生物学特性研究篇1
取发酵液，以4℃、4000r/min离心30min去除菌丝，再用0.45um水溶性滤膜滤去残余菌体，滤液用30kD超滤管以4℃、5500r/min超滤20min，用少量pBS溶液将蛋白洗脱，上层洗脱液（大分子物质）和下层超滤液（小分子）分别保藏待用。下层超滤液用乙酸乙酯等体积萃取（萃取2次，每次用原溶液1/2体积的乙酸乙酯萃取，再合并），45℃旋转浓缩至1/10体积。生物学活性代谢产物的活性分析将1.2.4节上层洗脱液和下层超滤液分别对供试菌株B5和B3进行牛津杯生物学实验，每个处理重复3次。每支试管添加15mL牛肉膏液体培养基并灭菌，冷却后分别添加上述粗提取的下层超滤浓缩液2mL，混合后接种供试菌株B5，以35℃、120r/min摇床培养，分别于0h，4h、8h、12h、16h和20h，6个时间点测定培养液的吸光度，每个样重复处理3个，取平均值。生物学活性代谢产物判定取1.2.5节实验中具有生物学活性的液体，进行双缩脲蛋白显色实验，取3mL液体，加入0.1g/mLnaoH溶液3mL，震荡均匀，再加入2~3滴0.01g/mLCuSo4，震荡摇匀，观察是否出现紫红色，判断具有抑菌活性的代谢产物中是否有蛋白质，是否为活性蛋白抑菌生物学活性性质。
2结果与分析
2.1生物学活性菌株的筛选
牛津杯实验结果显示，30株放线菌中有2株对供试菌株具有明显的抑菌活性，编号分别为a22、a2，抑菌效果如图1所示。图1结果表明，a22和a2的牛津杯实验抑菌圈很明显，a22抑菌圈内径为6mm，外径为18mm；a2抑菌圈内径为6mm，外径为12mm。比较结果表明，a22和a2对供试菌株均具有生物学抑菌效果，且a22较强。重复实验结果也表明这两株放线菌对供试菌株的生物学抑菌效果比较稳定。
2.2菌株的形态观察
按实验方法对a22、a2进行形态学观察[25]，菌落及电镜照片分别见图2和图3。培养过程的观察结果表明，a22和a2的生长周期相似，都在72h左右长出成熟菌落，a22形成白色、边缘整齐凸起的圆形菌落；a2的菌落呈圆形，菌落呈灰色，边缘整齐无凸起，气丝呈粉状。a22在5d生成褐素，a2的色素形成稍晚在7d左右生成，并且在菌落形成后期可以闻到明显的土腥味，以上基本特征符合放线菌的生理特征，可以初步确定此两株菌均为放线菌。
2.3菌株的分子鉴定
对菌株a22、a2的基因组Dna进行提取，a22的pCR产物测序长度为1500bp，a2的pCR产物测序长度为1400bp，再利用BLaSt将所测定株菌株的序列与GenBank/emBL/DDBJ数据库中已知放线菌的16SrRna序列进行比较鉴定。结果表明，a22菌株与白色链霉菌（Streptomycesalbus）、a2菌株与灰色链霉菌（Streptomycesgriseus）同源性最高，且同源性均可达到99%以上。再将序列经ClustalX多序列比对后，利用neighbour-joining方法构建系统发育树，结果见图3。由图3可知，a2、a22分别与Streptomycesgriseus的模式菌株JX007982、Streptomycesalbus的模式菌株nRRLB-2365相似度最近，同源性最高，可确定a2、a22分别为Streptomycessp.的Streptomycesgriseus和Streptomycesalbus。
2.4菌株代谢产物活性分析
牛津杯实验结果表明，a22与a2的上层洗脱液没有生物学抑菌活性，下层超滤液的抑菌活性则非常明显，并且同一株菌的下层滤液，由于发酵时间不同和作用的供试菌株不同，呈现出的生物学活性效果也不同。牛津杯实验结果见图4-图6（图下为1.2.3培养时间）。如图5~图7所示，a22与a2在发酵30-36h的发酵代谢产物对供试菌株的生物学抑菌活性最强，对比图5与图6，a22对B5的生物学抑菌活性相对B3较强，而a2只对B5表现出了抑菌活性，总体上a22比a2对供试菌株的生物学抑菌效果更好。对比图5和图7，a22比a2的代谢产物对供试菌株具有更加稳定的抑菌生物学关系，抑菌生物学效果更强。为进一步分析a22和a2代谢产物的生物学活性效果，选用B5作为供试菌株，添加a22和a2代谢产物进行液体培养，测定发酵菌液的吸光度值，从生物量上比较a22和a2代谢产物对供试菌株的生物学活性，结果见表1、表2。6培养时间（h）菌株及发酵时间a22(24h)a22(30h)a22(36h)a22(42h)a22(48h)a22(54h)000000040.0370.0160.0090.0300.0350.04280.0460.0310.0160.0410.0390.053120.0560.0350.0350.0520.0650.068160.0620.0380.0660.0890.1030.113200.0910.0500.0730.1540.1940.176表2a2发酵液下层超滤液-B5液体培养吸光度分析结果培养时间（h）菌株及发酵时间a2(24h)a2(30h)a2(36h)a2(42h)a2(48h)a2(54h)000000040.0250.0150.0170.0280.0190.02380.0430.0220.030.0420.0360.031120.0470.0420.0530.0460.0620.062160.0850.0670.070.0780.0730.075200.1200.0790.0830.1330.0960.150表1、表2结果表明，a22和a2在30-36h发酵时间段发酵液超滤的下层超滤液对供试菌株的生物学抑菌活性最强，因为添加30-36h时段发酵液超滤后下层超滤液的B5培养液中菌体的吸光度值是最小，表明此时的B5菌体生长受到抑制，菌浓较低。在添加了发酵时间36h后的发酵液超滤下层超滤液的B5培养液中，菌体的吸光度值又变大，菌浓较大，这说明发酵36h后，积累的代谢生物学抑菌活性成分被降解或利用掉了，生物学抑菌活性成分浓度降低或没有生物学抑菌活性成分。表1、表2结果还表明，a22在发酵30h的代谢产物生物学活性效果最为显著。液态发酵生物学结果与牛津杯实验中图5、图7的结果也吻合。因此，可知a22的代谢产物对供试菌株的生物学抑菌活性效果要比a2强，a22在发酵30h时代谢积累的对供试菌株具有生物学抑菌活性的代谢产物浓度也大。
2.5生物学抑菌活性代谢产物分析
根据双缩脲实验结果，a22和a2发酵代谢对供试菌株具有生物学抑菌活性的代谢产物与双缩脲试剂均匀混合后只呈现出淡蓝色，而并未呈现出紫色，表明并未生成紫色络合物，再结合超滤管下层滤液分子量较小的特性，可以断定对供试菌株具有生物学抑菌活性的代谢产物并非蛋白质[26]，可能为某种抗生素类的小分子化合物。相对芽孢杆菌对白酒风味影响的研究[27-28]，放线菌在白酒酿造过程的作用并未引起太多关注，黄兵证明了放线菌与芽孢杆菌间存在互相的生长影响关系[29]，这同本实验得出放线菌代谢产物对产酱香芽孢杆菌存在生物学抑制活性作用的结论相似，说明放线菌能通过对产酱香芽孢杆菌的生物学调控来影响产香菌的生长和代谢积累白酒风味成分。另外，对比其他领域的放线菌生物学抑菌研究，相似体积与浓缩浓度下本实验所观察到的放线菌代谢产物抑菌圈较小[30-31]，抑菌作用柔和，说明放线菌对白酒酿造微生态存在并不是单纯的破坏，而是对其进行合理的调控，这也与本实验的研究初衷相吻合。固态发酵过程存在生物学调控、酶化学调控、工艺条件调控、环境基态和物态调控等，其中最核心的调控为生物学调控和物态调控，生物学调控中尤其是功能型群体微生物的调控[32]。关于放线菌对固态发酵过程功能性微生物群落的整体性生物学调控和风味调控机理目前本课题组正在进一步深入研究。
3结论
生物学特性研究篇2
关键词：梨；物候期；新梢生长；果实发育
梨是我国栽培的重要果树之一，其栽培面积和产量仅次于苹果和柑桔，居第三位。目前梨果生产中品种结构不合理、品种老化现象严重，主要表现为晚熟品种比例过大，且以酥梨、鸭梨为主，其栽培面积占梨果总面积的50%～60%，成熟期又比较接近[1]，因此市场销售压力大，直接影响果农的经济效益。本试验以新引进的日韩梨华山和圆黄为试材，就其主要生物学特性进行研究，旨在为制定优质标准化栽培技术提供依据。
1材料和方法
1.1材料
试验于2010年3月至2011年12月在河北省邯郸市东部的春风梨园进行，试材为高接结果4年的圆黄和华山梨，每品种选10株长势相近、生长结果正常的树为样本树。
1.2方法
1.2.1物候期观察采用定树全株观察，从萌芽开始，开花前每2d观察一次，花期每天定时观察，坐果后5d观察一次，物候期标准参照河北农业大学主编的《果树实验研究》[2]。
1.2.3果实纵横径测定从幼果期开始每品种标定20个果实，每10d测量一次果实的纵径和横径。
1.2.4果实发育研究从盛花末期至采收，每10d随机取10个果实，对果实内含物及硬度进行测定，其中果实去皮硬度用GY-1型果实硬度计测定，可溶性固形物用wYt-4型手持糖量计测定，可溶性糖用铁氢化钾法[4]测定，可滴定酸用酸碱中和滴定法[5]测定。
2结果与分析
2.1物候期
由表1可知，供试两品种都在3月上旬萌芽，4月初至4月上旬为花期，成熟期圆黄在8月中旬，华山为9月上旬，落叶期都在10月底。仅从开花物候期来看，二者可以互相作为授粉树。
2.2新梢生长发育特性
从图1可以看出，圆黄新梢加长生长呈双“S”型生长曲线，生长过程中出现两个高峰，从4月6日到4月20日为第1个生长高峰，此后到5月中旬为缓慢生长期，5月中旬到6月中旬为第2个生长高峰；华山只在4月上中旬出现1个生长高峰，此后缓慢生长至停长，这和华山树冠扩展较慢相一致。
新梢加粗生长都呈近双“S”型生长曲线，从4月6日至4月18日为快速加粗阶段，此后缓慢加粗至6月底，7月上中旬生长趋于停止。
2.3果实发育规律研究
2.3.1果实纵横径生长的动态变化果实纵、横径生长曲线如图3、图4所示。落花后至4月下旬为幼果迅速生长期，此期纵横径生长速率基本相同；4月底到6月中旬为缓慢增长期，纵横径日平均生长量分别为0.48cm和0.57cm，即从缓慢增长后期，横径开始大于纵径，果实由圆形变为扁圆；6月中旬至果实成熟为第2个生长高峰，持续时间两品种间存在差异，华山为80d，圆黄则接近70d。从第2个生长高峰开始，圆黄的增长速率明显大于华山，这与圆黄成熟期早有关。
2.3.2果实硬度的变化动态试验结果表明，两品种的硬度变化均呈下降趋势（图5），但在果实发育的不同阶段，果实硬度下降的速率不同，从6月25日到7月5日急剧下降，此后至8月初下降缓慢，接近成熟时曲线趋于水平，因此果实硬度可作为判断成熟期的参考指标。
3讨论
新梢迅速增长期较短，停止生长较早，在此期及时供给肥水，可以有效增大叶面积及叶片厚度，增强光合能力，对树体生长和果实发育有利，因此应在施基肥的基础上，在新梢加速生长期前2周左右及时追肥浇水。
果实发育过程中内含物的变化表现出一定的规律性。在果实发育前期，果实中糖含量低酸含量高，在后期酸含量逐渐降低，糖含量逐渐增加，即酸可能存在向糖转化的过程[6]，因此在落花后进行追肥，可以加速酸的降解和糖的积累；糖的增长与淀粉的水解转化有关[7]，所以在糖的高峰到来之前及时施肥，有利于提高果实中的含糖量和前期淀粉的积累量。
参考文献
[1]张玉星，李振茹，主编.梨科研与生产进展（三）[G].中国农业科学技术出版社，2006：166170.
[2]河北农业大学，主编.果树实验研究[m].1988：67.
[3]吕波，杨批修，郭超峰.酥梨生物学特性观察[J].果树科学，1996，13（3）：178180.
[4]X.H.波钦诺.植物生物化学分析方法[m].荆家海，丁钟荣，译.北京：科学出版社，1981：143147.
[5]仝月奥.果树营养诊断法[m].农业出版社，1982，13.
生物学特性研究篇3
关键词：生物学特征；调查研究；猪牙花
中图分类号：S682文献识别码：a文章编号：1001-828X（2015）017-000-01
一、调查地点与方法
1.调查地点
以生于通化市金厂镇驮道岭、江东乡左江岭有侧金盏花、延胡索、猪牙花、多被银莲花、牡丹草等多种野生早春花卉分布的地方作为，调查地点。
2.调查方法
（1）环境条件调查。4月开始至土壤冻结止，在早春花卉生育期内环境温度每隔5～10d监测1次，器官发育期每10～15d监测1次，其中气温按当地记录，地温用地温计于监测日10：00左右测5cm、10cm、15cm、20cm。郁闭度用光照度计监测。每月计算平均值。
（2）物候期调查。选择4个5m×5m样方内植株，从出苗到枯黄定期观察记录各生育时期，按形态建成的5%、75%、95%为初、盛、末期调查物候特点。每3-5d调查一次，花期每2-3d调查一次。
（3）花器官发育研究。每7～10d挖取地下器官作为观察样品，洗净泥土，切下芽体部分于Faa固定液中固定，实体显微镜下解剖观察。
二、结果与分析
1.调查地点的环境条件
猪牙花主要生于背阴山坡土质肥厚的林阴下或沟谷等处，土壤为粟棕壤，湿度较大，在60%左右，生育期限内气温、地温和郁闭长期条件变化情况见表1。
2.物候期
猪牙花为多年生类短命草本植物，物候期分为出苗期、蕾期、花期、果期、枯萎期、器官分化期（从芽体出现至花器官发育完成）和器官于地下生长期（分化完成的幼株伸长生长）。见表2，可见每种花卉的各物候期之间有明显的重叠和持续现象。
3.猪牙花各器官的发生
地上部分枯萎后，鳞茎鳞片基部生长点于6月初即分化出两枚叶片；6月上旬花原基开始分化出3枚外轮被片，而3枚内轮被片的发生，不同大小的鳞茎分化程度不一致；6月中旬六枚雄蕊已发生，花原基中间部分可见雌蕊出现，为三心皮。至7月末花器官发生完成，各器官进一步发育，9月初植株形态完全。
三、讨论
1.猪牙花对环境条件的需求
猪牙花主要生于背阴山坡土质肥厚的林荫下，土层深厚肥沃，土壤为粟棕壤，湿度较大，在60%左右，植株生长适宜温度要求不高，当地温6℃左右即开始出土生长，当温度升高30℃左右时地上植株则开始枯萎。
2.猪牙花的生长发育规律
猪牙花为多年生宿根草本植物，鳞茎每年更新生长，种群以种子繁殖扩大数量，易形成强势群落建群种。物候期均可分为出苗期、展叶期、蕾期、花期、果期、枯萎期、各器官在地下的分化和生长期，各物候期之间有重叠和持续现象。
3.猪牙花在园林中应用建议
猪牙花生于林荫下，为早春开花植物，用于庭荫树下作为地被覆盖栽培，可弥补乔木下层空间的不足，在短时间内可收到较好的观赏效果。减少了人工养护所花费的精力，填补我国北方早春园林观赏花卉稀少的空白。
生物学特性研究篇4
关键词：美凤蝶；形态特征；生活习性；经济效益；社会效益
樟树市地处北纬28°，东经115°，位于江西鄱阳湖平原南缘与赣中丘陵过渡地带的赣江中游。市域内除了远处隐约可见的山脉为背景外，其余部分均由海拔20~25m的赣江、袁河河谷地区的河漫滩平原构成，属低海拔亚热带平原气候，年平均气温为17.6℃、年平均降雨量1574mm、无霜期长达273天；该地土壤多呈酸性，耕作土壤以水稻土分布最广、河谷平原以层厚质肥的冲积土为主。
正是上述这种气候条件和土壤类型，决定了此地自然植被丰富多样，平原和山区除了种植水稻、花生、油菜、芝麻等油料作物外，大面积种植中草药植物、柑桔、柚子等也成了当地人的主要经济来源之一，因此樟树除了有“药都”之美誉外，更兼“柑桔之乡”之声誉。本地柑桔植物最常见的蝶类害虫是玉带凤蝶和柑桔凤蝶，而作为本地的一大“名蝶”之一的美凤蝶，由于观赏性强、繁殖能力不强，其幼虫对植物的危害性往往不太受人关注，因此对于初次接触美凤蝶的蝴蝶爱好者、农业类专业的学生、蝶类大棚养殖户而言，对于美凤蝶的学术研究价值、自然资源价值、经济价值及生活形态和习性可能并不一定了解，本文借此就赣中地区长期存在的美凤蝶的生物学特性探讨如下：
美凤蝶papilio(menelaides)memnonLinnaeus所属类别：鳞翅目凤蝶科，本地分布区域：阁山、玉华山及平原的柑桔园等地。
1形状特征
自然界中一些种类的蝴蝶,雄蝶的色彩斑纹大同小异,但其雌蝶则变化多端,差异极大,如有的具有尾突,有的没有尾突,更有多种不同的色彩斑纹和形态。美凤蝶就是上述雌体多型的一个代表种。
1.1成虫翅展105~145mm。雌雄异型且雌体多型。雄蝶体翅黑色。前、后翅基部色深，有天鹅绒状光泽，翅脉纹两侧蓝黑色。翅反面前翅中室基部红色，脉纹两侧灰白色；后翅基部有4枚不同形状的红斑，在亚外缘区有2列由蓝色鳞片组成的环形斑列，但轮廓不清楚；臀角有环形或半环红斑纹，内侧即cu2、cu1室有弯月型红斑纹，无尾突。雌性无尾突型前翅基部黑色，中室基部红色，脉纹及前缘黑褐色或黑色，脉纹两侧灰褐色或灰黄色。后翅基半部黑色，端半部白色，以脉纹分割成长三角形斑，亚外缘区黑色，外缘波状，在臀角及其附近有长圆形黑斑。翅反面前翅与正面相似；后翅基部有4枚不同形状的红斑，其余与正面相似。雌性有尾突型前翅与无尾突型相似，后翅除中室端部有1枚白斑外，在翅中区各翅室都有1枚白斑，有时在前缘附近白斑消失；外缘波状，在波谷具红色或黄白色斑；臀角有长圆黑斑，周围是红色。翅反面前翅与正面相似。后翅除基部有4枚红斑外，其余与正面相似。
1.2卵球形，橙黄色。直径约1.7mm，高约1.5mm。
1.3幼虫头部开初时期呈现黑褐色，随成长而颜色渐淡，老熟时则呈绿色。第1~3龄幼虫身体呈橄榄绿色，第2~4腹节有斜白纹在背部相接，第7~9腹节也有白纹扩展到背部。4龄幼虫体色转为绿褐色，背部白纹减退。老熟幼虫第4~5腹节有白色斜带，有时会在背面相接，带上有黑绿色小纹。第6腹节侧面也有1同色斑纹。气门褐色。臭角初龄时呈淡橙白色，随成长而颜色渐深，末龄时呈橙红色。
1.4蛹头部前面1对突起的末端呈圆弧形，第3腹节的后缘及第4腹节的前缘向两侧突出。绿色型蛹的背面有宽大的菱形黄绿色纹，翅面上则有褐色不规则斑纹；褐色型蛹的斑纹似木材的纹理，翅面上的斑纹则似青苔。
2寄主
芸香科（Rutaceae）的柑桔类（Citrusspp.）、双面剌（Zanthoxylumnitidum）、食茱萸（Z.ailanthoides）等植物。
3生物学习性及分布
美凤蝶本地雄性只有一种类型，雄蝶因为美丽华贵，给人一种巧夺天工之美，所以赣中地区之人常常叫她“黑凤蝶”或“黑玫瑰”，雌性分为有尾和无尾2种类型，其中无尾型雌蝶有人把它叫做“羽裳凤蝶”；但是雌性的白斑分布每只都不是完全一样的，还有雌性上翅也是白色的。
雄性躯体的翅背蓝黑色，翅底颜色较浅，翅膀基部有红色斑块。无翅尾，体型较雌性小。常活跃高处疾飞，较难接近。雌性多无尾型，翅膀色较淡，后翅边缘有一列黑斑和较大的白斑。翅膀基部有红斑。拍翼慢，善于滑翔，较易接近。
成虫爱访花采蜜，雄蝶飞翔力强，很活泼，多在旷野之地狂飞。雌蝶飞行缓慢，常滑翔式飞行。台湾亚种遍布各平地至海拔2500m的山区。1年发生3代以上，以蛹越冬。成虫全年出现，主要发生期为3~11月。卵期4~6天，幼虫期21~31天，蛹期12~14天。成虫将卵单产于寄主植物的嫩枝上或叶背面，老熟幼虫在寄主植物的细枝或附近其它植物上化蛹。成虫常出现在花丛中，还经常按固定的路线飞行而形成蝶道。
美凤蝶是我国南方种，多见于四川、云南、湖北、湖南、广东、福建、江西、海南等长江以南各省和台湾地区；日本、锡金、印度、缅甸、泰国等国也有该蝶的记载。
4经济效益和社会效益
蝶类是一种倍受人们喜爱的观赏性昆虫资源和植物重要的授粉媒介，由于其丰富的斑纹、艳丽的色彩、争姿夺艳的舞态，往往被人们誉为“花园里的神秘世界”，但其幼虫多以植物叶部为食。
美凤蝶，作为本地观赏性蝶类之一，除了幼虫为害柑橘类等芸香科植物叶部外，其蛹是很好的中草药物材料的引子之一，美凤蝶成虫经过整姿、展翅、风干后,可以作成精美的工艺品出口为国家挣取外汇，据资料表明：“蝴蝶之国”的台湾，每年靠蝴蝶制作好的工艺品出口就可以挣取几千万美元的外汇；在高校、博物馆和科研机构也可以制作成蝴蝶标本供教学、观赏、研究之用。同时，也可以成为地方蝶类养殖户和工艺品开发企业的一个经济增长点。
生物学特性研究篇5
【关键词】骨骼肌细胞膜；生物学特性；流动性；载体蛋白；Ca2+-atp酶；na+、K+-atp酶
1引言
重症肌无力(mG)是一种由烟碱型乙酰胆碱受体（naChR）抗体介导的细胞免疫依赖性补体参与的自身免疫性疾病，主要累及运动终板突触后膜的naChR，是一种最常见的神经肌肉传导紊乱疾病。
2骨骼肌细胞膜的流动性
膜的流动性是生物膜的主要特征，通常是指细胞或胞器膜上膜脂质的运动。
细胞膜上的双层脂质从热力学角度分析是较稳定的。膜结构的稳定力可能来自与膜平面平行作用的力和垂直作用的力，这两方面的力都是由疏水力和亲水力这两种相反作用力的总和形成。垂直于膜平面的亲水力主要倾向于把磷脂的极性基团拉向水相；相反的疏水力则把磷脂的碳氢链拉向脂中心部分，以避开水相。
因此，磷脂极性端的极性程度愈小则脂质双分子层愈趋于稳定。这两种相反的作用力呈动态平衡，因此磷脂分子经常处于不断轻微伸出和缩入膜双分子层的状态中，表现为膜平面的波形振荡运动。另一方面，与脂质双分子层平行方向的两种相反力，疏水力和范德华力都是使磷脂的脂肪链互相靠近并排斥水分子，极性端由于电荷之间的排斥或吸引力使磷脂分子相互之间分开或靠近。这两种相反力作用的结果，使每个组分经常可以彼此相互侧向置换。因此质膜的运动主要有以下几种形式：1、脂肪酰链的旋转异构化运动；2、磷脂分子围绕其长轴的旋转运转；3、磷脂侧向扩散运动；4、脂质分子在脂双层之间的翻转运动；5、脂肪酰链垂直于膜双分子层平面轴的振荡运动。这就是所谓的膜流动性。
3骨骼肌细胞膜上的酶
膜蛋白缺陷常涉及运转系统如载体蛋白、通道蛋白和离子泵等导致相应的功能异常。例如细胞膜胱氨酸载体蛋白的先天性缺陷造成胱氨酸尿症；糖载体蛋白缺陷导致肾性糖尿病等。膜受体蛋白缺陷引起的疾病，如家族性高β脂蛋白血症是由于成纤维细胞膜缺乏脂蛋白受体而影响血浆脂蛋白反馈调节所致；有一种非胰腺性糖尿病是由于组织细胞缺乏胰岛素受体而导致葡萄糖利用障碍；一些中枢神经系统疾病如帕金森病，与细胞膜上神经递质受体障碍有关。
3.1na+、K+-atp酶na+、K+-atp酶，又称钠钾泵（na+、K+-pump），是一种高分子蛋白质，镶嵌并贯穿整个脂质双分子层，具有载体和酶的双重作用，可以分解atp使之释放能量，并能利用此能量进行na+和K+的主动转运。
na+，K+-atp酶由两种亚基构成，在细胞膜上以(α、β)1和(α、β)2组成，最小的功能单位是二聚体。人的α亚基由1022个氨基酸残基构成，分子量为112KD，是活性中心所在，参与离子转运。该亚基可能是一个10次穿膜的肽链，中段在胞浆侧形成一个球形结构域，是水解atp和结合na+、K+的部位。α亚基有四种:α1，α2，α3和α4;β亚基是高度糖基化的蛋白质，由303个氨基酸残基组成，分子量为55KD，其中蛋白质部分约32KD。β亚基有三种:β1，β2，β3，不同亚基在骨骼肌收缩时功能不同，含β2亚型较多的大鼠腓肠肌收缩能力较强。na+，K+-atp酶属于p型atp酶，这类酶还有Ca2+，mg2+-atpase、H+，K+-atpase，它们的共同特征是在反应中生成一个共价磷酸化的中间产物，有构象的改变。
3.2Ca2+-atp酶Ca2+-atp酶又称钙泵，是由一条肽链构成，根据疏水性测定和分析，它有10个跨膜α螺旋，其n端和C端都位于胞浆侧。酶分子的atp结合位点、磷酸化位点和Ca2+离子结合位点也都位于胞浆侧。细胞膜钙泵每分解1分子atp可将1个Ca2+由胞浆转运至胞外，转运机制也是通过磷酸化和去磷酸化反应引起酶蛋白构象间的相互转换来完成的。
Ca2+是可兴奋细胞中一种重要的第二信使，它担负着“兴奋信号传感器”的角色，可兴奋细胞是通过Ca2+将电信号转变为生物效应（神经递质、激素分泌等）。细胞内钙稳态是生理条件下细胞将Ca2+控制和维持在正常范围内的一种能力。研究钙稳态是认识各种Ca2+依赖性神经生物学过程的共同基础，而Ca2+-atp酶正是精细、持续维持钙稳态的关键酶。
3.3超氧化物歧化酶（SoD）超氧化物歧化酶（SoD）是一种广泛存在于生物体内的重要金属酶。由于分子中活性中心的金属离子不同，分为Cu／Zn-SoD酶，Fe-SoD酶和mn-SoD酶等。它们通过催化超氧阴离子自由基的歧化反应，有效控制体内活性氧数量，避免细胞与组织受到过量活性氧的损伤。
4结语
骨骼肌是机体抗氧化酶活力水平最低的组织之一。由于SoD是一个以氧自由基为底物的专一酶，它能有效的清除o2-，从而进一步阻断毒性更强的oH的产生。因此骨骼肌细胞膜中超氧化物歧化酶的含量可间接的反应机体受自由基影响的程度。
参考文献
[1]许蕾，朱一飞，哈志远.重症肌无力患者细胞免疫水平的检测及临床意义[J].脑与神经杂志，2002，10（4）
生物学特性研究篇6
本研究所用菌株是从患病加州鲈鱼体表分离,通过分子鉴定和形态鉴定,初步鉴定为斑替枝孢(Cladosporiumbantianum),属真菌门(Fung)半知菌亚门(Deuteromycota)丝孢纲(Hyphomycetes)丛梗孢目(miniliales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢属(Cladosporium)。能引起皮肤暗色丝孢霉病[4],尤其侵染脑部引起脑囊肿或脓肿,少数为脑膜炎[5]。在pDa和pCa培养基上生长迅速,菌落扁平。鼠灰色绒毛状,中央高凸,呈纽扣状,表面有不规则皱褶,37℃生长良好。在Sabourand培养基上,菌落稍大,灰棕色绒毛状,背面黑色。菌丝灰棕色,分生孢子椭圆形、梨形、链生[6]。
为研究斑替枝孢的生物学特性和对其他淡水鱼类的致病性,本试验通过不同pH和不同温度条件对该真菌的生长状况和菌落大小的影响,研究该真菌的生物学特性。同时将该真菌回复感染草鱼和鲤鱼,观察真菌对草鱼和鲤鱼是否具有致病性,为淡水鱼类的中草药防治提供一定的理论依据。
1材料与方法
1.1材料
该菌株分离自患病加州鲈鱼体表溃烂处,在pDa培养基上纯培养,将获得的纯培养菌株保存于5℃冰箱备用。菌株的分离与鉴定见魏福伦等[6]的报道。
1.2方法
1.2.1不同pH对斑替枝孢的影响将该真菌接种在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的pDa培养基上,在25℃下恒温培养,观察真菌菌株的生长状况,每隔24h观察一次,采用十字交叉法测定真菌菌落直径并记录下来。每个梯度做3个平板,试验周期为15d。
1.2.2不同温度对斑替枝孢的影响将该真菌接种在pDa培养基上,在温度为5、10、15、20、25、30、35、40℃下培养,观察真菌菌株的生长状况,测量其直径记录下来。每个梯度做3个平板,测量方法同上。试验周期为14d。
1.2.3斑替枝孢的致病性用于回复感染的淡水鱼是草鱼和鲤鱼,取自乌江网箱[7]。取回后置自然条件下培养,待鱼在自然环境中生长状况稳定后进行回复感染。每组10尾鱼装到养鱼箱中,每次试验3箱鱼,一箱为对照组,另两箱为试验组。对照组将真菌菌株接种在鱼胸鳍下,放进鱼箱中培养。试验组一箱鱼直接刮入真菌菌株进行培养,另一箱鱼在鱼胸鳍下接种真菌菌株。每24h观察一次,观察该菌对淡水鱼是否具有致病性。记录每天的观察结果,试验周期为20d。
1.2.4数据分析用SpSS_Statistics-v19.0win32软件进行差异性计算,用SpSS软件的单样本t检验计算t值及Sig.(双侧)值。将Sig.(双侧)值与p值进行比较,p值表示概率,得出差异性是否显着。
2结果与分析
2.1不同pH对斑替枝孢的影响
由表1、图1可知,斑替枝孢在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的条件下均能生长。由表1可知,t值各不相同,但Sig.(双侧)值均为0.000,小于显着水平0.05,与t检验的零假设相符,即不同pH之间菌落生长速率存在显着差异(接种菌饼均为2mm)。pH9.0时,真菌生长速度最快,菌落直径达52.3mm,菌落最为致密,pH7.0、8.0时,真菌生长速度也相对较快,菌落直径分别达51.3、52.0mm,因此最适生长的pH为9.0。
2.2不同温度对斑替枝孢的影响
真菌的生长状况在不同温度下有明显的差异,在温度低于5℃和高于35℃时,均不能生长(接种菌直径为2mm)。在10~30℃范围内,该菌的生长速度随温度的升高而增快,在20℃时生长速度相对较快,菌落直径达61.7mm,菌落最为致密。25℃时,真菌生长速度也相对较快,菌落大小为58.7mm,但菌落不如20℃时致密。因此20℃为斑替枝孢的最适生长温度。用SpSS软件计算t值和Sig.(双侧)值,t值各不相同,Sig.(双侧)值均小于显着水平0.05,与t检验的零假设不相符,存在显着性差异(表2、图2)。
2.3斑替枝孢的致病性
将真菌菌株接种于草鱼和鲤鱼,培养后观察,发现此菌株对草鱼和鲤鱼的生长没有明显的影响,没有引起淡水鱼患病或死亡。在鱼体的伤口周围取材进行再培养,没有发现埃里格孢,初步判断斑替枝孢不感染草鱼和鲤鱼,单一菌株的斑替枝孢可能对淡水鱼无致病性。
3小结与讨论
斑替枝孢是枝孢属真菌,属半知菌亚门,菌丝体淡褐色至褐色,有时产生子座。斑替枝孢又叫毛样枝孢霉、枝孢样枝孢霉,为腐生真菌,广泛存在于自然界的土壤、某些动物的粪便、蔬菜、腐木、鸟巢、腐烂水果中[8],而从鱼类体表溃烂伤口分离该菌株则属首次。
生物学特性研究篇7
[关键词]干细胞；人牙周膜干细胞；免疫磁珠；流式细胞计量术；免疫细胞化学
[中图分类号]R783.5[文献标识码]a[文章编号]1008-6455（2008）05-04
isolation,identificationandbionomicsofhumanperiodontalligamentstemcells
panFeng1,DinGYin1,wanGGuang1,ZHaoYu2,niHua2
(1.Departmentoforthodontics,StomatologyHospital,theFourthmilitarymedicalUniversity,Xi'an710032,Shaanxi,China;2.Centeroftissueengineering,StomatologyHospital,theFourthmilitarymedicalUniversity)
abstract:objectivetoisolateandidentifytheperiodontalligamentstemcellsanddemonstrateitsbionomics.methodspDLSCswereisolatedbyimmunomagneticmethod.theflowcytometryandimmunocytochemistryprocedurewereusedtodisclosethecellcycleandsurfacemarkerofthepDLSCs.osteoinductionandadipoinductionweredonetoconformthemultidirectionaldifferentiationofpDLSCs.Resultstheacquiredcellshadclonalityandlowproliferation.mostofthecellswereinphaseG0/G1andtherewerehighexpressionofCD146andCD44onthesecells,meanwhile,CD34andCD45wereoflowexpression.thecellswereVimentinandStRo-1positivewhiletheirmultidirectionaldifferentiationabilitywasconfirmedinvitro.ConclusionimmunomagneticmethodwasaneffectivewaytoisolateandpurifythepDLSCs.theacquiredcellsshowedthecharacteristicsofstemcells.
Keywords:stemcell;humanperiodontalligamentstemcell;immunomagneticbeads;flowcytometry;immunocytochemistry
研究证实牙周膜内存在具有横向分化能力的干细胞(牙周膜干细胞)，在体外微环境作用下还可分化为成牙骨质细胞或成骨细胞[1-2]。因此，牙周膜干细胞（pDLSCs）作为一种新发现的干细胞，在牙周组织工程研究中有较大的应用前景。但是牙周膜组织量小、分离困难，一直成为制约牙周膜干细胞研究的重要原因。已有的克隆筛选法操作程序繁琐，周期较长[1]，因此需要寻找简便、快捷的筛选方法来分离牙周膜干细胞。本研究应用免疫磁珠技术对人牙周膜干细胞进行筛选，并扩增培养，通过对牙周膜干细胞生长曲线、克隆形成率、细胞周期、细胞表面抗原标记物测定及多向分化能力的研究对其生物学特性进行研究，以期建立一种便捷有效的分离方法并明确牙周膜干细胞的生物学特性，为进一步研究牙周损伤的发病机理及临床治疗提供基础。
1材料和方法
1.1实验材料和设备：α-mem培养基（Gibco，美国），羊抗小鼠磁珠试剂盒（Dynalbiotech，美国)，基质蛋白-l单克隆抗体(StRo-1，R&D，美国)，aBC型免疫组化检测试剂盒(Dkao，美国)；小鼠抗人波形丝蛋白单抗(Vimentin，Dkao，美国)；CD44-FitC、CD146-FitC、CD34-FitC、CD45-FitC小鼠抗人单克隆抗体（BeckmenCoulter，美国）；Co2孵箱(Heraeus，德国)；YJ-875型超静工作台(苏州净化设备厂，中国)；流式细胞分析仪(BeckmenCoulter，美国)；倒置相差显微镜及照相系统(olympus，日本)。
1.2实验方法
1.2.1取材及细胞培养：收集临床拔除的正常人牙周健康、无龋的新鲜第3磨牙，刮取根中1/3牙周膜组织，移入10cm无菌培养皿内，滴加少许α-mem培养液保持组织湿润，锐性分离牙周膜组织约1mm3组织块，将分离的组织块以1mm间距平铺于6孔板内，以无菌盖玻片覆盖组织块，加入培养液(含100ml/L胎牛血清，100μmol/L2抗坏血酸，2mmol/L2谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的α-mem培养液)，置入37℃、50ml/LCo2的孵箱中培养，待多数组织块周围有细胞游出后去除盖玻片，常规培养，每3天换液1次，细胞生长达80%汇合时传代。
1.2.2磁珠分离筛选牙周膜干细胞：将5μl磁珠剧烈振荡后移入离心管内，加入5ml含1％胎牛血清的pBS冲洗，放置于磁力架上静置2min后去上清，重复一次后重悬，置4℃备用。收集第4代人牙周膜细胞1×108个，以含1％胎牛血清的pBS重悬，加入小鼠抗人StRo-1抗体，4℃孵育60min，每隔10min轻振以防沉淀。以含1％胎牛血清的pBS清洗3次，去除残留抗体后重悬并加入磁珠，4℃孵育30min，每5min轻振一次。离心，去除含空白磁珠的上清液，以含1％胎牛血清的pBS重悬，将离心管置于磁力架上2min，缓慢弃除上清及未与磁珠结合的细胞。以含1％胎牛血清的pBS再次重悬并清洗与磁珠结合的细胞2次，弃上清，加入磁珠分离液，轻晃均匀2min后置于磁力架上2min，取上清液，重复2次以去除残存磁珠，离心，加入5ml含10％胎牛血清的α-mem培养液，重悬，调整细胞浓度为1×104/ml接种于6孔板内，37℃、50ml/LCo2的孵箱中培养。
1.3牙周膜干细胞生物学特性的研究
1.3.1细胞生长曲线测定：分别取筛选培养的牙周膜干细胞及牙周膜细胞，以1×103cells/孔接种于96孔塑料板，每组3孔，隔日换液。每天取一组，mtt法测各孔oD值，连续测10天，以时间为横轴、细胞数为纵轴绘制生长曲线。
1.3.2克隆形成率测定：将收集的对数生长期牙周膜细胞的培养上清1500rpm离心10min，经0.22μm直径的小滤器过滤后，与培养基以l:l比例混合作为适应性培养基。取筛选培养的牙周膜干细胞，调整细胞密度至10～15个/ml，100μ1/孔接种于96孔培养板中，培养12h后标记单个细胞孔，并补液至200μ1/孔，5天换液，光镜下观察克隆形成情况。
1.3.3流式细胞仪分析
1.3.3.1细胞周期分析：取筛选培养的牙周膜干细胞，胰酶消化，调整细胞密度为1×107/ml，pBS清洗2次，加入0.01mol/LpBS重悬，再加入预冷的无水乙醇2ml吹打混匀，4℃过夜，离心弃乙醇，0.01mol/LpBS清洗2次，加入5ml/L碘化丙锭1ml，4℃30min，过300目的尼龙筛网，流式细胞仪上机，进行细胞周期检测。
1.3.3.2表面抗原测定：取筛选培养的牙周膜干细胞,弃去培养液，pBS清洗两次，以含0.25%胰蛋白酶的pBS液消化5min，制成单细胞悬液，再以含2%牛血清白蛋白和0.1%偶氮钠的磷酸盐缓冲液(流式缓冲液)冲洗细胞,调整细胞密度为3.0×109/L，每个eppendof管加100μL细胞悬液，室温下分别与CD44-FitC、CD146-FitC、CD34-FitC、CD45-FitC小鼠抗人单克隆抗体5μL避光孵育15min，再以流式缓冲液清洗细胞，1000rpm离心5min，将细胞重悬于含1%多聚甲醛的流式缓冲液0.5ml固定。使用同型对照单克隆抗体确定背景标记。用流式细胞仪分析荧光细胞，专用配套软件计算细胞表面抗原阳性率，单位用%表示。
1.3.3.3免疫细胞化学染色：取筛选培养的pDLSCs制备细胞爬片，免疫细胞化学aBC法进行StRo-1及Vimentin染色，阴性对照以pBS替代一抗，进行细胞来源及表达检测，光镜下观察。
1.3.3.4体外多向诱导分化：①矿化诱导：取筛选培养的牙周膜干细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为2×104/ml接种于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-mem培养24h后换矿化诱导液(100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μg/ml维生素C、1×10-8mol/L地塞米松、10ml/L胎牛血清、α-mem培养液)培养，隔日换液。培养3周后吸弃培养液,pBS清洗,95%酒精固定10min,pBS清洗2次,加入0.1%茜素红(alizarinRed-S)室温染色30min，去离子水清洗3次，光镜下观察。②成脂诱导：取筛选培养的牙周膜干细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为1×105/ml接种于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-mem培养24h后换成脂诱导液（地塞米松10-6mol/L、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5mmol/L、胰岛素10mg/L、消炎痛100mmol/L、α-mem培养液）培养，隔日换液。培养3周后吸弃培养液，pBS清洗，10％中性甲醛固定10min，pBS清洗2次，油红o染色10min，去离子水清洗3次，镜下观察。
2结果
2.1形态学观察：所筛选细胞大部分呈类梭形，核为卵圆形、位于胞质中央，似成纤维样细胞（如图1）。
2.2细胞生长曲线测定：牙周膜细胞及牙周膜干细胞生长曲线均呈倒“S”形，在接种后1天两者细胞量均减少，自第2天起，细胞生长均加速，第8天达到生长高峰，进入“平台期”，此后，细胞生长速度减慢。总体而言，干细胞生长速度明显低于牙周膜细胞（如图2）。
2.3牙周膜干细胞生物学特性研究
2.3.1克隆形成率：10～12天有细胞克隆形成，镜下观细胞呈集落状生长，细胞形态成梭形，体积较小，排列紧密，中心细胞界限不清，呈圆形或不规则形状，周边细胞呈梭形或多角形。共获得克隆株43株，克隆形成率为14.93％。
2.3.2细胞周期分析：细胞周期动力学结果显示：大多数细胞处于G0/G1期(78.2％)，即静止期和Dna合成前期。G2期为2.3％，S期为19.5％。表明细胞增殖缓慢，大多数处于静止期或缓慢增殖期(如图3)。
2.3.3细胞表型特征鉴定：表面抗原CD146和CD44检测阳性率为92.8％及91.7％，CD34和CD45阳性率为1.6％及2.3％（如图4）。
2.3.4免疫细胞化学染色：筛选培养的牙周膜干细胞中StRo-1及Vimentin均为阳性染色，具有间充质干细胞的特征（如图5～6）。
2.3.5成骨诱导：成骨诱导液继续培养8天后，细胞呈复层生长，局部增厚，12天左右中央出现许多颗粒样改变，并逐渐连接成片，密度增高。21天左右孔板底部出现肉眼可见针尖大小灰白色小结节，并逐渐增大。茜素红染色可见红色矿化结节（如图7）。
2.3.6成脂诱导：经成脂诱导液培养至第10天左右，可见细胞形态发生改变，较培养初期更为饱满，至21天时油红o染色阳性，细胞胞浆内有大量脂滴形成（如图8）。
3讨论
以往成体干细胞的分离纯化常用方法有密度梯度离心法、贴壁培养法、克隆化培养筛选，但这些方法操作繁琐，且所需时间较长，不利于临床应用。根据干细胞表面特异性受体能选择性结合或粘附其它信号分子的原理，采用免疫磁珠筛选、流式细胞分选法分离和鉴定干细胞己广泛开展[3,9]。Seo[1]的研究结果显示人牙周膜干细胞表达间充质干细胞的特异性标志StRo-1，并利用免疫磁珠筛选首次成功获得人牙周膜干细胞。Gay等[4]使用StRo-1抗体对牙周膜细胞进行标记后，通过流式细胞仪对其进行筛选，获得27％StRo-1阳性细胞。在本实验中，我们通过使用包被二抗的免疫磁珠对复合StRo-1的牙周膜细胞进行分离纯化，获得牙周膜干细胞，筛选程序简单、迅速，细胞活性保持较好。经细胞生长曲线测定，牙周膜干细胞较同一来源的牙周膜细胞生长慢，符合干细胞慢增殖周期的特点。
克隆形成能力是干细胞的特点，高秦等[10]对人牙周膜细胞进行了克隆化培养，结果显示细胞培养10～15天有克隆形成，克隆形成率为0.62％。Gay等[4]对牙周膜干细胞及骨髓基质干细胞的克隆形成情况进行了比较，发现牙周膜干细胞有50个克隆形成，骨髓基质干细胞有35个克隆形成，证实牙周膜干细胞有较强的克隆形成能力。成体干细胞处于由周围间质细胞及其所分泌的相关生长因子或配体形成的微环境中，这些生长因子或配体与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。故为提高克隆形成率并尽可能的保持纯化后的细胞的未分化状态，本研究借鉴了高秦等[10]人牙周膜干细胞克隆化培养的方法，收集了牙周膜细胞的培养上清与普通培养基以一定比例混合，制备成适应性培养基，对所筛选的牙周膜干细胞进行了克隆化培养，共得到43个克隆，克隆形成率为14.93％，证实所获得细胞具有干细胞自我更新的特性。
细胞周期是反映细胞增殖动力学的重要指标。干细胞是处于相对静止状态的一群细胞，这种慢周期的特点是大多数成体干细胞的共同特征[11-12]。但在外界因素作用下，干细胞周期也会相应变化[13-14]。本研究对所筛选牙周膜干细胞的细胞周期分析显示，与高秦等[10]的结果有一定差异，可能原因有：①细胞来源不同，因不同个体的干细胞状态不会完全一致；②细胞获取方法不同，高秦等通过克隆化培养获取牙周膜干细胞，而本研究采用的是免疫磁珠直接筛选，不同的方法导致细胞所受外界条件刺激的不同，进而可能影响到细胞周期的变化。
目前，学者们还未找到牙周膜干细胞的特异性表面抗原标记物。Seo等[1]的研究结果显示牙周膜干细胞表达间充质干细胞表面抗原StRo-1及血管周围细胞表面标记物CD146及CD44。nagatomo等[15]发现牙周膜干细胞表达细胞表面抗原CD105、CD166及StRo-1。ivanovski等[16]发现牙周膜干细胞或骨髓基质干细胞均无CD14、CD45和CD34表达。高秦等[10,21]研究结果显示人牙周膜干细胞波形蛋白（Vimentin）及StRo-1呈阳性表达。在实验中我们对分离培养的细胞进行了表面抗原测定及免疫细胞化学染色，结果显示：Vimentin及StRo-l染色阳性，显示其间充质干细胞来源，此外，流式细胞分析结果显示间充质干细胞标记物CD44及CD146在牙周膜干细胞中高表达，而内皮细胞标记物CD34，造血系细胞标记物CD45的表达极低，从正反两方面证实了以往学者的结论。而多向分化研究结果也证实牙周膜干细胞可以经诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞，符合干细胞特征。
综上所述，本实验所筛选培养的人牙周膜干细胞为多角形、成纤维型细胞外观，具备克隆形成能力及慢细胞周期特点，免疫细胞化学染色及流式细胞术检测证实所培养细胞表达CD44、CD146、Vimentin、StRo-1，不表达CD34、CD45，均与文献报道一致。此外，经诱导培养，所培养细胞可分化为成骨细胞及脂肪细胞，进一步证实牙周膜干细胞具有多向分化能力。
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生物学特性研究篇8
【关键词】 心肌保护;电-机械耦联;钾
comparativestudyoncarotidaorticvascularsensitivitybetweenhumanandrats
guanyu-long1,dongpei-qing2,wancai-hong2,yangjing2,hemei-ling2
(1.departmentofcardiopulmonarybypass,cardiovascularinstituteandfuwaihospital,
chineseacademyofmedicalsciences&pekingunionmedicalcollege,beijing100037;
2.departmentofcardiopulmonarybypass,beijinganzhenhospital,capitaluniversityof
medicalsciences,beijingheart,lungandbloodvesselmedicalinstitute,beijing100029,china)
abstract:objectiveaorticvascularsensitivitywascomparedbetweendifferentspeciestosearchforpossiblecausesofsignificantdiscrepancybetweenbasicexperimentsandclinicalobservations.methodscarotidarterieswereharvestedfromanesthetizedwistarratsandcadaverswhodiedwithin2hours.theresponseto68mmol/lkclandnoradrenalinwasassessedforobservationofvascularsensitivitytoelectromechanicalcouplingvasoconstrictorandreceptor-mediatedvasoconstrictorbetweenratsandhuman.results(1)thearterialringsofratspossessedswiftandrepetitiveresponseto68mmol/lkcl.thetensionofringsrestoredtobaselinewhentheringswerewashedwithfreshkrebs-henseleitsolution.thearterialringsofcadavershadpersistentvasoconstrictionandthetensiondidnotrestoredaftertheincubationsolutionwasswitchedintofreshkrebs-henseleitsolution.(2)thearterialringsfromratsandcadaverspossessedsimilarresponsetonoradrenalinandsodiumnitroprusside.conclusionhumanandratshavesimilarreceptor-mediatedvasoconstrictionmechanism.theresponsetoelectromechanicalcouplingvasoconstrictionisdifferentbetweenhumanandrats,whichindicatshumanandratspossessdifferentchannelcharacteristic.sothosemaybetheprimarycauseofsignificantdiscrepancybetweenbasicexperimentsandclinicalobservations.
keywords：cardioprotection;electromechanicalcoupling;potassium
体外循环(cardiopulmonarybypass,cpb)心脏直视手术的患者，在围术期会受到不同程度的干扰和损伤。为减轻术后脏器功能不全的发生，学者们曾应用不同实验动物进行了大量的实验研究，但我们发现，有些在动物实验中应用的方法和技术在临床应用时结果不尽相同。本实验通过比较大鼠和人体动脉血管的生物力学特性，揭示不同种属间组织结构和功能方面的差异，从而为临床应用提供帮助。
1材料与方法
1.1实验材料wistar大鼠(清洁级，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心);人颈总动脉血管条(取自脑死亡供体)。
1.2实验仪器powerlab4腔张力检测仪;sartoriusbasicplusbp211d天平;jb-3型磁力搅拌器。
1.3实验步骤
1.3.1液体的配制实验当日配制krebs-henseleit(k-h)溶液(mmol/l)：nacl118，kcl4.7，cacl22.5，kh2po41.2，mgso4(7h2o)1.2，nahco325.0，glucose11.0，ph7.4;68mmol/lk+溶液：kcl68mmol，其他同k-h液;m199培养液：在无菌条件下配制m199溶液(购自gibcobrl公司)，放置于4℃冰箱中备用。
1.3.2标本的制备wistar大鼠(体重250±10g，n=10)，10%水合氯醛375mg/kg腹腔注射麻醉。取双侧颈总动脉血管，用眼科剪将血管条剪成3mm长的血管环。取自人尸体的颈总动脉血管备用(n=10)，用眼科剪将血管条剪成3mm长的血管环。
1.3.3颈总动脉血管电-机械耦联反应测定将制备好的大鼠、人颈总动脉血管分别悬挂于powerlab4腔张力检测仪的器官室挂钩上，调定大鼠血管基础张力为1.5g，人颈总动脉血管基础张力为3.0g，维持基础张力平衡1h。分别在器官室内加入68mmol/lk+溶液，连续记录血管张力，观测动脉血管对高钾的反应性，直至最大张力达平衡。使用k-h液进行换液，使得血管张力降至基础水平。重复上述刺激3次。
1.3.4颈总动脉血管α受体介导的血管收缩及非内皮依赖性舒张反应测定血管平衡1h后，大鼠血管使用68mmol/lk+溶液进行预处理3次，人颈总动脉血管无须预处理，分别在器官室内加入10-5mol/l的去甲肾上腺素。血管张力达平台期后加入10-5mol/l的硝普钠。
1.4统计学处理应用spss13.0统计软件进行统计分析，记录两组不同血管材料在不同刺激条件下张力随时间的变化值。两组数据进行t检验，用±标准差(±s)表示。p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1颈总动脉血管电-机械耦联反应结果加入电-机械耦联收缩刺激剂68mmol/lk+溶液后，大鼠颈总动脉血管张力缓慢上升，并在1h内达峰值。以k-h液冲洗3次后，血管张力迅速下降，并在30min内恢复至原有基础张力水平(1.52±0.03)g，与基础张力(1.52±0.02)g相比，p>0.05。再次加入68mmol/lk+溶液，血管张力再次上升。电-机械耦联反应刺激具有可重复性，见图1。而人颈总动脉血管张力缓慢上升，并在1h内达峰值。以k-h液冲洗3次后，血管张力无改变(7.51±0.19)g，与基础张力(2.52±0.04)g相比，p<0.01，见图2。
2.2颈总动脉血管α受体介导的血管收缩及非内皮依赖性舒张反应结果受到10-5mol/l的去甲肾上腺素刺激后，大鼠颈总动脉血管张力急速上升，20min内即基本达峰值，之后缓慢上升，连续性观测1h血管张力无衰减。加入硝普钠后，血管张力急速下降，在20min左右即达基础张力水平(1.43±0.13)g，与基础张力(1.53±0.05)g相比，p>0.05，见图3。人颈总动脉在去甲肾上腺素作用下血管张力缓慢上升，30min内达峰值。加入硝普钠后，血管张力缓慢下降，在30min达基础张力水平(3.21±0.28)g，与基础张力(3.06±0.13)g相比，p>0.05，见图4。
3讨论
在心脏直视手术中，cpb和心脏停搏为心脏和大血管手术提供了安全的保证。但在心脏停搏期间，心肌的缺血缺氧导致再灌注损伤的产生，部分患者在体外循环后发生心功能低下、心律失常等，影响了手术的顺利恢复。为此，学者们在心肌保护方面展开了大量的研究和探索，包括心脏停搏液的改良、灌注方式的改进、心肌损伤机制的探索等[1-6]。但是文献中有关心肌保护的研究结果并不一致。在动物实验中得到较好结果的一些心肌保护药物(如腺苷等)，在临床观察中并没有明显增强心肌保护的效果[7-8]。动物实验中发现的缺血预处理技术，在动物实验中可以明显改善之后心肌耐受缺血缺氧的能力，但在临床实验中也是不能得到验证[9]。这种动物实验与临床观察结果之间的巨大差异越来越受到学者们的重视，但具体机制尚不明确[10-11]。
本研究选择大鼠和人类动脉血管作为实验材料，从血管生物力学角度研究可能造成心肌保护基础实验与临床观察差异的可能原因。本组实验由于采用了powerlab4腔张力检测系统，压力传感器的设置较传统电生理检测装置有很大改进，采用了计算机模拟量到数字量转换(a/d)系统，敏感度大大提高。
血管平滑肌细胞受到刺激兴奋后，通过肌细胞特有的兴奋-收缩耦联机制产生收缩反应。在基础实验中，一般采用高钾作为电机械耦联反应的刺激剂，其浓度从30～100mmol/l不等，68mmol/lk+溶液是比较常用的一种。据报道，68mmol/lk+溶液可以在不同动物的不同血管产生强烈的收缩效应，并且没有脱敏现象。去甲肾上腺素作用于α肾上腺素能受体，受体分布广泛，因此是药理机械耦联反应实验中最常用的试剂之一，因此，选用这两种试剂作为生物力学实验的刺激剂。加入硝普钠观察血管的非内皮依赖性舒张反应。在电机械耦联实验中发现，大鼠对高钾有较强的耐受和调节能力，大鼠血管张力在去除刺激因素后迅速下降，说明细胞内存在快速的钙通道调节机制，从而降低细胞内钙离子浓度，引起血管张力下降。但其具体机制尚需要进一步的实验证实。在药理机械耦联反应实验中，人体血管与大鼠具有相似的α受体介导收缩反应和非内皮依赖性舒张曲线。但是人体血管上升(收缩)和下降(舒张)曲线更为平缓，说明收缩和舒张强度低于大鼠。这可能提示人体对药物具有一定的抵抗和适应能力。
尽管动物实验中经常采用高钾进行反复刺激，进行血管生物力学的检测。但是检测也显示，暴露于20mmol/l的高钾溶液，冠状动脉内皮细胞一氧化氮的释放并未受到影响，但是内皮细胞衍生的超级化因子(edhf)介导的舒张作用减弱[12]。本组实验则通过生物力学的角度直接证实了高钾的这种不利影响。人颈总动脉受到68mmol/lk+溶液刺激后，血管张力持续增高，改变细胞外k+浓度并不能使张力降低。这说明高钾对人体血管的不良影响较大鼠更为明显，人与动物血管调节钾代谢的机制存在明显差异。这种现象在临床上将会明显影响心肌保护的效果，表现在：①高钾引起心肌血管痉挛，影响心脏停搏液的均匀分布，使部分心肌代谢活动持续存在，加重心肌缺血。②钙内流导致细胞内钙超载。由于心肌收缩最终都是改变细胞内ca2+的浓度。高钾刺激引起的血管张力持续增加说明，细胞内ca2+浓度较高，细胞会调动质膜上的通道或通过耗能的ca2+泵，从而调节细胞内的钙浓度。但这些过程大多数都是耗能过程，会加重细胞缺氧。③心肌血管的挛缩影响复灌后血液的复流。④影响复灌后正常电机械活动的恢复。由于细胞外高钾本身对心肌电活动的产生和传导有影响，如果复灌后血运恢复不畅，也会间接导致心律失常的发生。
因此，根据本实验结果，有必要在进一步的实验中探索大鼠和人体血管电机械耦联反应差异的内在因素，将对心脏停搏液的改良起到有益的指导作用。在选择心肌保护的实验模型和实验设计时，应考虑不同种属的差异性。
【参考文献】
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生物学特性研究篇9
【关键词】红斑狼疮；系统性；骨髓间充质干细胞；生物学特性
骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalStemCells，mSC)具有高度自我更新和多向分化的潜能，并具有支持造血和免疫负调节作用［1］。大量的体外细胞培养实验［2,3］证明它具有诱导免疫耐受和免疫抑制的特性。mSC移植在SLe治疗中具有较广阔的应用前景。了解SLe患者自身mSC是否异常是判断选择自体或异体mSC移植治疗SLe的重要依据。SLe患者mSC的体外扩增及其生物学特性是协助我们评价SLe患者mSC是否存在缺陷的重要方面。
1资料与方法
1.1一般资料9例SLe患者均符合1997年美国风湿病学会修订的SLe分类诊断标准，SLe疾病活动评分(SLeDai)判断疾病的活动程度。9例患者的资料见表1。另选5例性别、年龄匹配的健康者作为对照组。
1.2骨髓mSC分离培养采用羟基淀粉沉淀联合Ficoll密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养mSC。具体方法无菌操作下抽取骨髓液10ml，以5×105U/ml肝素钠抗凝，先用羟基淀粉按1∶4体积加入，静置20min，通过自然沉降去除下沉的大量红细胞，剩余的含大量红细胞的下层液体，再用淋巴细胞分离FicollHypaque常规分离单个核细胞。将上述两步分离所得的骨髓单个核细胞充分混匀，悬浮于体积分数为10％的胎牛血清DmemLG培养液中，按约1×106/ml密度接种于25cm2培养瓶，置37℃、体积分数为5％的Co2饱和湿度的培养箱中。当显微镜下观察细胞已达90%融合时，则可传代。用0.5%胰酶/乙二胺四乙酸(eDta)(Gibco，美国)消化贴壁细胞，收集细胞并悬浮于完全培养液中，按104/cm2的密度接种于新的培养瓶中，置37℃、5%Co2饱和湿度细胞培养箱中培养，每3~4天更换1次培养液，约1周待细胞生长密度达90%左右时，进行再次传代。
1.3mtt法检测mSC的生长情况mtt比色法检测SLe患者第2代mSC的生长情况，作传代细胞培养的生长曲线分析。
1.4流式细胞术检测mSC表面分子的表达细胞培养扩增到第三代时，分别取100ul细胞悬液与鼠抗人CD29、CD44、CD34、CD45抗体室温反应30min。流式细胞仪检测。
2结果
2.1mSC的传代情况及形态
本实验进行了9例SLe患者和5例健康对照者mSC体外培养。5例健康对照者mSC均能成功体外扩增。9例患者中，5例mSC能传代扩增，传代率为55.6%。其中女性4例，男性1例，年龄16~26岁，平均年龄21.8岁；病程3~24月，平均病程9.8月；Dai评分为15~21，平均评分为18.6。5例SLe患者均合并有肾损害，其中1例合并有血液系统损害。mSC体外扩增不成功的4例SLe患者，均为女性，年龄26~45岁，平均年龄38.2岁；病程6~60月，平均病程37.5月；Dai评分为1322，平均评分为18.5。4例SLe患者均合并有肾损害，其中2例合并有严重血液系统损害。每例患者的临床资料及mSC体外培养基本情况见表1。
2.1.1体外扩增成功者5例mSC体外扩增成功的SLe患者，mSC生长情况与健康对照组相比较：原代培养时，细胞形态上与健康对照组相似，但纺锤形、梭形细胞的出现稍晚，一般于2~4d，健康对照组的一般出现于1~2d内；随后逐渐见集落形成，原代培养的时间平均为(14.2±1.45)d，与健康对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)，细胞呈长梭形旋涡样生长；传代后细胞生长较旺盛，平均传代时间(5.8±0.44)d，与健康对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。消化传代的细胞于24h内完全贴壁，形态与健康对照组相似。
2.1.2体外扩增不成功者mSC生长情况与健康对照组相比较：同等骨髓量分离得到的单个核细胞数量与健康对照组相比明显减少，且贴壁的纺锤形、梭形细胞的出现时间明显较晚，一般于6~7d，且仅零星分布，不成集落生长，随着培养时间的延长，其中2例可见细胞少量扩增，培养至第15天，约见20％~30％融合的短梭形细胞生长(图3)，至第30天，细胞基本自行凋亡；另2例至第18天，见部分长梭形细胞零星分布，融合少于10％，至第30天细胞基本自行凋亡。
2.2mSC表面分子的表达
流式细胞术检测BmmSC细胞表面抗原，结果显示体外扩增成功的SLe患者BmmSC均高表达CD29、CD44，而不表达CD34、CD45，第3代BmmSC纯度达95%以上，且各表面标志的表达与健康对照组相比较差异无统计学意义(p>0.05)。
2.3mSC的生长情况
SLe患者第2代mSC生长趋势与健康对照组相似，第3~4天生长活跃，第4天后生长渐缓，第56进入生长平台期。
3讨论
mSC是骨髓中具有高度自我更新和多向分化潜能的一群干细胞，体外培养易纯化、扩增迅速，具有支持造血、免疫调节和诱导免疫耐受的作用。本实验进行了9例SLe患者和5例健康对照者mSC的体外培养。健康对照者mSC均能成功体外扩增。9例SLe患者中，5例可以传代扩增，传代率为55.6%。有4例SLe患者mSC不能成功传代扩增，说明部分SLe患者mSC存在缺陷。另一方面，我们发现能成功传代的5例SLe患者mSC无论是从细胞形态、原代培养所需时间、平均传代时间及表面特异性分子表达均与健康对照组无明显差异，所培养、扩增的细胞能达到临床应用的要求。提示这部分SLe患者mSC生物学特性基本正常。
对两组扩增情况不同的SLe患者的临床资料进行比较，我们发现未能成功体外扩增的SLe患者具有如下的临床特征：①年龄较大。②病程较长。③合并有较严重的血液系统损害。④长期大剂量应用免疫抑制剂。
大量实验发现，mSC的生物学特性与年龄密切相关。骨髓中mSC的含量、质量以及细胞活性随着年龄的增长而下降［4,5］。骨髓中mSC的克隆数随着年龄的增长而逐渐减少，且BmmSC分泌SCF、FLt3L、iL6、tGFβ1及SDF1等与自我更新密切相关的细胞因子的能力逐渐下降，导致BmmSC的增殖能力逐渐减弱。另外，也有研究者指出［6］，病情较重的SLe患者，从骨髓中可提取的单个核细胞数原本就较少，所含mSC就更少。然而SLe病情轻重、病程长短及不同药物治疗是否会影响SLe患者mSC的体外扩增、生物学特性及功能，目前尚未能明确。
我们实验说明SLe患者mSC存在一定的异质性，因此应用mSC治疗SLe前，了解患者自身mSC是否存在缺陷是必需的。如果患者mSC本身存在缺陷，为避免治疗失败或复发，异体mSC输注为首选；如果mSC本身基本正常，自体mSC输注将是有效的。SLe患者mSC的体外扩增及其生长特性是协助我们评价SLe患者mSC是否存在缺陷的重要方面，为SLe患者mSC移植的治疗方法提供了理论依据。
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生物学特性研究篇10
利用多种吸附材料和分离方法对贵州产铁破锣全草和甘肃产铁破锣根茎的乙醇提取物进行了卓有成效的分离工作，共分离得到四十个化合物，并通过经典的化学方法和各种先进的波谱学技术(包括iR，UV，1HnmR，13CnmR，Dept，1H-1HCoSY，13C-1HCoSY，HmQC，HmBC，toCSY，mQC-toCSY，noeSY，ei-mS，FaB-mS和eSi-mS)，鉴定了其中三十三个化合物，已鉴定的化合物中，有18个为新化合物，12个系首次从该植物中分离得到。
新化合物包括16个环菠萝蜜烷型三萜皂甙、一个齐墩果酸型三萜皂甙和一个有机酸，分别命名为：铁破锣皂甙a［BC-ll，20ε1-24ε2-epoXy-9，19-cyclolanostane-3β，16β，18，25-tetraol-3一o-β-D-xylopyranoside]，铁破锣皂甙B[BC-12，(20S*－24R*)－epoxy一9，19-cyclolanostane－3β，13β，16β，25－tetraol-3-o-β-D-xylopyranoside]；铁破锣皂甙C[BC一10,（20S*-24R*）-16βacetoxy-20，24-epoxy-9，19-cyclolanostane-3β，12β，25-teriaol-3-0-β-D-xylopyranoside]；铁破锣皂甙D[BC-14，(20S*-24R*)-epoXy-9，19-cyclolanostane-3β，12β，16β，18，25-pentaol-3-o-β-D-xylopyranoside]；铁破锣皂甙e[BC-15，20εl-24ε2-epoxy-9，19-cyclolanostane-3β，12α，16β，18，25-pentaol-3一o-β-D-xylopyranoside]；铁破锣皂甙F[BC-13，(20S*，24R*)-16β-acetoxy-epoXy-9，19-cyclolanostane-3β，12β，18，25-tetraol一3一o-（β-D-xylopyranoside）；铁破锣皂甙G[BC一16，20ε1一24ε2一epoxy一9，19一cyclolanostane-3β，15α，16β，18，25-pentaol-3-o-β-D-xylopyranoside]；铁破锣皂甙H[gbc-23，(20S，24R)一15α，16β-diacetoxy-epoxy一9，19一cyclolanostanostane一3β，18，25一triol-3一o-β-D-xylopyranoside]；铁破锣皂甙ia[gbc-22，(20S，24S)-16β-acetoxy-18，24；20，24-diepoXy-9，19-cyclanostane-3β，15β，25-triol-3-o-β-D-xylopyranoside]；铁破锣皂甙J[gbc-20，(20S，24S)-16β-acetoxy一18，24；20，24-diepoxy一9，19一cyclane-3β，25-diol-3一o-β-D-xylopyranoside]；铁破锣皂甙K[gbc-18，(20S，24S)-15α-acetoxy-16β，24；20，24-diepoXy-9，19-cyclolanostane-3β，25一diol-3-o-β-D-xylopyranoside]；铁破锣皂甙L[gbc一19，15α-acetoxy一20ε1一24ε2一epoxy一9，19一cyclolanostane一3β，16β，25一triol-3-o-β-D-xylopyranoside]；铁破锣皂甙m[gbc-26，(20S，24R)-15α-acetoxy-9，19-cyclolanestane-3β，6β，20，24，25-pentol-3-o-p-D-xylopyranoside]；铁破锣皂甙n[gbc-27，20ε1-24ε2－eqoxy-9，19-cyclolanostane-3β，12α，15α，16β，25-pentaol-3-o-p-D-Xylopyranoside]；铁破锣皂甙o[gbc-30，20ε1-24ε2-epoxy-9，19-cycldanostane-3β，16β，18，25-tetra01-3-o-βD-glucopyranoside]；铁破锣皂甙p[gbc-31，20εl-24ε2-epoxy-9，19-cyclolanostane-3β，16β，18，25-tetraol-3-o-[β-D-glucopyrasy1一(1-6)]一β-D-glucopyranoside]；铁破锣Q[gbc-33，oleanolicacid一3一o一α一L一rhamnopyranosyl一(1-4)一β-D一glucopyran03y2(1-6)-β-D-glucopyranosyleste]和铁破锣酸[BC-07，9-苯基一2e，4e，6e，8e-壬-四烯酸]。
已知化合物包括3个三萜，即：蒲公英萜酮(BC-01)，蒲公英萜醇(BC-02)，表木栓醇(BC-03)；2个甾醇，即：e-24ξ-ethyl-ch01est-22一en一3α一ol(BC-04)，β一谷甾醇(BC-05)；3个有机酸，即：香草酸(BC-06)，阿魏酸(gbc-17)，硬脂酸(gbc032)；4个环菠萝蜜烷型三萜皂甙，即：升麻醇-3-o-β-D-吡喃木糖甙(gbc-08)，25-脱水升麻醇-3-o-β-D-吡喃木糖甙(gbc-09)，beesidei(gbc-21))beesioside(Ⅲ(gbc-25)；2个齐墩果酸型三萜多糖皂甙，即：铁破锣皂甙R[oleanolicacid一3一o一α一L-rhamnopyranosyl(1-2)一α一L一rhaminopyranosyl一(1-2)一。-L-arabinopyranosyl-(1-2)-α-L-arabinoyranosyl-28-o-α-L-rhamnopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranosyl(1-6)-β-D-glucopyranosylester]；铁破锣皂甙S[gbc-35，oleanolicacid一3一o-β-D-glucopyranosyl(1-3)一α一L-arabinopyranosyl-28一o一α一L一rhamoopyranosy1一(1-4)一β-D-g1ucopyranosyl(1-6)一β-D-g1ucopyranosylester3和胡萝卜甙(gbc一24)。
对铁破锣中分离鉴定的部分单体化合物进行了初步的生物活性筛选试验。受体结合试验表明部分单体化合物对三种受体(5-Ht受体、钙通道和GaBa受体)具有一定的拮抗活性。在较低浓度(5μg／ml)时，化合物gbc021-23和gbc-25对淋巴细胞增殖具有显著的促进作用；在一定浓度范围20-100μg／ml)时，化合物BC-11、BC-12和BC-14对GLC-82细胞株显示一定的抗肿瘤活性并且成一定的量效关系。首次发现两个结构较为独特的化合物，显示出了较好的药理学活性，有一定的应用和开发前景。这两个化合物是：铁破锣皂甙m(gbc-26)在低浓度(10μh／mt)时对钙通道的拮抗活性达79．55％，是一种钙拮抗剂，有望在防治心血管系统疾病方面有所突破。铁破锣皂甙K(gbc-18)在小鼠体内试验可明显抑制由Cona诱导的t细胞增殖，具有免疫抑制作用，是一种免疫抑制剂；鸡胚尿囊膜试验还显示铁破锣皂甙K还有抑制微血管生成方面的活性(20μg／ml)；其作用机理值得深入研究。这项研究工作为寻找开发新药的先导化合物及进一步开发和利用铁破锣这一丰富的药用植物资源奠定了坚实的基础。
关键词 铁破锣属铁破锣化学成分环菠萝蜜烷型三萜皂甙齐墩果酸型三萜皂甙铁破锣皂甙a-Q铁破锣酸药理活性钙离子受体拮抗活性免疫抑制活性抑制血管生成活性化学成分与民间疗效关系
结果与讨论
一、结构解析举例
1．铁破锣皂甙B(beesiosideB，BC-12)的结构测定
化合物BC-12，白色无定型粉末，mp.250-252℃(CHCl3-meoH)，[α]D20十13．6。(CHCl3meoHl：1，c，0．11)，Liebermann-Burchard反应阳性，molish反应阳性，薄层水解检识有木糖(Baw4：1：1)。FaB-mS显示m／z623[m十H]+，结合1H和13CnmR谱数据推测其分子式为C35H58o9，不饱和度为7。
BC-01
BC-02
BC-03
BC-04
BC-05 R=H
*BC-07
gbc-24R=Gic
gbc-08
bgc-09
*BC-14
*BC-10R=CoCH3
*BC-13R=CoCH3
*BC-14
*BC-10R=H
*BC-13R=H
＊BC-16
gbc-32
*gbc-18
＊gbc-19R=H
*gbc-20
gbc-21R=CoCH3
gbc-25R=oH
*gbc-22R=H
*gbc-23
gbc-26
*gbc-27
Fig1Structureschemicalconstituentsisolatedfrom
beesiacalthaefolia(maxim.)Ulhr.
iR谱在3600-3100及1045，1065cm-1出现强吸收，示甙类化合物；FaB-mS和ei-mS出现基峰m／z143(离子a)，及失水峰m／z125(离子b)，提示分子中存在部分结构a(25-羟基-20，24-环氧残基)，这是ocotillone型三萜的典型特征；1HnmR谱中δ3．93(1H，t，J＝8.0HZ可以归属a结构中的H-24，其13CHmR谱数据同beesiosideⅢ比较一致，证明a部分结构的存在。
lHnmR谱高场区显示一对aB系统质子的信号[δ0.35(1H，D，J＝3.6Hz，19-H)，o，58(1H，d，J＝3.6Hz，19-H)]，七个叔甲基质子的单峰信号[δ0294，1.00，1.31，1.36，1.59，1.68(2×CH3)]，提示该化合物的骨架为环菠萝蜜烷型三萜。糖的端基氢信号出现在δ4.84(1H，d，J＝7．6Hz)，说明甙键为β构型。低场区除了木糖质子和H-24信号外，还显示2个连氧碳上的质子信号[δ4.81(1H，m，Hz)，4.14(1H，m，同H-3'重叠，Hx)]。
13CnmR谱共显示35个碳信号。一组碳信号[δ107．45，75．53，78．52，71．26，67．05]可归属为木糖的C-1～C-5。低场区除了C-3和a部分结构碳信号外，还显示2个连氧碳信号[δ72.07，73.10]。
1HnmR谱中17位氢出现在δ2.76(1H，d，J＝8.4Hz)，考虑化合物的不饱合度，说明16位有羟基取代；1H-1HCoSY谱中δ4.8l(Ha，H-16)与δ2．76(H-17)相关，还与δ2.15(1H，m，H-15)和δ1．93(1H，m，H-15)两个氢相关13C-HCoSY谱中，δ72.07与84.81(Ha，H-16)相关5根据偶合常数(J16,17)大小可判断16经基与17位侧链处于顺式位置，因此确定16位经基为β构型；noeSY谱中，H-16α与H-17α相关，证明了上述结论。
Fig2StructureofBC-12(beesiosideB)
13CnmR谱中，C-18出现在高场区[δ14.05]，提示12位有羟基取代，这是因为C-18处在12位羟基的γ位引起高场位移所致。13C-1HCoSY谱中，δ73.10(C-12)与δ4.14(Hx，H-12)相关；1H-1HCoSY谱中δ4.14(Hx，H-12)与ll位两个氢δ2．55(1H，dd，Jl＝15.4，J2＝8.8Hz，H-11α)，1.42(1H，dd，Jl＝15.4，J2＜3.0Hz，H-11β＝相关；HmBC谱中，H-18和C-12远程相关，证明了上述结论。
化合物BC-12经异相酸水解得BC-12a，ei-mS亦出现基峰m／z143(离子a)，及失水峰m／z125(离子b)，提示分子中存在a部分结构，1HnmR谱中δ3．94(1H，t，J＝7.4Hz)可以归属a结构中的H-24，其13CnmR谱数据同beesiosideⅢ比较一致，证明a部分结构的存在。1HnmR谱显示环丙烷质子信号[δ0．39(1H，dd，J＝3．5Hz，19-H)，0.63(1H，dd，J＝3．5Hz，19-H)]七个叔甲基质子的单峰信号[δ0．96，1，03，1．20，1.35，l.58，1.68，1.70]，及δ2．76(1H，d，J＝8．3Hz，H-17)，3．49(1H，dd，J＝11．4，4．3Hz，H-3α)，4，82(1H，q-1ike，J＝7．4Hz，H-16)；另外还显示一对aBX系统质子信号[δ2．58(1H，dd，J＝15．4，8．9Hz，H-11)，1．43(1H，dd，J＝15．4，2.7Hz，H-11)和4．16(1H，dd，J＝8．9，2．7Hz，H-12)。13CnmR谱共显示30个碳信号；其中c-3向高场移至δ77．98。
12位经基的构型是通过比较H-12和H2-11之间的偶合常数确定的。Sakurain等用X光衍射的方法测定了beesiosideⅡ甙元的双乙酰化物的结构，其c(9)-c(11)-c(12)-c(13)间的拓扑角为-14．4。，若12-oH为α构型，则H-12和H2-11之间的偶合常数J1约为8Hz，J2＞4Hz；若12-oH为β构型，则H-12和H2-11之间的偶合常数Jl约为8Hz，J2＜3Hz(Fig，2)。在化合物BC-12a中H-12和H2-11之间的偶合常数Jl＝8．9，J2＝2．7Hz；化合物BC-12中H-12和H2-ll之间的偶合常数Jl＝8．8，J2＜3．0Hz，因此确定12-oH为β构型。noeSY谱中，H-12α/me-30／H-17α之间存在相关，亦支持这一结论。
BC-12的1HnmR谱中3位氢出现在δ3．47(1H，dd，J＝11．7，4．2Hz)，根据其裂分方式和偶合常数大小可判断3位氢为α构型；noeSY谱中H-28和H-3α相关，也支持上述结构；与化合物BC-12a比较其C-3位苷化位移值(低场位移10．48ppm)，确定木糖连在C-3位。HmBC谱中H-1'(δ4．84)和C-3(δ88．46)远程相关，证明了这一结论。
KeycorrelationsobservedfromHnBCofBC-12
SignificantcorrelationobservedfromnoeSYofBC-12
Fig3HmBCandnoeSYofbc-12
BC一12的noeSY谱中，H-16α／H-α／me-21、me-21．H-22α／H-23α／H-24α、H-22α／H-22β、H-23α／H-23β、H-22β／H-23β、H-24α／me-26／me-27之间检测到noe相关信号(Fig，3)，因此a部分结构的构型确定为20S*，24R*。
tab1.1HnmR(500mHz)and13CnmR(125mHz)SpectralDataofBC-
12(beesiosideB),BC-12aandgbc-26(beesiosidem)inpyridine-d5示强吸收带，提示分子结构中含乙酰基。1H和13CnmR谱提示该化合物为9，19环菠萝密烷型三花单糖甙，含有一个乙酰基[δH2.03(3H，s)，δc17l.563(tab．1)。
1HnmR谱高场区显示一对aB系统质子的信号[δ0．29(1H，d、J＝3．9Hz，19-H)，0．50(1H，d，J＝3．9Hz，19-H)]，七个叔甲基质子的单峰信号[δ1.01，1.08，l.28，1.47，1.50，1.53，1，833，还显示一组木糖的5个质子信号[δ3．69(1H，t，J＝10．6Hz，5'-H)，3.97(1H，t，J＝8．0Hz，2'-H)，4．10(1H，t，J＝8．6Hz，3'一H)，4．15(1H，m，4'一H)，4．32(1H，dd，J＝11．2，5．1Hz，5'一H)，4．82(1H，d，J＝7．4Hz：，1'-H)]；根据端基氢的偶合常数可判断贰键为β构型。
1HnmR谱低场区显示一个aBX系统连氧碳上的质子信[δ5．56(1H，d，J＝3.5Hz，Ha)4．69(1H，dd，J＝8．3，3．5Hz，Hb)，2．29(1H，d，J＝8．3Hz，Hx)]。HmQC谱中，Ha(H-15)，Hb(H-16)和Hx(H-17)三质子信号分别与碳谱中δ90．75(C-15)，79.94(C-16)和54.09(C-17)相先考虑到Ha(H-15)化学位移处于较低场，推测15位连有乙酰氧基，该化合物具有部分结构B(Fig，4)。
13CnmR谱共显示37个碳信号；一组碳信号[δ107．39，75．42，78．42，71．19，66．98]可归属为木糖的C-1～C-5。δ88.49可归属为C-3。该化合物的不饱和度为7，扣除9，19环菠萝蜜烷型a-D环骨架、一个糖环和一个乙酰基引起的不饱和度，分子中不再有其它环系。因此17位应连有一个8碳开环侧链。13CnmR谱低场区除了C-3、C-15，C-16和木糖碳信号外，还显示3个连氧碳信号[δ80.34，76.43，72.81]，说明分子中还有3个羟基。
Fig4Structureofgbc-26(beesiosedem)
1HnmR谱中甲基信号均为单峰，说明有一羟基位于25位，连氧碳信号δ72．81可归属为C-25。H-17只与H-16偶合呈双峰，提示C-20为季碳，说明有一羟基连在20位碳原子上，连氧碳信号δ76．43可归属为C-20。从生源上推测，另一羟基位于24位，1HnmR谱中低场区出现一质子信号δ3，76(1H，br，d，J＝9，0Hz，H-24)，HmQC谱中，H-24与δ80．34相关HmBC谱中，H-27与C-24远程相关，H-24与C-23，C-22远程相关，H-21与C-17，C-20，C-21远程相关(Fig．5)，证明了3个羟基位于C-20、(C24和C-25位。FaB-mS出现基峰m/143(100)，107，可解释为17位侧链部分分别失去一分子和三分子水所致。以上证据说明分子中存在部分结构a。
1HnmR谱中3位氢出现在δ3．47(1H，dd，J＝11．6，4．1Hz)，根据其偶合常数和裂分方式可判断3位氢为α构型。HmBC谱中的，δ4.82(H-1')与δ88．49(C-3)相关证明木糖连在C-3位。
结合HmQC，HmBC和与相关化合物beessiosideL(gbc-19)比较，所有碳信号和大部分氢信号都得以归属(tab．1)；因此该化合物的平面结构得以确定(Fig．4)。
C-15，16和17的立体化学是通过研究1H-1H偶合常数(J15,16＝3.5，J16,17＝8.3Hz)确定的。H-16和H-17之间偶合常数为8．3Hz，说明16位羟基与17位侧链处于顺式位置，即16位羟基为β构型；H-15和H-16之间偶合常数为3．5Hz，说明15位乙酰基α构型(若15位取代基为β构型，则J15,16＝9Hz)。
天然界中，17位含八碳开环侧链的四环三萜类化合物在20，24，25位同时具有3个羟基取代的化合物并不多见，从紫云英属(astragalus)中曾报道过侧链含24，25双羟基取代的四环三萜皂甙，Hirotanim等认为根据C-24的化学位移值可以判断C-24的绝对构型，24R构型时，C-24化学位移出现在δ79.7-80．5；24S构型时，C-24化学位移出现在δ77．1-77．3；同时报道了3个24S构型的环菠萝蜜烷型四环三萜皂甙类化合物，其C-24化学位移均出现在肝7．1-77．3。inadaa等报道了3个24R构型的环菠萝蜜烷型四环三花类化合物，其C-24化学位移均出现在δ79．7-80．0。化合物gbc-26中C-24化学位移值在δ80．35，因此推测其C-24的构型为24R。
在人参属植物中曾发现C-20含羟基取代的Ⅲ型化合物，文献报道，12-oH取代的化合物，20-oH与12-oH存在形成氢键的可能，此时20R或20S构型的化合物，其C-20的化学位移才有较大差别，可以根据C-20的化学位移判断20位的构型；但12位无羟基取代时，其C-20的化学位移并无显著差异。化合物gbc-26的1HnmR谱中有一甲基单峰出现在较低场δ1．83，根据HmBC谱(fig．5)应归属为18-CH3，与化合物gbc-19比较，其化学位移明显向低场位移，这显然是受到C-20羟基空间电负性作用的影响所致，说明20-oH与18-CH3处于δ位，因此20-oH确定为β构型，从推断C-20的绝对构型为S。
Fig.5SignificantcorrelationsobservedfromHmBCofgbc-26
综合上述分析，测定化合物gbc-26的结构为(20S，24R)-15。-acetoxy-9，19-cyclolanostane-3β，l6β，20，24、25-pentaol-3-o-β-D-xylopyranoside，命名为铁破锣皂甙m(beesiosidem)。
二、铁破锣化学成分与民间疗效关系问题的讨论及其应用前景问题的展望
铁破锣分布于我国南北各省，其根茎或全草药用，在民间有广泛的用药基础，具有清热解毒，凉血，活血，消肿，镇痛，散风寒的功效。民间用来治疗风寒感冒，风湿关节痛，红白痢疾，咽喉肿疼，头痛，牙痛等病，外敷治疗疮疗和毒蛇咬伤等。因此，从现代药理学的观点来看其民间疗效体现在三方面，即：解热镇痛抗炎作用、对心血管系统的作用、解毒及潜在的抗肿瘤作用。
我们通过对铁破锣进行系统的化学成分研究，从中分离出大致三种类型的化学成分，即：三萜及甾醇类、有机酸类和三萜皂甙类；全草中三类成分均有，根茎中只含后两类成分；无论全草或根茎，其三萜皂甙类化学成分都占绝对优势，是铁破锣的主要成分。
文献报道，蒲公英萜醇(taraxerol)具有抗溃疡及抗胃酸分泌的作用。表木栓醇(epifriedlinol)，有抗炎作用；腹腔注射30mg／kg，对交叉莱胶引起的大鼠足趾水肿可抑制50.1％。香草酸(vanillicacid)具有抗菌和抗真菌作用，体外实验还显示抗炎活性。阿魏酸(ferulicacid)具有抗菌、抗真菌、抗肝（细胞毒)、抗雌激素、抗肿瘤和抗有丝分裂等活性；体外可激活吞噬作用，还能抗氧化和清除自由基，保护膜脂体不受氧化。我们从铁破锣中分离得到的以上化合物揭示了其解热镇痛抗炎等方面的作用。
我们对铁破锣中含量较高的三萜皂甙类化学成分进行了精细的分离工作，结果显示大部分单糖甙及双糖甙均具有环菠萝蜜烷型四环三萜母核，而多糖甙则具有齐墩果酸型母核。
我们对部分环菠萝蜜烷型皂甙类单体化合物进行了初步的活性筛选试验，结果显示其对5-羟色胺受体有一定的抑制活性，5-经色肤是一种重要的炎症介质，提示此类化合物抗炎镇痛等方面的作用；部分单体化合物对钙离子受体显示了相对较强的拮抗活性，钙离子与camp共同组成第二信使，说明此类化合物在心血管)如扩血管、降压、促智等)方面的作用。对此类化合物的抗肿瘤实验结果表明多数单体化合物在低浓度(5μg／ml)时几乎不显示细胞毒作用，在一定浓度范围(20-100μg／ml)对某此瘤株显示一定的细胞毒活性。我们从中得到的升麻醇木糖甙(Cimigenolxyloside)，文献报道此化合物在较大剂量(300mg／kg，p，o，)时，能有效的抑制小鼠CCL4诱导引导起的肝损伤。揭示了铁破锣在治疗疮疖和解毒方面的作用。
铁破锣中齐墩果酸型三萜多糖皂甙的分出，体现出铁破锣在升麻族中的个性，已报道此种骨架的皂甙具有广泛的药理学活性涉及到增强机体免疫力、镇痛、降血脂、降血糖、降血压、保肝、抗癌及激素样作用等。日本学者曾报道过几个与铁破锣皂甙Q-S结构较为相近的化合物。这几个化合物可防止CCl4诱导引起的肝损伤，抑制天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶的活性；这提示铁破锣中齐墩果酸型三萜多糖皂甙可能与其解毒方面作用有关连。
在对单体化合物的筛选过程中，我们发现铁破锣皂甙m(gbc-26)在低浓度(10μg／ml)时对钙通道的拮抗活性达79．55％，是一种钙拮抗剂，有望在防治心血管系统疾病方面有一定的前景；从化学结构上看，此化合物在17位含有一个八碳开环侧链，且有天然产物中不太多见的20，24，25三羟基取代，比20，24环氧结构的化合物活性强的多，这一现象提示侧链开环的化合物对钙通道具有更高的拮抗活性，20，24，25三羟基可能与活性有关；这一初步的构效关系理论为寻找开发新药的先导化合物提供了思路。
另一个结构上较为新颖的化合物，铁破锣皂甙K(gbc-18)在小鼠体内试验可明显抑制由Cona诱导的t细胞增殖，具有免疫抑制作用，是一种免疫抑制剂；另外铁破锣皂甙K还有抑制微血管生成方面的活性(20μg／ml)；化学结构上看，此化合物含有20，24；16，24双环氧的缩酮结构，其作用机理值得深入研究。
天然产物在新药研制和人类卫生保健中占有重要地位，天然产物是大自然在漫长地进化过程中形成的，凝结了朴素的哲学思想，其疗效肯定，已成为食品、药品、化妆品等研制与开发的广泛的物质基础。我们通过对铁破锣系统的研究工作为寻找开发新药的先导化合物及进一步开发和利用铁破锣这一丰富的药用植物资源奠定了坚实的基础。
实验部分
一、仪器药品(略)
二、提取分离(略)
三、药理活性研究
1．受体结合试验
(1)材料及模型代号（方法略）
a样品来源：从铁破锣中分离得到的单体化合物。