准Dn段，此技术筛选并确定通用的条形码，通过分析就能得出物种鉴定，该技术快速、准确，是一种很有潜力的鉴定方法；此外，还有基于pCR的分子鉴定技术，它不需要研究Dna信息，而是用随机引物对Dna扩增，或者简单限定引物，该类技术主要用来研究生物的多样性和遗传关系，但是已经有用于中药材鉴定的报道；另外，还有一种基于分子杂交的Dna分子技术，它是依据序列差异导致酶切片段长度或数量的变化来进行鉴定的。目前已经有用于北沙参基原植物珊瑚菜、柴胡、灵芝、绞股蓝等中药材的鉴别。
1.2蛋白质标记技术。抗血清鉴别技术是一种较为常用的蛋白质标记技术，它是利用中药里面的蛋白质等抗原来制备具有特异性的抗体，从而用免疫学的测定方法来进行鉴别。目前已有用于半夏、茯苓、阿胶等中药中的报道；此外，还有蛋白质电泳鉴别技术。不同的中药含有的蛋白质所带电荷有差异，因此可以通过电泳分离鉴别，其中毛细管电泳近年来用的较多；另外，还有同工酶鉴别技术，它是利用中药中的同工酶的特异性，用酶活性分析等方法进行鉴别的方法。
2化学鉴定技术
2.1光谱鉴定技术。光谱鉴定技术包括中红外光谱鉴定技术、近红外和拉曼光谱鉴定技术、X-射线衍射图谱鉴定技术等。利用中红外光谱鉴定中药材有许多突出的优势，如能够反映中药的整体化学信息、快速、成本低、不用分离样品等，目前已经应用到多种药材上的鉴定；近红外光谱也常常用来鉴别中药材，当样本间的差异不大时，近红外光谱就能派上用场，是中红外光谱的一个有力补充；X-射线衍射图谱常常用来探测晶体结构，每种中药的X-射线衍射图谱都有其特征性，因此用X-射线衍射图谱来鉴别中药是可行的。
2.2色谱鉴定技术。色谱鉴定技术包括HpLC鉴定技术、GC鉴定技术、HpCe鉴定技术等。HpLC鉴定技术以液体作流动相，用高压输液系统把流动相压进有固定相的色谱柱，进行分离后用探测器检测。GC鉴定是利用化合物在固定相和气体流动相中的分配不同进行分离并检测，若中药材中含有挥发性组分，可考虑用该技术鉴别。HpCe是利用电场为驱动，利用样品中不同组分的差异，在毛细管中分离并检测。特别适用于含有有机酸、生物碱等物质的中药鉴定。
此外，色谱-光谱联用鉴定也吸引了科研工作者的注意。
3性状显微鉴定新技术
3.1仿生识别鉴定。仿生识别包括嗅觉仿生、味觉仿生和视觉仿生。嗅觉仿生含有化学传感器，当样品气体接触传感器时会引起传感器电导率变化，从而达到鉴别的目的。味觉仿生利用传感器作为膜，当样品液体接触膜时，膜电势会发生变化，从而起到鉴别作用。视觉仿生是利用标准光源照样品，分析透射或反射光的数值，达到鉴定目的。
3.2偏光显微镜鉴定技术。用偏光显微镜观察非均质性的晶体或分子排列杂乱的有机物时，颜色会有差异，中药材中的淀粉粒、石细胞、结晶体等在偏光显微镜观察时会有特异性变化，因此可以用来鉴别中药。
3.3电子显微镜鉴定技术。扫描电子显微镜适用观察植物中药的花粉粒、种皮、果皮的表面饰纹、表面组织的结构特征、组织细胞、晶体等，以及动物药材的体壁、鳞片、毛发等超微结构，从而进行鉴别。
3.4体视显微镜鉴定技术。体视显微镜有着较高的放大倍数，能很好的观测药品的纹理、颜色等，能看到肉眼看不到的药材特性。
4生物效应鉴定技术
生物效应鉴定是利用生物效应进行鉴定的一种方法，通过比较生物样品的特定反应来测定中药的活性，该技术效果好、安全，不过通用性不是很好。
参考文献
[1]张贵君.中药鉴定研究方法学[m].北京：人民卫生出版社，2010：1
[2]millerSe.Dnabarcodingandtherenaissanceoftaxonomy[J].procnatlacadSciUSa，2007，104：4775
[3]王若光，李春梅，王陆颖，等.基于激光解析/离子化-飞行时间质谱技术的中药地龙蛋白质组分析[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（13）：2489
[4]孙素琴，周群，陈建波.中药红外光谱分析与鉴定[m].北京：化学工业出版社，2010
[5]刘军，刘蓬勃.niRFt-Raman和FtiR光谱法无损快速鉴别药材的真伪-八角茴香及其伪品[J].现代仪器，2011（5）：19
[6]沈海龙.近红外漫反射光谱法快速鉴别地骨皮和伪品荃皮大青根皮[J].辽宁中医杂志，2010，6：1103
[7]叶文文，邵毅，胡润淮.白术的UpLC指纹图谱[J].中国现代应用药学，2010，27（9）：799
[8]胡岩，段天璇，曹枫，等.八角科植物果皮化学成分的LC/mS图谱特征及其在分类和药材鉴别上的意义[J].中国中药杂志，2010，35（14）：1836
光学显微技术篇10
【关键词】激光拉曼光谱；流体包裹体；应用
0前言
拉曼光谱是一种散射光谱，它是印度科学家C.V.Raman和K.S.Krishnan于1928年发现的。显微激光拉曼光谱是一种非破坏性测定物质分子成分的微观分析技术，是基于激光光子与物质分子发生非弹性碰撞后，改变原有人射频率的一种分子联合散射光谱[1-2]。显微激光拉曼光谱（LRm）是20世纪60年代才发展起来的作为一项新兴的微区分析技术，是20世纪70年代才开始渗人地学领域的，近年来，在矿物学、岩石学、矿床学及宝玉石的鉴定中已得到广泛的应用。目前，显微激光拉曼光谱已广泛应用于材料、化工、石油、高分子、生物、环保、地质等领域。利用激光拉曼光谱可对物质分子进行结构分析和定性鉴定其在微区分析上所显示的高精度、原位、无损和快速特点，使之逐渐成为地球科学基础研究中的一项重要分析手段[3-5]。流体包裹体作为某一时期特定地质事件见证者和唯一的原始成岩、成矿环境真实情况的记录者[6]，其应用越来越广泛，被越来越多的地质学家所重视，因此，对流体包裹体的研究也成为地质学重要的一个课题。LRm作为一种快速、简便的无损微区测试手段，在被深入应用于地质学领域的同时，在流体包裹体中也已得到了广泛的应用，国内已有不少学者[5，7-9]用此技术对流体包裹体进行了研究。
1激光拉曼在油气包裹体中的应用
油气的勘探与开发一直是人们关注的一个问题，包裹体的种类多样，其中油气包裹体是油气显示的一个方面，也是油气资源勘探研究的一种重要手段。沉积岩在成岩作用过程中，富含有机质的沉积物随着成岩温度和压力升高而发生分解，释放出甲烷、乙烷等一系列易挥发的烃类有机物[10]。这些烃类有机物会在成岩、成矿过程中会溶解于地层中的流体，有些会被寄存在宿主矿物中，形成包裹体。根据前人[6，10-12]。研究流体包裹体与油气勘探存在必然的联系。成岩作用研究是油气包裹体研究的基础，而包裹体的成分对分析成岩作用具有一定的建设性作用，不少学者对包裹体进行过成分的分析[9]。
据卢焕章等[13]将油气包裹体划分为为含碳氢化合物的包裹体，包括烃类包裹体及沥青类包裹体。有机包裹体是油气源岩演化过程的直接产物，是油气生成、演化、运移、聚集过程中遗留下来的原始样品和历史记载[12]。烃源岩的成熟度往往与油气的生成有着密切的关系，而评价烃源岩往往与有机质有着密不可分的关系。因此，根据有机包裹体的变化特征可以确定有机质的热演化程度和油气的形成阶段[12]。富含有机质的沉积物在成岩的过程中释放的烃类及有机质中有机酸在油气的生成和的过程中都占有极其重要的地位。前人[6]已经通过激光拉曼技术对有机质进行了研究，对油气的勘探又提供了进一步的可用数据。张鼐等[3]也利用激光拉曼对原油烃类拉曼光谱与油气包裹体烃类光谱进行对比研究。组成油气的烃类种类较多，成分也有差异，不同成分的烃类包裹体展示了成岩、成矿不同的过程，因此对烃类包裹体成分的测试也成为研究油气成藏的一个重要方面。油气中的成分很多都是由烃类构成的，构成烃类的碳氢元素多种同位素，不同来源、不同成因的地质流体可能会有不同的元素组成。李荣西等[9]认为对包裹体的同位素研究对古流体成因和来源方面都有特殊的用途，并用激光拉曼技术对单个流体包裹体同位素进行了测试，同时也证明了此方法的可行性。
岩石或矿物在形成的过程中，地层中的流体来源广阔，导致油田水成分复杂，含有盐类、气体、有机质和各种微量元素，其中盐类的组成和浓度决定着油田水的物理化学性质[6]，因此对流体包裹体的研究就变得异常重要。对包裹体盐度的测定可以很好的推算矿物或岩石形成时环境，传统的显微冷热台测温推算包裹体的盐度的方法操作较复杂，有不少学者[3，5，6]经过用激光拉曼测人工合成包裹体与实际流体包裹体对比发现此种方法与传统的方法误差很小，说明用拉曼光谱测定流体包裹体的盐度是可行的，并且是一个简便有效的方法。
目前，激光拉曼光谱除了在流体包裹体得到广泛应用，在地质学的其他领域也得到了广泛应用，例如矿床学、古生物、地球化学，尤其在宝玉石的鉴定方面，成为鉴定人工与天然宝玉石的无损分析比较有力的一种测试方法。
但激光拉曼光谱技术还存在一些问题，油气包裹体中的烃类包裹体往往会显示不同程度的荧光，而激光拉曼测包裹体成分时往往又受荧光的干扰，会影响实验分析测试的数据。因此，在应用激光拉曼光谱分析技术的同时，有待于寻求新的方法去解决现有的问题。
3结论
（1）流体包裹体作为某一时期特定地质事件见证者和唯一的原始成岩、成矿环境真实情况的记录者，在研究成岩、成矿等方面有及其重要的作用。
（2）油气包裹体是油气源岩演化过程的直接产物，是油气生成、演化、运移、聚集过程中遗留下来的原始样品和历史记载LRm已广泛应用于各个领域，对油气包裹体的研究具有重大意义，LRm逐渐广泛应用于油气包裹体的分析。因此，有待于寻求新的方法去解决现有问题。
【参考文献】
[1]memillanpF，Hofmeisteram.infraredandRamanspectroscopy[J].Rev.mineral，1988，18：99-159.
[2]徐培苍，李如壁，王永强，等.地学中拉曼光谱[m].西安：陕西科学技术出版社，1996：1-186.
[3]吕新彪，姚书振，何谋春.成矿流体包裹体盐度的拉曼光谱测定[J].地学前缘，2001，8（4）：429-452.
[4]段菁春，庄新国，何谋春.不同变质程度煤的激光拉曼光谱特征[J].2002，21（2）：65-67.
[5]丁俊英，英倪，培饶冰，等.显微激光拉曼光谱测定单个包裹体盐度的实验研究[J].地质论评，2004，50（2）：203-209.
[6]何谋春，吕新彪，刘艳荣.激光拉曼光谱在油气勘探中的研究初探[J].光谱学与光谱分析，2004，11，24（11）.
[7]张鼐，田作基，冷莹莹.烃和烃类包裹体的拉曼特征[J].中国科学：D辑，2007，37（7）：900-907.
[8]李荣西，王志海，李月琴.应用显微激光拉曼光谱分析单个流体包裹体同位素[J].地质前缘，2012，7，19（4）.
[9]张泉，赵爱林，郝原芳.显微激光拉曼在流体包裹体研究中的应用[J].有色矿冶，2005（01）.
[10]刘德良，谈迎，孙先如，等.鄂尔多斯古生界流体包裹体特征及其与油气演化关系[J].2002，20（4）：695-705.
[11]周振柱，周瑶琪，陈勇，等.流体包裹体地层学在石油勘探开发中的应用[J].石油勘探与开发，2011，38（1）：59-66.