细胞生物学研究技术篇1
细胞工程课程在生物科学专业的设置
本课程自从2007年在我校新办生物技术专业开设以来，根据学校对本科生物技术专业的培养计划，细胞工程是生物技术专业的主干课程，并于2009－2010学年第二学期开始开设。通过对该课程的教学，使学生掌握细胞工程所涉及的基本概念、原理、技术方法、应用基础等内容。通过近三年的教学实践，不断加强课程建设与发展，理论教学体系已经基本完善，实验教学平台基本建立。通过全面进行教学改革，已逐渐形成本校建设的特色课程。21世纪，生命科学全面快速发展。根据学科发展和社会需求趋势，在新办生物技术专业基础之上，2009年我校新办生物科学专业。然而，新办生物科学专业的困境是专业范围宽泛;如何在有限的时间内，全面、高效地培养适应社会需求的合格人才，是每位任课教师和教学管理者必须认清的首要问题。为了充分发挥我们医学院校的资源优势，在培养学生方向定位上，以健康教育为主要方向，兼顾生物制药等，但又与生物技术的培养方式不同。由于细胞工程是由细胞生物学、分子生物学、基因工程、工程学等学科理论技术有机结合的一门崭新学科，因而被设定为新办生物科学专业本科生培养计划的必修课程。
细胞工程课程在生物科学中的开设，是以普通生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、分子生物学、微生物学、免疫学等先修课程为基础。同时，将本课程的学习与基因工程、生物技术等课程的学习互相补充和相互促进，为将来从事生命科学基础理论研究、生物制品的开发和应用、疾病诊断技术的开发与应用等领域的工作打下必要的基础。在教材方面，以李志勇编著《细胞工程》(高等教育出版社)为基本教材，以杨吉成编著《细胞工程》(化学工业出版社)、安利国编著《细胞工程》(第二版，科学出版社)等为主要参考教材。在教师队伍配置方面，既有细胞生物学领域教学经验丰富的教授，也有年富力强的专业知识扎实的中青年骨干教师。细胞工程的理论教学和实验教学全部由既具有扎实生物工程学相关知识背景，又有基础细胞理论与实验技术背景的骨干教师承担。
细胞工程教学内容的设定与改革
细胞工程课程的特色，是以细胞工程技术方法的基本原理为课程教学切入点。在教学内容上，基本理论的讲授与技术方法过程的介绍并重;在本学科知识的系统性方面，既有本学科理论的系统性，又加强与其他相关学科的相互渗透交叉，尤其是以细胞生物学、生物工程的基础知识背景，为本学科的理论教学奠定基础;通过将现有技术的原理、应用归纳，与本学科相关技术的发展趋势讲解相结合;从内容上，客观系统地反映本学科相关领域应用前景、重点研究方向和尚待解决的科学问题;在理论上自成体系。根据教学计划，细胞工程在我校总学时设定为80学时，其中理论50学时，实验30学时。本课程的开设，一般在第三学年的第二学期，在普通生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、组织胚胎学等课程修完之后进行。细胞工程在教学内容、教学方法上又与以上学科大不相同，本课程教学是以技术方法的原理为基础理论的学科，因此实验与理论教学并重。细胞工程课程的理论课程内容，根据研究对象一般分为三大部分内容，分别为:细胞工程概论与基本技术、植物细胞工程、动物细胞工程。根据我校的教学实际情况和培养计划，我们对教学内容进行了适当的改革与调整。课程的内容重点在第一部分细胞工程概论与基本技术和第三部分动物细胞工程［1－4］。
细胞生物学研究技术篇2
专利数据时间（以公开年分析）：2002―2011
专利总件数：977，其中发明专利948，实用新型专利28件，外观设计专利1件。无锡专利总件数3件，其中发明专利3件，实用新型专利与外观设计专利均无。（限于我国专利审查程序，发明专利从提出申请到公开需要18个月的时间，实用新型专利从提出申请到授权公告需要1年左右时间，因此2011年的申请量数据只供参考）。
1、申请数量和趋势分析
以公开年分析
2002-2010年无锡市干细胞专利申请数为0，只有在2011年申请数为3件。
分析：近十年来，我国干细胞专利申请量大体上保持持续增长的态势，在2011年出现了较大增长，相较2010年增加了65件。从图中可以看出，自2009年以来，我国干细胞专利申请量有了明显的增长，这主要是因为2009年国家干细胞工程技术研究中心医学转化基地在上海成立，干细胞技术进入了临床应用阶段，我国也把干细胞研究列入了国家863和973计划。在973计划中，干细胞领域是立项最多的一个。从总体趋势来看，我国干细胞专利申请数量虽呈上升趋势，但干细胞产业化发展在我国刚刚起步，干细胞研究的关键技术也只是在最近5年才取得突破，总体水平偏低。而我市干细胞专利申请只有在2011年为3件，之前为一片空白，且这3件专利为一家公司所有。总体来讲，我市干细胞企业规模较小，发展历程短，竞争力相对较弱，干细胞产业在我市几乎没有基础。只有在近两年，我市共引进8家以“530”企业为主的干细胞研发领域的生物公司，相关研究才开始迅速开展起来。因此，要加快发展我市干细胞产业的步伐，加大推进力度。
3、国省分布状况分析
国内干细胞专利申请主要集中在江浙沪一带及北京、天津、广东等经济较发达地区，这些城市在干细胞投入研究方面起步较早，合资企业也相对较多，掌握了主要的技术市场。相比较，一些中部地区相对发展能力不是很强，技术比较薄弱，企业规模较小，发展历程短，竞争力较弱，需要政府进一步加快干细胞相关技术及基因工程药物科研成果向实际生产力转化，逐步推动形成干细胞研究和产业格局。
自2002年至今，无锡市干细胞专利申请量总共只有3件，且都为无锡人寰生物医药科技有限公司所有，占比为100%。
分析：根据我国干细胞专利申请量排名情况来看，干细胞专利技术基本都被大学、科研院所及医院所持有。截止2010年年底，国家干细胞与再生医学产业技术创新战略联盟成立，由国内27家干细胞与再生医学领域的一流科研院所、知名三甲医院、多家211工程重点高校、行业龙头企业等作为发起单位和理事成员单位。“十二五”规划明确将“干细胞研究、发育与生殖研究”列为六个重大科学研究，并在规划中要求有关单位集中优势力量，推进重大科学研究计划实施。政府还建立了科技部国家干细胞工程技术研究中心、发改委细胞产品国家工程研究中心和湖南长沙人类胚胎干细胞国家工程研究中心三大研究机构，推动干细胞的研究。但我国干细胞产业目前只处于研究起步阶段，现阶段我国干细胞产业领域单位数量不多，具有较大规模较强实力主导品牌单位也只有约10多家左右。与美国等发达国家比，我国干细胞产业投资规模较小，多数单位的干细胞产业与临床应用推广尚处于研究起步阶段。
干细胞产业在我市几乎没有基础，只有在近两年引进了8家以“530”企业为主的干细胞研发领域生物公司以后，相关研究才开始发展起来。2009年在马山成立了无锡国际干细胞联合研究中心，此中心致力于各类干细胞的提取、研究、重大疾病干细胞的鉴定、诊断、治疗和新药开发，推动和参与制定干细胞行业标准，对我市的基础和临床医学研究产生巨大影响和推动作用，标志着我市的干细胞研发和产业发展进入一个新的阶段。
4、ipC分类技术构成及趋势分析
国内ipC主要分布在：
C12n：微生物或酶；其组合物；繁殖，保藏或维持微生物；变异或遗传工程；培养基。
a61K：医用、牙科用或梳妆用的配制品。
a61L：材料或物体消毒的一般方法或装置；灭菌、消毒或空气的除臭；绷带、敷料、吸收垫或外科用品的化学方面；绷带、敷料、吸收垫或外科用品的材料。
a01n：人体，动植物体或其局部的保存；杀生剂，例如作为消毒剂，作为农药，作为除莠剂；害虫驱避剂或引诱剂；植物生长调节剂。
C12m：酶学或微生物学装置。
无锡市干细胞专利ipC分类主要分布在：
a61K：医用、牙科用或梳妆用的配制品。
C12n：酶学或微生物学装置。
无锡市干细胞专利申请集中在a61K和C12n上，技术分布情况与全国技术分布情况相一致，但技术发展方向较单一，我市企业大部分只有几十例临床案例，竞争力相对较弱。
二、国外
专利数据时间（以公开年分析）：2002―2011
专利总件数：2317件，包括美国，日本，英国，德国，法国，欧洲，wipo（世界知识产权组织），瑞士，韩国、俄罗斯。（由于技术条件原因，本次专利检索并不完整，数据仅做参考。）
1、专利区域分布分析（国别）
分析：在本次报告查阅的有关干细胞的专利申请中，美国在该领域的专利申请量占总量的31%，领先于其他国家，其后依次是wipo26%、日本15%、欧洲13%、韩国10%、德国2%。美国和wipo合计占比57%，基本控制了整个干细胞发展领域的专利技术。
2、申请数量及趋势
分析：从总量上看，美国、wipo在干细胞领域的专利申请量远高于其他国家。从趋势上看2007―2009年，干细胞领域专利量呈现震荡起伏态势，发展水平较为平稳。2010年可能受全球金融危机影响，申请量出现下降。1996年多利羊的诞生，引发了世界干细胞研究的热潮，但是由于涉及伦理等诸多因素，美国等西方发达国家限制胚胎干细胞的研究应用，除骨髓干细胞用于治疗白血病的技术被广泛使用外，其它干细胞治疗的临床应用进展缓慢。2009年奥巴马政府宣布对胚胎干细胞研究解禁，国际干细胞研究开始新一轮的发展热潮。基于科技竞争和医疗健康等原因，最近几年干细胞已成为世界各国竞相研究的大热点，全球干细胞市场也随之活跃起来。有统计数据显示，目前全球从事干细胞治疗心脏病研究的就有229家公司左右。虽然美国、日本、德国、韩国、英国等国家的干细胞企业和研究机构纷纷加大投入，试图占领干细胞研究和应用制高点，但实际上这些国家的干细胞产品研究绝大多数仍处于研究阶段，在全球真正上市的干细胞产品很少，全球干细胞市场尚处于初级阶段。尽管现阶段仍然无法实现干细胞产品的真正产业化生产
和销售，但是一些在干细胞领域领先的企业已经研发出多种产品，干细胞领域展现出的光明发展前景也逐渐将许多生物医药企业吸引到干细胞产品研发的行列，而许多以干细胞为主要业务的企业也如雨后春笋般不断涌现，大量的资金正在不断的涌入这个前沿领域中，这些都为干细胞产业化时代的到来带来希望。
3、ipC技术构成分析
分析：国外在干细胞领域技术分布主要集中在C12n、a61K等主要方向，其技术分布情况与国内技术方向相似。
分析总结
根据我国干细胞专利申请量情况来看，干细胞研究的关键技术刚刚起步。我国政府对干细胞技术非常重视，对干细胞的临床应用研究非常宽松。首先，中国的干细胞移植技术从动物实验到批准临床只需要12个月的时间，而在美国，则需要6-8年；其次，在中国，进行干细胞临床试验不仅不会向病人支付任何报酬，而且还要向其收取巨额的手术费用，而这在美国根本不可想象。干细胞生物学研究是我国与西方国家“起跑点”最接近的重大科学领域之一。无锡市在该领域的专利技术只能说还在起步探索阶段。我市干细胞库数量远远不及国内其他发展较早的干细胞库，临床案例也只有几十例，干细胞研究才刚刚开始。政府要进一步加快我市干细胞产业的发展步伐，加大推进力度。
细胞生物学研究技术篇3
器官和组织的缺损或衰竭是临床遇到的极具危害性的医学难题，尽管目前人们通过器官或组织移植、外科再造和使用机械装置等治疗手段，解决了一些现实问题，但这些方法均存在不少缺陷。因此，人们一直在寻求一种新的治疗方法。随着多学科成果和技术不断交叉、融合和相互渗透，逐渐形成了一门新的交叉学科——医学组织工程学。作为一场意义深远的医学革命，在医学界它被誉为是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上又一新的里程碑。
1医学组织工程概述
组织工程学概念的提出始于20世纪80年代末，由于其重要的科学意义、巨大的临床应用前景、潜在的开发价值，受到了各国科学界的重视。医学组织工程学利用工程学和生命科学的原理来研究和发展具有生物活性的人工替代物，融合了细胞生物学、工程科学、材料科学和临床医学等相关知识。核心理念就是将体外培养的高浓度的正常细胞扩增后，吸附在生物材料上，形成具有三维空间结构的复合体，然后将复合体植入组织器官的病损部位，种植的细胞在生物材料被机体逐渐降解吸收过程中继续生长繁殖，形成新的具有相应形态和功能的组织和器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的［1］。其最大优点是可形成具有生命力的活体组织，进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代，根据组织器官缺损情况进行塑形，达到完美的修复。
目前组织工程学的研究手段已经不再局限于初始阶段的细胞生物学和动物实验技术、分子生物学技术，而是广泛应用基因克隆技术、转基因技术、移植免疫学技术、生物材料合成与改良技术、生物材料的编织技术、生物力学技术、影像学技术和生物反应器等先进技术［2］，极大地提升了组织工程学的研究水平和其自身的发展速度。与传统的自体或异体组织、器官移植相比，克服了以创伤修复创伤的缺陷，将从根本上解决组织、器官缺损的修复和功能重建等问题。
2种子细胞
种子细胞是医学组织工程的生命源泉，它要确保在体外培养时有很强的增殖能力，并能定向分化，同时要保持其原来的生理性状。大多数观点认为种子细胞进入新的微环境后，会对新的微环境中的调节信号做出反应，从而定向分化为目的细胞。同时具备这些特点的干细胞就成了种子细胞的首选。应用干细胞治疗疾病较传统方法还具有低毒性，一次药有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；避免产生免疫排斥反应等诸多优点。在临床治疗中，造血干细胞应用较早，在提高治疗有效率和缩短疗程方面优于常规治疗，且效果令人满意。
按分化潜能干细胞基本上可分为三种类型：一类是全能性干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞（简称eS细胞），它可从早期胚胎的原始胚细胞及原始生殖细胞中分离培养获得，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，能分化出成体动物的所有组织和器官。由于在医学和生物学上具有巨大的潜力，而备受各国的高度重视，使其成为当前生物工程领域的核心问题之一，在这一领域，世界性的研究开发竞争正在迅速展开。eS细胞最诱人的前景是生产组织和细胞，用于“细胞疗法”，为细胞移植提供源源不尽的无免疫性的材料。任何涉及丧失正常细胞的疾病都可以通过移植细胞来治疗，包括帕金森病、糖尿病、外伤性脊髓损伤、细胞变性病、心肌病和骨损伤等［3］。尽管eS细胞培养体系和来源问题研究已经取得了巨大进展，但应用于临床还存在很多技术上的难题：其中最为重要的是其分化问题，目前关于eS细胞自我更新机制及其向不同组织细胞分化的机制均尚不清楚，因此如何防止其在体外培养时发生分化以及如何诱导得到纯化的分化细胞尚待研究；由于人胚胎干细胞来自具有发育成一个个体潜力的人胚胎，所以其研究不可避免地引发伦理道德问题的争议，并且在实际应用中还不能避免免疫排斥。
另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，一般认为其具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。人们可望从自体中分离出成体干细胞，在体外定向诱导分化为靶组织细胞并保持增殖能力，将这些细胞回输入体内，从而达到长期治疗的目的。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。成体干细胞是普遍存在的，常位于特定的微环境中，问题关键在于如何寻找和分离各种组织特异性干细胞。成体干细胞具有多分化潜能，其中骨髓基质细胞和脂肪源干细胞已有大量研究及部分临床应用，在个体化治疗中已用于骨、软骨、心肌再生等领域；在群体化治疗中需要解决同种异体移植的免疫原性问题，采用基因敲除技术或Rna清除技术去除抗原可能解决异基因细胞同种移植的免疫反应，但也有可能影响被敲除基因的其他功能［4］。最近，美国和日本相继公布了从人皮肤成纤维细胞转化为胚胎干细胞样细胞的研究成果，为解决这些问题带来了曙光，但要实现应用这一目标，还要进行更多、更深入的研究。
还有一类干细胞为单能干细胞，这类干细胞只能向一种类型或与之密切相关的两种类型的细胞分化。其中以脂肪源、肌源、上皮源及神经源干细胞为代表，作为组织工程的种子细胞，或以细胞治疗的方式进行了广泛研究，并已有临床应用的报道。
3支架材料
支架材料在医学组织工程研究中起中心作用，可为细胞提供黏附、增殖、分化并进而为组织的形成提供载体，还起到模板作用，引导组织再生和控制组织结构。作为理想的生物支架材料至少应具备以下特点:①良好的生物相容性：植入机体内不会引起炎性反应和毒性反应损害新组织的功能，维持正常细胞功能发挥;②良好的可塑性：根据目的组织器官加工成特定的三维结构;③具有缓释功能：支架的降解速率可根据不同细胞组织再生速度进行调整，而且能彻底被新生的自然组织所替代;④支架的表面化学特性和表面微结构适合细胞粘附。因此寻找一种既具有良好生物相容性和生物降解性又具有特定形状和连通三维多孔结构的支架材料是组织工程成败之关键因素。
近年来，人们不仅在组织工程的最早产品人工皮肤领域进行了更为完善的研究和开发，同时，在诸如人工骨、软骨、神经、血管材料等各系统，都进行了大量的研究和探索。目前研究的组织工程支架材料各自有各自的优点但也有不可避免的缺陷。国外研究较多的是pGa、pLa、pL2Ga等。这些材料具有可标准化生产、可降解、细胞相容性好等优点，但是这类材料本身亦存在一些固有不足，如生物相容性差及机械强度不稳定等。基于这些原因，研究人员一方面探索对聚醋类材料进行表面修饰，同时也在积极寻找其它类型的支架材料。通过对材料表面进行修饰，改善细胞与支架材料的相互作用;通过模拟细胞生长微环境，制备仿生材料，提高材料的亲水性、对细胞的黏附性，促进细胞的分化增殖。将合成材料与天然材料有机结合，已成为未来组织工程材料发展的新趋势。
研制复合材料、仿生材料、改性天然材料、纳米材料，是当前支架材料研究的主要方向。越来越多的学者设计出具有合适降解度、良好通透性、组织相容性好的软骨细胞体外培养支架材料。新材料的开发要求具有良好的各项生物学特性。通过将缓慢释放的生长因子或相关的基因整合到材料中，形成具有生物活性的生物材料，可以使种子细胞能在更接近于体内环境的生物材料上增殖、分泌基质、最终形成组织。
在组织工程材料的合成与制备中通过采用纳米技术对生物材料表面的改性或者直接采用纳米材料或复合材料，不仅能提高细胞对材料的黏附能力，也能提高材料的生物相容性，同时通过材料表面与细胞间相互的生物作用，能刺激并诱发所期望的细胞效应，有利于细胞的分化和增殖，纳米材料以其与传统材料无可比拟的生物学性能，已在组织工程和生物材料研究中显示出广阔的应用前景。纳米技术、组织工程技术和生物技术的发展与综合，将为培养支架的研究提供新的选择。
4生物活性因子
人体内的生长因子是通过细胞信号传递影响细胞活力的一类多肽因子，通过自分泌、旁分泌及内分泌作用，促进或抑制细胞生长、繁殖、迁移、黏附和基因表达的作用。在医学组织工程研究中，也需要在损伤组织的修复与病损器官的再生与功能重建中供给生长因子以促进种子细胞的分化和增殖。目前实验中常用的生长因子有成纤维细胞生长因子（FGF)、转化生长因子（tGF-β)、胰岛素样生长因子（iGF)、血小板衍化生长因子（pDGF)、骨形态发生蛋白(Bmp)等等。它们不仅可单独作用，相互之间也存在着密切关系，实验证明复合使用效果更好［5］。
在医学组织工程领域，生物活性因子对外源性生长因子或类生长因子作用的药物大多采用缓释技术，使其促再生作用持续一段时间。已有很多缓释材料在研究中，但目前尚未解决缓释体的有效释药浓度与组织器官再生所需药物浓度的相适应性。生物活性因子应用的另一个问题是多因子的协同作用及有序作用仍不清楚。
5组织构建
医学组织工程的最终目的是构建组织器官修复体内缺损。构建组织工程化人体组织或器官，涉及种子细胞在生物反应器中大规模培养、扩增技术，生物力学信号施加和化学信使生长因子或细胞因子的控制释放技术等多项关键技术。现在部分组织工程化组织已在临床应用中取得了初步的疗效，充分体现了它在未来医学应用中的巨大潜力。最早经批准用于治疗和投入市场的移植物之一是组织工程皮肤植片。目前各国科学家们正在为多种组织，包括骨骼、肝脏、动脉、神经、胰脏、皮肤、肾脏和膀胱，构建组织工程结构［6］。但是体内环境是一个复杂的综合体，除了各种生长因子、细胞间相互作用以及局部酸碱平衡等因素以外，局部生物力学刺激也是一个重要因素。构建理想的组织还有很长的路要走。
就现在而言，医学组织工程领域所遭遇的最大的挑战之一是需要为复合组织和器官构建一个功能血管网。因为不论对于哪种组织和器官，血管形成都是关键性的；另外，单一的器官中含有多种不同的细胞，同时分离和扩增几种不同的细胞，目前在技术上有一定的难度；其次，在构建过程中维持严格的三维结构也是现有技术手段无法解决的难题。
6展望前景
人体是一个具有复杂的形态结构、完善的功能的整体，要完全模拟人体的组织和器官并非易事。虽然经过近20年的研究，医学组织工程已取得非凡的进展，应用组织工程的原理与方法，已能构建多种组织并成功的修复相应的组织缺损，诸如皮肤、骨和软骨等组织和器官更是成绩斐然［7］。但是还有许多理论和技术问题有待进一步解决：在种子细胞的培养方面，细胞的筛选和纯化是一个公认难题；在组织再生过程中发挥特异调节细胞增殖和分化作用的生长因子，可控性缓慢释放技术依然不完善；组织工程化组织在体外或体内形成过程中的演变规律如何？这些演变规律与正常组织发育、再生及创伤修复等过程有何异同，对这些问题目前仍然缺乏全面系统的了解。
医学组织工程的产业化无疑能够创造极大社会效益和经济效益，我国的组织工程研究从无到有逐步发展壮大起来，并取得了重要的研究成果。目前在研究开发上已经逐渐从临床前研究进人到临床试验阶段，如果我们能够创造出具有我国自主知识产权的组织工程产品，率先应用于临床，这样不仅可挽救众多病人的生命和肢体，促进相关学科的科技进步，更能造福于人类，为形成新的知识经济产业打下基础。参考文献
［1］王国正.组织工程研究［J］.中国医学科学院学报，2003，25(1):35.
［2］SedovVm，andreevD，SmirnovatD，etal.theefficacyofcelltherapyinthetreatmentofpatientswithtropicvenousofloweslimbs［J］.angiolSosudKhir，2007，13(1):67-75.
［3］鄂征，刘流.医学组织工程技术与临床应用［m］.北京：北京出版社，2003：16.
［4］ChenXL，LiZL，ZhangwB，etal.experimentalstudyofmaxillarysinusliftingwithtissueengineeredbone［J］.ZhonghuaKouQiangYiXueZaZhi，2007，42（10）：610-613.
［5］HwangwS，RyuYJ，parkJH，etal.evidenceofapluripotenthumanembryonicstemcelllinederivedfromaclonedblastocyst［J］.Science，2004，303(3):1669-1674.
细胞生物学研究技术篇4
2014年7月，中科院生物物理所刘光慧研究员研究组及其合作者分别在国际权威学术期刊《细胞-干细胞》（CellStemCell）和《自然-通讯》（natureCommunication）连续发表了两篇重要研究论文，在确证现有基因组靶向编辑技术安全可靠性的基础上，创建了新型高效的人类遗传突变修复工具，并将其应用于镰刀形细胞贫血患者致病基因的靶向修复；同时利用人多能干细胞和基因组靶向编辑技术揭示了范可尼贫血的致病机理，首次提出多组织干细胞加速衰老或衰竭是其根本性病因，并基于此发展出相应的干细胞、基因和药物治疗策略。
人类诱导多能干细胞技术（ipSC）的出现，促进了人类基因组靶向矫正技术的快速发展，包括核酶介导的Dna同源重组技术（如ZFn、taLen及CRiSpR/CaS9等）和不依赖于核酶的大片段Dna同源重组技术（以第三代腺病毒载体HDadV为代表）。经遗传修复的自体干细胞具有治疗自身疾病的潜力，因此在个体化医学和再生医学中具有广阔的应用前景。在CellStemCell杂志发表的论文中，研究者首次综合运用HDadV、taLen和CRiSpR3种不同的方法，靶向矫正镰刀形细胞贫血患者ipSC中发生的血红蛋白基因（HBB）突变，发现这3种方法具有类似的打靶效率。同时，全基因组深度测序结果显示，taLen和HDadV在基因矫正过程中最大限度地保持了患者基因组的完整性，提示了这些方法的安全可靠。随后研究者整合taLen和HDadV作为基因组靶向修饰工具的独特优势，创建了效率远高于传统技术的新型人类疾病基因原位修复载体telHDadV，为开展基于干细胞的基因治疗奠定了基础，也使得再生医学研究向前迈进了一大步。该研究打消了干细胞和再生医学研究领域针对疾病基因靶向修复安全性的忧虑，同时，新型基因矫正载体的问世也将有助于加速干细胞临床转化的步伐。CellStemCell杂志同期发表的了题为“what’sChangedwithGenomeediting？”的preview评论：“这些发现无疑会鼓舞将基因组靶向编辑技术进一步应用于疾病研究和临床治疗”。
另一方面，范可尼贫血属于先天再生障碍性贫血，是一种严重的常染色体隐性遗传疾病，尚无有效的药物治疗手段。在natureCommunication杂志发表的论文中，研究者成功突破技术瓶颈，首次利用体细胞重编程获得患者体细胞来源的非基因组整合型ipSC，随后利用HDadV介导的基因组靶向编辑技术，在患者ipSC中原位矫正了致病基因，并证明了该技术体系的安全性。尤为重要的是，研究者首次在人组织干细胞水平阐释了范可尼贫血的新型病因学基础，即不仅归因于造血干细胞的过早衰竭，还与骨髓造血微环境间充质干细胞的加速衰老密切相关。在疾病治疗方面，该研究利用干细胞疾病模型首次筛选得到了可抑制范可尼贫血患者造血干细胞过早衰竭的小分子化合物，为实现该病的药物治疗奠定了基础。
上述两项研究工作得到多项国家自然科学基金项目以及“973”计划资助。
细胞生物学研究技术篇5
回想7个月前，婴儿被诊断为脑瘫，妇人至今仍心有余悸。的确，对于一个难产的妇人而言，好不容易将婴儿顺利产出，换来的却是一个婴儿瘫的诊断，这种打击是沉重的。
“救救我的孩子吧！求求您！”听完医生的诊断，产妇不顾身体的疼痛，苦苦哀求医生。
“这……”医生赶忙扶起身体虚弱、泪流满面的产妇，额眉深锁，因为他知道，对于脑瘫患儿无特殊治疗方法，除癫痫发作时用药物控制以外，其余症状多为对症处理。
“别急，别急！你在婴儿出生前不是申请了细胞产品国家工程研究中心的脐带间充质干细胞家庭保管服务吗？可以尝试对婴儿进行自体脐带间充质干细胞移植治疗，婴儿还有希望康复。”短暂的沉思过后，医生额前深深的皱纹突然舒展开来，语气充满希望和喜悦。
在获得婴儿家人的知情同意后，医院对患儿实施了4次自体干细胞移植，患儿目前发育良好，7个月可端坐，竖头正常，双下肢痉挛明显减轻。
……
其路漫漫，上下求索
天津昂赛细胞基因工程有限公司董事长、细胞产品国家工程研究中心主任韩忠朝教授在接受记者采访时说：“这是一个真实的案例，这样的案例在细胞产品国家工程研究中心不胜枚举。”在采访中，记者除了惊叹，更多的则是对干细胞临床应用之路的美好祝福和期待。
据韩忠朝教授介绍，细胞产品国家工程研究中心自2006年4月24日在天津开发区创办国内第一家间充质干细胞库以来，目前已储存脐带间充质干细胞5000多份；中心与北京、天津、南京等国内外多家有干细胞移植经验的三甲医院进行了科研合作，从2007年4月至2008年5月共治疗52例病人。其中，脐带间充质干细胞家人成员应用9例，所应用疾病脑梗塞1例，高血压、冠心病3例，糖尿病3例（其中伴风心病1例，伴脂肪肝1例，伴帕金森病、前列腺增生1例），肝硬化1例，婴儿脑瘫伴皮质盲1例，公共库保存的脐带间充质干细胞提供给无关患者应用46例，共治疗移植物抗宿主病（GVHD）12例，系统性红斑狼疮（SLe）、狼疮肾1例，神经系统疾病14例，消化系统疾病6例，心血管系统疾病5例，治疗其他系统疾病8例。
谈起脐带间充质干细胞卓有成效的临床应用案例，韩忠朝毫无期待中的兴奋和激动，坚定执着的眼神像沉淀过后的泉水一样明镜透亮，一系列的有利数据使韩忠朝更加坚信干细胞能给人类带来福音。
11年前，韩忠朝是法国医学科学院院士雅克・康最得力的助手，负责组建细胞分子生物学实验室；凭借“巨核细胞生长调控因子”研究成果，获得法国科学院的科技奖――罗伯格奖，并被巴黎第七大学聘为教授。1997年8月，韩忠朝结束了11年的海外游子生涯，顺利来到天津，担任中国医学科学院血液学研究所血液病医院所院长。
“如何把理论研究成果运用到实践中呢？应该进入市场，走产学研结合之路。”韩忠朝不无感悟地说，“科学研究是需要经济基础的活动，研究成果对经济发展不起促进作用，一味地在消耗国家的财富，任何一个有责任感的科学家都应转变理念，把理论研究成果转化成有用的生产力，这样才对得起国家，对得起自己的人生。”在法国做研究时，韩忠朝发现治疗血液疾病可以追本溯源到干细胞，而干细胞的研究技术在国际上已日趋成熟。他不再满足于眼前的理论研究，在他看来，科技研究成果只有在实践中得到应用才体现其价值和意义。所以回国后，韩忠朝就下定决心，将自己的科研成果应用到实践中造福国民。
利国利民，“昂赛”突围
“人体起源细胞就是干细胞，干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新并在特定条件下转变分化成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞，干细胞是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的祖宗细胞，”谈及干细胞神奇之处，韩忠朝幽默地称之为“干什么都行的细胞”。
事实上，刚回国时，对于“干细胞”这个词，国人还非常陌生，韩忠朝不厌其烦地向国人解释。后来，他发现单凭自己一张嘴，传播的范围实在太局限。从那时起，十年来韩忠朝一直笔根不辍，先后320余篇，其中在Lancet、Blood等国际SCi杂志发表近150篇，主编参编英文专著5部、中文专著5部，申请发明专利32项,已授权专利12项，成果荣获国内外科技奖共20项，包括1项国家自然科学二等奖、3项省部级科技一等奖。
1999年，干细胞生物学被美国《科学》推举为21世纪最重要的10项科学领域之首。大家这才发现干细胞是个造福人类社会的科学技术。
“迄今的研究表明，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。新生儿脐带为分娩废弃物，来源广泛，取材方便，不受任何伦理及法律的限制。脐带间充质干细胞移植是治疗血液系统疾病、自身免疫系统疾病、先天性遗传疾病以及神经系统疑难病的最有效方法之一，具有疗效确切、免疫原性小，安全性高等特点，同时可作为细胞治疗、基因治疗靶细胞以及组织工程研究的种子细胞。人类脐带间充质干细胞可作为生物制品申报新药，形成产业化，便于临床推广应用，将产生巨大的经济效益和社会效益。”虽然国人接受并了解干细胞的神奇功效，但是韩忠朝十分清楚，要想将干细胞变成“造福国民”的利器，这仅仅是万里长征的第一步。
“必须得成立细胞工程中心！”这样的念头，韩忠朝曾经在心中呼唤过无数次，因为他太清楚这样的中心意味着什么，它将会给国人带来无穷的福音。然而，要成立这样的中心，摆在韩忠朝面前的有两大难题：一是征求国家相关部门的支持，二是需要大量的资金。
……
功夫不负有心人。经过两年多的游说，韩忠朝终于换来国家和天津市的资金支持，2004年国家发展与改革委员会批准在天津滨海新区成立细胞产品国家工程中心。同年8月组建了项目法人公司――天津昂赛细胞基因工程有限公司（以下简称“昂赛”），经过三年的筹建，于2006年10月份通过国家验收评估，正式获得国家发展改革委员会的国家工程研究中心的授牌。“昂赛”自建立以来，坚持走自主创新的路线，采取先进的管理机制，集聚干细胞技术和人才优势，逐渐形成了技术、人才、经济良性循环发展模式，取得一批高水平的科技成果。在此期间，韩忠朝承担了国家863、973、国家自然科学基金、国家干细胞产业化基地示范工程项目以及细胞产品国家工程研究中心等30多个研究项目培养硕士生、博士生和博士后60多名。
如今，“昂赛”已具备良好的干细胞工程技术开发能力，建立了7个行业关键技术平台，与法国、美国、日本等国学术机构进行了广泛的学术交流与项目合作，与北京、广州等省市建立了产学研战略联盟。不仅如此，韩忠朝领导的科技团队已成功地创建了全球最大的干细胞库――天津市脐带造血干细胞库，并在世界上首次开展了血液干细胞移植治疗下肢缺血性血管病并取得显著疗效，首次发现了一个新的干细胞因子――人促血液血管细胞生成素，首次发明了人类脐带间充质干细胞库构建技术并建立世界首家脐带间充质干细胞库，创造了良好的社会与经济效益，又为我国的干细胞生物资源的保存和有效利用开辟了一个具有划时代意义的新途径。
自主创新，前瞻未来
2008年5月，韩忠朝获得由第十一届北京科博会组委会颁发的“中国自主创新风云人物”奖。在谈及如何领导企业探索自主创新之路时，韩忠朝不无担忧地说，“我国企业自主创新能力严重不足。我国发明专利授权中四分之三为外国人所拥有；申请专利数量最多的10家电子信息企业，其5年申请之和仅相当于美国iBm公司1年申请的专利数量。由于缺少拥有自主知识产权的核心技术，中国不少行业存在技术‘空心化’的危险。”韩忠朝分析造成这种状况的主要原因包括：企业研发经费投入不足，企业高级科技人员不足、流失严重，以企业为主体的创新体系尚未完全形成，国家相关优惠政策难以发挥应有作用。
在谈及如何提升企业自主创新能力的时候，韩忠朝提出五点建议：“第一，转变观念，加强领导，把企业自主创新能力建设真正置于国家战略的高度，使企业真正成为技术创新的主体；第二，深化改革，落实政策，强化企业自主创新的动力机制。加快推进企业产权及现代企业管理制度改革，强化国家财税优惠政策，改革国有企业业绩考核指标体系；第三，加强企业科技人才队伍建设，对特殊人才要给予特殊待遇，积极引导人才向企业流动，规范人才流动秩序；第四，促进企业创新体系的建设与发展。积极支持企业建立和完善研发中心，产学研结合模式必须以企业为主，促进企业组建技术联盟；第五，加强对引进技术的消化吸收和自主创新。国家应设立专项基金，引导鼓励企业和科研单位一起对引进技术进行消化吸收再创新；制定优惠政策，大力鼓励自主创新和对引进技术再创新。同时，国家在重点产业领域要限制重复引进技术和设备”。
细胞生物学研究技术篇6
生物医学电子显微学是电镜技术与生物医学相结合的边缘学科，是应用电镜观察研究细胞亚显微结构及其变化，揭示细胞结构与功能的科学技术，对建立现代医学完整形态学知识结构体系及分子生物学的研究至关重要。为生物医学专业研究生开设《生物医学电子显微学》课程，旨在使学员系统地学习超微结构知识，掌握超微结构的研究方法和实用意义，扩大科研思路，为课题设计和研究打下良好的基础。我室在多年教学实践中，经过积极探索，对教学内容、教学方法进行了系统的改革，几年的教学实践证明，这一改革取得了明显的效果。
1构建面向适应能力培养的教学内容
《生物医学电子显微学》的教学对象主要是硕士研究生，其目的是使学员掌握与研究相关的超微结构研究的实验技能，为超微结构研究奠定实验技术基础，拓展课题研究思路。为了使课程具有足够的宽广度和纵深度，并具有前沿性和前瞻性，提高超微结构的研究水平，突出电子显微学在基础医学及临床研究中的应用［1］。首先，将细胞超微结构纳入电镜技术的教学，系统地充实有关新的电镜技术和细胞超微结构的理论知识，把超微结构理论知识与电镜技术整合为生物医学电子显微学，作为一门学科进行建设。通过两部分内容的有机结合，让学员在学习电镜技术时了解细胞超微结构，在学习细胞超微结构的过程中掌握电镜技术。另外注重融合、吸纳本学科前沿的研究成果和实验实例，更新教学内容，将细胞生物学、分子生物学中的新进展、新技术融入教学，增设了培养细胞电子显微学研究技术、特殊组织细胞（如海马）的取材技术、电镜原位杂交技术、硝酸镧示踪技术、钙离子示踪技术等，使课程内容紧密结合基础研究和临床应用，为研究生更好的利用电镜技术为基础医学和临床研究打下基础。为了使研究生更好地进行超微结构研究，我们建立了开放型技术平台［2］，为研究生课题研究提供选题设计、实验技术方法、镜下图像观察、结果分析与论文撰写等技术指导，既保证了研究生课题的顺利进行，也促进了本学科实验技术的发展，充实了教学内容。同时多层次与我校形态学专家建立良好的协作关系，聘请他们协助指导研究生超微结构研究工作。
2实施有利于实验技能培养的教学法
改革教学方法，突出对研究生创新能力、实践能力的培养，增进研究生的科学素质;改进训练方法，解决课程中的重点与难点教学，加强实际工作能力的训练;应用多种辅助教学手段，建立互动教学园地，提高了教学质量。
2.1理论教学
在细胞超微结构的教学中采用大量典型的各系统超微结构照片、模式图和事例充实理论教学内容，使学员了解细胞亚显微结构的异常改变与功能变化、发病机理及疾病的关系，从而认识到电子显微学在疾病病因、病情、分型及鉴别诊断中的重要性。在有关电镜的结构与原理的教学中应用多媒体、视频、动画和实物等多种辅助教学方式，将抽象的理论形象化。在讲解样品制备技术时，强调取材的重要性，通过介绍失败事例使学员认识到样品制备在超微结构研究中的重要性。
2.2实验教学
在实验教学中重点训练学员基本技能，培养动手能力，使其掌握正确规范的实验技能。通过实验教学加强学员对课程的重点、难点的理解和掌握:①突出重点，培养学员的动手能力;②突破难点，使学员掌握电镜操作技能;③强调镜下观察分析的重要性，提高学员的研究能力;④考试、考核并举，重在能力培养。
3新教学法的实施效果
通过教学体系的改革与调整，拓展了教育规模，提高了学员对生物医学电子显微学的认识及科研技能掌握和应用的能力，增加了选课率，增加了研究生在课题研究中的电镜使用率。两年来完成了593人次.2374例的样品测试任务。通过对教学内容、教学方法的改革，以及新技术、新方法在教学中的应用和充实，促进了教员查阅文献的主动性，追踪技术进展的积极性，使教员队伍综合素质整体跃升。通过建立开放型技术平台，促进了电镜实验技术的发展，两年来协助完成科研任务474项，在临床医生和研究生的配合下开展了电镜诊断研究，涉及到肿瘤疑难病例的诊断、肾穿刺活检的电镜诊断、神经.肌肉活检电镜诊断等，开展了对细胞组织起源的鉴定，细胞损伤的早期观察，纳米材料的测定等，既提高了自身的业务水平，又解决了临床疑难，推动了临床科研，提高了电镜的有效使用率，使教学改革成果显著。
［参考文献］
细胞生物学研究技术篇7
近4年来，娄晋宁领导的团队已经实施了26例胰岛移植治疗糖尿病研究。
他的团队从事的干细胞治疗糖尿病的研究可以说是当今医学界最前沿、最热门、最受瞩目的研究领域之一。由于理论体系的不完善，技术手段的局限性等诸多未解难题以及伦理道德方面的争议，使得干细胞的研究一直处于既让人无限期待，又被人不断质疑的纠结之中。
谁都知道创新之路的漫长和曲折，探索就会有失败，失败就会有收获。只有怀着内心梦想的人才可能持之以恒，锲而不舍。
做应用研究比做理论研究更难
娄晋宁的手机更像是一本常年随身的病历夹，往来的许多短信包含大量临床患者反馈的信息资料。
一个多月前，他们刚刚进行了国际首例人胚胎胰腺干细胞分化胰岛移植治疗1型糖尿病的临床研究。作为这个项目的主要负责人，娄晋宁需要及时了解每例患者的血糖、胰岛素用量以及患者其他指标的变化情况，以便在以后的研究中不断改进技术方法。
干细胞是体内存在的一类具有自我更新的能力，又有分化成为其他组织细胞潜能的特殊细胞可以用来制备各种功能细胞并应用于疾病的治疗。干细胞的研究也因此在全世界范围内如火如荼。
目前，有两类疾病应用干细胞治疗可能有效，一是神经损伤，二是糖尿病。因为，干细胞可以分化成为神经细胞和胰岛细胞，并且神经细胞和胰岛细胞移植证实能够有效治疗这些疾病。由此，干细胞研究被认为最有可能在这两个领域取得突破。
1978年进入大学学习前，娄晋宁已经有7年的临床医疗工作经验，经过5年医学院本科和3年中国医学科学院的研究生学习，奠定了他基础医学和临床医学的工作基础。在瑞士留学的10年间，娄晋宁先后从事了脑型疟疾，多发性硬化，移植免疫排斥、缺血-再灌注损伤和胰岛移植治疗糖尿病等方面的研究。由于具有基础研究和临床医疗两方面的工作经验，娄晋宁更热衷于将基础研究的结果与临床应用相结合。但他也深知“做基础研究的人不容易，要把基础研究转化成临床应用更不容易”。
娄晋宁和他的团队一直承担国家“十一五”计划和“十二五”计划干细胞技术治疗糖尿病的研究课题。研究主要采用人胚胎胰腺组织来源的干细胞，通过体外扩增和定向诱导分化制备成胰岛内分泌细胞，并将这些细胞诱导成为胰岛样结构。
在体外证实这些分化的胰岛能够对葡萄糖刺激产生胰岛素释放后，它们先后在糖尿病小鼠模型和糖尿病大鼠模型都获得了满意的治疗效果。之后，他们进一步应用胰腺全切除手术制备了恒河猴糖尿病模型，并将人胚胎胰腺干细胞分化胰岛分别移植到恒河猴的肝脏和肾包膜下。经过10只恒河猴，长达近4年的有效性和安全性的评价，课题组证实，人胚胎胰腺干细胞分化胰岛治疗糖尿病在恒河猴有效并且安全。
实验研究的成功并不意味临床应用的开始。在干细胞技术治疗糖尿病临床应用前必须解决一系列的技术问题如：采用多大胚胎的干细胞？干细胞体外扩增到多少数量？如何筛选分化后的功能胰岛？如何评价分化胰岛的安全性？干细胞分化胰岛移植到什么部位？移植多少胰岛数量？移植后进行哪些指标监控？等等。除此之外，还要申请通过医学伦理委员会的审批以及病人签署知情同意书。这些问题的解决都涉及主管部门、基础研究团队，临床研究团队和病人之间的密切合作和沟通。
近来的研究表明，来自人胚胎早期的干细胞系具有分化效率低和成瘤性高的缺陷，而来自成年人体的干细胞往往存在增殖能力低下的缺陷。而人胚胎组织来源的干细胞既具有很强的自我更新能力，有具有较好的分化潜能，并且我国学者曾经进行了近1000例的临床实验，证明用人胚胎胰腺组织移植治疗糖尿病有效。因此，娄晋宁团队决定采用人胚胎胰腺组织来源的干细胞进行这项研究，并通过医学伦理委员会审批和患者签署胚胎组织进行同意书解决了所涉及的医学伦理问题。
娄晋宁团队首先证实，来源于3个月内的人胚胎胰腺组织的干细胞，具有体外增殖能力较强，分化后成熟度较高的双重优点，并且在细胞移植后不发生免疫排斥反应。
此后，娄晋宁团队分别解决了这种干细胞的体外扩增、定向诱导分化和形成胰岛样结构三个技术难题，使一个人胚胎胰腺来源的干细胞可以在体外扩增到10个亿细胞，并且诱导分化后胰岛数量可以达到50万当量，胰岛素分泌功能相当于正常胰岛的50%。这些干细胞技术在数量和质量上的突破为临床应用奠定了基础。
基本的素质是锲而不舍
目前，干细胞的临床应用仅限于自体干细胞治疗，国内用此类干细胞治疗的疾病已达30种之多。自体干细胞移植的最大好处是安全，但多数治疗可能无效或短时间有效，并且相关的作用机制也没有搞清楚。
不同于自体干细胞移植，1型糖尿病的发病机制是自身免疫所导致的胰岛细胞破坏，并且临床研究研究证实采用胰岛细胞移植能够有效治疗1型糖尿病。因此，采用干细胞体外扩增和定向诱导分化技术所制备的胰岛移植，其治疗的机制就是胰岛细胞的替代治疗。到目前为止，采用这种干细胞技术治疗糖尿病在国际上还未见文献报道。
娄晋宁寄希望以基础研究学者要求的逻辑性以及临床研究者要求的精密性、完备性来控制研发节奏，回归医学临床治疗研发的理性轨道。
“其方法就是把自己的研究‘做实了’”。
据娄晋宁介绍，首例干细胞分化胰岛移植经过医学伦理委员会的审批，由患者签署了知情同意书，并接受免费治疗。移植所采用的干细胞经过功能筛选来自3个不同的胚胎，经过30天的体外扩增和定向诱导分化，培养的细胞达到140个培养瓶，诱导分化后的胰岛达到50万当量。目前，移植后的初步结果显示，干细胞分化胰岛移植后患者的血糖控制改善，胰岛素用量减少，进一步结果有待组织活检的证实。
干细胞移植是前沿研究，在研究的初始阶段，每一个探索都可能存在缺陷，任何技术和方法都有一个从不完善逐步到完善的过程。娄晋宁认为，对于发生率和死亡率高、又缺乏特异有效治疗手段的疾病，应当在确保安全性的前提下鼓励和支持探索创新。
细胞生物学研究技术篇8
细胞培养基和细胞培养工艺是生物制药和疫苗产业中最关键的部分，我国在此领域人才奇缺，在“”的呼唤下，有着近30年海外背景的罗顺回国创业，为祖国发展贡献自己的智慧。
从国际知名科研工作者，到兼具科研创新、经营管理等多重素质的综合型人才，罗顺实现了角色的成功转型，也在生物制药王国画下壮美的蓝图。
“1号”人才引进回国
美国钢铁大王卡耐基曾说过：将我所有的工厂、设备、市场、资金全部夺去，但是只要保留我的组织人员，四年之后，我仍将是一个钢铁之王。1950年，钱学森决定返回祖国时，主管他研究工作的美国海军次长大为震惊。他认为：钱学森无论在哪里都抵得上五个师。他说，我宁肯枪毙他，也不愿放他回中国。这充分说明了科技人才对一个企业乃至一个国家的重要性。不论在国外还是回国发展，罗顺都是这种不可替代的人才。
罗顺是从华中农业大学毕业后走出国门的，那是1985年，当时算是公派留学。去美国有一个明确的目的，就是希望研究生物化学的一些特性。结合大学学生物化学时研究过酶的一些特性，罗顺开始了对酶的表达情况的研究。
在美国，罗顺一鼓作气，完成俄勒冈州立大学生物化学专业硕士、弗吉尼亚理工大学分子生物学博士学位，并在哈佛大学医学院完成针对癌症的博士后研究。毕业后，因为出色的科研才华受到美国各大知名制药公司的青睐，他先后供职于瑞士制药公司、美国BeckmanCoulter公司、美国基因Xp生物技术公司、美国细胞培养基公司、美国基因泰克生物制药、美国安进生物制药。在美国待了近30年，罗顺的事业和生活就像他的名字一样，顺风顺水。
2011年的中国生物制药行业，方兴未艾，面临新的发展机遇。2008年陆续回国的同事和朋友都纷纷劝他回国发展生物制药。如果继续留在美国，自己创业，基本只能是个梦想;如果回国，能为国内的生物制药贡献自己的智慧。说干就干，罗顺是一个果敢的人，当下决定回国创业。
在罗顺看来，当时的生物制药作为战略新兴产业，国家对其支持力度很大。中国是一个巨大的医药市场，生物制药是它的核心。并且随着人们对生活品质的提升，越来越关注高质量、健康的生命。尽管近年国家也引进了一批生命科学领域里高水平的专家学者，不过这些人更多是从事基础理论研究，缺少实践者。他认为，要把研究成果转换成生产力，转换成社会价值的东西，你必须要通过产业化。而这正是罗顺回国想实现的。
2011年，时任北京市委书记刘淇亲自批示，将罗顺作为国家第六批第一号人才，引进回国。
回国后，在甘肃做投资的朋友的支持下，罗顺将起点选在甘肃兰州。虽然与科技资源相对丰富的北京失之交臂，可罗顺后来发现，这里非常适合开展培养基的研究。
个中艰辛唯有自知
万事开头难。从未有过经营管理经验的罗顺，碰到了一个接着一个的棘手难题，很多都让他始料不及。
“最大的困难是人才。我带回的是美国技术专家团队，他们中大部分人不会说中文，而且很多是学者型的人才，他们有技术但是遇到问题解决不了，不适应国内的环境。”从论文成果到进入市场成为相对成熟的产品，这中间有一个对企业家和科学家来说是高风险、高投入的关键环节，而要实现这一环节的无缝链接，亟需大批既懂经营也懂科技的科技经营人才。为此，罗顺投入很大的精力来培养本土的团队。
第二个需要面对的问题，就是国内的经济环境、政治环境，以及大家对生物制药行业的误解，大家往往觉得今天投资，明天就能有回报。
“生物制药行业是一个长期投资，大量投资，慢回报的一个行业。所以，不论政府方还是投资方都会提出疑问：他们这么厉害，怎么还没赚到钱？整个社会上的反映也会是，干了两年半，怎么还没有成为世界最大的培养基公司？或者新药怎么还没有研发出来？”这一点让刚回国的罗顺颇感憋屈和无奈，“培养基不是做药的，我们是做原材料的，这是理念上需要纠正的。”
最重要的问题是，国内外都对本土公司的技术不看好，没信心。“很多人觉得，中国公司的技术绝对不如美国的公司，美国的东西一定比中国好。”罗顺说，这种心态似乎形成了一种惯性，植根于每个人的头脑中。“美国人觉得中国制药是劣质、质量不好，原材料质量更不好。我现在做生物科技技术，我也有一个理念，我做的是原材料的事，要做到跟世界一样的水平。”这是罗顺的目标。
从国家部委到地方政府，从投资方到合作方，每个人都在寄希望于罗顺，此时的他，背负多方压力，唯有埋首科研、尽心经营，用事实告诉人们，他的目标达到了。
瞄准生物制药的CpU――细胞培养基
细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境，是生物医学工程中最重要的组成部分。细胞培养基市场主要由美国三大公司――美国英杰（invitrogen/Gibco）、西格玛SaFCBio、海克隆（Hyclone/GeHealth）垄断。中国细胞培养基市场年需求量大约在600～700吨，由于目前中国并没有能够大规模生产细胞培养基的厂家，而现有的几家小型供应商的产品研发能力不足、生产技术和工艺又不成熟，所以产业化需求难以满足，中国市场上95%的培养基都需要依赖从美国进口，从而导致我国生物制药产业受困于成本高、受制于人的窘境，且如果国内研发、生产能力持续落后，发展缓慢，将长期依赖进口。
最初注意到细胞培养基，是罗顺还在美国生物制药公司的时候。当时，美国几家著名的生物制药公司都与他保持着联系，他们希望罗顺能给他们在这方面提供技术支持，或是担任顾问提供指导。朋友们就纷纷劝他，不如回国，开一个细胞培养基的公司。
“就像计算机的CpU一样，再好的计算机pC设计，如果没有CpU这个核心，生产不出好电脑。”罗顺回国后最成功的是，瞄准了生物制药的CpU――细胞培养基。
细胞培养基对生物制药的产业和行业而言，是一种关键的生产原材料，也是一项关键的生产的技术。罗顺早期的研发工作就是围绕生产的工艺开发进行的，主要是细胞代谢理论的研究、细胞培养基的开发、细胞培养工艺的开发。在对细胞代谢理论进行系统研究的基础上，罗顺建立了一个细胞代谢效率的理论，这个理论就是指导我们怎样给细胞提供最有效的营养，而这个最有效的营养组合就是细胞培养基。由他领导的CHo细胞培养课题组以其在业内一流的药用蛋白产量著称于世，创世界最高产量达每升11克，同时拥有3项专利，罗顺本人获得2010年安进科技创新最高奖。自此，他的科研实力在业界声名鹊起。
“我们把美国一流的细胞培养基技术带回来了，等于是带回来国际一流的新产品开发技术研发平台。短期内，可以研发出将近100种细胞培养基配方，这对中国的生物制药产业的意义是巨大的。”任何一个企业，凭借这项独一无二的工艺，就能涉入更多的生物制药领域，打造起核心竞争力。而对整个产业来讲，更是有着“革命”般的作用，它提高了整个产业的生产效率，发挥了榜样的作用。
打造生物科技的“黄埔军校”
如果说罗顺带回的细胞培养基技术，让我国生物制药行业摆脱了美国培养基公司对中国市场的垄断，而且能提高客户公司的生产的效率和核心竞争力。那他带回的干粉工艺流程，更是填补中国细胞培养基干粉生产的空白。
在罗顺的公司，美国CRB设计团队（曾参与编写美国Gmp）首次为中国企业设计、监理、建设，并且这也是国内首家引进针磨技术的企业，生产车间采用国际一流的干粉生产设备。针磨技术解决了国内干粉培养基生产时温度、湿度、粒度稳定性等难题，取代了国内传统的球磨工艺，大大减少了培养基在研磨过程中的损耗，使得公司拥有了符合cGmp标准的工业化大规模细胞培养基生产平台，产能可达300吨/年。
在工艺开发的过程中，罗顺深刻地感受到，科学研究、成果转化和应用，人才不仅是一个非常重要的因素，而且是第一因素。甘肃健顺生物科技有限公司在成立之初就决定要培养年轻的人才队伍，因为这对公司的长期发展至关重要。
在此理念的指引下，依托“无血清细胞培养基工程实验室”，团队培养出了一批中国乃至世界的具有扎实理论基础和实践能力的生物技术人才。同时，与当地大专院校（兰州大学、甘肃农业大学、西北师范大学等）、科研院所联合培养人才，以能力培养为核心，综合素质培养为主线，培养技术型人才和高级经营管理人才，并在科学研究和产学研相结合过程中，掌握国际领先的研发设备，逐步探索出符合公司特色的培养体系。
“我们想打造一个开明、民主、自由的公司文化，也像在美国一样，很多年轻人都直呼我的名字。我们提供单身员工的宿舍，我们有食堂，食堂的伙食非常好。我们与高校联合组织篮球比赛、马拉松，给他们提供放手去做的条件，允许他们出错。”
罗顺对于人才培养可谓费尽心思。公司会对培养对象进行专业辅导培训。如：组织国外专家举办生物医药学科的科学讲座，使培养对象深入了解生物医药产业的先进理念和国际领先的技术水平;每周开设外国专家与新进人才在生物医药领域英语、汉语的专业语言交流提高课程，增强科研合作与交流的能力;鼓励和支持培养对象参加学术交流等活动，了解生物医药领域的一些最新研发动态，拓宽年轻人才的知识结构和研究视野。
在培养过程中发扬“传、帮、带”的精神。通过外国专家亲自到实验室指导实验的方式，培养他们的实验动手能力和独立开展科研的能力。在专家们规范严谨的指导下，一批年轻的科研人员已逐步掌握了试验的方法和操作的要领，并成为了我们科研团队的主力军。
同时，还会有计划地安排年轻科研人员跟随专家团队去境外培训进修，促进团队与境外、国外学者的交流，使年轻科研人才逐渐在国内外科学舞台上崭露头角，并逐步培养和成长为中国生物医药界的新生力量。
“我是希望，能打造出中国生物制药工艺开发――细胞培养基的‘黄埔军校’。”罗顺说，如果公司发展到一定程度，希望能在兰州大学或其他高校建立生物工程专业。他说，在美国，也只有为数不多的几所大学拥有这个专业。他希望能把该领域世界一流专家教授都请来讲授，这样，也能为国内这个领域培养更多人才。
携健顺生物扬帆远行
致力于“无血清个性化化学成分界定细胞培养基”及其工艺的研究开发，同时提供培养基配方委托生产、Clonepix细胞株筛选等技术支持配套服务，2011年3月，甘肃健顺生物科技有限公司（以下简称“健顺生物”）成立，罗顺是公司创始人。
“我们的最终目标就是，降低最高端的生物制药的成本，让更多的老百姓用上生物制药。”罗顺深谙生物科技的这一文化核心和理念，“我们哪怕做非常小的一件事情，也是希望为客户降低成本，用药去治病救人，我们公司的文化是植根于此的。”
目前，健顺生物的产品主要应用于生物制药（治疗性重组蛋白，包括单克隆抗体）、细胞治疗以及人/兽用疫苗的工艺开发与生产。
“健顺生物与美国领先细胞培养基公司一样，拥有世界一流的干粉生产线设备技术、工艺流程，年产量可达300吨，这是国内公司所不具备的。最重要的是，与欧美生物制药公司一样，拥有一流的高等生物细胞培养基配方开发基础理论与技术平台，就连美国三大培养基公司都不具备。”健顺生物独具优势的竞争力让他们初战告捷。
公司成立3年来，在罗顺的带领下，凭借自身全球领先的研发技术水平和过硬的产品质量，目前已产生强大的市场价值，已与兰州、成都、上海、广州、山东、北京、武汉、石家庄、浙江、等十多个省市地区超过35家生物药企建立业务联系，与30多家药企已签订了合作协议，并签订了工艺开发技术项目10多项。同时已与上海、成都等多家大型药企签订了培养基长期供应合同，完成了从一开始的10L、100L的小规模供应到现在10000升以上的批量供应的产业化规模，其中国内创新药开发领军（上市）企业康弘药业等多家知名药企已将我公司细胞培养基列入其新药临床申报，将健顺生物细胞培养基确定为其新药的唯一指定原材料供应商。同时，健顺生物与具有全球竞争创新能力的生物医药公司展开合作，签订了10年的委托供应研发协议。
当然，罗顺对公司未来的定位绝不止于此，在他看来，“这不只是一家以技术服务为主的企业和一支成熟的世界领先的技术团队，更重要的是以技术力量所带来的客观周边效应。公司落户兰州，希望能对甘肃生物制药行业的发展产生积极的影响，使甘肃省的高新技术产业园区在全国乃至全世界立于领先地位。”
为中国生物制药行业提供世界一流的细胞培养基与研发服务！力争在细胞培养基领域成为世界一流的技术与产品供应商！填补中国工业化无血清细胞培养技术和产品的空白！而罗顺作为健顺生物的掌舵人，更是踌躇满志、信心满满，相信梦圆时分已不再遥远。
专家简介：
罗顺，甘肃健顺生物科技有限公司创始人、总裁。
美国弗吉尼亚理工大学分子免疫学博士，美国哈佛大学医学院Dana-Farber癌症研究所博士后，毕业后加入瑞士生物制药公司（Serono），从事生物制药研发工作20多年，先后在BeckmanCoulter、JRHBiosciences、SigmaSaFC、基因泰克（Genentech）、安进（amgen）等公司担任要职，主要负责研发技术部门工作，期间创办了GeneXpBiosciences公司。
细胞生物学研究技术篇9
诱导性多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，ipS）是通过基因转染技术(genetransfection)将某些转录因子导入动物或人的体细胞，使体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonicstemcell，eS）细胞样的多潜能细胞。ipS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与eS细胞非常相似，而且在Dna甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与eS细胞几乎完全相同。ipS细胞的研究受到人们广泛的关注，是目前细胞生物学和分子生物学领域的研究热点。ipS细胞技术诞生还不到2年，却为干细胞的基础研究和临床疾病治疗研究带来了前所未有的希望，ipS细胞技术的出现使人们从eS细胞和治疗性克隆等激烈的伦理学争论中解脱出来。但是，目前制备ipS细胞的方法在安全性方面还存在一定问题，因此探索一种高效、安全的ipS细胞的制备方法显得十分必要。
1ipS细胞的制备方法
2006年takahashi等［1］研究小组利用分别携带oct4、Sox2、myc和Klf4转录因子的4种逆转录病毒载体感染小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblasts，meFs)，经过G418药物筛选成功获得第1批ipS细胞。但是这批ipS细胞系中Dna甲基化的方式与自然存在的eS细胞不同，而且这批ipS细胞不能形成畸胎瘤。okita等［2］研究小组报道了第2批ipS细胞的产生。他们采用与制备首批ipS细胞相同的方法，但是采用了不同的筛选基因。第2批ipS细胞系Dna甲基化的方式与自然存在的eS细胞的甲基化方式相同，并且能形成畸胎瘤。2007年末，takahashi和Yu等［3，4］两研究小组分别在细胞和科学杂志上报道关于ipS研究里程碑的实验结果， 他们都成功获得了人的ipS细胞系。Yamanaka采用与诱导小鼠ipS相同的方法，成功将人成纤维细胞诱导成多干细胞。thomson研究小组采用与Yamanaka不同的方法，他们利用慢病毒载体运输oct4、Sox2、nanog和Lin28转录因子转染imR90胚胎成纤维细胞，并且成功地获得了人ipS细胞。2008年1月nakagawa等［5］研究小组报道他们可以利用oct4、Sox2和Klf43种转录因子将小鼠和人的成纤维细胞成功诱导出ipS细胞。aoi等［6］研究小组将小鼠肝细胞和胃上皮细胞成功诱导为ipS。Stadtfeld等［7］实验小组利用oct4、Sox2、cmyc和Klf44种转录因子将胰岛细胞诱导为ipS细胞。
Hanna等［8］研究小组在细胞杂志上报道了他们将小鼠终末分化的B淋巴细胞诱导成ipS细胞的实验结果。他们采用类似于利用成纤维细胞制备ipS细胞的方法，使用4种转录因子（oct4、Sox2、cmyc和Klf4）及CCatt/增强子结合蛋白（C/eBpα），成功地将成熟B淋巴细胞诱导为ipS细胞。
eminli等［9］研究小组利用逆转录病毒载体携带oct4、Klf4和cmyc3个转录因子将神经祖细胞诱导为ipS细胞，之后Kim等［10］研究小组报道利用慢病毒载体携带oct4和cmyc或oct4与Klf4两种转录因子就可以将成人的神经干细胞诱导为ipS细胞。他们检测到在成人神经干细胞中oct4和cmyc的表达量高于胚胎干细胞中oct4和cmyc的表达量，因此考虑利用逆转录病毒载体只携带两种转录因子诱导成人神经干细胞为ipS细胞并获得成功。由此他们推测当被诱导的体细胞中高表达某个或某几个转录因子时，可以减少其他转录因子的使用。
当一系列人正常体细胞被诱导成ipS细胞之后，科学研究者开始研究患者的细胞是否也能诱导成ipS细胞。Dimos等［11］研究小组报道他们将肌萎缩侧索硬化症（amyotrophiclateralsclerosis，aLS）患者的细胞成功诱导成为ipS细胞。随后park等［12］报道他们将腺苷脱氨酶缺陷相关严重的联合免疫缺陷、三型葡萄糖脑苷脂沉积症、帕金森综合征、舞蹈症、青少年i型糖尿病等患者的细胞诱导为ipS细胞。
体细胞可以诱导为ipS细胞，但是获得ipS细胞的几率很低。于是科学研究者们研究能否找到提高ipS细胞产生效率的方法。mali等［13］报道他们将SV40大t抗原和oct4、Sox2、cmyc和Klf4同时诱导成纤维细胞能显著提高ipS细胞产生的效率，而且ipS细胞提前1～2周产生。Huangfu等［14］报道Dna甲基化转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂能显著提高ipS细胞产生的效率。aasen等［15］研究小组报道采用逆转录病毒运输oct4、Sox、Klf4和cmyc诱导人角化细胞产生ipS细胞的效率比诱导人成纤维细胞产生ipS细胞的效率至少提高100倍，而且大大缩短了产生ipS细胞的时间。
maherali等［16］研究小组报道了制备ipS细胞新的研究平台，并指出可从分子、遗传和生化机制上改造细胞程序重排技术。他们开发了一种新的ipS细胞诱导技术，采用doxycycline诱导转录因子的表达，从而可以通过药物来控制ipS细胞的产生，其制备的ipS细胞从结构和功能上都与人类胚胎干细胞很相似。人们研究发现，不同的皮肤细胞类型用于诱导产生ipS细胞的时间也不同［16］。Huangfu等［17］研究小组报道仅利用反转录病毒表达oct4和Sox2两种转录因子，同时借助抑制组蛋白去乙酰基酶活性的小分子化合物丙戊酸（Valproicacid，Vpa）的作用就能将人的成纤维细胞系BJ和nHDF逆转成ipS细胞。
最近，Stadtfeld等［18］报道他们利用腺病毒载体运输oct4、Sox2、Klf4和cmyc4种转录因子成功获得无病毒整合的ipS(adenoipS)细胞。okita等［19］研究小组采用2种质粒分别携带oct4、Sox2和Klf43种转录因子和cmyc转录因子共转染人或小鼠的体细胞并使之诱导成为ipS细胞，经过检测并无质粒整合进入ipS细胞基因组中，即获得了在基因组水平无转录因子整合的ipS细胞。Frank等采用带有loxpCre系统的病毒载体诱导ipS，此系统可将整合到ipS基因组中的4种外源转录因子及病毒基因成分完全剔除，因而所获得了完全没有病毒基因组的来源于parkinson患者成纤维细胞的ipS;而Knut等人使用含有转座子系统的病毒载体也成功获得了完全没有病毒基因组的来源于人胚胎成纤维细胞的ipS。这些无病毒基因组成分的ipS诱导成功为其临床实际应用奠定了基础。ipS细胞产生的方法归纳见表1。表1诱导ipS产生的方法
小鼠胚胎成纤维细胞［13］oct4，Sox2，Klf4小鼠及人成纤维细胞［5］oct4，Klf4，cmyc神经祖细胞［9］oct4，Klf4成人神经干细胞［10］oct4，cmyc成人神经干细胞［10］oct4，Sox2，cmyc，Klf4，nanog人角质细胞［16］oct4，Sox2人成纤维细胞系BJandnHDF［17］
2ipS细胞的应用
ipS细胞技术是一把了解细胞核基因组重序(reprogramming)的钥匙，因为ipS细胞在功能上与胚胎干细胞几乎完全相同。因此，ipS细胞的诱导产生过程将是我们了解基因组重序分子机制和个体特异的疾病发生机制的最理想的模型。Hanna等［20］近期已经进行了ipS细胞应用基础研究的首次尝试，利用人类镰状细胞性贫血的小鼠动物模型，取其尾尖部皮肤的成纤维细胞，通过导入oct4、Sox2、Klf4和cmyc基因，获得自体ipS细胞;进一步采用基因特异性打靶技术对人类镰状血红蛋白等位基因进行纠正后，将体外培养的自体ipS细胞诱导为造血干细胞，移植后可治疗动物模型的镰状细胞性贫血。Dimos等［11］报道将aLS患者的体细胞诱导获得的ipS细胞成功定向分化为运动神经元，而aLS疾病的特征就是患者的运动神经元受到破坏。与此同时，martin研究小组发表将oct4、Sox2、Klf4和cmyc诱导得到的ipS细胞定向分化为有功能的心肌细胞的研究结果。
3ipS的安全性
ipS细胞技术的问世为生命科学的研究和人类疾病的治疗带来巨大的希望，随着研究的深入进行，多种终末分化细胞甚至是患者的细胞都能被诱导成ipS细胞，还有ipS细胞初步应用小鼠疾病模型治疗的成功，这一切似乎预示着ipS细胞距人类疾病的临床治疗不远了。但是，ipS在投入临床疾病治疗之前，必须考虑ipS细胞安全性的问题。目前制备ipS细胞的方法主要是利用逆转录病毒运输系统将几种转录因子导入体细胞，逆转录病毒在染色体上随机插入整合到体细胞基因组内并启动转录因子的表达。逆转录病毒的随机插入存在着潜在的风险，有的转录因子如cmyc和Klf4，它们本身就是一种原癌基因，导入cmyc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20%［2］。由于cmyc基因具有危险性，研究者投入无cmyc基因的ipS研究，但是经过研究发现这些无cmyc基因的ipS细胞依然具有致瘤性。
4展望
ipS细胞技术诞生还不到2年，但却受到极大的关注和广泛的研究，现已成为生命科学研究领域研究和探讨的焦点，为基础研究和临床疾病治疗带来前所未有的希望。人类ipS细胞的建立被公认为2007年最重要的科技进展之一，这项技术不仅可以从体细胞建立个体特异的多能干细胞系，解决了细胞移植治疗中的免疫排斥问题，而且为研究人类细胞的重编程的机理以及研究个体特异的疾病发生机理提供了有力的方法。在干细胞研究领域，ipS细胞技术的出现无疑是具有里程碑意义的突破，多种体细胞经过体外培养和诱导均可转变成为具有多向分化潜能的干细胞，并且证明了几种已知的转录因子可以使已分化的体细胞逆转为未分化的状态，表明细胞的巨大可塑性。但是，ipS细胞在应用于临床之前，还面临许多问题: ①逆转录病毒和慢病毒载体导致肿瘤发生的潜在风险需要加以有效防范;②需要深入研究比较ipS细胞和heS细胞在细胞生物学特性、定向分化机制等方面是否具有显著的差异;③需建立一种新的方法以避免基因转染或基因转导带来的潜在风险，如通过某些化学药物或因子激活体细胞中固有的上述转录因子的方式以替换外源性基因转染的方式，或者用某些因子的短暂性表达代替永久性导入;④提高制备ipS细胞的效率。需指出的是，ipS细胞研究的突破并不意味着eS细胞研究的衰亡，因为ipS细胞所使用的转录因子正是来源于eS细胞长期研究的积累。
参考文献
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细胞生物学研究技术篇10
【关键词】肿瘤;病理诊断技术;研究进展
细胞病理学创建至今已达150年左右，在此期间，生命科学取得了日新月异的发展，尤其是在近20年，现代生物化学、免疫学及分值生物学等学科得到突飞猛进的发展。电子显微镜的发明使得传统病理学诊断技术从细胞水平向亚细胞结构深入，免疫学知识与病理学不断融合，产生了免疫组织化学技术。另外，计算机技术在组织细胞图像处理中的运用，产生了定量细胞病理学。现代病理学采集了众多学科知识与技术，对肿瘤病理诊断具有重要意义。肿瘤病例诊断的准确性对医师制定治疗方案具有重要影响，同时也在一定程度上影响了医师对患者预后的判断，肿瘤病理诊断技术在临床中发挥的作用越来越重要。
1.肿瘤病理诊断技术分类
1.1电镜技术
电镜技术已经广泛应用于肿瘤的诊断中，且掌握了大多数肿瘤的超微结构及诊断要点。张宏波[1]在研究中指出，在电镜下可区分光镜较难区分的肉瘤及癌、腺癌及低分化鳞癌、各种恶性梭形肿瘤、神经内分泌肿瘤等，另外，一些未分化或分化较低的肿瘤在电镜下也无法确诊，需配合免疫组化等方法弥补电镜诊断的不足。
1.2免疫组织化学技术
近年来，免疫组化技术的快速发展使肿瘤病理诊断发生了巨大的变化，染色方法由aBC、pap等发展为敏感性更高的免疫金银法[2]。李金明[3]认为针对不同类型的肉瘤和癌、中枢和外周神经肿瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤等特异性较高的单克隆抗体，免疫组织化学技术在极大程度上提高了肿瘤病例诊断的准确性。目前，临床肿瘤诊断通常采用细胞骨架中的中丝蛋白检测，包括上皮性肿瘤的细胞角质蛋白等。李小康[4]认为，随着大量病例的积累，以往临床上认为对某些肿瘤或组织具有特异性的标记物，包括上文所说的中丝，特异性也不明显，原因在于无论从哪种胚叶来源的肿瘤，因基因表达的变异，均存在多分化的潜能，也可出现上皮细胞向间叶细胞化生，或间叶细胞向上皮细胞化生等不同细胞间相互转化的现象，起源于同一胚叶的不同细胞可进行相互转化，因此，有可能出现不同类型的中丝同时表达的现象，使得诊断的难度加大。临床上已经了解多种原因可造成免疫组化染色的假阳性或假阴性。霍兰茹[5]等人为，对免疫组化不可过度迷信，对染色结果的判断需持更慎重的态度，并强调充分结合光镜常规染色切片观察的重要性。以往临床认为免疫组化技术可取代电镜技术，现对免疫组化技术持中肯态度，认为其需与电镜技术互相补充。
1.3细胞增殖活性测定
细胞增殖周期的概念对肿瘤学理论及实际工作具有重要意义，从肿瘤病理研究来看，对肿瘤细胞增殖活性的研究与肿瘤良恶性的甄别、复发和转移能力及预后等有着密切关系。目前用于测定细胞增殖活性的方法有很多，如S期3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺入技术、核分裂计数等。流式细胞术主要用于肿瘤细胞Dna含量的测定，以确定肿瘤的倍体术及细胞增殖活性。李新忠[6]认为，绝大部分良性肿瘤为二倍体，极少部分为非整倍体，恶性肿瘤多为非整倍体，高恶性肿瘤与低恶性肿瘤相比，非整倍体更为常见，由此可见，细胞增殖活性与恶性肿瘤的组织学分级相关，并可用该方法判断预后。核分裂计数是目前为止临床上最简而易行的判断肿瘤增殖活性的方法，对许多肿瘤的良恶区别及病理诊断具有重要意义，同时于组织学分级及预后联系密切。宋艳华[7]等认为核分裂计数可有效区分平滑肌瘤及平滑肌肉瘤，因此需对核分裂计数进行统一标准，可采用体视学原理进行核分裂计数。
1.4激素受体检测
肿瘤病例中，采用最多的是孕激素受体及雌激素受体的检测，可确定乳腺癌的预后及治疗方法的选择。以往临床上孕激素受体及雌激素受体的检测方法多以生化或组化方法，自从雌激素及孕激素受体单克隆抗体生产后，可采用免疫组化的方法确定孕激素及雌激素受体。韦敬[8]等人为乳腺癌分化越差，合成孕激素及雌激素的能力则越弱，孕激素与雌激素受体阳性率则越低，预后就越差。孕激素及雌激素阳性率高的乳腺癌可加用内分泌治疗从而获得良好的治疗效果。同时检测乳腺癌Ki-67阳性率及雌激素阳性率可判断乳腺癌预后及选择治疗方案，采用Ki-67测得癌细胞增殖较高，说明分化低、恶性程度较高，因此雌激素阳性率较低。以往临床上采用的抗雌激素抗体为H222，现发现新的抗体iD5，可稀释后使用，减少了检测的费用，且不受固定时间的影响，敏感性较高，值得临床推广。
1.5图像分析技术
临床上长期以来病例观察多以半定量或定性描述为主，使得肿瘤病理诊断、分型及分级等发生困难，也较难进行大系列的统计分析研究。图像分析技术在形态学领域的应用产生了形态测量学，为解决肿瘤病理诊断、分型及分级等困难带来了福音。在肿瘤病理学中，平面测量学技术是使用最为广泛的技术，也被称为图像细胞测量术[9]（imageCytometry，iCm）。张亚娟[10]等在研究中提出，图像细胞测量术主要用于形态参数的测量分析、细胞核Dna倍体状态的图像分析及显色反应产物的图像分析。肿瘤细胞具有组织结构及细胞异型性，用iCm对细胞的核周长、核面积及核直径等进行测定，可更加客观的区分癌及癌前改变、肿瘤的病理组织学分级及良恶性肿瘤等。流式细胞术可对细胞核Dna进行测量，但是其无法进行形态学分析，可能忽略Dna异常的小细胞，加上混入样本的非肿瘤细胞干扰的结果，对某些实际上已有Dna倍体异常的病例得出假阴性的诊断。孙雪英[11]认为，iCm可依据细胞形态对异常细胞进行选择性测定，从而弥补了流式细胞术的缺陷，用iCm对Dna倍体状态进行测定可得出更加精确的组织学分级。iCm还可用于细胞化学、免疫细胞化学的显色反应产物定量分析。朱通伟[12]等认为，iCm可对细胞增殖活性、凝集素受体及癌基因产物等进行定量分析对肿瘤病理研究及实际应用具有重要价值。
1.6分子生物学技术
近年来，分子生物学技术在肿瘤病理研究领域引起了一场革命。有研究中认为，在核酸分子杂交技术、Dna重组技术等基础上发展的多聚酶链反应-单链构型多态性分析技术[13]等在肿瘤病理诊断中的应用给肿瘤病因学及发病学、基因诊断及治疗等方面的研究带来了巨大的发展。赵丽霞[14]等认为，分子生物技术对肿瘤有无基因突变的检测及判断预后具有重要意义，p53基因突变与乳腺癌、肺癌、结直肠癌等预后关系密切;K-ras基因突变与结肠癌及非小细胞性肺癌的恶性程度及预后密切相关。在肿瘤发病学及病因学方面，目前发现eB病毒与鼻咽癌、鼻腔t细胞瘤等有关，人体免疫缺陷病毒感染可引起淋巴瘤;人类状瘤病毒与食道癌及宫颈癌息息相关，另外，HBV与肝癌的关系正在研究中。
2.小结
总之，近年来，多种跨学科新技术的开展师德肿瘤病理学尤其是诊断性肿瘤病理学有了长足的进步。这不但使病理诊断更加准确，同时可更加客观的对肿瘤组织学分析、恶性程度及预测与后等进行判断，为临床治疗方案的选择提供了更加可靠的依据。另外，也对深入研究肿瘤发病学及病因学创造了更好的条件，对肿瘤的防治起到了积极的作用。各项新技术各有优势及不足，需相互补充达到相得益彰的结果。
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