细胞与分子生物学技术篇1
【关键词】创新型人才细胞生物学课程体系教学模式
【中图分类号】Q2【文献标识码】a【文章编号】2095-3089（2012）12-0009-02
生物技术是推动21世纪科技进步的最重要的技术之一，是实现我国经济社会全面协调可持续发展的重要产业。围绕生物技术核心的“着力提升生物医药研发能力，开发医药新产品，加快发展生物医学工程技术和产品，大力发展生物育种，推进生物制造规模化发展，加速构建具有国际先进水平的现代生物产业体系，加快海洋生物技术及产品的研发和产业化”，已成为“十二五”国家战略性新兴产业发展规划中的重要内容。
总书记在清华大学百年校庆大会上的重要讲话中提出“着力推动‘中国制造’向‘中国创造’转变”，建立创新性国家已成为国家战略任务。在创新已成为经济社会发展的主要驱动力的今天，具有创新知识的人才是实现“中国创造”的核心要素。高等教育的根本任务是人才培养，因此，面对建设创新型国家对人才的重大需求，探索高等学校创新性人才培养的教育模型和教育机制，培养更多符合时代需求的创新性人才，是落在广大教育工作者肩上的重要任务。
西南大学生物技术专业本科首批招生于1999年秋季，是国内较早设置该专业的高校之一。作者一直致力于生物技术（工程）专业细胞生物学课程教学，对课程建设与实践颇有一些心得体会，本文就培养创新型生物技术（工程）人才的细胞生物学课程建设和实践进行探讨。
1.细胞生物学理论内容的优化
作为生物技术专业重要的专业基础课程，细胞生物学既具理论的抽象性，同时又富有技术的实践性。从理论角度，细胞生物学与生物化学、分子生物学、遗传学等其它专业课程互相联系、渗透，密不可分，同时又是细胞工程等生物技术其它专业课程的基础，在生物技术课程体系中起着承上启下的枢纽作用。
分析当前高等本科教育的国内细胞生物学教材不难发现，教材的组织架构基本是依循在介绍细胞基本成分之后，从细胞膜、细胞质、细胞核这种像剥蛋壳式的由外向内的机械式线条，显得呆滞和孤立，缺乏与其它课程的有机联系。从内容的组织上诸多内容与生物化学、分子生物学、遗传学等课程内容重复，如细胞的成分与结构、细胞核结构与功能（染色体结构与功能）等。科学设置细胞生物学课程体系，对学生牢固掌握基础理论、引导学生从基础理论原理中衍生创新设计能力、综合培养学生科学思维能力、提升学生综合素质至关重要。
1.1形成以“细胞结构和功能-细胞生命活动原理-细胞的分子、遗传改造原理”的理论课程体系
即在理论的组织架构上以细胞功能结构为基础，贯穿细胞活动的基本原理，衍生现代新理论、新技术和领域发展新趋势。内容上主要表现于
①以“细胞结构和功能-细胞生命活动原理-细胞的分子、遗传改造原理”为模块设置理论课程，围绕细胞基本结构和功能系统阐述细胞生物学基本概念、基础理论和基本方法原理。②在现有基础理论课群中，增设以现代生物技术为基础的细胞生物技术基本原理理论课程，课程内容注重以原核细胞与真核细胞为表达系统的生物技术发展过程和技术原理的阐述，让学生能从技术原理和历史技术创新角度对现代生物技术进行系统了解，更能将生物化学理论、分子与遗传技术原理在细胞层次统一结合起来，在理论教学中阐述细胞内生命活动的基本原理，以及生物技术改造的理论基础。③19世纪年代末，显微镜的发明缔造了细胞生物学的根基，近代物理学的发展更是促进了细胞生物学的突飞猛进。在新技术、新发明层出不穷的现代社会的教育过程中，将现代科学信息、现代科学理念、科学技术实时引入教学中，不仅是对细胞生物学的扩充，更是培养学生创新性思维的重要内容。因此，跟踪物理理论技术发展，结合生物技术及其它交叉领域的新理论、新技术的创新，培养学生创新意识的理论内容显得必不可少。
1.2建立“活化”的理论教学模式
①活化——教学理念要以活细胞为根基：细胞不仅仅是物理或化学上的纯结构组成，或是无机小分子及有机大分子的无生命的随机组合。细胞是有生命的，它不仅表现在它是生命结构和功能的基本单位，更重要的是细胞是生命的连续体系，从结构和功能都表现为基本物质在时空上的动态组合和生命代谢活动的有序性。因此，理论教学中，以细胞内蛋白质的合成、运输与分泌为主线索，设置细胞结构和功能的课程内容，表现细胞结构与功能的联系和细胞生命活动的时空表达。
②活化——课堂教学要有活跃的氛围：摒弃传统的理论教条式的灌输模式，采用现代多媒体技术和丰富的网络资源，将死板的文字描述转变为形象影像、动画，启动学生想象力。课堂教学中采用问题式、讨论式的教学方法，围绕一个理论主题问题，在讨论过程中“教”与“学”互动、“师”与“生”角色互换，以培养学生主动学习和以问题为基础的探索理论的能力，学生的科学思维能力在自然中养成，创新之火在自然中点燃。
2.实验课程
实验课程的内涵并不是理论课程简单的实验验证，而应该把它看作是创新型人才苗子孵育的第一基地。
2.1形成层次化的实验课程体系
整合现有细胞生物学实验课程，根据现代生物技术的产业特点和发展趋势，扩充与现代生物技术方法和措施相关的细胞生物技术基础实践，沿“细胞结构基础-细胞综合技术-创新研究”递进式内容，融合现有分散的专业、专业基础实验课，创新性构建一个系统的、层次化的生物技术本科专业的细胞生物学实验课程内容：
①细胞结构基础内容：一对一的细胞结构印证，组合经典细胞生物学实验内容，从细胞基本结构、细胞组分的分析、到细胞拆合和重组，利用基本技术和方法验证理论知识，完整认识细胞基本结构和基本方法，建立运用科学原理解决具体问题的实验基础。此部分内容为细胞及其技术手段和方法的认识和专业基础技能实验训练内容。除必要的经典实验外，增设生物技术领域前沿技术和方法，保持实验内容的先进性。
②细胞综合培育内容：一主题多技术的综合运用。以细胞培养为主线条，按细胞融合、细胞转染及细胞基因重组、重组细胞遗传表达产物的分离纯化内容进行模块设置实验内容。
③创新研究内容：多知识、多技术、生物技术多领域的发散式的自主实验性研究内容。“细胞结构基础-细胞综合技术-创新研究”的实验课程体系。
2.2建立“4+3+2+1”制式的实验教学模式
①40%基础指令性实验教学：教师决定实验内容，设定实验程序，学生进行验证性操作。对于前沿技术手段，采用网络资源和多媒体技术进行系统介绍。强化学生对细胞基本结构的认识，培养学生对现代细胞生物学方法的认识和应用、对细胞生物学基本技能的熟练掌握。
②30%综合指导性实验教学：教师命题，教师主导性设计，以一个实验内容使学生了解多种实验技术和方法的综合运用。培养学生综合运用实验技能能力和团队合作能力。
③20%综合研究性实验教学：教师命题，教师指导学生设计，综合应用多种实验技术和方法在一个实验主题中。培养学生的科学思维能力和综合设计能力。
④10%自主创新性实验教学：学生自由选题，自主设计，教师辅地帮助学生创新性实践。对可能的学生创新性研究成果，适时地进行成果转化或专利保护，认识知识产权保护的重要性。培养学生的创新精神和创新实践能力。
以上内容思考意旨是通过系统化内容的细胞生物学课程设置，建立集基本（础）知识、基本技能、实践能力、科学创新思维培植为一体、适合以培养生物技术专业学生综合素质、实践能力和创新能力的细胞生物学课程体系。
参考文献：
[1]国务院.“十二五”国家战略性新兴产业发展规划.2012
[2].清华大学百年校庆讲话.2011
[3]翟中和.细胞生物学【m】.2011
细胞与分子生物学技术篇2
光镊(opticaltweezers)又称为单光束梯度力光阱(single-beamopticalgradientforcetrap)，是一种利用高度汇聚的激光束形成的三维梯度势阱来俘获、操纵微小粒子的技术[1]。其中，势阱是指一个包围着局部最小势能的区域，因形如陷阱而被称为势阱。光镊自1986年由美国科学家arthurashkin[2]发明以来，已被广泛应用于生物医学、物理、化学等领域，成为一项重要的研究工具。最初，基于光学显微镜的光镊系统满足了对生物系统同时进行操纵和观测的需要。随着研究的深入，生命科学要求能够进行单分子层次的研究，光镊配套的成像观测系统因此发展出了在秒级时间尺度上的位移测量精度为10－10m级的光镊以提高空间分辨率；为了避免光镊高强度聚焦激光束可能产生的热效应和光化学效应，近场光镊和飞秒脉冲光镊应运而生，克服了传统光镊的热效应问题，有利于保持生物分子的稳定性。为适应生物系统的复杂性，双光镊、三光镊、四光镊和全息光镊等系统的出现实现了多粒子操控。随着光镊的进一步发展，光镊将有可能走出实验室，进入制造业、临床诊断等主流产业中去。本文将综述光镊及拉曼光镊的基本原理和特点，及其在生物医学领域中的研究进展、现状和展望。
光镊的原理和特点
光镊原理简述
光镊是基于光的力学效应的一种新的物理工具。这里以透明电介质小球为模型来阐明光镊的基本原理。如图1，当一束光穿过电介质小球时，将发生反射和折射，在这个过程中，光子与小球碰撞产生的动量变化将使小球受到散射力和梯度力。散射力(Fs)正比于入射光强，方向沿光传播的方向；梯度力(Fg)正比于入射光强的梯度，方向沿光强的梯度方向。光镊是依靠光的梯度力形成的，当达到焦点附近的梯度力大于散射力时才能形成一个稳定的三维光学势阱来稳定地捕获生物粒子。这一稳定的三维光学势阱是由一束激光通过一个短焦距透镜汇聚来实现的。如图2所示，无论入射光从法线之上或者法线之下入射小球，小球所受到的合力均指向焦点(f)，从而使小球被稳定“钳夹”在焦点的位置。
光镊的特点
光镊的基本功能赋予了其在生物医学研究领域中的独特优势。1)光镊可捕获和操控数十纳米到数十微米的微粒，而大多数生物微粒，诸如细胞、细胞器甚至生物大分子，都恰好在这一尺度范围内。因此，光镊可用于操控和研究生物微粒。2)光镊以一种温和的、非机械接触的方式完成夹持和操纵物体，捕获力是施加在整个微粒上，而不是像机械捕获那样集中在很小的面积上，不会对捕获的生物微粒造成机械损伤和污染。3)由于光的无形性和穿透性，光镊可以在保持细胞自然生活环境的情况下对其进行捕获与操纵，而且，光镊的所有机械部件离捕获对象的距离都远大于捕获对象的尺度(1000倍)，是遥控操作，几乎不干扰生物粒子周围环境和它的正常生命活动。4)光镊能产生皮牛顿量级的力，且在捕获焦点附近表现出虎克弹簧的性质，能满足单分子力学和单细胞研究的需求，是重要的传感探测工具。另外，光镊与拉曼光谱结合被称为拉曼光镊技术。拉曼光镊被广泛应用于生物医学研究中，因其具有微量检测、快速和高精度等优点，特别适合生物样品的化学成分分析[3]。单独使用拉曼光谱进行测量时需要将激光束聚焦到样品上，再探测光束焦点处样品激发的光谱信号。用拉曼光谱技术研究活细胞时，待测细胞需要固定在载玻片上，这样就改变了细胞周围的微环境，可能对细胞机能产生影响。光镊的引入避免了这种情况，因为它可以非接触地操纵活细胞。因此，拉曼光镊可以获得单个活细胞的拉曼光谱，提取单个活细胞的结构信息[4]。
光镊和拉曼光镊技术在生物医学领域中的研究进展
基于多种成像技术的发展，光镊已经从物理学领域中脱颖而出，演变为一项适用于生物医学研究的多功能工具，这是由于光镊可以从单细胞的研究中获得详细的信息。其中，多光镊应用于单细胞的分析拥有巨大潜力，利用其平行测量功能，可以为研究人员提供良好的分析数据，例如，多光镊用于细胞异质性的研究、生物力的测量用于单细胞机械性能的研究等。利用光镊对分子马达和单分子力的研究可以得到其他方法难以获得的研究结果。光镊应用于细胞信号传导和组织工程也有广阔的前景。另外，光镊与微流控系统结合时，可以精确地控制细胞的化学环境，因而可以实现对酸碱性、渗透压、药物和温度等环境因素的实时、动态研究。随着自动化及其它便于操作的光镊设备的发展和跨学科学术合作的日益频繁，光镊技术将成为生物医学领域中一种经常使用的研究工具。
应用于血细胞和血液系统疾病的研究
血细胞
由于生物细胞的多样性和复杂性，在许多情况下，为了从研究中得到相关信息，需要对大量细胞进行研究。如果对细胞一个接一个地研究，研究过程会过分耗时。为了解决这一问题，多光镊被开发出来以实现对单细胞的平行研究。Ramser等[5]开发了双光束光镊系统来研究红细胞，并使用不同波长的激光获得了红细胞的拉曼光谱，发现波长514.5nm的激光激发出的光谱质量最好，且500～1650cm－1范围内的光谱峰随时间发生了变化，这是由于这一区域的光谱对氧从血红素中解离的光解作用较为敏感所致。Cojoc等[6]应用多光镊技术在多个位置成功捕获了红细胞，他们使用衍射分光镜将激光分裂为多光束，使用氩离子激光探测被捕获的红细胞。多光镊技术与单光镊相比有三个独特的优势：1)允许细胞在三维空间内排布；2)允许细胞的侧向移动，激光可从不同位置激发拉曼光谱；3)入射在细胞上的激光强度分散，降低了光损伤的可能性。国内外有许多应用拉曼光镊对血细胞进行研究的报道。拉曼光镊基于光子的非弹性散射，通过获得入射光子与散射光子的能量差异，观察分子键的振动状态，从而获得丰富的分子结构信息。因此，拉曼光镊可以快速灵敏地分析红细胞，特别是分析血红蛋白的状态。Deng等[7]使用拉曼光镊技术研究了酒精对红细胞的作用，他们记录了细胞与20%酒精接触过程中的拉曼光谱随时间的变化情况，发现表示血红蛋白的光谱带强度随着红细胞与酒精接触时间的延长而下降。王桂文等[8]应用拉曼光镊技术俘获形态正常和发生形变的红细胞并获得其拉曼光谱，以平均光谱、主成分分析(principalcomponentanalysis，pCa)等方法分析不同形态红细胞的光谱差异与胞内血红蛋白的变化，以及这些差异和变化对光谱诊断分析的影响。结果发现，在正常的生理环境下，红细胞发生皱缩甚至形成棘形细胞，都不会影响光谱判别分析。最近，该实验组应用拉曼光镊结合气体循环供给装置，收集并分析了不同氧合状态的单个红细胞的拉曼光谱[9]，发现较强功率的激光照射会导致血红蛋白凝集特征峰(1248cm－1和1371cm－1)升高。i1638/i1547比值是区分氧合态与去氧合态的良好标志，经较长时间保存的红细胞氧合能力增强，但去氧能力没有显著变化；α地中海贫血HbH-CS患者的红细胞氧合能力比正常对照强，但其去氧能力较差。由此可见，拉曼光谱特别适合分析血红蛋白。这主要因为血红蛋白的活性中心由卟啉环组成，卟啉环可以吸收几个可见光区的波长，使用接近这些波长的激光照射红细胞，就会出现共振效应，测量集中在血红蛋白分子上，而不会受到其他细胞成分和环境的干扰。由于在全血中可以检查到许多血细胞缺陷，血液细胞的分选受到关注。Grover等[10]使用两束相反方向的激光，在光捕获的基础上，通过图像处理系统区分红细胞、白细胞和血小板，并最终将分选好的各类细胞转运到微流系统的指定容器中。该分选方法快速、精准。这说明当分选对象在大小、形状上存在较大差异时，可以利用其在光场中所受作用力的不同对其进行分选。paterson等[11]利用Bessel光产生的环形对称光场将红细胞与淋巴细胞分开，正是由于两种细胞的受力不同，在光场中的行为也不同。在该研究中，研究者发现双凹形的红细胞在Bessel光的外环上聚集后才到达Bessel光中心，而球形的淋巴细胞则直接到达Bessel光中心。最近，Yang等[12]使用光镊技术来测量凝血细胞之间的力，通过观察血红细胞的活动，发现凝血共经历三个阶段；通过测量血红细胞间的相互作用力，发现肝素使血细胞之间的力变小并延长了凝血时间，而氨甲环酸使凝血过程跳过前两个阶段而直接进入最后阶段。由于光镊的力范围在飞牛至纳牛，正好涵盖了许多细胞内和细胞间的生命过程，所以，可以很好地应用于测量细胞间或细胞内分子之间的相互作用力。
血液系统疾病
血液系统疾病主要表现在血细胞的异质性，由于拉曼光镊可以获得详细的生物细胞分子的结构信息，因此，可用于对细胞异质性的研究。Chan等[13]利用拉曼光镊技术获得了正常和癌变白细胞的拉曼光谱，发现癌变的白细胞Dna光谱带强度比正常白细胞低。Chan等[14]还通过捕获白血病病人的活体白血病细胞获得了可复制性的拉曼光谱，并应用pCa方法将正常和癌变白细胞的拉曼光谱进行了区分。由主元线性鉴别分析法(principlecomponentlineardiscriminantanalysis，pC-LDa)进行监督分类，敏感度可达到95%。因为使用了真实的临床病例，提高了这项研究的应用价值。Jess等[15]应用双光镊并结合拉曼光谱和微流控芯片，获得了单个Hi60人类早幼粒白血病细胞的拉曼光谱。微流控芯片的应用显著加快了细胞的拉曼光谱检测进程。DeLuca等[16]采用拉曼光镊技术，在单细胞水平上研究了β-地中海贫血红细胞的携氧能力和细胞膜脆性，发现地中海贫血红细胞的携氧能力下降，且其对于氧分压更为敏感；测量到的膜剪切系数显示地中海贫血红细胞膜脆性增加了40%，证实主要影响血红蛋白合成的基因缺陷对于红细胞的机械性能也存在强烈的影响。王桂文等[17]应用拉曼光镊技术收集了一例重型α地中海贫血患者单个红细胞的拉曼光谱。结果发现，重型α地中海贫血患者红细胞的拉曼光谱信号显著低于正常对照，并检测到一定比例的有核红细胞；正常对照的红细胞拉曼光谱均一，而重型α地中海贫血患者的细胞形态和拉曼光谱均显示出多样性；中等大小、形态接近正常的一类红细胞，其细胞间光谱差异最大；可观察到部分外表形态正常的红细胞，但其血红蛋白可能发生了血红素凝集和蛋白质变性。该实验组[18]还将pCa和反向传播Bp网络预测模型相结合，进行了地中海贫血红细胞类型的判别。pCa结果显示，正常对照与中间型α地中海贫血细胞(HbH-CS)基本可以区分，但正常对照与重型β地中海贫血细胞及HbH-CS与重型β地中海贫血细胞间的差异不明显。将归一化处理的前5个主成分进行Bp网络训练及预测，结果发现，正常对照与HbH-CS间的预测正确率高达97.90%，正常对照与重型β地中海贫血细胞及HbH-CS与重型β地中海贫血细胞间的预测正确率分别为90.72%和86.28%。综上所述，通过将光镊与拉曼光谱和微流控芯片相结合，可用于检测血细胞中血红蛋白的生理状态，并对血细胞进行分选，具有很大的临床应用潜力。应用该方法，可以获得异质红细胞与正常红细胞的拉曼光谱，通过pCa等数据分析手段实现对异质红细胞的鉴别和分选。另外，多光镊的应用明显扩大了对血细胞的研究范围，提高了研究效率。
光镊和拉曼光镊技术应用于微生物和感染性疾病的研究
微生物
大肠埃希菌
由于通过拉曼光谱可获得被分析物的分子指纹，因此，拉曼光镊也可被应用于对单个微生物细胞组分的研究。Xie和Li[19]使用波长为785nm的激光获得了大肠埃希菌的拉曼光谱，用此方法获得的光谱具有较好的信噪比(signalnoiseratio，SnR)和较小的背景干扰。他们发现，大肠埃希菌在60℃以上培养时，代表核酸的光谱带强度显著下降。该实验组进一步的研究[20]还发现，使用拉曼光镊能够区分不同培养条件下平台期的细菌。生物对激光的反应取决于激光的波长和强度。与可见光相比，近红外激光能够降低光损伤。neuman等[21]研究了波长为790～1064nm的激光对大肠杆菌的近红外光效应，发现光损伤最小的激光波长为830nm和970nm，而光损伤最大的激光波长为870nm和930nm。Rasmussen等[22]研究光镊捕获对大肠杆菌的生理损伤，通过测量胞膜内外pH梯度来确定细菌的生理状态，发现，波长1064nm、功率6mV的激光捕获大肠杆菌60min，其细胞膜内外的pH梯度无显著下降，而用同样波长、功率18mV的激光捕获仅几分钟，大肠杆菌细胞膜内外的pH梯度就明显下降；他们还发现，振荡条件下培养的大肠埃希菌比非振荡条件下培养的受到的生理损伤小。mirsaidov等[23]对大肠杆菌的生存力进行了研究，与之前的研究结果不同，研究人员发现光损伤与近红外激光波长(840～930nm)的关系微弱，但与激光强度呈线性相关，大肠杆菌的致死光能量为5J。moritz等[24]通过拉曼光镊技术结合pCa方法，在单细胞水平上研究了大肠埃希菌对抗生素的反应，发现，培养4h，无抗生素组在729和1245cm－1出现谱峰，而在1660cm－1没有谱峰；1vol%青链霉素组和5vol%青链霉素组在1660cm－1出现谱峰，但是在729和1245cm－1没有谱峰。头孢菌素组的光谱在729和1245cm－1与青链霉素组相似，反应了抗生素存在下细菌胞内腺嘌呤的生理变化。但是，头孢菌素组的光谱在1660cm－1没有谱峰，这可能与青链霉素引起70S核糖体单体在细胞内的聚集有关。可见，通过对获得的拉曼光谱进行数据处理分析，可得知细胞内外生物大分子的变化情况，因此，拉曼光镊可用于研究环境因素对微生物的作用及其机制。
酵母菌
Xie等[25]通过拉曼光镊技术获取酵母菌的拉曼光谱，再通过与已知正常和死亡酵母菌的拉曼光谱进行比较来筛选正常酵母菌。由于伊红只能使死亡的酵母细胞着色，因此通过拉曼光镊技术分选出的酵母细胞可以通过伊红染色的方法复查。应用此方法对6个酵母细胞进行筛选的精确度为100%。说明可以利用拉曼光镊对酵母菌进行筛选。然而该研究只用了6个细胞，该方法的可靠性需要更大的样本量来加以验证。Creely等[26]通过波长785nm的激光获取酵母菌的光谱，研究该波长的激光对酵母菌的损伤，发现酵母菌被785nm的激光捕获2h未出现细胞损伤，未在拉曼光谱中观察到蛋白质构型的改变，说明785nm的激光对酵母菌的光损伤很小。eriksson等[27]将光镊与微流控芯片相结合，研究酵母细胞氧化应激的信号路径。其中，绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFp)与信号路径中的蛋白相结合，可通过荧光显微镜观察细胞的反应。他们发现，转录因子Yap1p是在抵抗氧化应激中起主要作用的调节因子。当细胞受到氧化应激时，Yap1p-GFp进入细胞核，而在正常情况下，Yap1p-GFp应回到细胞胞质中。该实验组还以同样的方式研究了不同葡萄糖浓度下的Snf1路径。tao等[28]应用拉曼光镊技术探测粘红酵母细胞内的胡萝卜素、核酸及其他重要生物分子。他们发现，胡萝卜素和脂质的合成在对数期末才出现显著增加，在平台期之后总量达到最大；核酸在早期的合成增加，随着酵母菌生长逐渐平稳，核酸合成反而逐渐下降。这些实验说明拉曼光镊系统作为一种快速、便捷、可靠的方法，可以用于胡萝卜素合成过程的菌体内研究。一般来说，生物对激光的反应取决于激光的波长和强度。通过改变捕获激光的光学性质，可以实现不同的研究目的。就非损害的光学捕获而言，应该使用近红外激光。但是，由于不同的生物分子和细胞对激光的反应不同，光镊用于捕获微生物时，应该探索特定波长和强度的激光对该生物的影响。将拉曼光谱与光镊相结合，能够获得细胞内各组分和细胞外分子的详细信息，可用于鉴别不同微生物，检测其生活状态及生命过程。另外，荧光显微镜和特定荧光团的使用能够帮助检测到细胞内某些特定物质的生命活动。
感染性疾病
mohanty等[29]基于红细胞在光镊夹持下的旋转运动提出了疟疾的高效诊断方法。当健康红细胞与高渗缓冲液接触时，红细胞变为半月形并在光镊捕获下旋转，而疟疾感染的红细胞不旋转，受感染个体中健康的红细胞低速旋转。该特征可被用于筛查血样。通过该方法在30s内可分析完成20个红细胞。最近，Saraogi等[30]通过用光镊测量受到疟原虫感染的单个红细胞的布朗运动来研究红细胞物理性质的改变。光镊捕获力是该实验的一个重要参数，因为光镊捕获力与激光强度、被捕获对象的物理性质有关。测量布朗运动的功率谱是确定光镊捕获力的方法，该实验就采用测量功率谱的办法来确定光镊的捕获力，进而了解被捕获红细胞的物理性质。研究发现，正常红细胞与被感染红细胞的功率谱出现具有统计学意义的角频率不同。由于感染引起红细胞物理性质的改变，从而使角频率发生变化，但是角频率的变化与感染各个阶段的关系不大。实验中发现仅有不到10%的红细胞受到寄生虫感染，但是，从感染病人血液中提取的未受疟原虫侵染的细胞，角频率也存在明显的增加，这说明了旁观效应的存在。由于疟原虫可以引起血红细胞性质的变化，因此，通过光镊对受感染红细胞的运动、物理性质等数据进行测量，可为诊断疟疾提供帮助，有望成为疟疾的辅助诊断工具。目前，在口腔医学领域中应用光镊或者拉曼光镊技术进行的研究不多。梁裕芳等[31]应用拉曼光镊技术比较分析了口腔毛滴虫和阴道毛滴虫的拉曼吸收峰，并寻找具有分类学鉴别价值的特征拉曼峰。通过光镊随机俘获单个大小一致、有活力的虫体并记录其拉曼光谱，收集数据并做pCa分析。通过实验发现，不同来源的虫体在937cm－1、1002cm－1和1446cm－1谱峰的强度和谱型有差异，因此，根据1002cm－1谱峰的信号强度，并结合937cm－1和1002cm－1峰强度比值(i937/i1002)及1002cm－1和1446cm－1峰强度比值(i1002/i1446)，可以作为区分阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的量化指标。可见，拉曼光镊技术可以用于鉴别两种毛滴虫。
光镊和拉曼光镊技术应用于肿瘤疾病和抗癌药物的研究
肿瘤疾病
乳腺癌
由于癌细胞在生物分子构成上发生了显著变化，癌细胞的大小、物理性质等也会发生相应的改变。Guck等[32]使用以光镊为基础设计的“光担架”研究乳腺癌细胞，发现乳腺癌细胞比正常乳腺细胞更容易发生形变。更强的形变能力被认为与恶性肿瘤细胞需要形变后进入循环系统而发生远处转移有关。这一方法可以用于微流细胞筛选，并根据细胞膜变形能力进行诊断。
前列腺癌
由于前列腺特异性抗原检测的高假阳性率，临床上迫切要求提高诊断前列腺癌的准确性。由于拉曼光谱中包含了大量的化学物质结构信息，拉曼光镊被广泛应用于肿瘤细胞与正常细胞的鉴别。Harvey等[33]应用拉曼光镊技术结合pCa，区分前列腺癌细胞(pC-3)和膀胱细胞系(mGH-U1)，发现mGH-U1比pC-3含有更多的核酸和蛋白质。这项研究显示拉曼光谱包含大量化学物质的结构信息，例如，氨基化合物Ⅰ和氨基化合物Ⅱ的光谱带分别位于1650cm－1和1570cm－1，脂质的光谱带在1200cm－1至1400cm－1的区域内占优势，含苯丙氨酸的蛋白质在1002cm－1能被清楚地观察到，也有蛋白质在860cm－1的位置出现光谱带，在800cm－1以下区域的弱带一般代表核酸。Harvey等[34]还采用化学方法固定前列腺癌细胞、早期前列腺良性肥大细胞和尿道细胞，并应用拉曼光镊技术对这三种细胞进行鉴别。实验结果显示，敏感性大于72%，特异性大于90%。可见，该研究方法有可能应用于临床，通过简单的尿液检查对前列腺癌进行诊断。与活体组织检查相比，该方法对患者造成的痛苦少，但就其敏感性和特异性而言，仍无法取代活检。
结直肠癌
Zheng等[35]应用拉曼光镊技术获得了200个正常和200个癌变结直肠细胞的拉曼光谱，并使用ann和pCa对光谱进行分类。结果显示：80个光谱的单盲试验，敏感性和特异性均达到86.3%；双盲试验，敏感性达到85%，特异性达到92.5%。Chen等[36]制备了取自直结肠癌变组织的细胞悬液，用光镊捕获正常和癌变结直肠上皮细胞并获得其拉曼光谱，分析显示癌细胞包含更多的核酸和蛋白质。通过单盲试验，敏感性达到82.5%，特异性达到92.5%。Deng等[8]使用拉曼光镊技术对正常和癌变的直结肠细胞进行研究，发现正常直结肠细胞的光谱带强度比(1002/1300)为1.08，而癌变直结肠细胞的光谱带强度比为0.85。1002cm－1的光谱带代表蛋白质，1300cm－1的光谱带代表脂质，可见，正常的直结肠细胞比癌变的直结肠细胞含有更多的蛋白质和更少的脂质，因此通过选择合适的参数(如光谱带强度比)，可实现对细胞良、恶性的快速鉴别。
其他肿瘤
Banerjee和Zhang[37]应用拉曼光镊来区分星形胶质细胞和它的癌变细胞，与其他肿瘤的研究结果相似：癌变细胞的蛋白质和脂质的光谱带强度比星形胶质细胞的光谱带强度高，这项研究说明拉曼光镊有在较为复杂的领域中进行研究的潜力。姚辉璐等[38]利用拉曼光镊获得了鼻咽癌细胞株和正常人鼻咽部气道上皮细胞株的单细胞拉曼光谱，结果显示：正常细胞和癌细胞的平均拉曼光谱有显著差异，正常细胞的光谱强度比癌细胞明显要高，正常细胞的光谱带强度比(1304/1336)为1.05，癌细胞为1.22。证明拉曼光镊可以成为区别正常鼻咽细胞和鼻咽癌细胞的有效手段。该实验组[39]还应用相似的实验模型获得了正常肝细胞株和肝癌细胞株的单细胞拉曼光谱，得到了类似的结果：正常细胞和癌细胞的平均拉曼光谱存在显著差异；癌细胞谱线强度整体变弱；正常细胞1658cm－1处峰和1450cm－1处峰的强度比值为0.63，癌细胞为0.99；癌细胞的核酸、蛋白质、脂类等重要生物分子在结构或含量上都发生了不同的改变。用pCa方法对单个细胞的平均拉曼光谱进行分析，结果发现pCa可以正确区分出正常细胞和癌细胞。
抗癌药物
国外学者使用光镊研究Dna插入药物与Dna的结合方式和亲和性。过去的研究发现喹唑酮类药(pD153035)为新型酪氨酸激酶抑制剂，还发现pD153035可以直接插入Dna，说明这种多靶向定位药物具有很大的治疗人类恶性肿瘤的潜能。Cheng等[40]使用双光镊来确定pD153035的亲和性常数(Ka)和插入位点之间最小的碱基对数(n)。光镊系统与一个倒置的光学显微镜结合，包含两束激光，一束采用减反射镜来控制，作为固定势阱，另一束采用扫描镜来控制，作为扫描势阱。另外，用一个四象限光电二极管探测被捕获微珠的位置。为了构建Dna-微珠复合体，将噬菌体Dna片段的生物素酰化末端与t4Dna连接酶捆绑，末端附着于抗生蛋白链霉素包裹的平均直径为1.87μm的微珠上。实验结果表明，Dna在1mmol/L的甲次砷酸钠液中明显增长，在(23±0.5)℃的环境温度下，Ka=(1.18±0.09)×104mol－1L，npD153035=11bp。在测量Dna分子力的实验中，直接进行Dna的操作并不方便，通常需要将Dna链的一端与微珠相连，以便于对Dna的操控。
光镊和拉曼光镊技术应用于亚细胞结构的研究
除了细胞水平的研究，拉曼光镊也可应用于对亚细胞结构(如染色体、线粒体、Dna、Rna等)进行研究。ojeda等[41]采用拉曼光镊技术，捕获操控染色体并获得即时光谱，成功鉴别了三个不同的染色体。他们使用光镊分离三个不同的染色体，获得拉曼光谱并进行GDa分析，再用光镊将染色体放置于载玻片上，通过G带染色来验证光谱的检测结果。实验结果表明能够根据拉曼光谱区分这三个染色体，从而证实了使用拉曼光镊技术无需染色就能够鉴定人类染色体。Reiner等[42]使用光镊技术从溶解的人HL-60细胞中成功提取出单个线粒体并完成线粒体Dna异序性的检测。用线粒体绿色荧光染料(mitotrakerGreenFm)对线粒体染色标记，利用紫外光使细胞溶解，用荧光辨认单个线粒体，再用红外激光捕获线粒体并将其移动到微小的吸液管尖端，线粒体被吸入缓冲液，为分析线粒体Dna(mtDna)做准备。使用pCR技术3次Dna扩增后，通过基因测序的方法发现单个线粒体中mtDna的异序性比率约为50%。该研究说明，荧光显微镜及荧光染料的发展为光镊对细胞中某些特定物质的研究打下了基础。tang等[43]应用拉曼光镊技术研究从大鼠的肝脏、心肌和肾脏组织中提取出来的线粒体。首先记录脂质、蛋白质、核酸的拉曼谱峰，再通过拉曼光镊获得各组织中提取出来的线粒体的拉曼光谱，发现从不同组织中提取的线粒体的差异是由于各组织中线粒体组分的不同造成的，例如，肝脏线粒体和心肌线粒体的光谱差异源于脂质的结构和蛋白质的分子量不同。tang等还发现，当线粒体与含100μmol/LCa2+的KCl缓冲液接触时，1602cm－1的拉曼谱峰强度下降。这项研究说明拉曼光镊技术可以研究单个线粒体的生命活动及其与药物、毒素接触时的组分变化情况。
光镊和拉曼光镊技术应用于生物学基础研究
在一些研究中，需要以可控的方式去除某些细胞成分而又不损伤其他细胞组分。此时，可以采用脉冲紫外激光或者近红外激光作为光刀攻击细胞器，使其不可逆地失去功能。paterson等[11]使用紫外光二极管为光源，以相对较低强度的光切细胞膜，向仓鼠卵细胞中引入外源Dna。Stevenson等[44]使用钛宝石激光，以同样的实验模型研究细胞的转染率和生存力，研究显示光手术非线性地依赖于光强度，作用于细胞膜上的激光强度为1.2μJ/cm2时，细胞转染率为50%。光刀也可应用于研究细胞不同部分的功能。Grigaravicius等[45]将光刀应用于老化研究。Dna的自我修复作用在维持胞内生化反应中起着至关重要的作用，为了更多地研究Dna修复分子与Dna损伤位点之间的动力学，在时间和空间上有控制地敲除特定Dna很重要，光刀提供了卓越的空间和时间控制，因而成为该实验的理想工具。将光刀与荧光显微镜结合，他们发现，对Dna轻度损伤的修复发生在实际发生Dna损伤位点的旁边而并不直接位于该位点上，其原因需要进一步的研究。另外，紫外激光也可在细胞膜上钻孔，以观察荧光染料在细胞内的扩散，该技术被应用于研究细胞内区室之间的连接情况[46,47]。将紫外光导向相邻两个细胞的邻接点可引起两个细胞的融合，He等[48]应用这种方法，使用1550nm的飞秒脉冲激光将人肝癌细胞与人子宫颈癌细胞融合，细胞融合率为37%。多光镊的出现实现了多个粒子的同时操作，而使激光穿过空间光调制器(SLm-spatiallightmodulator)可得到需要的光结构。随着成像技术和计算机的发展，实现了全息计算直接与SLm连接，最终建立起全息光镊系统。monnoret等[49]将设计的储液池与全息光镊结合，引导多个橡胶微珠与cos-7细胞的特定区域结合，这项研究作为使包裹配合基的橡胶微珠与细胞膜密切结合的基础，可应用于细胞膜受体的动力学研究。此外，光镊在组织工程学研究中有巨大的应用潜力，mirsaidov等[50]通过将微流控系统与分时光镊结合，成功构建了人工合成组织。其中，微流控系统将细胞导入组织装配区；分时光镊用于将细胞组装成为复杂的培养组织，之后，这些细胞被包裹在模拟细胞外基质的可光聚合水凝胶中。通过上述过程的反复操作，该人工合成组织的体积逐渐增大。
细胞与分子生物学技术篇3
1生物分析原理
将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放入样品管，在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品在喷嘴附近组成一个圆柱流束自喷嘴的圆形孔喷出，于水平方向的激光束垂直相交，相交点成为测量区。染色的细胞经激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被呈90℃角方向放置的光电倍增管荧光检测器和向前角放置的光电二级管散射光检测器接收，经转换器转换或电子信号后，经模/数转换输入计算机，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小活性，核酸含量，酶和抗原的性质学物理和生化指标。
2细胞分选原理
在压电晶体上加上频率为30kH2的信号，使之产生同频率的机械振动，流动室也就随之振动，于是通过测量区的液柱断裂成一连串均匀的液滴。由于各类细胞的特性信息在细胞形成或液滴以前在测量区已被测定，并储存在计算机中，因此当某类细胞特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以标定的电荷，而不符合分选条件含细胞悬液滴及不含细胞的空白液滴不被充以特定电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转和向右偏转。落入指定的搜集器内，不带电的液滴不发生偏转，垂直落入废液槽中被排出，从而达到细胞分类，收集的目的。
3主要性能指标
荧光测量的灵敏度：流式细胞技术均可检测到
分辨率：分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV表示，流式细胞仪最佳状态CV
流式细胞仪的分选速度为：3000个/s～6000个/s。大型仪器可达每秒几万个细胞。
4流式细胞技术的临床应用与分析
流式细胞仪是今年来发展起来的现代细胞学分析技术中的常用仪器。它具备快速，准确量，化学特性。目前已广泛应用于免疫学，细胞生物学，血液学，肿瘤学，病理学，遗传学，临床经验学多领域。
4.1FCm在免疫学中的应用
流式细胞术是在细胞分析和分选的基础上发展起来的一种新的细胞参数计量技术。它以其快速灵活和定量的特点，广泛应用于免疫学理论研究和临床实践：有现代免疫技术基石之一之称。尤其同单克隆抗体的结合应用，在淋巴细胞及其亚群分析，淋巴细胞功能分析，免疫分型，分选，肿瘤细胞的免疫检测，机体免疫状态的监测，免疫细胞系统发生及特性研究等方面都起着相对重要作用。
4.2在血液学中的应用
血液病多为肿瘤性，免疫性和遗传性疾病，恶性血液病约占总数的一半以上，流式细胞仪（FCm）在血液病及淋巴瘤的发病机制，诊断治疗和预后判断学方面都具有重要价值。
白血病患者的异常细胞在分化过程中受外因，内因或突变等因素的影响曾克隆性异常增殖。白血病的免疫分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。FCm结合单克隆抗体的应用对白血病经行免疫分型。可以提高白血病分型诊断的符合率。可为指导治疗和判断预防提供帮助。
4.3流式细胞技术在细胞生物学中的应用
流式细胞技术在细胞生物领域内的应用，是流式细胞仪在基础研究中应用范围最广的领域。目前细胞生物学研究中，应用最频繁也是最普通的是细胞周期分析，包括细胞周期个时期的百分比和细胞周期动力学参数的测定内容。在方法学上除一般的化学染色方法外还有抗溴脱氧脲嘧啶核苷单克隆抗体技术，对同一细胞的参数测定技术则导致了对细胞周期的一些新发现，典型的方法是吖啶橙双染技术，这个技术不仅可以进行细胞周期分析，而且给细胞周期的研究带来了一些新的概念。流式细胞测量术和分选术在染色体，，和精细胞的研究及遗传学，分子遗传学也都有用武之地。
4.4流式细胞术在肿瘤学中的应用
流式细胞仪在肿瘤学研究方面已成为重要手段之一。近年来引起肿瘤研究者的极大关注。对于制定近年来荧光细胞化学技术的发展以及荧光探针标记单克隆抗体为流式细胞技术研究各种肿瘤抗原，肿瘤蛋白，致癌基因开辟了新途径，极大地提高了肿瘤研究水平，并为流式细胞技术在肿瘤学研究中开辟了更广阔的应用前景。
4.5流式细胞技术在aiDS病检测在的分析
流式细胞术用aiDS病免疫功能的检测的重要手段，采用参数荧光标记计数可对t淋巴细胞及亚群经行分析并通过动态监测t细胞亚群可以对HiV感染者或aiDS发病都进行区别。仅为HiV携带者，病毒未复制时，其th细胞下降不明显。当发展为aiDS时th细胞水平明显下降，如th1细胞＜th2细胞时，HiV在细胞间的传播和感染更敏感，易发生aiDS。同时，当HiV阳性而无症状的患者，其tc对tc激活剂不反应者，其体内CD+4th细胞水平下降迅速。条件致病微生物感染率也同时增加，对tc激活剂反应敏感者，可维持CD+4th细胞水平降低较慢或不降低，减少发生aiDS的几率。
4.6流式细胞仪对自身免疫性疾病相关HLa抗原的分析
有些疾病的发病常与一些类型的HLa抗原检出有关，在这些疾病中，某些HLa抗原检出率比正常人群检出率高，最典型疾病是强直性脊柱炎，其外用HLa-B27表达及表达程度与疾病的发生有很高的相关性，利用FCm可以进行HLa-B27/HLa-B7双标记抗体检测HLa-B27阳性细胞，同时又排除交叉反应。通58%～97%的强直性脊柱炎患者可检出这种抗原，而正常人仅为2%～7%检出这种抗原。FCm检测HLa-B27快速，特异，敏感，为强直性脊柱炎的临床诊断提供了有力帮助。
总之，流式细胞技术在血液学，肿瘤，细胞生物学和自身免疫性疾病临床诊断治疗中具有广泛的应用价值。
细胞与分子生物学技术篇4
颅面部发育是包含了多个不同发育来源的干细胞相互作用的复杂过程。牙齿包含至少2个胚层来源的组织，外胚层来源的口腔上皮形成牙釉质，中胚层形成牙齿其余结构，如牙髓、牙本质和牙骨质。而颅面部其他骨组织（如颅骨的扁骨）则主要来源于间充质前体细胞、中胚层前体细胞及细胞基质。牙齿组织发生始于胚胎发育第5周，并持续整个乳牙替换期。胚胎5周后，原始口腔上皮带形成并在未来牙板上下颌部增厚。上皮带内陷形成前庭板和牙板。成釉器的形成始于牙板下方并经历了牙齿发育3个阶段：蕾状期、帽状期、钟状期。在蕾状期，上皮细胞迁移至外胚间充质下方，外胚间充质细胞排列更加紧密包绕牙蕾。接着，在帽状期牙蕾细胞进一步增殖形成帽状结构。上皮细胞形成成釉器，外胚间充质细胞在成釉器下方增殖形成牙。包绕牙的地方形成牙囊。钟状期，成釉器内表面进一步加深，细胞开始分化。牙内皮细胞与牙通过基膜相互作用。牙内皮细胞与牙细胞停止增殖，细胞核迁移至基膜对侧，细胞伸长。牙内皮细胞成为牙釉质前体细胞并释放信号，牙成为成牙本质细胞。成牙本质细胞不断分泌有机基质，即前期牙本质，成牙本质细胞渗出突起，胞体向牙髓中央移动。成牙本质细胞分泌羟基磷灰石及矿物质，前期牙本质成为牙本质。牙釉质前体细胞形成牙釉质，成为成釉细胞。牙根的发育与牙冠不同。内釉上皮与外釉上皮细胞层从颈环开始向下方生长形成牙根赫威特上皮根鞘。赫威特上皮根鞘诱导牙分化为成牙本质细胞形成根部牙本质。成牙骨质细胞、牙周膜纤维细胞及牙槽骨成骨细胞这3种细胞对牙齿在牙槽窝中起到支持、平衡作用，并都来自牙，统称为牙周组织。牙周膜的干细胞和前体细胞具有多种自我更新及分化潜能。
2种子细胞在牙髓再生中的策略
2.1利用干细胞进行牙髓再生
利用干细胞进行牙髓再生的定义是将外源性干细胞植入宿主根管系统中进行牙髓再生。被移植的细胞或来源于宿主体内或来源于异体细胞。这些细胞经过简单分离或通过培养扩增后用于牙髓再生。由于干细胞能够对微环境变化做出反应，进行细胞分化及细胞分裂，因此干细胞治疗能够有效地修复组织缺损。有许多研究表明，体内移植牙髓干细胞或其他种类干细胞可以在异位形成牙髓样组织。Huang等的研究报道了将根尖牙干细胞或牙髓干细胞植入牙根并埋入小鼠背部，可以观察到牙髓样组织形成及牙本质的沉积。Cordeiro等报道了人脱落乳牙干细胞复合凝胶植入牙片后埋入小鼠背部皮下，可以观察到血管化牙髓样组织形成。细胞移植有许多优点，如可控制移植的细胞数量及优化最适宜牙髓再生的干细胞亚群。经分选的细胞具有更强能力，促使在根管中形成神经、血管及牙本质。iohara等报道牙髓细胞中CD31-/CD146-或CD105+细胞亚群，比其他前体细胞具有更高自我更新能力及分化潜能。一些非牙源性间充质干细胞，如骨髓间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞也能形成牙髓样组织。尽管获得这些细胞会给患者造成创伤，但当牙源性间充质干细胞无法获取时，这些细胞可成为替代的候选细胞。关于干细胞移植进行牙髓再生的研究报道，主要集中于不同种类的干细胞复合支架材料，体内移植后进行原位或异位牙髓样组织再生观察的基础性工作。真正进入牙髓组织再生临床前或临床试验的研究报道较少。尽管这些基础研究工作具有科学意义，但在细胞移植技术在向临床治疗的转化过程中仍然遇到很多问题。首先，用于治疗的干细胞来源问题。如果使用的是源于非人种属的干细胞，将会由于免疫排斥的问题受到限制。具有免疫原性的细胞移植可能会引起免疫排斥及感染。细胞冷冻储存系统可能出现细胞流失，并增加额外花费。而传统组织工程技术中的种子细胞来源、培养技术、对支架的复合程度、植入体内后潜在的免疫原性、细胞活性等因素都限制了该技术的实际临床应用。
2.2无细胞移植的牙髓再生治疗
牙髓再生的临床转化，不仅要满足安全、有效两个基本条件，还应考虑到简便、实用和经济的原则。哈佛大学干细胞与再生生物学研究中心的研究发现，在多种组织再生过程中都存在体内干细胞的迁移和募集现象，称为干细胞归巢（stemcellshoming）。这些募集的机体自身干细胞都不同程度地参与了创伤愈合和组织再生的过程。现已证实，机体干细胞归巢可以通过2种完全不同的途径来实现：一种是非血流依赖性的运动，主要是近距离的细胞募集，例如缺损组织相邻干细胞龛中的干细胞可以感应损伤产生的信号分子，通过主动的变形虫样运动，到达组织缺损区域，发挥再生作用；另一种是血流依赖性迁徙，主要是远程机体干细胞龛（例如骨髓）中干细胞的动员和归巢，包括细胞感受信号刺激，动员机体干细胞龛中干细胞入血，随血流（bloodflow）远程迁徙，最后到达损伤区域局部毛细血管，穿透血管壁，参与组织修复过程。由于减少了潜在的污染、过高的成本、免疫排斥以及复杂的体外规模培养技术等缺点,利用细胞因子和趋化因子等实现细胞归巢,可放大宿主自我修复潜能,因此细胞归巢技术似乎比细胞移植具备更多的优势。现在已经证实干细胞巢/巢存在于体内很多成体组织或器官中,包括脑、骨髓、外周血、血管、骨骼肌肉、皮肤、牙齿、心脏、肠、肝、卵巢上皮和等。尽管干细胞归巢的生物机制尚未完全阐明，但归巢的干细胞参与组织修复再生的现象已经引起了学者的高度关注，并在动物研究中得到证实。Kim等学者通过细胞归巢技术观察到牙髓样组织的异位再生。他们通过对临床拔除的人离体牙进行根管预备，包括牙髓拔除及机械预备，通过高温灭菌去除牙齿中的生物活性及有机成分，采用生长因子复合胶原支架植入离体牙内，经过3~6周大鼠皮下体内移植，可以观察到全长根管内形成牙髓血管、牙本质及神经复合物。该研究首次描述了通过内源性细胞归巢技术进行牙髓再生。他们选用一些生长因子如成纤维细胞生长因子，血管内皮细胞生长因子，神经生长因子（nGF）以及骨形态发生蛋白-7（,Bmp-7）用于牙髓再生。细胞归巢的含义来源于骨髓移植后，造血干细胞（HSC）在体内的迁移，从骨髓到外周最终到达干细胞龛内。细胞归巢技术的最大优势在于能够利用宿主体内的细胞进行组织再生，从而避免外源性细胞处理过程。
3生物支架材料在牙髓再生中的应用
不论是细胞移植还是自体细胞归巢进行牙髓组织再生，生物支架材料的选择都是非常重要的考虑因素。使用能维持干细胞生存以及血管神经再生的支架材料，使组织工程牙髓进入临床应用变得更为现实。牙髓组织再生的支架材料应该具有如下特征：有合适的空隙率，便于植入干细胞或前体细胞及生长因子传递营养物质；具有可控的生物降解性，植入机体内的支架材料可被自体组织取代；优良的生物机械性，可供软硬组织附着的良好的生物活性；良好的生物相容性，无免疫排斥。目前牙髓组织再生的研究多集中于异位再生。天然多聚材料因含有天然的细胞外基质成分而具有良好的生物相容性及生物降解性。Zhang等使用胶原海绵、多孔陶瓷及纤维状钛网复合牙髓干细胞进行研究，4周后可以观察到牙本质涎蛋白的表达，裸鼠皮下植入细胞支架材料6~8周后，可以看到支架材料表面有牙本质涎蛋白的表达及结缔组织再生，而陶瓷组织则有钙化组织形成。聚乳酸（pLa）、聚羟基乙酸(pGa)和二者共聚物，是目前组织工程领域应用最广泛的材料之一。el-Backly等将从兔牙牙髓中提取的DpSC复合于pLGa上，并植入家兔皮下，12d后观察到牙骨质及管状牙本质的形成。Huang等将人SCap及DpSC分别与pLGa复合并接种于长约6～7mm，孔径约2.5mm的牙本质管中，一端使用三氧矿物聚合物封闭1mm后植入裸鼠皮下，3月后观察发现，在管腔内充满有血管化的牙髓样组织;在牙本质管内壁上有连续的牙本质样物质沉积。这些材料的生物相容性好，降解速率可控，具有良好可塑性，能满足不同复合方法和置入条件的需要。胶原是一种天然的蛋白质，可从动物的皮肤、骨骼、韧带等组织中提取，因其优越的生物相容性、生物可降解和弱抗原性而被广泛应用于组织工程支架材料。prescott等将DpSC联合牙基质蛋白(dentinmatrixprotein1，Dmp1)与胶原支架复合后，接种于牙本质片上并植入裸鼠皮下，6周后观测到了牙髓样组织生成。通过细胞归巢技术，胶原凝胶溶液复合多种生长因子（如pDGF,FGF,VeGF等）可以观察到牙髓组织异位再生。
4生长因子在牙髓再生中的考虑
牙髓干细胞在牙髓组织中的增殖、分化、生存及活力受到多种信号分子、受体及转录因素的调控。不论采用干细胞移植技术还是基于细胞归巢技术进行牙髓再生研究，生长因子对牙髓细胞的作用均不可忽视。不同的信号通路参与调控牙髓再生的全过程，由多条信号通路交织成的调节网络在牙髓再生过程中发挥着必不可少的作用。牙髓细胞表达多种不同的生长因子，这些生长因子协同在病理生理条件下调节牙髓的血管形成及牙本质形成。血小板衍生生长因子（pDGF）是由血小板释放的生长因子，在血管形成及细胞增殖过程中发挥作用。有研究表明，pDGF能促进人牙髓组织中成纤维细胞增殖，并增强成骨细胞中VeGF表达并促进牙髓损伤部位血管形成。体内研究中，将根管处理后的人牙埋入大鼠背部，可以观察到pDGF能促进牙髓牙本质样组织形成。Bmp2与VeGF是牙髓牙本质复合体中发现的生长因子，参与牙髓愈合反应过程。最近的研究表明VeGF与Bmp2以剂量依赖方式相互作用，并在牙髓血管形成中发挥作用。转化生长因子在牙齿及牙本质发育过程中发挥作用。研究表明，tGF-β1能刺激Ⅰ型胶原合成，增强碱性磷酸酶活性，促进牙髓细胞增殖。melin等学者研究表明tGF-β1参与调节牙髓组织的细胞增殖、迁移、细胞外基质形成过程。tGF-β1对根尖牙来源及其他类型的细胞均有趋化作用。在细胞招募阶段，tGF-β1这种趋化性可以吸引更多的干细胞或前体细胞至牙齿受损部位。
5结语
细胞与分子生物学技术篇5
过去――200多万到60多亿，高新企业创业史上的奇迹
冠昊生物的创立，来源于几个旅美华人学者想利用自己在美掌握的处理动物组织的新技术来发展我们中国人的高端医用产业的愿望。他们试图开发一类以动物组织为原料的天然生物材料，制成一系列生物型人工器官，如人工血管、人工韧带、人工食管、寿命更长的生物（心脏）瓣膜等等，并使之产业化。
动物组织是与人体组织在组成和结构上最相似的材料，都以胶原蛋白为基质组成，相应器官及组织的结构如胶原纤维的排列、层次等都高度相似。理论上说，动物组织是人工器官的最理想材料。各国生物材料研究者都在致力于开发以动物组织为原料的生物材料，用于制造人工器官及植入替代体。然而，由于动物组织有三大缺陷，一直没有取得重大突破。
缺陷一：稳定性差，易生物降解。
传统上，动物组织参照尸体的甲醛（福尔马林）保存法，用戊二醛交联胶原来稳定，通称固定。戊二醛虽比甲醛毒性小，仍具有相当毒性，用戊二醛固定的动物组织，植入体内会随着生物降解而释放出有毒性的戊二醛，毒害周围组织，这种长期残留的毒性造成动物组织难以在人体上应用。
当时，冠昊创办人发明了一种新的固定技术，并获得美国专利授权。这种技术可以使稳定性增加并可调控，固定产物降解时不会释放出有毒物质，生物相容性更好。几位创办人就是想凭这一技术打天下。
然而，动物组织还有其他两大缺陷：
缺陷二：作为异种组织，植入人体后会引起强烈的免疫排斥反应。
国内外一直以来都没有行之有效的办法来解决。曾有人试图用抑制人体免疫功能的办法来强迫人体接受这一异物，但收效甚微。
缺陷三：动物组织易发生不可逆变性，难用经典灭菌法灭菌。
无论是γ―射线辐照灭菌，还是高压加热灭菌，都使其发生不可逆变性，力学性能降低，大大影响其应用。
只靠一个固定技术，难以克服动物组织的固有缺陷；回国创业，“水土不服”，对国内情况尤其是医疗器械产业化的路径不熟悉；国有制风投、创投融资更偏向于搞稳健投资，不愿做冠昊生物这样风险较大的公司，使得几个创业者，一时难以融到资金。
出于无奈，公司的几位创办人只好通过朋友熟人来融资。资金有限加上技术不足，让冠昊生物近四年未能做出合格产品。只有投入，没有产出，有限的资金用完后，多数投资者不愿再注资，为避免负债扩大，经全体股东同意，公司宣告结业。到了结业遣散时，公司只剩下董事长朱卫平和一个职员，一个司机和两个技工共5人处理余下的事务。就是在这种情况下，朱卫平邀约徐国风来他的公司参观。
徐国风教授是中国生物材料领域的领军人物，中国生物医学工程学会的学术带头人及技术专家。早年曾在暨南大学创建国内第一所以生物材料为研究方向的生物医学工程研究所，成为当时全国生物材料学术交流的中心；参与创建了中国生物医学工程学会生物材料分会，担任分会的第一、二、三届秘书长长达12年；还和顾汉卿教授共同主编了国内第一本生物材料专著《生物医学材料学》，在生物材料的分子设计和再生医学工程制品研发方面皆拥有很深的造诣，拥有数十项中外专利；同时也是国内外最早倡导再生医学工程研究，倡导用生物模板原位诱导再生的学者之一。
一直以来，朱卫平都不相信天然生物材料这一很有前景的产业会这样夭折，认识徐国风后，心中那濒于熄灭的火焰，重新燃起了希望。带徐国风参观濒临结业的公司后，朱卫平问他是否有兴趣和信心将这奄奄一息的公司重新搞起来。徐国风答：“有！”
朱卫平当时说的话让徐国风记忆尤深：“徐教授，我给你50%股份，我们共同搞好这家公司，你不是为我打工，你是为自己打工。”
徐国风心里十分感动！他还是第一次遇到愿意分一半股权给自己的老板。知道朱卫平为企业付出的心血，徐提出朱55%，自己45%。
朱卫平就问：“徐教授，你认为你的技术值多少钱？”
“起码一百万以上吧。”徐不假思索脱口而出，说后暗暗后悔，觉得说少了。
朱卫平马上说：“好！你的技术值100万，占45%，那我出115万现金，占55%。”
就这样，朱卫平和徐国风从115万现金开始，重新把企业运作起来。显然，115万元是不够的，尤其当研发进入临床试验之后，需要投入更多，后来朱再投入100多万元，两人股份比例变为60%：40%。
重组后的研发进展很顺利。2003年重组，2005年，冠昊生物便拿到首个产品的试产证。有产品开始销售之后，很快融到了资金，新的资金注入让两人如虎添翼。这样，冠昊由200多万起步，经8年艰苦创业，至2011年在深圳的创业板上市，市值达40个亿，增值1600倍，创下高新企业创业史上的奇迹，现在市值已经超过60亿。
现在――以先进技术制胜，与进口产品争夺市场，创奇迹
多数情况下，国产产品与进口产品竞争，靠的是价格便宜。然而，冠昊生物的产品靠的是技术，不是低价。冠昊产品售价与进口产品相当，甚至某些规格比进口产品还贵，产品市场占有率却达40%以上，在国内外众多品牌竞争下，国内市场占有率第一。
徐国风谈到，在产品的市场开拓过程中，冠昊曾遇到过不少困难。由于产品属创新产品，许多大医院不相信这家小企业能够研发出。曾有医院对冠昊的销售人员说，“你回去吧，我们不会用你们产品的，我们手术刀、剪刀都是用进口的，何况你这类国产的产品！”许多医院都要经过冠昊反复讲解产品的技术特点，并经过多次免费使用，才认识到产品的优良品质。
然而，正所谓“真金不怕红炉火”，经过了两三年的耐心推广，冠昊生物的产品已逐步取代了进口产品，成为国内市场占有率第一的产品。
冠昊生物的优势之一，是拥有自主知识产权的核心技术。针对动物组织固有的缺陷，冠昊生物创建了四大核心技术，把动物组织变成可诱导人体组织或器官进行再生性修复的新型生物材料，并环绕这四大核心技术及其开发的产品，申请了103份中外专利，已获得授权的有90项，其中美国专利11项，加拿大6项，欧盟6项，日本6项，澳洲8项，俄罗斯8项，英、法、德各1项，中国42项。
这四大核心技术分别是：
①环氧固定技术。
用于固定动物组织，比传统的戊二醛固定法优越许多，无残留毒性，生物相容性好，稳定性可在较宽范围内调控，易于做到使降解速度与组织生长速度基本同步，有利于再生性修复。
②多方位去免疫原性（又称去抗原性）技术。
近年发展起来的免疫分子生物学及免疫化学发现，引起免疫排异反应的不是胶原蛋白整个大分子，而是分子中某些处于特殊能量位置的基团，这些基团数量不多，但有较高的能量，易被机体的免疫机制所识别，易引起免疫应答，称为抗原决定簇或抗原表位。冠昊生物设计了从多方面封闭抗原表位的方法，有效去除有关基团的免疫原性（即抗原性），将动物组织的生物相容性提升到一个新台阶。
③胶原蛋白分子的力学改性技术。
应用分子设计原理，冠昊生物通过适当交联及接枝的方法对胶原分子进行改性，提高其力学强度，以补偿因生化处理及灭菌处理所引起的力学损失，使生化处理及灭菌的自由度更大。
④富集生长因子及干细胞促进组织或器官再生性修复技术，也称诱导再生技术。
冠昊生物应用偶联剂引入能凝聚生长因子和干细胞的组份，使之能征集生长因子及干细胞，原位诱导组织或器官的再生。
依靠这四项核心技术，冠昊生物克服了动物组织的固有缺陷，开发出一大类生物相容性优异的天然生物材料，用于替代人体病变切除或外伤造成缺损的组织或器官，可诱导对有关组织或器官的再生性修复，这在无论国内国外都属于重大创新。
徐国风说：“我们原本只想开发一种以动物组织为原料，生物相容性更高的天然生物材料，用于制造组织或器官的替代体。然而在动物实验中发现，经过我们核心技术处理的动物组织材料，能在植入原位诱导组织或器官再生。我们分别诱导了兔和狗的硬脑膜再生；羊的前叉韧带再生；狗的胸段8cm食管的再生；最近还诱导了兔和狗的角膜（板层）再生。我们的生物型硬脑（脊）膜补片在临床应用了之后，不少神经外科的医生在二次开颅手术修补颅骨时，都观察到产品诱导出人的硬脑膜再生，他们都纷纷向我反馈，打开颅腔后发现原来的补片不见了，长出了一个完整的硬脑膜出来。有些医生还专门拍了照片发给我。事实上，我们应用自己创建的有自主知识产权的核心技术，以动物组织为原料开发除了一大类能在原位诱导组织或器官再生的新型生物材料，我们称之为再生医学材料。”
冠昊生物自主研发的再生医学材料及再生型医用植入器械产品技术指标均达到国际先进水平，填补了国内外产品的空白。目前，冠昊只有三个产品在销售。分别是生物型硬脑脊膜补片（脑膜建）、生物型胸普外科修补膜（胸膜建）、生物型无菌护创膜（得膜建）。而生物型组织补片、骨诱导型可降解吸收生物活性骨修复材料及其制品、微整形用耐吸收透明质酸交联凝胶、诱导再生型人工角膜、椎间融合器、疝补片等高新产品也正在研发。
未来――致力于发展再生医学产业链和产业群
徐国风描绘冠昊的未来是以已有的再生医学材料及制品为中心向周边发展相关产业，如关节软骨aCi技术治疗产业；角膜损伤的再生性修复产业；免疫细胞保存和治疗产业；再生医学院抗衰老产业；再生医学美肤嫩肤产业等等，最终形成再生医学产业群。
向周边扩展的第一步，就是干细胞、前体细胞、免疫细胞技术应用的产业化。
2013年，冠昊生物引进了aCi技术，应用膝关节软骨病变患者的自体软骨前体细胞与公司本身的再生医学材料结合（俗称“细胞+支架”），经过扩增培养后，再植入切除病变软骨的部位，使其在原位诱导再生性修复。
为此，在冠昊的研发大楼建立了符合国际标准的，通过Gmp体系认证的细胞及干细胞培养室。并与有关医院合作建立了“前店后厂”的运作模式，开展了这一新医疗技术治疗。由医院收治患者，用关节镜微创手术切除病变软骨，同时取少量健康软骨组织，交由冠昊的细胞专家提取前体软骨细胞，在再生医学材料支架上进行扩增培养，再送回医院植入切除部位，在原位诱导再生性修复。目前已完成多例临床，效果良好。
通过多年的工艺优化筛选，冠昊已制出生物相容性高，可诱导角膜再生的人工角膜样品，并在兔和狗的角膜板层移植中诱导再生长出新的角膜板层。已送型式检验，准备进入临床试验。
自体免疫细胞经扩增后用于治疗癌症，疗效已获业界认可，还有理论认为，青壮年时期将免疫细胞保存下来，到了年长体衰时再注回身体，可增强身体免疫功能，令人精神焕发，仿佛回复到青壮年时的体魄，这被称为免疫细胞抗衰老。冠昊生物也引进了免疫细胞保存技术，结合自身研发的细胞扩增技术，用于癌症及抗衰老治疗。
徐国风坚信，这将会是一大突破，发展前景无限。他还特别提到ipS技术极有可能最先应用于皮肤，让皮肤细胞返老还童，让皮肤组织青春常驻。
将成体细胞（如上皮细胞）诱导其重编程，使其转化为近似于胚胎细胞的多潜能干细胞的ipS技术被认为是细胞层面的“返老还童”，是干细胞研究的最新成果。
2013年7月18日，国际学术权威杂志Science杂志刊登了北京大学生命科学学院邓宏魁教授和赵扬博士带领的研究团队在生命科学领域的一项革命性的研究成果――用小分子化合物诱导体细胞重编程为多潜能干细胞。这一发现引起学界的轰动。
依靠敏锐的触觉，冠昊生物马上与邓教授联系支持其研究，并与北大签订合作协议，组建北大――冠昊干细胞与再生医学研究院，开展技术研究和应用研究，成果的产业化由冠昊公司独家实施。
诱导成体细胞“返老还童”，最先是使用基因诱导，后来发现可以使用小分子多肽，而邓宏魁更进一步的发现只需要小分子化合物便可，重编程的应用前景可谓十分光明。
抢占先机与邓宏魁合作是朱卫平和徐国风引以为豪的一步，也是冠昊生物未来战略的重要一步。徐国风预测，该成果将首先应用于皮肤细胞，让部分皮肤细胞重编程为多能干细胞，再诱导分化为皮肤干细胞和皮肤各细胞的前体细胞（即年青的皮肤细胞）。
如果将这一技术运用到每天都用的美容化妆品上，就等于每天都能将一部分成年的，甚至即将进入老年的皮肤细胞“返老还童”为年青的、甚至是孩童时期的皮肤细胞，使皮肤、容貌青春常驻。引用水果保鲜的概念，又有学者称之为“皮肤保鲜”。
尽管目前这种诱导重编程的方法有着转化率不高的缺点，只有万分之几，甚至十万分之几，但对于皮肤保鲜来说已经足够。皮肤的衰老并非猝然，而是今天有万分之几，明天有万分之几的日积月累，缓慢老化。因此，只需要每天有万分之几的皮肤细胞“返老还童”，就足以减缓甚至对消这一老化过程，令人容貌青春常驻。
徐国风说要实现皮肤的“返老还童”，还需要解决许多实际的问题。例如，如何使诱导小分子能被皮肤所吸收，并进入与皮肤细胞发生作用的微空间，如何诱导多能干细胞分化成皮肤干细胞及皮肤各细胞的前体细胞等等。
对此，徐国风自信能与邓宏魁教授的团队一起研究解决有关应用的技术问题，并正计划兼并一家基础较好的化妆品公司，作为实施干细胞与再生医学嫩肤美肤的平台。
冠昊公司能否在不久的将来，开创出干细胞与再生医学美容新时代？徐朱这两人能否再创造出新的奇迹？和邓宏魁能否获得诺贝尔奖一样，都是令人着迷的问题。
细胞与分子生物学技术篇6
【关键词】治疗性克隆；细胞核;移植；胚胎干细胞
1治疗性克隆概述
治疗性克隆（therapeuticcloning）是体细胞核移植技术和最新的人胚胎干细胞技术结合的产物，将成为人类医疗历史上革命性的技术.该技术首先应用患者体细胞，如皮肤细胞、骨髓间充质干细胞，作为核供体，移植入去核的人卵母细胞，获得克隆胚胎；然后从克隆胚胎分离建立胚胎干细胞系；并将这些胚胎干细胞在一定条件下，诱导分化成所需要的各种类型的细胞用于治疗目的［1，2］.目前已报道，将产生多巴胺的神经元细胞用于治疗帕金森症［3］，将产生胰岛素的胰岛细胞治疗糖尿病患者［4］.从理论上来说由于使用的是患者自身的细胞生产出来的治疗用细胞，移植这些细胞到患者体内将不会产生免疫排斥反应.另一方面，每年都有数以百万计的患者需要细胞、组织的修复或者器官移植，由于胚胎干细胞可以无限传代，在数量上可以保证治疗的需要，从而解决可供移植的细胞、组织和器官来源严重不足的瓶颈问题［5］，为人类健康和长寿提供了新的希望.
近年来，利用核移植技术和胚胎干细胞技术相继建立了人核移植胚胎干（nucleartransferembryonicstemcell，nteS）细胞系和人兔异种间nteS细胞.这2项阶段性研究成果的取得，标志着治疗性克隆研究的巨大进步.韩国科学家Hwang等［6］通过核移植技术获得了人人nteS细胞.他们以健康女性志愿者的体细胞为核供体，以其自身卵母细胞为受体.在30枚核移植囊胚中，得到20个内细胞团（iCms），建成1株人nteS细胞系，可传代培养70代以上.上海第二医科大学盛惠珍研究小组［7］在国际上首次构建了人兔核移植重构胚.分别将5，42，52和60岁4个年龄组的人皮肤成纤维细胞核移入去核兔卵母细胞内，获得nteS细胞，通过原位杂交、免疫组化、核型和同源基因分析等证实nteS细胞具有人源性，并且保持干细胞的未分化特性，能形成类胚体，在一定诱导条件下可以分化为神经、肌肉等3个胚层的细胞群.200506，汉城国立大学的研究者［8］以患者的皮肤细胞为供体，以志愿者捐赠的卵母细胞为受体，利用体细胞核移植技术成功建立11株人核移植胚胎干细胞，这些细胞具有多能性，染色体正常，与供核患者的Dna一致、组织相容性抗原一致.
2治疗性克隆的应用前景
eS细胞在生物医学的各个领域均有广阔的应用前景，nteS细胞也有着同样广阔的前景，为临床治疗学、细胞生物学、生物发育学、比较动物学等研究提供研究材料和方法.
2.1临床疾病的治疗nteS细胞与普通的细胞移植治疗相比，具有革命性的进步.它以患者的体细胞为核供体，通过核移植技术获得的nteS细胞，与患者的遗传物质相同，可以消除受体对供体的免疫排斥反应，为目前多种退形性疾病，如心脏病、脊髓损伤、帕金森病、1型糖尿病等的治疗带来了新的希望.特别是一些目前还没有找出致病基因的遗传病，如脊髓侧索硬化症，nteS细胞移植是最有希望的治疗方法.目前已经应用nteS细胞在体内外分化成多种细胞，包括神经细胞和生殖细胞［9，10］.尤其Barberi等［9］建立了一套方法，能使nteS细胞向中枢神经系统细胞特定分化，能产生高效率的神经胶质细胞、寡突细胞、神经元细胞，包括多巴胺能神经元、γ氨基丁酸能神经元等，将分化的多巴胺能神经元移植到parkinson病模型后，能改善其症状.细胞治疗的途径有两种：其一，nteS细胞定向分化后移植.细胞扩增后，体外定向分化，对分化细胞进行纯化，将获得的目的细胞移植到病变部位，替代丧失功能的部分细胞；其二，nteS细胞原位移植.与定向分化后相比，nteS细胞原位移植有以下缺点：①没有经过纯化，可能将污染的异源饲养层细胞带进移植部位；②nteS细胞没有转入经选择基因，无法控制植入细胞的命运，可能发生癌变；③nteS细胞分化成分复杂，目的细胞分化成分少，可能出现大量非必须细胞的分化.
2.2细胞生物学通过研究nteS细胞的体外分化特性，可以识别某些靶基因，对人类新基因的发现，功能基因的研究，以及基因治疗的研究均有重要意义.通过探讨nteS细胞体外增殖和分化的机制，了解各种生长和分化因子的作用，为组织再生和修复的研究提供了新的工具；通过诱导nteS细胞癌变，可分析肿瘤细胞发生的分子机制.nteS细胞作为一种得天独厚的研究材料，对于阐明细胞增殖、分化、凋亡、迁徙、恶变等机制有着重要意义.自发现eS细胞以来，人们已经利用eS细胞建立了多种细胞类型的体外分化系统，体外分化的多种细胞类型都曾被成功的植入胎鼠或成体鼠，在受体鼠体内形成有功能的细胞群.
2.3发育生物学由于哺乳动物在母体内受胚胎发育的个体大小和内环境条件的限制，很难系统地研究其早期的发育进展、细胞分化及调控机制等.比较动物卵母细胞质对同种或异种细胞核发育的影响，在细胞和分子水平上为研究哺乳动物胚胎早期发育的调控机制提供了良好的材料和方法，也为研究胚胎发育的影响因素提供了便利条件.建立在eS细胞和基因打靶技术基础上的复杂的转基因系，使人们可以建立有效的分析系统，从而在分子水平上研究不同的生物学问题.它不仅可以将一些在发育过程中对动物体非必需或可被替代的特定基因进行敲除(geneknockout)，在体内进行功能缺失研究，而且还可以研究基因在不同发育时期中的作用.nteS细胞作为一种体外细胞系，提供了一个研究处理整体细胞群的实验体系.因此，就有可能人为地产生一些基因突变，如对胚胎致死性基因的研究等，也可利用这些突变的基因来克隆产生转基因小鼠，从而建立基因突变的模型.
3治疗性克隆面临的问题
3.1亟待解决的问题①体细胞克隆效率与nteS细胞建系效率普遍较低：核移植胚发育至囊胚的几率为19%～25％，与牛、猪的核移植囊胚发育率相当分别约为25％和26％；从克隆囊胚获得nteS细胞的效率仅有4%~16％，平均8.2%［11］.②卵母细胞来源问题：nteS细胞用于人治疗性克隆，卵母细胞的需求量是非常大的，目前尽管已有许多措施来改进核移植技术，但仍没有明显提高.要得到一个nteS细胞系平均需要12个囊胚，而所需要的卵母细胞数就更多了，一个nteS细胞系平均需要666个.如果nteS细胞系用于人类疾病的治疗，这样的代价是非常大的，即使目前报道的最高效率的建系，也是30个卵母细胞，才能得到一个nteS细胞系.另外一种替代策略就是利用非灵长类异种哺乳动物的卵母细胞，例如兔、山羊等.③伦理问题：胚胎生物技术涉及使用早期未着床的胚胎，特别是治疗性克隆技术还将无法避免的使用通过体细胞克隆获得的人的早期克隆胚胎.世界各国尤其是西方国家对此争论很大［12，13］.迫于社会公众与宗教的压力，大多数西方国家对治疗性克隆技术应用于人类，持反对态度，不允许国家科研经费支持治疗性克隆的研究.④临床应用问题：如eS细胞系可能在培养过程中出现染色体非整倍性问题，eS细胞定向分化能力及分化细胞的稳定性问题；其次，异种核移植产生的人动物重构胚还存在安全性问题：异种重构胚在发育早期含有2种线粒体，以后供核体的线粒体取代了受体的线粒体，但受体卵浆中所带的异种蛋白，包括细胞器及mRna，它们的命运如何，是否也像线粒体一样完全被供核体所取代，还有待进一步证明.再次，在核移植的过程中，可能存在跨种间病毒传染，例如，人兔核移植胚胎干细胞，有可能将某些目前未知的兔疾病传染给人类，就像艾滋病病毒可能是从非洲猩猩而来那样.
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3.2建立我国知识产权的治疗性克隆技术随着干细胞技术和体细胞核移植技术的研究进展，我国学者在治疗性克隆的技术方面也处于世界前列.当前，在我国研究和发展治疗性克隆技术，建立我国知识产权的治疗性克隆的细胞产品，创建细胞治疗产业，是一个很好的机遇.我国在治疗性克隆研究领域的优势：①目前，我国在哺乳动物克隆技术的研究方面处于国际先进水平，相继成功克隆出了牛、羊等动物.1991年，西北农林科技大学生物工程研究所在世界上首次获得山羊胚胎细胞核移植成功，共得到5只羔羊.1998年，该研究小组用来自成年雌性山羊的皮肤成纤维细胞作供体，采用细胞质内直接注射的方法将供体细胞核直接注入去核卵母细胞内，胚胎激活后移植到受体母羊子宫角，获得了2只体细胞核移植后代，这是世界上首批成年体细胞克隆山羊，并获得了克隆山羊的第4代后裔，目前仍生长健康.②宽松的人文环境.中国公众有着不同于西方的伦理观念，对于动物权利和早期胚胎的担心没有西方国家严重，也基本没有因为宗教信仰而反对胚胎生物技术的问题.③法律和法规的基本保证.为保证和促进人胚胎干细胞研究的健康发展，国家科技部和卫生部联合下发了《人胚胎干细胞研究的伦理指导原则》，使治疗性克隆的研究合法化.但我国明令禁止克隆人和买卖人类胚胎.
然而，中国的优势不能在治疗性克隆的研究领域走在国际前列，主要原因是经费不足和相关学者缺乏协同研究.应用克隆技术结合胚胎干细胞体外诱导分化和细胞治疗方法的关键是技术问题.我们希望临床学者与基础细胞生物学家联手合作，借鉴国外的思路，应用自愿者的卵母细胞，建立中国人的nteS培养技术，为治疗性克隆的临床应用奠定基础.我们坚信，中国有可能在这个领域走在世界前沿.
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细胞与分子生物学技术篇7
测定人体各种生物学指标的多种技术已被用来确定核辐射照射强度和人体吸收剂量的关系。这些技术中大多数是以核辐射引起的人体生物学效应为基础,反应的程度与辐射剂量成正比例。因此,这些生物学反应被为“生物学剂量计”或称作“生物学指标”。辐射损伤理想的生物学指标应是特异性的、敏感的,适于测定小剂量的辐射量,并能在照后最短的时间内确定损伤的程度,其方法学应该是简单的,适用大量人员的筛选和甄别。本文介绍具有以上特点的几种测定技术。
1细胞检测技术
核辐射损伤引起的血细胞质与量的改变,是生物学效应的主要特征之一。其次是生殖细胞(),毛发等。
1.1血细胞检测血细胞是机体对辐射射线反应较敏感的细胞之一。核辐射损伤可使造血干细胞有丝分裂受到一定程度的抑制,使外周血细胞发生间期死亡。凡是超出允许剂量的照射,依据照射量的大小,各种血细胞均有不同程度的减少。外周血细胞数减少的首先是淋巴细胞,其次是粒细胞、血小板,红细胞反应迟钝。淋巴细胞减少对早期诊断有重要意义。中性粒细胞和血小板对辐射的预后有判定意义。血细胞计数是常规方法,一般较熟练的检验人员都能正确进行检测。人体受超允许剂量的核辐射后,外周血细胞数首先下降,效应出现早,分析方法简单。
1.2细胞检测细胞在发生发育的几个阶段对辐射都十分敏感。可用流式细胞仪检测处于3期各阶段的细胞辐射效应。同时结合显微镜下形态学方面的改变,可以精确判断受照射的程度。检验速度快,灵敏度高(0.1Gy)。
1.3毛发检测检测毛发也是判定受辐射损伤程度的简便、精确的方法之一。从受核辐射照射的患者中发现,出现最早的躯体效应是白细胞减少和毛发脱落。核辐射可导致毛囊细胞死亡和减少。毛发上皮细胞的染色体畸变率高,检测全身各部位的毛发可确定受照射部位。
2细胞遗传检测技术
体细胞的遗传对核辐射有极灵敏的感受剂量,可小至0.05Gy。细胞遗传检测技术有微核检测、染色体畸变检测等。
2.1微核检测微核可在各类受照射细胞中检出,但最适合的是淋巴细胞。计数微核简便快速,能检测不同个体对辐射的敏感性。微核检测技术在不断改进,使用松胞素B以后,使其灵敏度显著提高,可预知人体受照射前的微核率水平,能检测0.05Gy的剂量。如无照射前的对照指标,可检测0.1Gy的剂量则更为可靠。用微核检测作为生物剂量计,需要建立各自不同条件下的剂量-效应曲线鉴别微核的条件有三:①微核的染色体必须与主核完全一致。②微核必须与主核完全脱离,不能有丝状相连。③微核必须为核的1/3以下。
2.2染色体检测染色体畸变对核辐射有较强的特异性,其灵敏度很高。对低Let的急性照射,可检测的最低剂量为0.05～0.1Gy,直至到4Gy时还有明显的剂量依赖性。染色体畸变的双着丝粒体的自然发生率很低(0.05%～0.1%),受照射后的变化可维持数周甚至数十年,仍可检测到双着丝粒体。染色体畸变检测是目前生物剂量中最先进的技术。
采用染色体畸变作为生物剂量计,各实验室都要对不同辐射品质和不同照射条件建立各自的剂量-效应曲线。染色体分析技术在实际应用上已十分成熟,高分辨率的分带技术也已应用于实践中。染色体分析技术要具有经验和熟练的技术,不足的是比较费时。
3辐射诱变分子化学检测技术
一定剂量的核辐射,可使体内大分子蛋白质化学性状发生改变。
3.1生物化学检测人体受超量辐射后,体内某些酶释放入血液。部分Dna和核酸发生降解。可以用许多体液如:唾液、血液、尿液的化学成分的改变来估算辐射损伤的剂量。常用的检测项目有淀粉酶、牛磺酸、胸腺嘧啶核苷和脱氧细胞嘧啶核苷等测定方法。这些材料易获得,定量方法简单、实验时间短。
3.2其他检测技术用于估算辐射剂量的其他技术有电子自旋共振技术。它可测定由辐射造成体内自由基产生的数目。检测材料多用牙齿和指甲。血型糖蛋白a位点突变检测,细胞电泳速率等均可用于估算辐射对人体的效应关系。
4小结
核能的应用造成的辐射环境与人的健康关系越来越密切。尤其是接触核装备的专业技术人员,除了采取有效的防护措施外,必须定期对接触核设施的专业人员进行以上几种技术的检测,并制定各种设施中不同辐射品质和不同照射条件下的剂量-效应曲线,与制定的正常人组的本底剂量-效应曲线进行比较,经统计处理,分析估算出专业接触人员的受照射剂量程度,以便监督防护措施的落实情况和为进行有效治疗提供依据。
细胞与分子生物学技术篇8
【中图分类号】R734.2【文献标识码】B【文章编号】1007-8517(2009)24-0100-01
肺癌是常见的恶性肿瘤之一,目前治疗是以手术、化疗、放疗为主,联合生物治疗、中医中药治疗等的综合治疗模式,但随着肿瘤分子生物学、免疫学以及分子生物学技术的发展,肺癌生物治疗不断被赋予新的内容,治疗方法逐渐扩展到基因治疗、免疫治疗以及近年来兴起的分子靶向治疗[1],为肺癌治疗开辟了更为广阔的前景。本文就肺癌生物治疗的现状及研究进展综述如下。
1肺癌生物治疗现状
生物治疗的原理是通过为肿瘤患者补充具有杀死、抑制肿瘤能力的免疫细胞和能力,调节患者自身免疫功能,达到控制和清除肿瘤细胞的目的,主要包括细胞因子技术、基因治疗技术、肿瘤疫苗技术、免疫活性细胞继承性输注技术、单克隆抗体及其耦联物技术等[2],彼此之间并没有明确的界限,它们的出现标志着肿瘤生物治疗体系的基本形成,虽然途径与方法各异,但目的都是通过最大限度的利用人体自身所具有的抗肿瘤能力来治疗恶性肿瘤。生物治疗有自己独特的优点,毒副反应较低.仅在高剂量时有低血压、发热皮疹、抗原抗体反应等,发生率较低[3],临床上治疗肺癌应用最多的为细胞因子,免疫调节剂、基因治疗和分子靶向治疗药物也已应用于临床,过继免疫细胞中淋巴活化杀伤细胞(LaK)已见报告,为今后生物治疗的发展研究提供了丰富的内容。
2肺癌生物治疗研究进展
2.1分子靶向治疗肿瘤分子靶向治疗是利用分子靶向药物特异性,以肿瘤组织或肿瘤细胞中所具有的特异性分子为靶点,阻断该靶点的生物学功能,或选择性从分子水平来逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为,从而达到抑制肿瘤生长甚至肿瘤消退的目的[4]。其中以表皮生长因子受体(eGFR)和肿瘤血管生成作为靶点的药物占60%,以表皮生长因子受体作为靶点的治疗药物包括吉非替尼、埃罗替尼、西妥昔单抗等,以肿瘤血管生成作为靶点的治疗药物包括贝伐单抗、ZD647、内皮抑素、基质金属蛋白酶等,其它靶向治疗药物如基质金属蛋白激酶(mmps)抑制剂、血管生成因子抑制剂、法尼基转化酶抑制剂(Ftis)、环氧化酶抑制剂、组氨酸脱乙酰化酶抑制剂等分子靶向性药物正在进行临床前或临床试验研究中[5]。
2.2细胞因子治疗常用于肺癌的细胞因子有干扰素(iFn)、白细胞介素(iL)、肿瘤坏死因子(tnF)、红细胞生成素(epo)和集落刺激因子(CSF)等。细胞因子的应用是目前最成熟的生物治疗方法,尤其是iFn和iL,目前已经在肺癌治疗中应用非常成熟,CSF、tnF、epo等也逐渐被广泛应用,在肿瘤的治疗中起到了重要作用。iFn是最早发现具有抗癌效应的细胞因子,早在1980年第一次用于小细胞肺癌(SCLC)的实验中就显示出了良好的前景。iL一24是近来发现的一种新白介素,利用腺病毒转染的方法发现其可以抑制肺癌细胞的增殖并可以增强肺癌细胞对放疗的敏感性。CSF及epo的应用对于克服骨髓抑制、预防传统放化疗所产生的白细胞下降及红细胞减少无疑起到了保驾护航的作用,为提高放化疗药物的使用剂量从而达到更好的治疗效果起到了关键作用[6]。
2.3免疫治疗主要包括肿瘤疫苗、过继性免疫治疗及补充细胞因子,其中发展最快的是肿瘤疫苗。目前应用的肺癌疫苗有肿瘤细胞疫苗、胚胎抗原疫苗、病毒疫苗、癌基因产物疫苗、人工合成多肽疫苗、抗独特型疫苗和树突状细胞疫苗等,树突状细胞疫苗能形成强有力的特异性细胞免疫应答,有效地清除血源性播散的肺癌细胞,发展最为瞩目[7],Ueda等应用Cea652体外冲击致敏树突细胞,治疗Cea阳性的肺腺癌患者,发现治疗后患者病情稳定,血清中Cea水平明显降低。受到重视的还有第3代疫苗:核酸疫苗,包括Dna疫苗和Rna疫苗,Dna疫苗在体内可持续高表达相应抗原,被树突细胞摄取并致敏后,激发高效的细胞和体液免疫反应,是最有潜力的肿瘤疫苗发展方向。
2.4基因治疗
2.4.1p53基因治疗在基因治疗研究中,以腺病毒转染抑癌基因p53的表达研究较为成功。国外对重组腺病毒介导的p53基因治疗nSCLC的临床研究已基本完成,结果显示腺病毒p53注射液在nSCLC中有抗瘤活性。一项研究中,对12例气道阻塞且无法手术的肺癌患者瘤内注射重组腺病毒p53注射液106―1011pfu,28天重复一次,其中6例患者症状得到缓解。然而也有研究者将重组腺病毒p53注射液联合化疗治疗nSClC,发现两组疗效和生存期无显著差异。
2.4.2杀伤基因将具有杀伤作用的基因片段导入细胞复制的Dna序列中,从而打断细胞基因的连续性,抑制基因的过量表达和肿瘤细胞的增殖。自杀基因和凋亡基因通过引发肿瘤细胞的凋亡而起到杀伤肿瘤细胞的作用。tK基因-GCV系统是最有希望在临床上用于肿瘤基因治疗的方法之一,在肺癌基因治疗中具有显著作用。
2.4.3Rnai技术在针对肿瘤的基因治疗策略中,Rnai技术以其自身的诸多优势,在不影响正常基因功能的前提下,可以针对在细胞癌变过程中发挥重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因、血管生成因子及其受体以及部分关键酶等,抑制突变基因表达或基因的过量表达。如Zhang等用HeR-1siRna抑制了肺癌细胞a549的eGFR的表达,使肺癌细胞比对照组细胞数减少了85%,eGFR蛋白表达下降了70%以上,对顺铂的敏感性增加了4倍。
3展望
作为一种新的治疗模式,生物治疗目前还存在很多问题,如各种治疗药物的有效性、安全性还有待于进一步评价,是否有必要采用特异性检测手段筛选分子靶向药物的适应人群来实现个体化用药,及建立这类药物与手术、放化疗之间的最佳联合方案还需不断摸索。但我们深信在不久的将来,随着对肿瘤生物学特性和行为了解的不断加深、分子药物研究的不断发展,将会出现一批新型的低毒、高效靶向治疗药物,为肺癌乃至其他所有肿瘤患者带来福音。
参考文献
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[2]罗荣城,左强.肺癌生物治疗与生物化疗研究进展[J].癌症进展杂志,2006,4(6):492-496.
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[4]朱小花,田应选.肺癌生物分子靶向治疗研究进展[J].实用医技杂志,2006,13(16):2931.
细胞与分子生物学技术篇9
这对合格率不高的现代人而言，无疑是个利好消息。
全国各地捐精者数据显示，中国成年男子的合格率不到30%。不合格主要表现在浓度、活力、存活率、形态等方面。中国每8对育龄夫妇中就有1对存在不孕不育问题，不孕不育发病率在12.5%-15%左右，患者人数超过4000万。
这项在基础研究上取得的突破，虽然尚未实现用人体干细胞诱导分化出人工，临床应用还遥遥无期，但这一消息无疑给辅助生殖领域与广大的不育患者带来新的希望。
不过，技术的两面性，也引发医学界一连串的疑问，人工与中天然生成的是否实质等同，携带的遗传基因是否正常，是否会发生基因突变，子代的安全性是否可靠，若未来技术成熟至可用于临床，其背后的医学伦理将如何考量？没有尾巴的“人工”功效如何
由中国科学院院士、中科院动物所研究员周琪领衔的这支科研团队，首次在体外模拟了的发育过程，并将得到的细胞直接注入小鼠卵细胞中，产生的健康小鼠后代已经存活了15个月，这批小鼠已经成功生育了下一代。
动物在精巢中形成，精巢中生有原始的、尚未成熟的精原细胞，每个精原细胞都含有与体细胞内数目相同的染色体。在发育过程中，一部分精原细胞分裂增殖为初级精母细胞。初级精母细胞经过两次连续的减数分裂，才成为成熟的雄性生殖细胞――。
“人工”的培育过程是：科研人员将小鼠胚胎干细胞诱导分化成原始生殖细胞，然后将其植入一个人工模拟的“自然组织环境”，原始生殖细胞分裂产生功能性细胞。
普通的像小蝌蚪似的，这些人工不同，是圆的，并没有那条细长的尾巴。
体外模拟的重点是，找到能够模拟减数分裂过程的关键因子。在经过一些尝试后，科研人员“幸运”地在较短的时间内得到了这些缺一不可的关键因子。
减数分裂是一个非常关键的过程，也是体外诱导形成功能性的一个主要障碍。减数分裂，使性细胞配子的染色体数目减半，两性配子结合后，合子的染色体数目又重新恢复到亲本水平。这一过程使有性生殖的后代始终保持亲本固有的染色体数目，保证了遗传物质的相对稳定。
为了证明减数分裂确实在体外发生了，研究人员必须在研究结果中提供减数分裂特定时期的核Dna含量、正常的染色体数目和形态，以及体外诱导形成的细胞产生健康后代的能力等证据，这是“黄金标准”。
这一团队培育的人工只有一套染色体，说明整个培育过程确实经过了减数分裂关键的发育阶段。
在过去的20多年里，科学界一直尝试在实验室里培养出人工细胞，各国科学家各显神通。
1994年，美国宾夕法尼亚州大学兽医学院的研究人员发展了在小鼠间移植精原干细胞的方法；1996年，科研人员将健康雄性老鼠的冷冻精原干细胞，植入了不能生育的雄性老鼠体内之后，后者顺利产生了。
此后数年，人工研究一度没有突破性的进展。直到2003年初，日本一个科研小组宣布，他们成功地把实验鼠的胚胎干细胞变成了细胞。
2012年，中国科学院上海生命科学研究院研究员李劲松研究团队建立了小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系，这一细胞能使卵细胞“受精”，生产出半克隆小鼠，但问题是随着细胞的传代，受精能力会逐渐丢失。三年后，法国一家生物技术公司Kallistem的研究人员宣称，他们从6个患有不育症的男性中提取出精原细胞，成功培育出成熟的人造细胞。
然而，这些研究都没能达到“黄金标准”，减数分裂指标不够，而且所获得的单倍体生殖细胞的功能性也没有得到验证。
“（我们的）研究最大差别是实现了生殖细胞在体外完成减数分裂过程，这是一个新起点。”周琪团队成员之一、如今已在南方医科大学任职的赵小阳接受《财经》采访时表示。
最新的研究成果也还是有不足之处。如对于人工没有尾巴的特征，有专家就担忧，这样的人工无法自己游向卵子，只能借助外部注入来实现结合。
在周琪看来，人工的尾巴没有那么重要，“人工有可能发育出尾巴，但是从发育的角度来看，对小鼠是不需要的；人类在未来的应用中是否需要人工的尾巴，还需要进一步研究。”他说，有不同的发育阶段，培育出的小鼠是还没有变形的阶段，但其已经具有了的功能了，这是最重要的。
美国斯坦福大学博士维托里奥・塞巴斯蒂亚诺认为，这项科研进展是一个里程碑，尽管距离临床应用尚有不小距离，但是我们无法预料用这种方法得到的配子会对后代产生怎样的影响，这个话题非常值得讨论。
周琪团队也在关注“人工”会否基因突变，相关的研究也在跟踪进展。“任何生命科学研究，包括干细胞研究，存在变异的可能性都很大，这个问题是回避不了的，也是这个领域的热点问题。”周琪告诉《财经》记者，现在取得的成果还只是在基础研究、针对基本知识层面的挑战，“目前的人工培育技术还不是解决无精症的实际通道”。有了试管婴儿技术，还需要人工
在等待培育人工的路上，各种辅助生殖技术已走得很卖力了，如接受捐精做试管婴儿的技术，就在各国被频繁应用。可调查显示，一些获得捐精的家庭并不快乐，这使人工技术的需求极为迫切。
30岁的刘川（化名），是山东省济宁市一家工厂的老板。今年初，妻子生下了体重6斤8两的儿子，这个很吉利的数字，让刘川很开心。
作为一名无精症患者，在医院做过多次分析与穿刺确诊后，刘川最终听从了主治医生的建议，接受由库提供的匿名，做人工授精手术。刘川并非孤例，仅山东省在去年就增加了7000多个周期的试管婴儿手术。
“一想到不是自己的，心里就觉得别扭。”刘川接受《财经》记者采访时说。
在他的主治医生孙秀芹看来，刘川的情况并非孤例，“我们接触到的患者中，很多在通过试管婴儿技术生下宝宝后，都会有这样的心态”。孙秀芹是山东济宁第一人民医院生殖医学中心的主任医师，曾组建了鲁西南地区最大的生殖医学中心，并组织实施了济宁地区首例第一代试管婴儿、第二代试管婴儿、冻融胚胎试管婴儿手术。
前不久，孙秀芹参加了一个辅助生殖技术伦理会，会上一名辅助生殖领域的专家作报告称，在对接受供精人工授精手术的家庭进行随访时发现，600多个受访家庭，多半存在家庭不幸福的情况。
无精症患者靠供精进行试管婴儿手术，是目前的医学技术下，唯一的可行手段。
如果男方数量稀少或活动量不足，可以采用“第二代试管婴儿”技术，即直接将注射入卵母细胞胞浆内，以达到怀孕目的。卵子与要正常结合，一个卵子周围需要围绕2万个以上才能实现，而弱精症患者，数量远远达不到，只能用显微注射针人工将注射到卵子中。
无精症患者要想让女方受孕，只能用库里的捐赠，借助“第一代试管婴儿”技术，将与卵子放在体外共同培养，让和卵子的自由结合来实现受精过程。
一般在手术前，医生都会反复向夫妻双方强调手术后可能的心态变化，可仍然有很多家庭会出现问题，甚至会后悔生下试管婴儿。
“谁都想生一个与自己有血亲关系的孩子，迫不得已靠供精生下试管婴儿，有心理阴影这也是可以理解的。”孙秀芹说。
北京大学人民医院计划生育与生殖医学科主任医师沈浣也常常碰到这样的案例。她在接受《财经》记者采访时说，为了尽量避免患者手术后后悔，或者出现复杂心态，他们一般不给太年轻的夫妇进行试管婴儿手术，“有的心智不太成熟，考虑不周全”。
“人工”技术的推出，显然，有望解决刘川们的烦恼。
“若干年后，这一技术成熟了，用体细胞就可以制造人工。临床上患有无精症的患者比较多，又都迫切希望要有自己血亲的后代，这对于患者与辅助生殖领域来说都是值得期待的。”孙秀芹表示。
沈浣期待“人工”的相关科学研究能有更突破性的进展，比如用人体干细胞诱导出成熟的、有受精能力的、对子代也很安全的。逃不过的伦理讨论
人工技术用在人类身上还有很长的路要走，因为对实验动物来说，20%的健康后代或许已经足够好，在人类身上就不行了。可毕竟这项技术已经有了，是不是未来就不需要男性了？每一次“人工”，甚至是每一个人工辅助生殖技术推出后，科学界与公众都会产生这样的讨论。
对此，赵小阳表示，“这项技术需要用到男性的遗传信息（体细胞），（与自然生育）唯一的差异就是可以在体外实现，而不是体内。”
目前看，人工技术未来的应用可能有两大类：一是作为科学研究的一个新载体，建立人类不育症的体外模型，用于人体不育机制研究和药物筛选；二是投入临床应用，体外获得病人体细胞来源的功能。
这项成果还处于研发阶段，如果未来投入临床应用，不但需要严格的、漫长的科学验证阶段，还要看是否符合伦理。
按照原卫生部于2003年修订的《人类辅助生殖技术伦理原则》，医务人员不得实施生殖性克隆技术，不得进行各种违反伦理、道德原则的配子和胚胎实验研究及临床工作。
沈浣告诉《财经》记者，国内进行诱导生殖细胞的研究是可以的，但是诱导生殖细胞成功了，是否可以用来做人的胚胎，还需要通过伦理委员会进行伦理评估，“每家医院在临床上运用新技术，都要通过伦理委员会评估新技术对患者、后代、社会的利害”。
这样的讨论不仅涉及伦理，也有社会、法律等层面的问题。
比如，在未来如果人工、人工卵子、人工卵巢、人工子宫等技术都成熟了，即使是七八十岁的夫妇也能轻易地生孩子，那么当他们接受了人工生殖技术，孩子出生后还没成年时父母就去世了，谁来抚养？
虽然这些恼人的问题一时都还无法解答，对于那些真正的不孕不育患者，新技术是解救的唯一出路，不得不期待。他们甚至希望的更多。
如，随着国家二孩政策的放开，高龄生育的人群在怀孕时面临各种问题，最突出的问题就是女方没有卵子；有的患者由于刮取子宫内膜或宫腔内容物的手术（刮宫），造成子宫发生不可逆的变化，无法生孩子，而中国法律不容许代孕；还有，中国现在30岁以下女性中，卵巢早衰的发病率为1%，要怀孕必须使用人工供卵。而现有的人工辅助生殖技术中，在库找到很容易，但国内没有卵子库，要找到捐赠的卵子很困难。
面对这些生殖难题，多数患者还是寄望于生命科学领域的科学家们有所斩获。美国斯坦福大学遗传伦理学专家汉克・格雷利，在其最新出版的《性的终结与人类生殖的未来》一书中说：在20年到40年内，当夫妻想要孩子时，父亲只需要提供，母亲只需要提供一些皮肤细胞。格雷利声称，干细胞技术已经可以让他的设想成为现实。
细胞与分子生物学技术篇10
生物学是现代医学、农业科学与生物技术等应用科学的根本，只有了解基础生命现象的运作原理与机制，才可能有创新性想法将其化为能增加人类福址的应用上。上世纪60年代，台湾生物学研究主要集中在基础医学和农学（包括森林学）及工业微生物学领域，特别是李先闻领导的台湾中研院植物研究所开展的水稻细胞遗传学、放射线诱变育种等研究，以及魏岩寿领导的台湾中研院化学研究所开展的应用微生物学研究最为著名。
在岛内高校，除与医学和农学有关的系/所外，其余与生物学有关的研究机构只有台湾大学化学工程系（研究工业微生物）、农业化学系（研究农业微生物）、森林学系、生理学系，以及省立中兴大学植物学系和森林学系等。
1965年，台湾科技主管部门在中研院植物所内成立“生命科学研究中心”（1987年改名为台湾科技主管部门下属“生命科学研究推动中心”），主要任务是审议各学科的学术交流及合作联系事宜，与岛内生物学、医学、农学研究机构合办科技性研习会，补助购买学术图书期刊和仪器，发行《生命科学简讯》杂志月刊。
这一时期的生物科学类专题研究计划仍以自由研究为主，分为生物、生化、海洋生物、农业、医学与公共卫生研究等五类。
这一时期，台湾科技人员取得的重要成果包括：对台湾维管束植物、苔藓植物、鱼类、鸟类、菌类、藻类及昆虫等生物资源进行调查研究，1976年出版《台湾植物志》，鱼类、菌类、昆虫及藻类也有若干目录及专志出版；开展水稻基础生产力研究，包括水稻的生长模型及其生长介量变异研究，水稻余留物分泌的植物毒物质及其对水稻生长的影响研究，水稻潜伏性细菌研究，水稻根系机能与土壤中理化性质的研究及水稻光合作用研究等；植物组织培养研究，包括无病毒马铃薯在试管内结球的研究，人参组织及细胞培养研究，水稻花药培养研究，台湾重要果树的组织培养繁殖研究及烟草、甘蔗、水稻等原生质体融合研究等；台湾二期作稻低产原因及其解决方法研究，包括环境因子对产量构成要素的影响，植物根活性、光合作用及光合成物质的生产、土壤因子、肥料及植物调节素、病虫害对一、二期作稻的影响，及提高二期作稻产量的对策研究等；草虾、斑节虾、砂虾及红尾虾的大量繁殖技术研究，乌鱼完全养殖技术、虱目鱼人工繁殖技术、温度及盐度对鱼虾类的存活、生长的影响研究，以及养殖池水质变化与养殖之间关系研究等；金门血丝虫病防治研究；蛇毒药理学研究；鼻咽癌诊断及免疫学研究，包括血清免疫球蛋白igG、iga、igm、eB病毒有关的抗原、抗体、血中醣蛋白、t细胞及B细胞研究等；针刺止痛的神经学研究；肝炎与肝癌研究；鸡母珠毒蛋白及蓖麻毒素的抗癌研究等。
1982年起，台湾科技主管部门对岛内生物科学类专题研究的支持经费持续增加，首次超过1亿元新台币，1986年达到3.798亿元，1989年更高达7.36亿元。1984年起增加对生物技术研究的经费支持，1985年起再加上肝炎防治研究及补助购买中型仪器设备，1988年起又增加对分子生物研究及生态及公害医学研究的支持。
1982年台湾科技主管部门资助生物科学类专题计划数仅378件，1986年增至728件，1989年更增至1091件。在推动目标导向型大型计划方面，1983年该部门首次组织实施“生物技术与肝炎防治研究计划”，1985年推动“民众常见疾病的分子层次探讨计划”，1988年又推动“农业生物分子遗传研究”、“中药研究”、“农业园艺作物遗传与生理研究”、“生态资源与公害基础医学研究”，1989年推动“灵芝研究”、“乌脚病研究”等多年期计划及群体性研究计划，显示其不断朝向主动协调研究计划的方向迈进。
主要生物研究机构
台湾中研院1959年开始筹备成立动物研究所。经过筹备主任梁序穆与以后的苏仲卿等人11年的努力，终于在1970年2月正式成立，首任所长为苏仲卿，最初研究人员有林飞栈、李文蓉、黄仲嘉、詹昆源、万家茂、周延鑫及郑森雄7人。以后，历经张昆雄、周延鑫所长的努力，大力扩展各项研究领域，在经费拮据及全体科技人员同心协力下，于1989年在台北市南港区建成“动物所研究大楼”并启用。
该所早期以岛内动物基础研究为主，重点放在海洋生物、昆虫的显微形态、生理生化、分类及生态学等方面，对于台湾动物学及农渔业发展有重要贡献。80年代后期，国际上兴起分子生物学和基因学研究高潮，该所配合这一新趋势也快速成长及蜕变。在吴金洌担任所长期间，整合所内研究重点，将研究方向转为以理论动物学为基础，辅助应用科学发展，并于1991年3月通过所务会议，将该所研究人员分为分子细胞学、个体生理学和族群生态学三组。
1996年邵广昭接任所长，延续三组研究方向，推展诸多研究项目，其中以水产动物为模式材料的基因调控机制研究、个体以上层级的生理及环境适应，以及生物多样性的研究（包括分类、生态及演化）成为该所研究的主要特色。2002年8月，游正博返台接任动物所所长，2003年在宜兰县礁溪乡建立临海研究站。其后，该所依照原来的三大方向继续发展，特别是在斑马鱼器官分化及基因调控、鱼类病毒致病分子机制、动物环境适应调控机制、无机砷遗传毒理、族群生态及分子演化等方面持续性深入探讨，取得创新性成果。
进入新世纪后，对功能性基因及生物多样性研究潮流兴起，台湾中研院在2001―2003年间开始筹备成立基因研究中心及生物多样性研究中心，由动物所第三组族群生态学组研究人员为主，于2005年1月转至生物多样性中心。其他分子细胞学组及个体生理学组的研究人员，在现任所长游正博领导下，努力整合研究重点、积极网罗优秀人才，全力重整实验室，设立核心仪器室，并在2005年将该所改名为细胞与个体生物学研究所，将研究重心转移至分子和细胞层次的研究。
该所目前共有23位研究人员，包括特聘研究员3名、研究员3名、副研究员7名、助研究员10名，所内设有公共仪器室生化组、公共仪器室影像组、台湾斑马鱼实验中心、临海研究站等部门，研究目标着重在个体生物生长、适应与发育过程中细胞与细胞间的交互作用，以及个体生物面对环境变迁所进行的适应行为。重点研究方向包括：水生及海生生物技术；藉由动物模式系统或系统生物学研究方法分析细胞与个体生物的功能；细胞正常以及异常功能的分子机制探讨；细胞结构分析。
在上述4个研究领域中，水生及海生生物技术具有最悠久的发展历史及良好声誉，其研究成果主要归功于位在宜兰礁溪的临海研究站。临海的地缘关系方便海生生物繁衍、研究与观察。该所也是台湾最早使用斑马鱼作为模板来研究水生生物的研究单位。针对水生生物多元化的生理研究是该所的一大特色。