单细胞生物的共同点篇1
【关键词】靶向
comConstructionandidentificationofamycobacteriumsmegmatisstraintotargetedlydelivereukaryoticcoexpressionplasmidencodinghumangranulysinandmurinesinglechainiL12
【abstract】aim:toconstructarecombinantmycobacteriumsmegmatisstrainthatcantargetedlydelivertheeukaryoticcoexpressionplasmidpZm03encodinghumangranulysin(GLS)andmurinesinglechainiL12intomacrophages.metHoDS:Codingsequencesofhumangranulysin，murinesinglechainiL12andorimweresimultaneouslyclonedintopBudCe4.1，whichhadmultiplepromoterstoformtheshuttleplasmidpBudCe4.1/GLS/iL12/orim(simplynamedpZm03).theshuttleplasmidwastransformedintomc2155andidentifiedfromtherecombinantsbypCR.thetargetingpropertyoftherecombinantwasdetectedbycoincubatingthestrainswithmurinemacrophageRaw264.7.ReSULtS:thenewrecombinantstrainthatcouldtargetedlydeliverpZm03intomacrophageswassuccessfullyconstructed.ConCLUSion:itisfeasibletotargetedlydelivereukaryoticexpressionplasmidsintomacrophagesbyusingmycobacteriumsmegmatisasanattenuatedbiologicalvector.
【Keywords】granulysin;interleukin12;mycobacteriumsmegmatis;shuttleplasmid;macrophage
【摘要】目的:构建携带编码人天然颗粒溶素（GLS）和小鼠单链iL12基因的真核共表达载体pZm03，并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗.方法:将人GLS，小鼠单链iL12基因和分枝杆菌复制子orim同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCe4.1中，得到穿梭质粒pZm03.以pZm03电转化耻垢分枝杆菌mc2155，通过pCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒；通过与小鼠巨噬细胞株Raw264.7共孵育检测重组菌的靶向性.结果:成功得到了可靶向递送GLS/iL12真核共表达质粒pZm03进入巨噬细胞的新型重组菌.结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.
【关键词】颗粒溶素；白细胞介素12；耻垢分枝杆菌；穿梭质粒；巨噬细胞
0引言
结核病位居单一病原引起死亡的严重传染病之首［1］.在结核病的感染、发病与治疗过程中，宿主本身的免疫素质和免疫状态是决定预后转归的重要因素［2］.其中巨噬细胞既是重要的抗原呈递细胞，也是参与形成潜伏感染的关键环节.本研究目的旨在构建一种携带人天然颗粒溶素（granulysin，GLS）和小鼠单链iL12基因的真核共表达载体pZm03、并可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌治疗性活疫苗.为明确该重组疫苗的靶向递送和目标基因在巨噬细胞内的转录和表达效果，我们首先在细胞水平上进行了初步探索.
1材料和方法
1.1材料携带人GLS基因的质粒pGLS738由本实验室构建；携带小鼠单链iL12基因的质粒pSFGmiL12由GrahamJ.Liechke博士惠赠，其中p40，p35两亚单位基因由一45bp的Linker连接，其编码产物的生物学活性已在活体内证明；含有分枝杆菌复制子orim的质粒pmV261及耻垢分枝杆菌mc2155由torin博士［3］惠赠；多启动子真核共表达载体pBudCe4.1购自invitrogen公司；质粒pUC118购自大连宝生物公司；质粒peGFpC1，e.colitop10为本室保存；小鼠巨噬细胞株Raw264.7购自第三军医大学药理学教研室.质粒Dna小量抽提试剂盒、pCR产物及凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司；小量组织/细胞总Rna抽提试剂盒、正常熔点琼脂糖（nma）、限制性核酸内切酶、高保真probesttaq酶、t4Dna连接酶、逆转录试剂盒（Ver.3.0）、DnamarkerDL2000等均购自大连宝生物公司；Lipofectamin2000购自invitrogen公司；山羊抗人GLS抗体购自基因公司；即用型免疫细胞化学试剂盒购自武汉博士德公司；Rpmi1640培养液购自Gibco公司；小牛血清为杭州四季青公司产品.
1.2方法
1.2.1pZm03质粒的构建根据GenBank（登录号：nm_006433）中人GLS的cDna序列，设计引物p1，p2，分别含有Bspei，Hindiii和BamHi酶切位点.p1的序列为5′GCtCCGGaaaGCttCatatGGGCCGtGaCtaCaGGaCCt3′;p2的序列为5′taGGatCCGtCGaCGaGCtCtCaCCtGaGGtCCtCaCaGat3′，引物由大连宝生物公司合成.由于表达产物定位于巨噬细胞胞质内表达，因此在引物设计中去除了GLS的分泌肽序列.根据小鼠iL12p40，p35两亚单位编码基因的序列设计p3，p4引物，分别含有ecoRi，noti和Hindiii，Kpni酶切位点.p3的序列为5′GaattCGCGGCCGCatatGGGtCCtCaGaaGCtaaC3′;p4的序列为5′GataaGCttGGtaCCGGatCCtCaGGCGGaGCtCaGat3′.引物由上海博亚生物公司合成.根据paL5000中orim的编码序列设计p5，p6引物，分别含有BamHi，nhei和nhei，Hindiii酶切位点.p5的序列为5′GGatCCGCtaGCtaaaGCCaGGtGaGCCCaCCaGCtC3′;p6的序列为5′GCGaaGCttGCtaGCGCaCtaCaaCGGaGttCGCCaCGt3′.引物由上海博亚生物公司合成.pZm03质粒的构建路线见图1.
图1pZm03真核共表达质粒的构建程序
1.2.2重组质粒的细胞转染及表达小鼠巨噬细胞株Raw264.7以含100mL/L小牛血清Rpmi1640培养液，置24孔板内，以37℃，50mL/LCo2培养，按转染试剂盒说明书用重组pZm03质粒和空质粒pBudCe4.1分别转染Raw264.7细胞.转染48h后分别收集实验孔及对照孔的细胞做:①以RtpCR法对两种目的基因的mRna进行检测：抽提细胞总Rna进行逆转录，以各自的cDna为模板，分别以p1和p2，p3和p4为引物，作pCR扩增；②GLS表达产物的检测：取出培养孔内细胞爬片进行免疫细胞化学检测，具体方法按照试剂盒说明进行.
1.2.3重组耻垢分枝杆菌菌苗的构建及其靶向性检测将对数生长期的mc2155菌株以预冷的100mL/L甘油在4℃低温洗涤3次［4］，取90μL感受态细菌加入10μL纯化的pZm03质粒，轻轻混匀，冰浴10min，转入预冷的1mm电转杯中，2500V，4ms电击一次，迅速加入0.8mL完全7H9培养基，37℃孵育3h后涂布到含Zeocin40mg/L的7H10固体平板上，37℃孵育72h后挑取阳性菌落增菌后抽提质粒，同时取1mL菌液，离心弃上清，沉淀加入0.5mL三蒸水，100℃热裂解8min，取上清2μL或质粒抽提物1μL为模板，分别作GLS，iL12和orim的pCR扩增.以鉴定正确的重组菌1×1011cfu/L感染培养的Raw264.7细胞，12h后取出培养孔内的细胞爬片进行抗酸染色并观察.同时将鉴定正确的重组菌划线传代5～10代后再次以pCR法进行鉴定，以观察重组质粒的稳定性.
2结果
2.1pZm03质粒在小鼠Raw264.7细胞中的转录与表达在转染有pZm03质粒的Raw264.7细胞中同时扩增出了编码人GLS和小鼠单链iL12的cDna片段（图2）.图中第1，4泳道分别为约267bp的GLS片段和约1671bp的iL12片段，与理论预计值图2pZm03真核共表达质粒转染Raw264.7细胞后转录产物的RtpCR结果完全相符.用山羊抗人GLS抗体为一抗，生物素化的兔抗山羊抗体为二抗，对pZm03质粒转染的小鼠Raw264.7细胞作免疫酶染色，发现在细胞质中有强阳性染色颗粒（图3）.a:用pZm03质粒转染后的Raw264.7细胞;
B:用pBudCe4.1质粒转染后的阴性对照.
图3pZm03质粒转染Raw264.7细胞48h后颗粒溶素的表达×250
2.2重组耻垢分枝杆菌菌苗的构建及其靶向性检测以重组菌裂解物或质粒抽提物为模板，作GLS，iL12和orim的pCR扩增（图4）.图中第1，2和3泳道分别为约267bp的GLS片段、约1671bp的iL12片段和约1914bp的分枝杆菌复制子orim片段，与理图4携带pZm03质粒的重组耻垢分枝杆菌菌落pCR鉴定论预计值完全相符.感染Raw264.7细胞后进行抗酸染色观察证明，重组菌具有良好的靶向递送能力，能够在目标细胞中巨量富集，镜下可见红色的抗酸染色菌株在巨噬细胞胞质中富集，巨噬细胞核呈蓝色，在细胞间隙中只有极少量散在分枝杆菌的存在（图5）.
图5感染12h后Raw264.7细胞中重组分枝杆菌的富集×1000
3讨论
细胞免疫是宿主抗结核感染的主要保护机制，活动性结核病患者全身整体免疫状态倾向于th2型［5-6］.iL12是一种功能强大的th1型免疫反应诱导剂，外源给予iL12可产生th2免疫状态向th1型免疫状态的逆转.在一个已建立th2型免疫反应的感染动物中，外源给予iL12仍能诱导出一个独立的与新免疫原相关的th1型免疫反应，pollock等［7］发现能够促进th2反应和强烈ige反应的CpB2.8抗原当与iL12共同免疫小鼠时，依旧能够引发出th1型反应并与一定程度上的保护作用有关.将共表达小鼠单链iL12与分枝杆菌保护性抗原ag85B的真核质粒免疫小鼠，通过细胞因子本身的生物学活性及其佐剂作用可以优化宿主抗结核的特异性免疫反应，诱导机体产生更加有效的免疫保护作用［8］.同时iL12对维持一定数量的th1记忆细胞也是必需的［9］，但iL12只能通过刺激免疫系统间接发挥治疗作用，不能对巨噬细胞内的mtb产生直接的杀伤作用.研究发现短尾猿用BCG第二次接种免疫后可激发2到9倍于初免时的Vγ2Vδ2+t细胞扩增，这是由于激活了初免时的记忆性t细胞，产生的回忆性反应引起的，并且这种扩增可持续7mo之久，其扩增强度与保护短尾猿免受致死性mtb攻击有正相关［10］；另有学者利用来自ppD反应阳性健康者的外周血单个核细胞，研究了受抗原刺激后扩增的t细胞抑制巨噬细胞内分枝杆菌生长的作用，发现BCG活菌苗和mtb全细菌裂解液刺激的记忆性t细胞能显著抑制分枝杆菌的胞内生长，而休眠t细胞缺乏此抑制能力，这表明休眠t细胞需要特定的抗原刺激来激活.耻垢分枝杆菌是人体的正常菌群，使用重组耻垢分枝杆菌菌苗，一方面可作为新型减毒有机体载体向巨噬细胞靶向递送GLS/iL12真核共表达质粒，另一方面还可对已经感染结核杆菌的机体进行二次免疫激发，以对结核病进行交叉基因治疗和免疫治疗（同时还可以结合药物治疗）的综合治疗.其原理是利用耻垢分枝杆菌菌体抗原与iL12共同作用于结核感染的机体后，通过分枝杆菌属共同抗原促进并激发宿主针对结核杆菌的特异性细胞免疫，纠正机体的免疫状态，间接清除体内的结核杆菌；与此同时耻垢分枝杆菌还可以作为基因治疗的减毒生物体载体，将含有激活的细胞毒性t淋巴细胞分泌的GLS基因的真核共表达质粒pZm03靶向导入巨噬细胞中表达，通过GLS与传统药物完全不同的机制直接杀灭胞内潜伏的结核杆菌，从而阻断结核杆菌在巨噬细胞内的潜伏.我们将编码人GLS的Dna片段和小鼠单链iL12基因、分枝杆菌复制子orim同时克隆入pBudCe4.1后，构建了可在分枝杆菌中复制，同时又可以在真核细胞中进行共表达的穿梭质粒pZm03，并转染小鼠巨噬细胞株Raw264.7，在体外从细胞水平同时检测到了两种基因的转录与表达产物，一方面表明在小鼠来源的巨噬细胞中同时获得此两种功能基因的表达是可能的，另一方面也证明利用分枝杆菌作为生物体载体靶向递送治疗性基因是可能的.这为后续在活体动物模型中应用该方法研究GLS，iL12及耻垢分枝杆菌的协同细胞免疫作用机制和免疫治疗作用奠定了基础.
参考文献
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单细胞生物的共同点篇2
【关键词】肝细胞;枯否细胞;共同培养技术;清蛋白类;细胞因子类;大鼠
【摘要】目的观察大鼠肝实质细胞与kupffer细胞体外共同培养时对两者生长、形态及功能的影响。方法采用原位二步ⅳ型胶原灌注法、percoll液密度梯度离心法分离wistar大鼠肝实质细胞与kupffer细胞;体外将肝实质细胞与kupffer细胞按6∶1比例共同培养。观察不同情况下肝细胞生存时间和形态，每隔24h检测培养上清液中清蛋白和谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)的水平，并在培养36h用放免法检测上清液中白细胞介素1(il?1)、白细胞介素6(il?6)、肿瘤坏死因子α(tnf?α)含量。结果单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速，并向正常肝细胞的形态演变，肝细胞可培养存活至15d;共同培养组肝细胞生长增殖缓慢，细胞可培养存活至10d。共同培养组上清液中清蛋白水平在24、36、48、60h比单独培养组低(t=2.551～3.139，p<0.05);alt、ast水平在24、36、48、60h比单独培养组高(t=2.446～3.108，p<0.05);共同培养组kupffer细胞保持il?1、il?6、tnf?α分泌功能，而单独培养组未检测到il?1、il?6、tnf?α。结论大鼠kupffer细胞和肝实质细胞在适宜的培养条件下可进行共同培养，二者可以保持良好的分泌功能，可用于实验研究。
【关键词】肝细胞;枯否细胞;共同培养技术;清蛋白类;细胞因子类;大鼠
theeffectofco?cultureinvitroofkupffercellswithhepatocytesonmorphologyandfunctionofhepatocytesinratskouchen?guang,caocheng?bo,yanxiao?wen,etal(departmentofgeneralsurgery,theaffiliatedhospitalofqingdaouniversitymedicalcollege,qingdao266003,china);[abstract]objectivetoobservethegrowth,morphology,andfunctionofhepatocyteswhenculturedinvitrowithkupffercellsinrats.methodsin?situⅳcollagenasetwo?stepperfusionmethodandlowspeedgradientcentrifugtionbypercollfluidwereusedtoisolateparenchymalhepaticcells(phc)andkupffercellsinwistarrat,respectively.cocultivationofphcandkupffercellswasdoneinvitroaccordingto6∶1ratio.thelivetimeandformofthecellsunderdifferentcircumstanceswereobserved.altandastlevelsinculturesupernatantweredetectedat24?hour?interval,andtheconcentrationofil?1,il?6andtnf?αmeasuredbyradioimmunoassayat36hours.resultsinsolitary?culturegroup,thehepatocytesgrewquicklyanddeve?lopedtotheformofnormallivercells,whichcouldsurvive15days;forthoseinco?culturegroup,thecellsgrewandgeneratedslowly,whichsurvived10days.thelevelsofalbumeninsupernateofco?culturegroup,at24h,36h,48hand60h,werelowerthanthatinsolitary?culturegroup(t=2.551-3.139,p<0.05),andthatofaltandast,atthesametimepointsasabove,werehigher(t=2.446-3.108,p<0.05).inco?culturegroup,thesecretoryfunctionofil?1,il?6,andtnf?αwasretained,andinsolitary?culturegroup,noil?1,il?6,andtnf?αweredetected.conclusionhepatocytesandkupffercellsofratcanbeculturedtogetherunderasuitablecondition,andthefavourablesecretoryfunctionofthecellsbemaintainedforempiricalstudy.
[keywords]hepatocyte;kupffercell;coculturetechnique;albumins;cytokines;rats
肝细胞分离、培养是研究肝脏和肝细胞的良好方法。尽管肝细胞在体内拥有相当强的增殖能力，但要肝细胞在体外保持分化状态且能继续增殖却非常困难。要明确影响肝细胞生长、分化和死亡的因素等，仍然面临认识水平和技术的挑战。实验已证实，肝实质细胞与非肝实质细胞或非肝细胞的共同培养可有效延长肝细胞的生存时间，促进肝细胞增殖;有助于保持细胞间特有的胆管结构，促进形成缝隙连接;可促进肝细胞的合成和分泌功能;有助于肝细胞维持其解毒功能[1?4]。目前进行的共同培养主要有肝细胞?非肝细胞培养或肝实质细胞?非实质细胞培养，而对肝细胞与kupffer细胞的共同培养的报道还较少。本实验在体外将肝实质细胞与kupffer细胞共同培养，观察体外联合培养体系中肝细胞形态、生长情况、功能的变化以及kupffer细胞细胞因子分泌情况,旨在为肝细胞在病毒学、免疫学、药理学及肝细胞移植等方面的研究提供良好的平台。
1材料与方法
1.1材料
雄性wistar大鼠6只，体质量180～200g，spf级，由青岛市药物检验所实验动物中心提供。rpmi?1640完全培养基购于中国医学科学院生物医学工程研究所;ⅳ型胶原酶、2.5g/l胰酶、锥虫蓝均购于美国sigma公司;percoll液购自于北京华美公司;考马斯亮蓝g?250、谷丙转氨酶(alt)试剂盒、谷草转氨酶(ast)试剂盒均由杭州博日生物技术有限公司提供;125i肿瘤坏死因子?α(tnf?α)放射免疫分析试剂盒、125i白细胞介素1(il?1)放射免疫分析试剂盒、125i白细胞介素?6(il?6)放射免疫分析试剂盒均购自北京普尔伟业生物科技有限公司。
1.2方法
1.2.1肝细胞及kupffer细胞的分离本文参照smedsrod等[5]方法加以改良分离收集肝细胞，利用percoll液密度梯度离心法收集kupffer细胞。
1.2.2肝细胞和kupffer细胞的培养及观察单独培养组调整肝细胞密度至1.5×108/l并接种到培养皿，置于含体积分数0.05co2孵箱，在37℃、100%湿度条件下培养，12h后更换新鲜培养液。共同培养组将肝细胞按1.5×108/l的细胞密度、kupffer细胞按2.5×107/l细胞密度(6∶1)共同接种于培养皿，置于含体积分数0.05co2孵箱，在37℃、100%湿度条件下培养，12h后更换新鲜培养液。每培养12h更换培养液并吸取上清液用全自动生化检测仪检测清蛋白、alt、ast、il?1、il?6、tnf?α，并观察细胞形态及生长情况。
1.2.3检测指标采用考马斯亮蓝g?250方法测定清蛋白，采用elisa法分别检测上清液中alt、ast、il?1、il?6及tnf?α含量。
1.3统计学处理
采用ppms1.5软件[6]进行统计学处理，数据以±s表示，组间比较用两样本均数t检验。
2结果
2.1形态学观察
倒置显微镜下，新分离的大鼠肝细胞晶莹透亮，呈圆球形，折光性强，有立体感。台盼蓝染色计数显示健康肝细胞的比例平均为92%。同时，新分离的kupffer细胞胞浆透亮，多呈圆球形，少数呈多形性，散在分布，大小不一致，约6h后，细胞开始伸展，体积增大，48h后细胞充分展开，呈典型的星形或多边形，边界不清。在单独培养组，肝细胞的生长、增殖较共同培养组的细胞迅速，接种4h后肝细胞贴壁、伸展，连接成条索状;24h后绝大多数肝细胞贴壁，呈扁平状，体积明显增大;48h后肝细胞贴壁牢固，细胞开始增殖，细胞间出现岛状连接，部分肝细胞呈双核;72h后肝细胞开始增殖，在原来肝细胞周围出现透明且体积较小的上皮样细胞，呈多边形，逐渐铺满培养皿底;10d后培养液的上清中悬浮细胞逐渐增多，细胞开始大量死亡;至培养15d时细胞全部死亡。在共同培养组，24h后绝大多数肝细胞贴壁，呈扁平状，体积增大;肝细胞生长增殖缓慢，于96h即开始出现少量的死亡细胞漂浮，至培养10d时细胞基本全部死亡。
2.2功能测定
共同培养组清蛋白水平在24、36、48、60h低于于单独培养组(t=2.551～3.139，p<0.05);共同培养组alt、ast水平在24、36、48、60h明显高于单独培养组(t=2.446～3.108，p<0.05);培养36h后，共同培养组上清液中il?1为(0.17±0.03)μg/l，il?6为(0.03±0.01)μg/l，tnf?α为(39.73±5.26)pmol/l，而单独培养组未检测到上述细胞因子。见表1～3。
表1各组大鼠肝细胞上清中清蛋白水平比较(ρ/g·l-1，±s)组别n24h36h48h60h单独培养组60.679±0.0450.556±0.0300.535±0.0440.536±0.044共同培养组60.548±0.059*0.472±0.057*0.468±0.047*0.477±0.033*与单独培养组比较,*t=2.551～3.139，p<0.05。
表2各组大鼠肝细胞上清中alt水平比较(z/u·l-1，±s)组别n24h36h48h60h单独培养组682.40±4.1882.90±2.6080.90±4.1682.80±2.92共同培养组689.90±3.69*86.90±2.62*87.20±3.50*89.80±4.65*与单独培养组比较,*t=2.666～3.108，p<0.05。
表3各组大鼠肝细胞上清中ast水平比较(z/u·l-1，±s)组别n24h36h48h60h单独培养组6142.20±5.54140.50±6.44150.60±4.42149.50±3.94共同培养组6151.20±5.57*148.90±5.33*160.80±6.78*155.60±3.24*与单独培养组比较,*t=2.446～3.090，p<0.05。
3讨论
3.1肝细胞的分离及形态功能观察
肝细胞是肝脏最主要的实质细胞类型，正常生理状况下占60%。肝细胞完成肝脏的绝大部分功能，是肝脏的主要效应细胞，同时也是生物及化学损伤的主要靶点。肝细胞性状的生物学检测，包括形态和功能两方面。研究发现，细胞接种2h后就开始贴壁，20h后约有80%的细胞贴壁，细胞贴壁后开始变平变薄，可见双核细胞和多核细胞，部分细胞开始小范围的呈岛状连接;48h变化更明显，整个细胞变薄并向四周拉平，细胞形成岛状连接成片，可见许多双核细胞和多核细胞;培养1周后可见少量的新生细胞，透亮，胞浆与胞核的区别不很明显;培养2周后，可见大量的新生细胞，也呈岛状生长，极具立体感[7?8]。
3.2kupffer细胞在机体防御和肝细胞损伤中的作用
kupffer细胞寄居于肝血窦内皮细胞之间或之上，是体内固定型巨噬细胞中最大的群体，占巨噬细胞总数的80%～90%，约占肝细胞总数的15%[9]。kupffer细胞的主要生理功能包括吞噬和清除功能，能吞噬和清除进入肝脏有害于人体的外来抗原、某些有害物质以及分泌前列腺素和氧化类物质，杀灭肿瘤细胞。以往研究发现，牛磺酸和支链氨基酸对四氯化碳所致的肝细胞损伤具有保护功能，其保护作用可能是通过抗脂质过氧化作用实现的[10]。在病理情况下，多种因素致使kupffer细胞活化，活化后其功能则明显增强，可合成和分泌多种生物活性物质，释放的大量促炎递质如tnf?α、il?1、il?6、il?8、氧自由基、一氧化氮以及花生四烯酸代谢产物等，能够参与机体的炎症反应和免疫反应，导致和加重肝细胞的损伤[11]。kupffer细胞能够通过表达fasl，与肝细胞表面的fas直接结合，诱导肝细胞凋亡[12]。kupffer细胞还能募集中性粒细胞和淋巴细胞进入肝组织，加重肝细胞损伤。鉴于kupffer细胞在肝脏功能中的重要作用，建立适宜的肝细胞kupffer细胞体外培养体系，对于进行肝细胞移植、肝细胞功能和药物代谢等的研究有重要意义。本实验kupffer细胞生长良好，保持il?1、il?6、tnf?α等细胞因子分泌功能。
3.3共同培养体系中kupffer细胞对肝细胞影响
共同培养体系即是将两种细胞(可以来自同一组织，亦可以来自不同的组织)混合共同培养，从而使其中一种细胞的形态与功能稳定表达，并维持较长的时间。原代肝细胞培养体系中由于分离过程的影响，总会有一些非实质细胞的污染。在复杂的细胞培养体系中，星形细胞来源的纤维母细胞和其他细胞也可以产生细胞外基质和细胞因子，从而建立起局部区域而支持肝细胞增殖或分化培养。本实验研究结果表明，肝细胞和kupffer细胞按6∶1的比例同步贴壁共培养，肝细胞在体外的生存时间和活性会受到一定的影响;共同培养组细胞培养基中的alt、ast释放明显增加，说明kupffer细胞能诱导肝细胞的损伤。清蛋白由肝脏合成，因此清蛋白浓度可以反映肝脏的功能。以往研究发现，活化的肝内非实质细胞产生tnf?α、il?6等细胞因子诱导肝细胞清蛋白合成的下降[13]。本研究显示，共同培养组清蛋白水平低于单独培养组，同时共同培养组检测到有il?1、il?6、tnf?α产生，而单独培养组未检测到三者，提示kupffer细胞与肝实质细胞体外共同培养时，通过分泌il?1、il?6、tnf?α使肝细胞蛋白合成功能受损。
本实验研究了kupffer细胞与肝实质细胞体外共同培养时，肝实质细胞生长、形态及功能的损伤情况，但其具体机制目前并不清楚。kupffer细胞和肝细胞的相互作用及其结果值得深入、全面地研究。
【参考文献】
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单细胞生物的共同点篇3
关键词:掌握有丝分裂减数分裂
单倍体的和卵细胞通过受精作用可以恢复为二倍体。减数分裂过程中四分体中的非姐妹染色单体的部分片段发生交换、非同源染色体自由组合，使得配子的遗传多样化，增加了后代的适应性，因此减数分裂不仅是保证生物种染色体数目稳定的机制，同且也是物种适应环境变化不断进化的机制。
有丝分裂和减数分裂既有区别又有联系，怎样使学生在这里既能把握联系又能区分不同呢？结合课堂教学实践，应该从以下方面入手：
1如何快速根据图像判定有丝分裂和减数分裂的时期
1.1根据染色体行为判断细胞分裂时期
首先，如果发现染色体无规律分布，则为前期。
其次，如果发现染色体排列在中央，则为中期。
最后，如果发现染色体移向两极，则为后期。
1.2根据染色体数目判断细胞分裂方式
首先看染色体的数目：奇数的话一定是减数第二次分裂（但是减数第二次分裂期染色体数目不一定为奇数），否则可能是有丝分裂或者减数第一次分裂。
其次看有无同源染色体：有的话一定不是减数第二次分裂。
最后如果有同源染色体，看同源染色体的行为。如果有联会、四分体存在则一定是减数第一次分裂。反之则为有丝分裂。
2有丝分裂和减数分裂的理论区别
首先，减数分裂过程中细胞连续分裂两次，而有丝分裂过程中细胞只分裂一次。
其次，减数分裂的结果是染色体数目减半，而有丝分裂的结果是染色体数目不变。
再次，减数分裂后，一个细胞变为四个含有不同遗传物质组合的子细胞（考虑四分体中非姐妹染色单体片段交换）。或者两两相同的子细胞（不考虑单体片段交换）。而有丝分裂后，一个细胞只形成两个遗传物质相同的子细胞。
第四，减数分裂过程中有其特有的同源染色体配对和同源非姐妹染色单体间的局部交换，而有丝分裂则没有。
最后，减数分裂发生部位为或者精巢和卵巢，有丝分裂发生部位为体细胞（但是原始生殖细胞即性原细胞发生增殖时属于有丝分裂）。
3有丝分裂和减数分裂的生物学意义区别
3.1有丝分裂的生物学意义：细胞有丝分裂的重要意义，是将亲代细胞的染色体经过复制以后，精确地平均分配到两个子细胞中去。由于染色体上有遗传物质，因而在生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。可见，细胞的有丝分裂对于生物的遗传有重要意义。有丝分裂的目的是细胞增殖，即细胞数量的增加。对于单细胞生物体，细胞分裂意味着生物个体数的增加。多细胞生物体的生殖活动也是通过细胞分裂完成的。对于多细胞生物体，细胞分裂则是生物体生长发育的基础。细胞分裂保证了细胞有足够大的表面积与环境进行物质交换，从而保证了新陈代谢对物质更新的需求。因此细胞分裂是生物体生长、发育和繁殖的基础。
3.2减数分裂的生物学意义：减数分裂是遗传学的基础。其目的是产生成熟的生殖细胞。具体表现在：
3.2.1基因分离律的细胞学基础：在减第一次分裂过程中，因为同源染色体分离，分别进入不同的子细胞，故在子细胞中只具有每对同源染色体中的一条染色体。减数分裂中同源染色体的分离，正是基因分离律的细胞学基础。
3.2.2基因连锁和互换的细胞学基础：同源染色体联会时，非姐妹染色单体之间对称的位置上可能发生片段交换，也就是父源和母源染色体之间发生遗传物质的交换。这种交换可使染色体上连锁在一起的基因发生重组，这就是染色体上基因连锁和互换的细胞学基础。
3.2.3配子的遗传基础多样化：由于减数分裂，使每种生物代代都能够保持二倍体的染色体数目。在减数分裂过程中非同源染色体重新组合，同源染色体间发生部分交换，结果使配子的遗传基础多样化，使后代对环境条件的变化有更大的适应性。
4有丝分裂和减数分裂的种类区别
4.1有丝分裂的类型：出现纺锤丝的细胞分裂均可看作是有丝分裂。所以减数分裂也是一种特殊的有丝分裂。
4.2减数分裂可分为三种主要类型
4.2.1配子减数分裂：配子减数分裂，也叫终端减数分裂，其特点是减数分裂和配子的发生紧密联系在一起。在雄性脊椎动物中，一个精原细胞变为初级精母细胞后减数分裂为2个次级精母细胞，2个次级精母细胞又一次进行减数分裂，总共形成4个精细胞。精细胞在经过一系列的变态发育，形成成熟的。在雌性脊椎动物中，一个卵母细胞经过减数分裂形成1个极体和1个次级卵细胞，次级卵细胞再分裂形成一个卵细胞和一个极体，极体也分裂为两个极体，总共形成一个卵细胞和三个极体。
4.2.2孢子减数分裂：孢子减数分裂，也叫中间减数分裂，（居间减数分裂）见于植物和某些藻类。其特点是减数分裂和配子发生没有直接的关系，减数分裂的结果是形成单倍体的配子体（小孢子和大孢子）。小孢子再经过两次有丝分裂形成包含一个营养核和两个雄配子（）的成熟花粉（雄配子体），大孢子经过三次有丝分裂形成胚囊（雌配子体），内含一个卵核、两个极核、3个反足细胞和两个助细胞。
4.2.3合子减数分裂：合子减数分裂，也叫初始减数分裂，仅见于真菌和某些原核生物，减数分裂发生于合子形成之后，形成单倍体的孢子，孢子通过有丝分裂产生新的单倍体后代。此外某些生物还具有体细胞减数分裂现象，如在蚊子幼虫的肠道中，有一些由核内有丝分裂形成的多倍体细胞，在蛹期又通过减数分裂降低了染色体倍性，增加了细胞数目。减数分裂由紧密连接的两次分裂构成。通常减数第一次分裂分离的是同源染色体，所以称为异型分裂或减数分裂。减数第二次分裂分离的是姊妹染色体，类似于有丝分裂，所以称为同型分裂或均等分裂。
5有丝分裂和减数分裂的相同点及联系
5.1Dna分子的数量计算都相同：其一，有染色单体时，Dna数等于染色单体数。其二，无染色单体时，Dna数等于染色体数。
5.2染色体数的计算都相同：染色体数等于着丝点数。
5.3都有纺锤丝、染色体出现：纺锤丝、染色体在两种分裂过程中均出现。
单细胞生物的共同点篇4
一本章的主要内容和特点
本章是在学生初中阶段初步学习过细胞的知识，以及在前一章学习了关于生命的物质基础知识的基础上，进一步学习高中阶段的关于细胞的知识。生物体的一切生命活动，主要是在细胞内进行的。因此，高中阶段有必要从细胞是生命活动的基本单位的高度，进一步讲述真核细胞的亚显微结构和主要功能的知识，以及有关细胞增殖、分化、癌变和衰老的知识。
本章包括三节教材：第一节《细胞的结构和功能》；第二节《细胞增殖》；第三节《细胞的分化、癌变和衰老》。第一节《细胞的结构和功能》内容很丰富，共分三小节：第一小节《细胞膜的结构和功能》，本小节内容以及章的引言和第一节的引言，共需用3课时教学；第二小节《细胞质的结构和功能》，需用2课时教学；第三小节《细胞核的结构和功能》，共需用2课时教学。第二节《细胞增殖》，需用1课时教学。第三节《细胞的分化、癌变和衰老》，需用1课时教学。此外，本章有两个学生实验。
第一节《细胞的结构和功能》，在分成小节讲述之前，用了几小段文字和一些图表，先介绍了几点有关的内容：观察细胞内部的精细结构，必须应用电子显微镜或其他更为精密的仪器；细胞的种类繁多，大小、形状各不相同，功能也不相同；细胞可分为原核细胞和真核细胞两大类，绝大多数生物是由真核细胞构成的；细胞虽然微小，但是有非常精细的结构和复杂的自控能力，这些是细胞能够进行各种生命活动的基础。真核细胞比原核细胞复杂得多，因此，首先学习关于真核细胞的结构和功能的知识。
第一节的第一小节《细胞膜的结构和功能》，主要讲述细胞膜的分子结构和细胞膜的主要功能两方面的内容。第一方面，关于细胞膜的分子结构，明确提出细胞膜是一层由磷脂和蛋白质构成的膜。在细胞膜的中间是磷脂双分子层，这是细胞膜的基本支架；有的蛋白质分子排布在磷脂双分子层的表层；有的蛋白质分子部分嵌插或贯穿在整个磷脂双分子层中。构成细胞膜的磷脂分子和蛋白质分子大都是可以流动的，这种特点对于细胞膜完成各种生理功能非常重要。再有，在细胞膜的外表有一层糖蛋白，叫做糖被，它在细胞生命活动中有重要功能。第二方面，关于细胞膜的主要功能，主要讲述细胞膜与周围环境进行物质交换的功能，而对细胞膜的其他多种功能不可能都加以介绍。由于细胞膜与周围环境进行物质交换的内容比较复杂，学生在学习上有一定难度，因此教材本着化繁为简、深入浅出的精神，主要讲述了自由扩散方式和主动运输方式，略去了其他运输方式。教材强调指出，自由扩散是被动运输的方式；主动运输方式的特点是必须有载体蛋白质的协助，需要消耗细胞内新陈代谢所释放的能量。主动运输能够保证活细胞按照生命活动的需要，主动地选择吸收所需要的营养物质。接着，在讲了上述两种运输方式的基础上，明确指出细胞膜的通透性特点：细胞膜是一种选择透过性膜。
第一节的第二小节《细胞质的结构和功能》，主要讲述细胞质基质和细胞器两方面的内容。第一方面，关于细胞质基质的内容有：细胞质基质中含有多种无机的和有机的化合物；细胞质基质是活细胞进行新陈代谢的主要场所；在细胞质基质中存在着多种细胞器。第二方面，关于细胞器的内容，占了本节的大部分篇幅，重点讲了线粒体和叶绿体这两种细胞器，主要说明这两种细胞器在动植物体中存在的部位、在细胞内的分布、基本结构和主要功能，这些知识是学习后面有关章节必备的基础知识。此外，还简要讲述了内质网、核糖体、高尔基体、中心体和液泡这5种细胞器。本节教材最后强调指出，在活细胞完成各种生命活动的过程中，细胞质基质和细胞器是相互协调的，各种细胞器之间也是密切联系的。，全国公务员共同天地
第一节的第三小节《细胞核的结构和功能》，主要讲述细胞核的结构、细胞核的主要功能、原核细胞的基本结构三点内容。第一点，关于细胞核的结构，简要介绍了核膜、核仁和染色质的知识。第二点，关于细胞核的主要功能，强调了细胞核是遗传物质储存和复制的主要场所，是细胞遗传特性和细胞代谢活动的控制中心，因此它是细胞结构中最主要的部分。第三点，关于原核细胞的基本结构，很简要地介绍了原核细胞在大小、细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核这几个方面与真核细胞不同的特点，并且强调指出原核细胞最主要的特点是没有由核膜包围的细胞核。
第二节《细胞增殖》，在节的引言中指出细胞增殖是生物体的重要基本特征，细胞以分裂的方式进行增殖；细胞分裂是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础；真核细胞的分裂方式有有丝分裂、无丝分裂和减数分裂三种方式。本节教材主要讲述两方面内容：一方面，以大部分的篇幅讲述真核细胞的有丝分裂方式；另一方面，简要介绍真核细胞无丝分裂方式的特点。
关于有丝分裂的内容，主要有三点。在讲述这三点内容之前，先明确指出有丝分裂方式是真核细胞进行细胞分裂的主要方式，多细胞生物体以有丝分裂的方式增加体细胞的数量，体细胞进行有丝分裂是有周期性的。接着，讲述第一点内容，即细胞周期，主要讲述了细胞周期的概念、细胞周期包括分裂间期和分裂期两个阶段、这两个阶段所占时间的长短。第二点内容，讲述细胞分裂间期，强调指出这个时期是新细胞周期的开始，最大的特点是完成了Dna分子的复制和有关蛋白质的合成，为紧接着的细胞分裂期准备了条件，因此，细胞分裂间期是细胞周期中极为关键的准备阶段。第三点内容，讲述细胞分裂期，明确指出这个时期的特点主要是细胞核明显地发生着染色体的有规律的连续变化。为了研究的方便，分裂期又分为前期、中期、后期、末期。本节教材以较多的篇幅，着重讲述了分裂期各个时期细胞核内染色体的变化特点。在讲述了有丝分裂上述知识的基础上，最后指出有丝分裂的重要意义：将亲代细胞的染色体经过复制以后，精确地平均分配到两个子细胞中去；由于染色体上有遗传物质，因此使生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。
关于无丝分裂方式，简要介绍了这种分裂方式的过程，以及因为在分裂过程中没有出现纺锤丝和染色体，所以叫做无丝分裂。
关于减数分裂方式，仅仅指出这种分裂方式是一种特殊方式的有丝分裂，与有性生殖细胞的形成有关，具体的分裂过程留待后面的有关章节讲述。
第三节《细胞的分化、癌变和衰老》，主要讲述了三方面的内容。关于细胞的分化，主要内容有：首先，明确指出细胞分化是生物界中普遍存在的一种生命现象，仅有细胞的增殖，而没有细胞的分化，生物体是不能正常发育的。接着，讲述了细胞分化的概念，并且说明细胞分化是在生物体整个生命进程中的一种持久性变化，但是在胚胎时期达到最大的限度。再有，提出多细胞生物必须经过细胞分化，体内才会形成多种不同的细胞和组织。最后，说明高度分化的植物细胞仍然保持着细胞的全能性。
关于细胞的癌变，之所以放在本节教材的第二部分来讲，是因为细胞的畸形分化与癌细胞的产生有直接关系，与细胞分化的知识有密切联系。细胞癌变的主要内容有：首先，提出癌细胞有一些独具的特征，教材中只介绍了癌细胞能够无限增殖、形态结构发生了变化、表面也发生了变化等特征。其次，讲述了导致细胞癌变的三大类致癌因子，即物理致癌因子、化学致癌因子和病毒致癌因子，同时也提出了致癌基因。最后，简要讲述了从多方面来预防细胞发生癌变。
关于细胞的衰老，首先说明细胞的衰老和死亡也是一种常见的生命现象。接着，进一步说明衰老的过程是细胞内生理和生化发生变化的过程，最终反映在细胞的形态、结构和功能上发生了变化，因而具有细胞衰老的共同特征，教材中提出了5种衰老的特征。最后指出，至今还没有一种假说能够完全揭示细胞衰老的原因。目前的科研工作表明，细胞衰老可能是多种内因和外因共同作用的结果。
二本章与其他章的联系
1.关于细胞膜的分子结构特点和功能的知识，对于后面学习《生物的新陈代谢》，讲述物质出入细胞、物质代谢等内容，是重要的基础知识。
2.关于细胞器的知识，与讲述物质代谢和能量代谢有直接关系。例如，叶绿体的结构和功能与光合作用关系密切，线粒体的结构和功能与有氧呼吸关系密切。
3.关于有丝分裂的知识，对于后面学习《生物的生殖和发育》一章中关于减数分裂的知识，是重要的基础。
单细胞生物的共同点篇5
【关键词】微流控芯片；肿瘤相关成纤维细胞；胃癌；耐药
theRelevanceofCaFsinfluencingtheDrugResistantofGastricCancerCellsandtheGRp-78expressionBasedonmicrofluidicChip/SHUaiZhi-feng，HanCui-cui，ZHanGXiao-jie.//medicalinnovationofChina，2016，13（09）：005-008
【abstract】objective：theplatformofmicrofluidicchipisusedtoexploretherelevanceofcancer-associatedfibroblasts（CaFs）influencingtheresisitenceofhumangastriccancerSGC7901cellstochemotherapydrugsandtheexpressionofGRp-78，toprovidethenewideathatCaFsandGRp78astargetsimprovetumordrugresistanceforclinicalwork.method：amicrofluidicchipsystemofthree-dimensionalco-culturewasdesignedindependentlywhichcouldbeusedfordrugsensitivedetectionandproteinsemi-quantitativeinthisexperiment.three-dimensionalcultureofgastriccancercelllinewasachievedbyperfusingcellsuspension-gelmixture.apoptosisstainingwasappliedtodetectthesensitivityofSGC7901cellstochemotherapeuticdrugscisplatinwithdifferentconcentrationsinseparateculturegroupofSGC7901cells（thecontrolgroup），co-culturegroupofSGC7901cellsandnFs，co-culturegroupofSGC7901cellsandCaFs.theexpressionsofGRp78inthecontrolgroupandexperimentalgroupweredetectedbyimmunofluorescentassay.Result：Comparedwiththecontrolgroup，thesensitivityofhumangastriccancerSGC7901cellstocisplatinintheco-culturegroupofSGC7901cellsandCaFswasobviouslylowerthanthatinthecontrolgroup（p
【Keywords】microfluidicchip；Cancer-associatedfibroblasts；Gastriccancer；Drugresistance
First-author’saddress：BasicmedicalCollege，HeilongjiangUniversityofChinesemedicine，Harbin150040，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.09.002
胃癌是我国最常见和死亡率最高的恶性肿瘤之一[1-2]，严重影响人们的生命和健康。化疗是治疗进展期和转移性胃癌的主要方法，但现应用5-FU、顺铂和紫杉醇为基础的各种联合化疗方案的总体有效率只有20%～40%，肿瘤细胞对化疗药物产生耐受性常常导致化疗失败[3-4]。已有研究发现，CaFs在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等过程中均起到了重要作用，并可能与肿瘤的耐药性相关[5-6]。微流控芯片是一种在微米尺度空间对流体进行操纵为主要特征的科学技术，由于芯片中流体通道直径与细胞生长所需空间相适宜，通过连续动态供养、多种细胞的三维共培养，使细胞生长环境更加类似于其在体内的真实生长状态[7]。因此，本研究拟通过微流控芯片平台进行CaFs、nFs和胃癌细胞共培养，来探索CaFs影响胃癌细胞对化疗药物的耐药及其与GRp78表达的相关性，从而为临床工作提供以CaFs和GRp78为靶点来改善肿瘤耐药的新思路。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1细胞系人胃癌细胞系SGC7901细胞，为齐齐哈尔医学院医药科学研究院提供。
1.1.2新鲜组织获取人新鲜胃癌组织来源于本院附属医院肿瘤外科，人包皮新鲜组织来源于本院附属医院泌尿外科，均由术中获取，获取前经患者或家属知情同意和本单位伦理委员会许可。
1.1.3主要试剂优质胎牛血清、碘化丙碇（pi）染色剂、羊抗人GRp78抗体、鼠抗人平滑肌肌动蛋白抗体Sma和鼠抗人β-actin抗体均购自Sigma公司；FitC标记荧光二抗、辣根酶igG抗体、蛋白提取剂试剂盒和BCa蛋白定量试剂盒均购自碧云天公司；基底膜提取物（Bme）购自R&DSystems公司；Rpmi1640和imDm基础培养液购自hyclone公司；顺铂购自aladdin公司。
1.2方法
1.2.1微流控芯片的构建与处理本课题组设计了微流控芯片CaD图形，并交于大连海事大学基于标准软光刻技术制作SU-8负胶模板。此设计用于药敏检测及蛋白半定量的三维联合共培养微流控芯片体系，通过灌注细胞悬液-凝胶混合物于三维培养池内来实现胃癌细胞系的三维培养；通过中部连接通道上的二维培养单元来实现成CaFs、nFs与胃癌细胞的非接触式共培养；并通过微型注射泵持续注入实现流动实时营养物供给，使细胞所处的环境更加接近体内肿瘤微环境，以便模拟人体内肿瘤的真实状况。主要方法：于模板上制作pDmS基片，等离子清洗活化pDmS基片和玻璃载玻片，使之相互键合，完成芯片制备过程。使用前，向芯片的进液孔注入无水乙醇并使之充满整个通道，然后用蒸馏水冲洗乙醇，操作3次，将芯片于高压蒸汽锅内高压灭菌，烘箱中烘干，紫外消毒后使用。微流控芯片及局部结构示意图见图1。
1.2.2实验分组实验分单培养组（对照组）和共培养组（实验组）。对照组为单培养组（胃癌细胞系SGC7901细胞），共培养组分为SGC7901细胞+CaFs共培养组、SGC7901细胞+nFs共培养组。
1.2.3药敏检测三组芯片中各实验组细胞培养48h后，通过mS26微量泵经芯片药物入口将顺铂泵入芯片，将芯片置于孵箱内诱导48h。pBS注入芯片，冲洗细胞后向芯片中注入pi染液，倒置荧光显微镜下观察。
1.2.4耐药相关蛋白表达三组芯片中各实验组细胞培养48h后，免疫荧光检测各实验组细胞中GRp78蛋白的表达。
1.3统计学处理采用SpSS19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用字2检验，以p
2结果
2.1顺铂药物敏感性的检测为了验证CaFs对肿瘤细胞药物敏感性的影响，笔者把各实验组细胞用顺铂作用48h，pi染色后荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。SGC7901细胞+CaFs共培养组与单培养组相比，SGC7901细胞对顺铂的敏感性较SGC7901细胞单独培养时低（p
2.2GRp78蛋白表达的检测为了验证CaFs和SGC7901细胞共培养后对SGC7901细胞中GRp78蛋白表达的影响，以及探讨GRp78的表达与CaFs引起的肿瘤细胞对顺铂耐药的相关性，用芯片平台免疫荧光法检测SGC7901细胞GRp78蛋白表达水平。SGC7901细胞+CaFs共培养组SGC7901细胞中GRp78蛋白表达较对照组升高（p
3讨论
胃癌的发病率占消化系统肿瘤的第一位，是我国死亡率最高的恶性肿瘤之一。早期胃癌主要通过手术治疗，而晚期和转移性胃癌主要依靠化疗，但胃癌的耐药现象往往导致胃癌化疗失败，因此探讨胃癌耐药机制成为一项重要的研究课题[7-8]。
以往的大量体外实验研究证实，许多化疗药物均能显著诱导胃癌细胞系发生凋亡，但这一结果在内体研究时往往效果并不明显，因为体内肿瘤微环境要远比体外单一的实验环境复杂得多，尤其是肿瘤相关成纤维细胞（CaFs）可能参与了胃癌细胞的耐药过程[9]。
本课题组构建了微流控芯片细胞三维共培养平台实现肿瘤相关成纤维细胞与胃癌细胞的非接触共培养，探讨CaFs对胃癌细胞耐药性的影响。微流控芯片技术构建的实验室具有微型化、高通量、集成化的优势，能实现肿瘤细胞的三维动态培养。利用微流控芯片将肿瘤细胞和间质细胞进行共培养，芯片通道与细胞大小相适应，模拟了细胞在体内生长所需的空间；利用微量泵给细胞提供流动培养基，并带走代谢废物，更加真实地模拟肿瘤在体内的生存状态，构建了体内肿瘤微环境，是进行肿瘤相关研究的理想模式。
肿瘤间质相关成纤维细胞（CaFs）与创伤修复过程中的成纤维细胞不同，不再向正常表型转化，而保持持续活化的特征，并通过产生各种细胞因子促进临近肿瘤细胞的生长、侵袭和转移，促进肿瘤的演进。CaFs和肿瘤细胞之间的相互作用表现在许多方面，它还可能与肿瘤细胞的耐药性有关，而以往对肿瘤耐药性的研究多侧重于肿瘤细胞本身，但越来越多的研究者发现肿瘤间质成分可能通过各种途径影响肿瘤细胞的耐药性。为了验证CaFs对肿瘤细胞药物敏感性的影响，笔者把各实验组细胞用顺铂作用48h，pi染色后显微镜下细胞凋亡情况。结果显示CaFs+SGC7901共培养组与单培养组相比，SGC7901细胞对顺铂的敏感性较SGC7901细胞单独培养时低（p
CaFs可能通过代谢调节、免疫调节等途径促进肿瘤细胞的耐药。肿瘤细胞由于增殖速度快，必然导致营养相对供应不足，造成局部低氧和酸中毒的微环境，可诱导葡萄糖调节蛋白（Glucoseregulatedproteins，GRps）的产生[12]，其中GRp78是这种应激性蛋白的代表。它是一种内质网分子伴侣蛋白，许多研究报道GRp78高表达与某些肿瘤细胞耐药相关[13-15]。本研究用微流控芯片平台免疫荧光法检测SGC7901细胞GRp78蛋白表达水平，探讨CaFs引起的胃癌细胞对顺铂的耐药是否能引起与GRp78蛋白表达的改变。结果CaFs与SGC7901细胞共培养组SGC7901细胞中GRp78蛋白表达较对照组升高（p
综上所述，肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤微环境中最主要的宿主细胞，肿瘤微环境中的CaFs可能通过增加肿瘤细胞中GRp78蛋白的表达而引起胃癌细胞对顺铂的耐药，微流控芯片构建的肿瘤细胞成纤维细胞共培养体系能真实模拟体内肿瘤微环境，是研究肿瘤的理想模式。
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单细胞生物的共同点篇6
【关键词】辛伐他汀;CD40;iFnγ;单个核细胞;急性冠状动脉综合征
effectsofSimvastatinonexpressionofCD40inperipheralBloodmononuclearCellsinducedwithiFnγ tianCaixia1,Qinweichao1,wanGJianing2,QiUFangcheng1,LiUtangxin3*(1DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospital,2instituteofClinicalmedcine,RenminHospital,3Departmentoforthopedics,taiheHospital,YunyangmedicalCollege,Shiyan,Hubei442000,China)
abstract:objectivetoexplorethechangeofCD40expressioninperipheralbloodmononuclearcells(pBmnC)withinductionofiFnγ,andtheeffectsofsimvastatinonexpressionofCD40inducedwithiFnγinpBmnCswithdifferentgenotypes.methodsFortytwohealthyvolunteerswereenrolled,pBmnCswereseparatedfromheparinizedvenousbloodbydensitygradientcentrifugationandthenculturedwith100μg/LiFnγor20μmol/Lsimvastatinfor24h.theCD40expressionlevelwasdeterminedbyflowcytometry.GenotypesoftheCD401C/twereassayedbypolymerasechainreactionrestrictedfragmentlengthpolymorphism(pCRRFLp).theexpressionlevelsofCD40inpBmnCwithdifferentgenotypeswereanalyzed.ResultsthelevelsofCD40expressionwithoutinterventionwasincreasedafter24h,however,therewasnosignificantdifferenceamongCC,Ctandttgenotypes(p>0.05).thelevelsofCD40expressioninpBmnCinallgenotypeswereincreasedsignificantlyafterinductionwithiFnγandculturefor24h,andtheincreaseextentofCCgenotypewassignificanthigherthanthatoftheothergenotypes(p<0.05).SimvastatincouldsignificantlyinhibitedtheexpressionofCD40inpBmnCinducedwithiFnγ,whiletheinhibitoryeffectsofSimvastatinhadnosignificantdifferenceamongdifferentgenotypes.ConclusionCD401C/tpolymorphismcouldinfluencetheCD40expressionofpBmnC,SimvastatincouldmarkedlyinhibittheexpressionofCD40inpBmnCsinducedwithiFnγ,buttherewasnosignificantdifferenceintheprotectiveeffectsofSimvastatinamongdifferentgenotypesofpBmnCs.
Keywords:Simvastatin;CD40;iFnγ;mononuclearcell;acutecoronarysyndrome
最近的研究[1]发现，他汀类药物除具有调脂作用外，还具有抗炎症反应作用。CD40属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，具有所有炎性因子的共同特征。药物基因组学研究认为[2]，基因表型与药物疗效之间存在着明显关系。辛伐他汀是否影响CD40的表达及对不同基因表型个体的抗炎效应是否相同还不清楚。本文探讨经干扰素γ(iFnγ)干预后，辛伐他汀对CD40表达的调节作用，并进一步探讨其对携带CD40不同基因表型的单个核细胞表达CD40的影响。
1资料与方法
1.1一般资料
随机选择郧阳医学院附属人民医院体检保健科的健康志愿者42例，均经体检及实验室检查排除任何感染症状和炎症状态，平均年龄(25.43±3.15)岁，其中男30例，女12例。
1.2外周血单个核细胞的分离及培养
采集健康志愿者外周静脉血16mL，eDtana2抗凝，用pBS缓冲液1∶1稀释，轻轻颠倒试管混匀。用尖头吸管将稀释血轻轻平铺于离心管内的淋巴细胞分离液表面(比重1.007)，稀释血与淋巴细胞分离液体积比为2∶1，可见二者间形成清晰界面，室温下水平式离心机2000r/min离心20min，离心后单个核淋巴细胞呈白膜状悬于分离液层与红细胞层之间，用尖头吸管小心吸取单个核淋巴细胞层至新的离心管，用含10%胎牛血清的Rpmi1640培养液洗涤2次(室温下水平式离心机1500r/min离心10min)，将清洗后的细胞重悬于Rpmi1640培养液中(含10%胎牛血清、1nmol/L谷氨酰胺、105U/L青链霉素)，取0.1mL，台盼兰染色，显微镜下计数活细胞比率，要求>95%。
将细胞接种于培养皿中，置于37℃5%Co2培养箱孵育2h后，吸出培养液，用37℃预热的新鲜培养液清洗3次，洗脱未贴壁细胞，贴壁细胞即主要为单核细胞。瑞氏染色鉴定贴壁细胞中单核细胞比率占85%以上。将贴壁细胞用细胞刮片轻轻刮下，重悬于Rpmi1640培养液中，调整细胞浓度为1×106/mL，并接种于24孔培养板，2mL/孔。
1.3研究对象CD401C/t单核苷酸多态性基因分型
改良的碘化钠法提取模板Dna，聚合酶链反应扩增包含1C/t位点的特异性片段，扩增产物用5U限制性内切酶ncoⅠ酶切，37℃反应6h，反应终止后，消化片段用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶(eB)染色，紫外灯下观察。
1.4实验分组
给予100μg/LiFnγ干预作为刺激状态组，以20μmol/L辛伐他汀先与单个核细胞共孵育1h，再给予100μg/LiFnγ刺激为辛伐他汀干预组，24h后用流式细胞仪检测培养的单个核细胞表面CD40的表达水平。
1.5统计学分析
计量资料用x±s表示，两样本之间计量资料比较用两独立样本t检验，多样本之间计量资料比较用单因素方差分析，所有数据均在SpSS11.5软件包上分析，p<0.05为有统计学意义。
2结果
2.1研究对象基本资料
42例研究对象按照CD401C/t位点基因型分为CC基因型(13例)，Ct基因型(24例)和tt基因型(5例)。研究对象的临床和生化特征见表1，可见三种基因型研究对象间性别、年龄、Bmi、收缩压、舒张压、血糖、tC、tG、LDLC、HDLC、apoai、apoB等差异无统计学意义(p均>0.05)。表142例不同基因型研究对象间临床和生化特征的比较
2.2基础状态下CD40基因1C/t多态性对单个核细胞表达CD40的影响
基础状态下，三种基因型单个核细胞培养24h后，细胞表面CD40表达量均显著升高。CC、Ct、tt三种基因型单个核细胞在0hCD40表达量无显著性差异，培养24h后，三种基因型单个核细胞CD40表达水平也无显著性差异，见表2。表2基础状态下不同基因型单个核细胞表达CD40水平的比较(x±s,mFi)
2.3iFnγ刺激状态下CD40基因1C/t多态性对单个核细胞表达CD40的影响及辛伐他汀的干预作用
100μg/LiFnγ刺激状态下，单个核细胞培养24h后CD40表达量呈显著升高水平，不同基因型单个核细胞CD40表达上升的幅度有显著性差异，分别为CC型上升6.41倍，Ct型上升3.68倍，tt型上升2.35倍，20μmol/L辛伐他汀显著抑制经iFnγ诱导后CD40的表达，然而对不同基因型单个核细胞的抑制程度没有显著性差异，对CC、Ct、tt型的抑制率分别为46.4%、39.6%、36.8%。表3三种状态下不同基因型单个核细胞培养24h后表达CD40水平的比较(x±s,mFi)
3讨论
急性冠状动脉综合征(acuteCoronarySyndrome,aCS)是以动脉粥样硬化斑块破裂或糜烂，继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征，炎症反应的激活可能是发生aCS的因素之一。最新的研究证实[3]，炎性细胞因子CD40在aCS发生发展过程中起到了激活炎症细胞、启动炎症反应的作用，是介导这一炎症反应的重要介质。在正常情况下，血管内皮具有抵抗白细胞浸润的能力，并且只少量表达CD40，血管内皮受到损伤时，如干扰素γ(iFnγ)的刺激下，CD40大量表达，并与其配体CD40L结合，进而激活粥样斑块中的巨噬细胞、内皮细胞以及t淋巴细胞分泌黏附分子、细胞因子(iL6、tnFα、iFnγ等)、基质金属蛋白酶和组织因子等[4]。因此，CD40CD40L的激活能加速动脉粥样硬化的发生发展，并触发斑块不稳定，裂缝形成，甚至破裂，导致aCS的发生。
激活的单核/巨噬细胞是CD40的重要来源之一，机体单个核细胞不仅容易获取、分离、培养，而且被激活后可与内皮细胞粘附并向内皮下迁移，这也是动脉粥样硬化发生的首要步骤。iFnγ可诱导单个核细胞募集，促进泡沫细胞和指纹形成，促进血管壁细胞产生炎性因子，还可显著促进单核细胞分泌CD40[5]。
我们的体外实验证实，经iFnγ刺激后，单个核细胞大量表达CD40，这与国外报道相一致[6]。iFnγ是aCS炎症反应中关键的介质之一，也是调节CD40生成的主要因子，实验结果提示，iFnγ能直接激活人外周血单个核细胞，参与机体的炎症反应。
基因组的变异是普遍存在的，且绝大多数变异都不具功能性，没有生物学意义，不影响基因表达产物的功能或表达水平。我们在前面的研究[7]中发现中国湖北地区汉族人群CD40基因启动子上游1位点存在单核苷酸C和t的互换，但此多态性在中国人中是否具有功能性、是否影响CD40基因的转录或翻译效率，尚需探讨。本实验发现携带CD40不同基因表型的单个核细胞经iFnγ刺激后，CD40表达上升的幅度有显著性差异，CC基因型上升的幅度最大，Ct基因型次之，tt基因型上升幅度最小，据此可推测CD401C/t基因多态性可能在某种程度上影响CD40的表达。目前尚不明确CD40基因1C/t多态性影响CD40基因转录效率或翻译效率的机制，推测可能CD40基因1C/t多态性通过一些未知的Dna结合序列影响CD40基因的转录或翻译，也有可能该多态性并不真正影响CD40基因的转录，只因与CD40基因中另一个有功能的多态性连锁而得出上述结论。iFnγ可促进单核/巨噬细胞合成tnFα、iLβ及表达nFκB，我们在研究中虽没有检测这些因子的表达水平，但不排除CD40基因1C/t多态性通过与这些炎性因子的相互作用影响单个核细胞表达CD40效率的可能。CD40基因的转录和翻译调控复杂，启动子区任何微小的变异都有可能影响该系统的调节，要完全了解CD40基因1C/t多态性的功能需进行单体分析及分析与各种转录因子的共同作用。
随着分子生物学的发展和人类基因组计划的完成，药物基因组学成为研究的热点，不同患者对同一种药物的作用效果和药物代谢可能存在差异，而这种差异可能是由不同患者所携带的基因型不同引起的。他汀类药物是临床上常用的治疗冠心病的药物，具有很好的调脂和抗炎疗效[8]。本研究用20μmol/L辛伐他汀观察其对单个核细胞表达CD40的调节作用，并进一步探讨其对不同基因表型单个核细胞的影响，发现辛伐他汀可显著抑制iFnγ诱导的CD40的表达，但在不同基因型单个核细胞中，辛伐他汀的抑制效率没有显著性差异，对CC、Ct、tt型的抑制率分别为46.4%、39.6%、36.8%。本研究在体外证实了辛伐他汀的抗炎作用，下一步我们将探讨在非炎症状态下，即单一辛伐他汀处理细胞，观察其对基础状态下单个核细胞的影响。
综上所述，经辛伐他汀处理后，炎症因子CD40大幅度下降可以初步反映临床上aCS患者在他汀类药物治疗后的良好效应，提示应激状态下单个核细胞对早期他汀药物干预反应良好，炎症活动减弱，有助于斑块钝化，然而在临床上对不同基因型的患者使用辛伐他汀治疗，在抗炎效果上可能没有差异。
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单细胞生物的共同点篇7
补体成分激活后产生的裂解片段，能与免疫细胞表面的特异性受体结合。这对于补体发挥其生物学活性具有重要意义。
补体受体(complementruceptor’CR)曾按其所结合配体而命名为C3b受体、C3d受体等；但经详细研究后发现，补体受体并非仅与C3裂解产物反应，因而按其发现先后依次命名为CR1（CD35），CR2（CD21），CR3（CD11b/CD18）’CR4(gp150’90:CD11c/CD18)。其主要特征列于表3-5。此外，尚有其他补体成分的受体，如Ciq受体、C3a受体、C5a受体等。因对其了解不够清楚，不拟介绍。表3-5补体受体的特征（略）
一、CR1（CD35）
CR1作为免疫粘附(immuneadherent’ia)受体而引起免疫粘附现象早已熟知。此受体也称为C3b受体或C3b/C4b受体。据报道，红细胞上的CR1数约为50～1400个/细胞，其数目显著少于B细胞和吞噬细胞，但体内90%的CR1却存于红细胞上。
提纯的CR1为分子量约200kD的糖蛋白，但后来发现它有4种分子量不同的同种异型。最近，wong等（1986）已经阐明，分子量的差异是由于基因不同所致。
CR1的免疫功能可能有以下几方面：①中性粒细胞和单核-巨噬细胞上的CR1，可与结合在细菌或病毒上的C3b结合，促进吞噬细胞的吞噬作用；②促进两条激活途径中的C3转化酶（C42），C3bBb）的激活；③作为i因子的辅助因子，促使C3b和C4b灭活；④红细胞上的CR1可与被调理（结合有C3b）的细胞、病毒或免疫复合物等结合，以便运送到肝、脾进行处理，SLe病人免疫复合物量明显增多，其红细胞膜上的CR1在体内有运送免疫复合物的作用；⑤B淋巴细胞膜上的CR1与CR2协同作用下，可促使B细胞活化。
二、CR2（CD21）
CR2旧称C3d受体，已经证明，它是B细胞上的eB病毒受体。CR2配体按其亲和性的高低程度依次为C3dg、C3d、ic3b。C3b亲和性虽低，但亦可与其反应。
CR2的免疫功能尚未阐明清楚，但实验表明，当加入CR2配体时可使B细胞活化。据此推想，在抗体的二次应答中它也许会想某种作用，即借结合在抗原复合物上的C3裂解产物，引起针对该抗原的二次抗体应答。
三、CR3（CD11b/CD18）
CR3亦称为ic3b受体，CR3的配体是iC3b’但CR1、CR2、也和iC3b反应。CR3与配体结合时尚需有二价离子存在，为其特点。
CR3是由分子量165kD的α链（CD11b）和95kD的β链(CD18)非共价结合的糖蛋白’识别此分子的单克隆抗体有mac-1和mo-1等。CR3与CR4（CD11C/CD18）有共同的β链，因此其功能也多有相似之处，白细胞粘附缺陷病（leucocyteadhesiondeficiency）病人缺乏这种共同的β链。病人的中性粒细胞虽正常，但不能停留在感染的部位，因此病人易反复遭受感染。这表明CR3和CR4均与吞噬功能密切相关。
单细胞生物的共同点篇8
一、选择题(本题共40题，每小题1.5分。每题只有一个选项最符合题目要求)1.生物体进行一切生命活动的基础、细胞结构和生命活动的物质基础以及生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础依次是()①细胞分裂②细胞分化③新陈代谢④同化作用⑤构成细胞的各种元素和化合物a.④⑤①B.③⑤① C.③⑤④D.①⑤④2.科学家经研究认为“河南蜱虫叮咬事件”的元凶为一种新型的布尼亚病毒，这一病毒主要由蜱虫传播。下列与该病毒有关的说法正确的是()a.新型布尼亚病毒体内含有2种核酸，5种碱基B.该病毒可能装配有蜱虫细胞的某些成分C.该病毒可通过基因突变和染色体变异等方式产生变异，疫苗的研制必须具有针对性D.该病毒由于寄生在蜱虫细胞内，可借助光学显微镜进行观察3.用差速离心法分离出某动物细胞的甲、乙、丙三种细胞器，测定其中三种有机物的含量如图所示。下列有关叙述正确的()a.葡萄糖进入甲分解为Co2和H2oB.乙一定与分泌蛋白的加工修饰有关C.丙合成的物质遇双缩脲试剂呈紫色D.酵母菌与该细胞共有的细胞器只有丙4.下列化合物中含有的化学元素种类最少的一组是()a.抗体和糖蛋白B.纤维素和脱氧核糖C.性激素和tRnaD.质粒和呼吸酶5.某20肽中有天冬氨酸4个(R基为—CH2CooH)，分别位于5、6、15、20位(如图);肽酶X专门作用于天冬氨酸羧基端的肽键，肽酶Y专门作用于天冬氨酸氨基端肽键。下列有关叙述中，正确的是()a.该20肽至少含有20个肽键B.若氨基酸的平均分子量为a，则该20肽的分子量为20aC.肽酶X完全作用后产生的多肽共含有氨基酸19个D.肽酶Y完全作用后产生的多肽中o原子数比20肽多4个6.生物体的生命活动离不开水。下列关于水的叙述，错误的有几项()①在最基本的生命系统中，H2o有自由水和结合水两种存在形式②由氨基酸形成多肽时，生成物H2o中的氢来自氨基和羧基③有氧呼吸时，生成物中H2o中的氢全部来自线粒体中丙酮酸分解④H2o在光下分解，产生的[H]将固定的Co2还原成(CH2o)⑤贮藏中的种子不含水分，以保持休眠状态⑥缺水时，动物体通过调节能使机体减少水的散失a.一项B.二项C.三项D.四项7.由1分子磷酸、1分子碱基和1分子化合物a构成了化合物b，如上图所示，正确()a.若m为腺嘌呤，则b肯定为腺嘌呤脱氧核苷酸B.在禽流感病原体、幽门螺杆菌体内b均为4种C.atp断开两个高能磷酸键，可形成b，a为核糖D.若a为脱氧核糖，则由b构成的核酸完全水解，得到的化合物最多有8种8.下列有关质壁分离和质壁分离复原的叙述，正确的是()a.能否发生质壁分离和质壁分离复原也可作为判断动物细胞是否为活细胞的依据B.在质壁分离现象中，与细胞壁发生分离的“质”是指细胞质C.将洋葱根尖分生区细胞放在0.3mg/mL的蔗糖溶液中，能观察到质壁分离现象D.在质壁分离和质壁分离复原过程中，主要是观察细胞中液泡体积的变化9.如图所示为油料作物的种子在成熟过程中，4种有机物(可溶性糖、淀粉、含氮化合物和脂肪)的变化情况。下列相关叙述，正确的是()a.图中1和2代表的是糖，4代表的是脂肪B.图中4代表淀粉，可用碘液来检查C.随着种子的成熟，含氮化合物主要是淀粉、核酸等D.向该类型种子的提取液中滴加苏丹Ⅲ，溶液将呈红色10.下列有关物质跨膜运输的叙述中，正确的是()a.神经递质由突触前膜释放到间隙中的方式是主动运输B.mRna在细胞核中合成后进入细胞质中要穿过2层膜C.水稻叶肉细胞无氧呯吸产生的Co2被同一个细胞利用要穿过2层磷脂双分子层D.植物细胞光合作用产生的o2被相邻细胞利用要穿过6层磷脂分子11.各取10%的无菌葡萄糖溶液100mL加入两瓶中，分别加入少许等量的酵母菌液，混匀、密封，按下图装置实验。如果测定甲、乙装置中CaCo3沉淀均为10g，撤去装置，将两瓶溶液用滤菌膜过滤掉酵母菌，滤液分别倒入下列U型管中，开始时液面相平，下列对一段时间后a、B液面变化及原因叙述正确的是()a.a、B液面不变，因为生成的CaCo3相等，分解的葡萄糖也相等B.a上升B下降，因为甲消耗的葡萄糖少，溶液浓度大C.a下降B上升，因为甲进行有氧呼吸，分解的葡萄糖多，溶液浓度小D.a下降B上升，因为乙进行无氧呼吸，分解的葡萄糖少，溶液浓度大12.小麦植株中能使aDp含量减少的是()①叶绿体中Dna的复制过程②叶绿体中[H]被消耗的过程③线粒体中[H]被消耗的过程④无氧呼吸产生酒精的过程⑤神经递质释放的过程⑥叶绿体中光反应过程⑦海带从海水中吸收碘a.③④⑥B.②③⑤C.④⑤⑦D.①③⑤⑥13.下图为水稻根细胞对Si的吸收速率和氧分压的关系图，分析此图信息错误()a.图中a、C两处用于根代谢活动的酶有很大的不同B.aB段，o2是限制根细胞对Si吸收速率的主要因素C.在C点以后，通过中耕松土，可进一步促进对Si的吸收而表现为m1的曲线D.氧分压继续增大，aC曲线将为m2曲线14.下列物质转变过程属于光反应是()a.①③⑤⑦B.①②④⑧C.②③⑦⑧D.①④⑦⑧15.下列图中有关动植物糖类、脂质的种类与关系正确的是()16.下列关于科学史中研究方法和生物实验方法的叙述中，正确的是()①研究光合作用的反应过程和噬菌体侵染细菌实验——同位素标记法②孟德尔豌豆杂交实验提出遗传定律——假说演绎法③探究酵母菌细胞呼吸方式——对比实验法④分离各种细胞器和叶绿体中色素的分离——差速离心法a.②③B.①②③C.①③D.①②④17.将某绿色植物放在特定的实验装置中，研究温度对光合作用与呼吸作用的影响(其余的实验条件都是理想的)，实验以Co2的吸收量与释放量为指标。实验结果如下表所示：下列对该表数据分析正确的是()a.昼夜不停地光照，温度在35℃时该植物不能生长B.每天交替进行12小时光照、12小时黑暗，温度保持在25℃，该植物积累有机物最多C.昼夜不停地光照，该植物生长的最适宜温度是30℃D.每天进行14小时光照，温度在30℃时，该植物积累的有机物是温度在35℃时2.71倍18.配置不同浓度梯度的蔗糖溶液，从小到大依次为n1、n2、n3…….，再将每个浓度溶液都各分为两份装入烧杯中，编号为a1、a2;B1、B2;C1、C2………。向a1、B1、C1……….中放入从相同部位取出的大小相同的萝卜块，半小时后，向浸有萝卜块的溶液内加入少许甲稀蓝粉末(标记溶液为蓝色)。用细头滴管吸取蓝色溶液，缓慢从滴管中向对应浓度的蔗糖溶液中(a1—a2;B1—B2;C1—C2…….)横向放入一滴蓝色溶液，观察小液滴的移动方向。下列说法不正确的是()a.本实验操作可以用来探究植物细胞液的浓度B.若a2中液滴向下移动，则a1中的萝卜块硬度将变大C.若C2中液滴向上移动，则C1中的萝卜块细胞可能发生质壁分离D.若a2中液滴向下移动，C2中液滴向上移动，则B2中的液滴静止不动19.如图表示某高等植物体内的生理过程，有关分析正确的是()a.阶段Ⅰ生成的naDpH将作为还原剂固定二氧化碳B.能够在叶肉细胞生物膜上进行的生理过程有Ⅱ、ⅢC.过程⑤可为细胞吸收mg2+等离子提供动力，而不是过程①D.过程④、⑤进行的场所有细胞质基质和线粒体20.如图表示一株生长迅速的植物在夏季24h内Co2的吸收量和释放量，光合作用速率和呼吸作用速率用单位时间内Co2的吸收量和Co2的释放量表示(图中a、B、C表示相应图形的面积).下列表述不合理的是()a.在18:00时和6:00时，该植物光合作用强度与呼吸作用强度相等B.假设该植物在24h内呼吸速率不变，光合速率为85mg/hC.该植物在一昼夜中有机物积累量的代数式可表示为a+C–BD.中午12:00时左右，叶片上部分气孔关闭，光合速率下降，与植物光合速率时相比，此时该植物叶绿体内C5的含量下降。21.下列有关生物学实验的叙述正确的有()(1)探究温度对酶活性的影响，可选择过氧化氢溶液作底物(2)在电子显微镜下拍摄到的叶绿体的结构照片属于概念模型(3)孟德尔遗传规律的研究过程和摩尔根果蝇眼色遗传的研究过程均用了假说演绎法(4)在模拟细胞大小与物质运输的关系时，琼脂块表面积和体积之比是自变量，氢氧化钠扩散速度是因变量(5)色素的提取和分离——提取色素时加入无水乙醇越多，纸层析时色素带的颜色越浅(6)观察细胞有丝分裂——所选材料中，分裂期时间越长的，观察到分裂期的细胞数越多(7)观察细胞减数分裂——显微镜下观察不到着丝点排列在赤道板上的减数分裂时期细胞a.一项B.两项C.三项D.四项22.豌豆黄色圆粒豌豆与绿色圆粒豌豆杂交，F1出现黄圆、绿圆、黄皱、绿皱四种表现型，其比例为3∶3∶1∶1，推知其亲代杂交组合的基因型是()a.YyRr×yyRrB.YyRR×yyRrC.YYRr×yyRRD.YYRr×yyRr23.图5表示干细胞的三个发育途径，有关说法正确是()a.aB经过有丝分裂，B具有多项分化潜能B.aC经过细胞分化，C的遗传信息发生改变C.aD收到信号变化，D内高尔基体的功能增强D.CD不受基因调控，C的细胞结构不发生改变24.下列关于四分体的叙述，正确的是()①每个四分体包含一对同源染色体的4条染色单体②四分体就是四条染色单体③复制后的同源染色体都能形成四分体④只有减数第一次分裂时期形成四分体⑤四分体时期可发生交叉互换现象⑥四分体时期的下一个时期是联会⑦细胞中有几个四分体，就有几对同源染色体a.①④⑤⑦B.①②③⑦C.④⑤⑥⑦D.③④⑤⑦25.在山羊遗传实验中，一黑色山羊与白色山羊杂交(白色与黑色由两对等位基因控制且独立遗传)，子一代均为黑色。子一代个体间随机交配产生子二代个体中黑色：浅黄色：白色=12：3：1，则黑色个体和浅黄色个体中杂合子的比例分别为()a.1/6、2/3B.1/8、1/3C.5/6、2/3D.5/8、2/326.某哺乳动物的基因型为aaBbee，如图是其一个精原细胞在产生精子细胞过程中的某个环节的示意图，据此可以判断()a.图示细胞为次级精母细胞，细胞中含一个染色体组B.该精原细胞产生的精子细胞基因型有aBe、aBe、abeC.图示细胞中，a基因来自于基因突变或基因重组D.三对基因的遗传遵循自由组合定律27.下列关于细胞的分化、衰老、凋亡和癌变叙述，正确的有()①细胞的分化、衰老和癌变对于生物体都是有积极意义的②细胞分化使多细胞生物中的细胞功能趋向全面化，提高细胞代谢的效率③人胚胎发育过程中尾的消失是细胞坏死的结果④细胞衰老表现为细胞核体积变小、色素含量增加、细胞膜的通透性降低⑤细胞凋亡受遗传物质的严格控制，并且在凋亡的过程中存在基因表达⑥细胞癌变主要是因为原癌基因和抑癌基因发生突变⑦癌细胞比正常细胞分裂周期长a.一项B.两项C.三项D.四项28.下图表示雄果蝇体内某细胞分裂过程中，细胞内每条染色体Dna含量变化(甲曲线)及与之对应的细胞中染色体数目变化(乙曲线).下列说法不正确的是()a.CD与FG对应的时间段，细胞中均含有两个染色体组B.D点所对应时刻之后，单个细胞中可能不含Y染色体C.eF所对应的时间段，Dna含量的变化是由于同源染色体的分离D.BD对应的时间段，可发生姐妹染色单体相同位点上的基因变化29.据科技日报消息，美国弗吉尼亚大学研究人员在最新一期癌症研究杂志上，称他们发现了一种命名为RhoGD12的基因，该基因有助于避免癌细胞扩散，他们发现带有该基因的癌细胞会失去转移能力。对该基因的作用最可能的解释是()a.当这种基因添加到癌细胞后，在癌细胞中表达并产生一种糖蛋白，由此阻止癌细胞入侵其他组织器官B.当这种基因添加到癌细胞后，在癌细胞中表达并产生一种蛋白质，由此使癌细胞迅速分化为其他组织器官C.该基因使癌细胞迅速衰老D.以上说法都不对30.某种昆虫长翅a对残翅a为显性，直翅B对弯翅b为显性，有刺刚毛D对无刺刚毛d为显性，控制这3对性状的基因均位于常染色体上。现有这种昆虫一个体细胞的基因型如右图所示。下列说法正确的是()a.长翅与残翅、直翅与弯翅两对相对性状的遗传遵循自由组合定律B.若无互换，该昆虫一个初级精母细胞产生的精细胞基因型有4种C.细胞有丝分裂后期，移向细胞同一极的基因有a、a、b、b、D、dD.为验证基因的自由组合定律，必须用基因型为aabbdd的异性个体来与该昆虫进行交配31.将叶面积相等的a、B两种植物的叶片分别放置在相同的、温度适宜且恒定的密闭小室中，给予充足的光照，利用红外测量仪每隔2min测定一次小室中的Co2浓度，结果如右图所示。对此实验叙述中，正确的是()a.若a植物在第5min时光照突然减弱，C5含量将增加B.当Co2浓度约为0.8mmol/L时，B植物比a植物具有更大的净光合速率C.25min以后，两种植物叶片各自的光合速率大于其细胞呼吸速率D.从开始到第10min期间，光合作用积累的有机物总量a植物大于B植物32.豌豆花的位置分为叶腋和茎顶两种，分别受t和t基因控制。种植基因型为tt和tt的豌豆，两者数量之比是2∶1。两种类型的豌豆繁殖率相同，则在自然状态下，其子代中基因型为tt、tt、tt的数量之比为()a.7∶6∶3B.9∶2∶1C.7∶2∶1D.25∶10∶133.下列有关遗传的说法，正确的是()①摩尔根在证实基因在染色体上的过程中运用了类比推理方法②父亲色觉正常，母亲患红绿色盲，生了一个色觉正常的克莱费尔特症(XXY)患者，这一定是由于父方减数第一次分裂异常所致③若卵原细胞的基因型为aaBb，则初级卵母细胞的基因组成为aaaaBBbb，为四倍体细胞④在性状分离比的模拟实验中，用甲、乙两个小桶分别代表雌、雄生殖器官，甲、乙小桶内的彩球分别代表雌、雄配子，则甲、乙两桶的彩球数要相等a.①②B.③④C.②D.②④34.豌豆子叶黄色(Y)对绿色(y)为显性，孟德尔用纯种黄色豌豆和绿色豌豆为亲本，杂交得到F1，F1自交获得F2(如图所示)，正确的是：a.图示中雌配子Y与雄配子Y数目相等B.③的子叶颜色与F1子叶颜色相同C.①和②都是黄色子叶、③是绿色子叶D.产生F1的亲本一定是YY()和yy()35.某种鱼的鳞片有4种表现型：单列鳞、野生型鳞、无鳞和散鳞，由位于两对同源染色体上的两对等位基因决定(用a、a，B、b表示)，且BB对生物个体有致死作用，将无鳞鱼和纯合野生型鳞的鱼杂交，F1有两种表现型，野生型鳞鱼占50%，单列鳞鱼占50%;选取F1中的单列鳞鱼进行互交，其后代中有上述4种表现型，这4种表现型的比例为6:3:2:1，则F1的亲本基因型组合是()a.aabb×aabbB.aaBb×aabbC.aaBb×aabbD.aaBb×aabb36.某动物种群有aaBb和aabb两类个体，比例为1∶1，两对基因自由组合，雌雄个体比例1∶1。已知aaB_个体致死，假如种群中全部个体都能够自由交配，且子代中除致死基因型外全部个体都成活，则成活子代中aaBb所占的比例是()a.3/32B.6/32C.6/57D.12/5737.基因a、B、C分别控制酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ的产生，这三种酶共同作用可将一原本无色的物质变为黑色素，即无色物质――酶Ⅰ X物质――酶Ⅱ Y物质酶Ⅲ黑色素。若两亲本基因型均为aaBbCc，则子代中能正常合成黑色素个体的几率是()a.1/64B.3/64C.9/64D.27/6438.甲、乙、丙个体的基因组成分别为，若三者都产生了ab、aB的配子，则下列个体及产生上述配子的机理对应一致的是()a.甲——同源染色体分离;乙——染色体变异;丙——基因重组B.甲——染色体变异;乙——交叉互换;丙——同源染色体分离C.甲——同源染色体分离;乙——交叉互换;丙——基因重组D.甲——交叉互换;乙——染色体变异;丙——交叉互换39.早金莲由三对等位基因控制花的长度，这三对基因分别位于三对同源染色体上，作用相等且具叠加性。已知每个显性基因控制花长为5mm，每个隐性基因控制花长为2mm。花长为24mm的同种基因型个体相互授粉，后代出现性状分离，其中与亲本具有同等花长的个体所占比例是()a.1/16B.2/16C.5/16D.6/1640.如图是人类某一单基因遗传病系谱图，已知Ⅱ1号个体的家族没有该病基因，若Ⅲ1号与Ⅲ2号个体生一个正常孩子甲，则甲携带该致病基因的概率为()a.7/l7B.7/18C.1/9D.1/6第Ⅱ卷(非选择题共40分)41.(8分)核基因编码的蛋白质在细胞内快速运输取决于自身氨基酸序列中是否包含了信号序列以及信号序列的差异，如下图所示。(1)研究发现，经②过程进入内质网的多肽，在内质网折叠成为具有一定__________的蛋白质，③过程输出的蛋白质并不包含信号序列，推测其原因是______________。经②③过程形成的蛋白质经过④途径送往溶酶体或成为膜蛋白或成为_________。(2)某些蛋白质经⑥、⑦过程进入线粒体、叶绿体时，需要膜上________的协助。线粒体和叶绿体所需的蛋白质部分来自⑥、⑦过程，部分在___________的指导下合成。(3)某些蛋白质经⑧过程进入细胞核需通过______(结构)，这一过程具有_______性。(4)除了图中⑤外，送往不同细胞结构的蛋白质具有________，这是细胞内蛋白质定向运输所必须的。42.(11分)如图1表示一个植物细胞内发生的部分代谢简图，图中①～⑤表示反应过程，a～L表示细胞代谢过程中的相关物质，a、b、c表示细胞的相应结构;图2表示密闭大棚内(温度恒定)一昼夜空气中的Co2含量变化，图3中曲线代表在一定光照强度下某植物的光合作用强度与Co2浓度的关系，请据图作答：(1)为了研究植物体细胞中染色体的形态，应选择根尖分生区观察，找到的依据是___。(2)图1中，反应过程①的场所是，反应过程④的场所是。结构a中发生的能量转换过程是________。在其他环境条件适宜而光照强度恰为光补偿点时，单位时间内a～L中产生量与消耗量相等的气体有____________(用图1中的字母表示)。(3)图2中植物光合作用和呼吸作用强度相等的点是____________，积累有机物最多的点是___________。(4)图3中若降低光照强度，曲线中a点将向________移动。若其他条件不变，图3中纵坐标含义改为二氧化碳吸收速率，请在右图坐标系中画出相应的变化曲线。43.(9分)图12表示细胞分裂的不同时期染色体与核Dna数比例的变化关系;图13表示某动物处于细胞分裂不同时期的图像。请据图回答：(1)图12中BC段形成的原因是_________________，De段形成的原因是__________。(2)图13中_________________细胞处于图12中的CD段。(3)图13中具有同源染色体是__细胞，甲细胞中有_个染色体组。丙细胞处于__时期。(4)图13中丁细胞的名称为___________，如果丁细胞中的m为X染色体，则n一定是__________。若m的染色单体上出现等位基因，则原因是发生了__________。44.(12分)某二倍体植物的花色由位于三对同源染色体上的三对等位基因(aa、Bb、Dd)控制，研究发现体细胞中的d基因数多于D基因时，D基因不能表达，且a基因对B基因表达有抑制作用如图l。某黄色突变体细胞基因型与其可能的染色体组成如图2所示(其他染色体与基因均正常，产生的各种配子正常存活)。(1)根据图1，正常情况下，黄花性状的可能基因型有__________________。(2)基因型为aabbdd的白花植株和纯合黄花植株杂交，F1自交，F2植株的表现型及比例为_____________，F2白花中纯合子的比例为_____________。(3)图2中，基因型为aaBbDdd的突变体花色为__________。(4)为了确定aaBbDdd植株属于图乙中的哪一种突变体，设计以下实验。实验步骤：让该突变体与纯合橙红植株个体杂交，观察并统计子代的表现型与比例。结果预测：i若子代中_________________，则其为突变体甲;Ⅱ若子代中_________________，则其为突变体乙;iii若子代中黄色：橙红色=1：l，则其为突变体丙。请写出iii的遗传图解。________淄博实验中学高三年级第一学期第一次诊断考试试题2015.10生物答案一、选择题(本题共40题，每小题1.5分。每题所给的四个选项中只有一个选项最符合题目要求)1—5：BBCBC6—10：CCDaC11—15：BaCDa16—20：BDDCD21—25：CaaaC26—30：BBCaC31—35：BBCCB36—40：DDCDa二、(非选择题共40分)41.(8分)(1)空间结构信号序列在内质网中被(酶)切除(水解)分泌蛋白(或“分泌至细胞外”)(2)蛋白质(或“膜蛋白”或载体)线粒体或叶绿体基因(Dna)(3)核孔选择(4)不同的信号序列42.(11分)(1)细胞呈正方形，排列紧密(2)叶绿体囊状结构薄膜;线粒体基质;光能(电能)活跃的化学能稳定的化学能;D=K、G=i(2分)(3)D和B;D(4)左下;如下图(2分)43.(9分)(1)Dna复制;着丝点分裂。(2)丙、丁(答不全不给分)(3)甲、乙、丙;4减数第一次分裂的后期(4)次级精母细胞;常染色体;基因突变或减数第一次分裂的前期同源染色体的非姐妹染色单体间交叉互换(基因重组)。44.(12分)(1)aaBBdd、aaBbdd(2)白花：黄花=13：3(2分)3/13(2分)(3)黄色(4)黄色：橙红色=1：3黄色：橙红色=1：5遗传图解如下：(4分)
单细胞生物的共同点篇9
【关键词】视网膜
0引言
视网膜为了有效地发挥其功能，需要一个稳定的内环境，这一内环境稳定性的维持依赖于内层血视网膜屏障。内层血视网膜屏障是由视网膜微血管内皮细胞（RmeC）、RmeC间紧密连接（tJ）、基底膜、周细胞、胶质细胞足突和极狭小的细胞外间隙共同组成的一个复合体，是存在于视网膜神经层的血管与神经组织之间的一个动态的调节界面[1-3]。在动物体内许多实验已经得出血视网膜内屏障中，视网膜müller胶质细胞（RmGC）与RmeC之间存在多种形态和功能学上的联系，但这些因素受到动物个体差异、种群差异及其它神经组织的影响，于是就需要建立一种简化的内层血视网膜屏障（iBRB）的体外模型。我们采用原代培养的RmGC与RmeC建立体外iBRB模型，并研究RmGC对于屏障tJ的作用。
1材料和方法
1.1材料①RmeC培养及鉴定：选择wistar大鼠15只，乙醚麻醉处死，取出眼球，置于含有青霉素/链霉素的pBS中浸泡5min取出，无菌操作取出视网膜，用pBS冲洗，剪碎，1g/LⅠ型胶原酶（Sigma）消化30min，过双层的53μm尼龙筛网（上海德华金属网带有限公司），收集滤液离心，洗涤细胞，加入peCam抗体包被的免疫磁珠，4℃孵育30min，置于磁珠分离装置（mCp-1，Dynal）上用100mL/LFBS洗涤结合磁珠的细胞，将细胞接种于明胶包被的培养板中，加入含75g/L内皮生长添加剂（Sigma）的100mL/L胎牛血清（FBS，杭州四季青）的培养液。细胞培养箱（Heraeus）环境为37℃，50mL/LCo2，950mL/L空气，细胞扩增传代采用2.5g/L胰酶（Gibco）和0.2g/LeDta（1∶1）混合消化液（te）。RmeC鉴定采用兔抗大鼠Ⅷ因子抗体（Zymed）免疫组化染色。②RmGC的培养及鉴定：出生2d的wistar新生鼠麻醉处死，取出眼球，剥离视网膜，用pBS冲洗，剪碎，用2.5g/L胰酶消化20min，加入100mL/LFBS终止消化，经53μm尼龙筛网，细胞悬液离心洗涤后接种于培养板中，加入100mL/LFBS培养液。培养环境及传代方法同RmeC。RmGC鉴定采用兔抗大鼠GFap（Dako）和小鼠抗大鼠vimentin（Dako）免疫组化染色。③体内iBRB模型建立方法采用改良tretiach等[4]和nakashima等[5]方法，预先使用10g/L明胶包被的聚酯材料、微孔孔径0.4μm、微孔膜面积4.67mm2的transwell（no.3450，Corning）小室。第5～6代RemC生长接近70%时，弃去血清培养液，加入无血清培养液，继续培养24h。取第3～4代生长状态良好的müller细胞，换液加入RmeC培养基，继续培养24h以上。te消化两种细胞制成单细胞悬液，共培养组先将transwell小室倒置，RmGC按照10000/cm2的密度接种于小室外底面，在37℃孵箱中待其大部分贴壁（约2h），翻转置于多孔板孔中，RmeC按照20000/cm2的密度接种于transwell小室内底面，补充上下室培养液。
1.2方法transwell（Corning）小室共48只，分为共培养组20只，RmeC组20只，müller细胞组4只和空白组4只。RmeC组和müller细胞组transwell小室分别只接种RmeC和müller细胞。空白组不接种细胞。跨细胞层电阻测量是评估内皮细胞细胞旁通道通透性的重要方法之一[6]。在共培养3～9d时，使用eRS电阻仪(millipore)测量teR。为避免血清蛋白在电极上沉着，在teR测量时将小室放入37℃pBS环境中，测量后放回原多孔板，重新加入培养液。操作方法同仪器说明。每个小室测量2次，计算平均值，细胞teR计算方法为各小室teR平均值减去空白组teR平均值，乘以小室滤膜面积。
1.2.1透射电镜检测将BRB共培养模型中RmeC贴附的滤膜材料从小室中剪下，在室温下用pBS液清洗，再置于25mL/L戊二醛固定液中，室温下固定1h，冰上固定30min，此时用固定缓冲液清洗3次，每次5min，然后在冰上置于20mL/L锇酸溶液中1h，用固定缓冲液清洗3次，每次5min。然后将滤膜剪成1mm×5mm小条，依次在冰上经过100，300和500mL/L乙醇溶液，每次脱水10min，含20g/L乙酸双氧铀700mL/L乙醇溶液脱水20min，900mL/L和1000mL/L乙醇溶液中脱水，每次10min。用乙醇和Co2临界点干燥。透射电镜标本组织包埋在epon树脂中，制作超薄切片，乙酸双氧铀和枸橼酸铅染色，HitachiH-600透射电子显微镜(Japan)观察并照相。扫描电镜标本固定在一个自制平台上，溅射镀金膜，electronicJSm-840扫描电子显微镜(Japan)观察并照相。
1.2.2Zo-1免疫荧光染色从小室中剪下RmeC贴附的滤膜材料，在室温下用pBS液清洗，在冰上0.2g/LtritonX-100透化孵育2min，pBS液清洗。室温下37g/L多聚甲醛固定细胞15min，0.5mL/LtritonX-100中孵育5min，用pBS液清洗，封闭血清孵育20min。将滤膜剪成4mm×4mm的小块，RmeC面朝上置于培养皿中，加入Zo-1抗体(SantaCruz，1∶100)在4℃湿房中孵育过夜。空白对照为用pBS代替Zo-1抗体，阴性对照为用免疫前的兔血清代替Zo-1抗体。pBS液清洗，加入羊源性Cy-3-标记igG(Dako，1∶200)孵育1h，pBS液清洗3次。置于载玻片上，加500mL/L甘油1滴，封片。部分标本用4，6-联脒-2-苯基吲哚（Dapi）复染核1min。标本用olympusBX51倒置荧光显微镜观察，选择不同波长，用532nm波长的绿色激光激发Cy3，在640nm下接收，此时Cy3发出红色荧光，复染标本，不动标本，切换UV荧光，观察Dapi染色，Retiga1300CCD数码相机照相。
1.2.3Zo-1蛋白电泳transwell小室分为2组，RmeC组和共培养组，每组至少18只。在3，5，7和9d，每组取4只小室进行蛋白检测，0.25g/L胰蛋白酶消化RmeC细胞，同时用吸管吹打，使之脱离培养膜，收集细胞悬液，离心（500g）10min。加入含有蛋白酶抑制剂的Ripa缓冲液，反复吹打裂解细胞，再离心（15000g）60min，弃上清。采用Lowry法，以牛血清白蛋白为标准品，采用Bio-Rad蛋白电泳仪检测蛋白浓度（DCproteinassayKit;BioRad）。按照每泳道10μg加载于SDS-paGe凝胶样品孔中，以恒压110V/30ma电泳至溴酚兰抵达凝胶底边。电转印于nC膜上。丽春红染色，tBSt缓冲液配制的50g/L脱脂奶粉封闭2h。室温下，加入兔抗鼠Zo-1一抗(1∶500)或兔抗鼠actin一抗(SantaCruz，1∶500)，4℃过夜，tBSt缓冲液洗膜3次，每次10min。加入HRp标记的二抗(1∶3000，Dako)，37℃孵育1h，洗膜3次，每次10min。采用eCL化学发光法显色（pierce）。使用Kodakdigitalscience1D（Kodak，USa）做蛋白条带光密度分析，半定量结果＝Zo-1蛋白条带光密度/actin蛋白条带光密度。
统计学处理：实验结果采用均数±标准差（x±s）表示，采用SpSS10软件统计数据，进行t检验和方差分析，p＜0.05表示数值差异具有统计学意义。
2结果
2.1共培养系统中RmeC和RmGC的形态RmGC接种在微孔滤膜上可于1h贴壁，至3h细胞贴壁牢固，6h开始增生，细胞多角形有较长的突起（图1a）。RmeC接种在微孔滤膜上3h开始贴壁，约6h贴壁牢固，24h开始增生，细胞成多角形或者梭形，3d细胞铺满90%，4d基本融合，单位面积内细胞继续增多，7d单位面积内细胞数量停止增加（图1B）。
2.2微孔滤膜上细胞的超微结构透射电镜图像显示RmeC在膜上呈单层生长，细胞内线粒体和内质网丰富，并有该细胞特异的weibel-palade小体，RmGC呈复层生长，细胞内有丰富的线粒体、糖原和微丝，细胞间隙较大，两种细胞均可有突起深入微孔中，但在样本中没有发现RmGC和RmeC间的连接。培养9d的模型切片中发现，相邻的RmeC胞膜紧密相连，没有缝隙（图1C）。
图1a:多角形微孔膜上的RmGC（bar:100μm）;B:融合的RmeC;C:紧密连接结构
2.3跨细胞电阻变化跨细胞电阻（teR）可以间接的反映RmeC层的紧密连接的变化和屏障功能。图2显示在RmeC单层、RmGC层和共培养层的teR的变化情况。RmeC层teR在8d时达到最高，为（86.3±7.9）Ω·cm2。在有RmGC存在的共培养组teR7d时为（97.6±3.6）Ω·cm2，约为7d时RmeC组的2倍，8d达到峰值（113.5±5.3）Ω·cm2。RmGC组teR值很低，波动在-5.7～15Ω·cm2。在6～9d共培养组和RmeC单层的teR差异有统计学意义（p＜0.05）。RmeC单层和共培养层teR峰值约为86Ω·cm2和113Ω·cm2，此时细胞间紧密连接发育成熟，可用于进一步的通透性实验。
图2RmeC单层、RmGC层和共培养层teR的变化
2.4细胞间的Zo-1表达变化在RmeC生长至融合过程中，1dZo-1在细胞质内表达，3dZo-1在胞核内强荧光表达，胞质和细胞边缘弱荧光表达，7d细胞边缘荧光增强，胞核和胞质中荧光强度明显减弱。在与RmGC共培养时，RmeCZo-1表达要强于同时的RmeC单层（图3）。蛋白半定量显示整个培养过程中Zo-1表达随培养时间延长逐渐增强（图4）。
a，C，e:RmeC单独培养1，3，7d；B，D，F:RmeC共培养1，3，7d
图3RmeC与RmGC共培养组和RmeC单独培养组Zo-1在细胞中表达部位变化。各时间点两组RmeC均有Zo-1的表达，在1dZo-1主要表达在细胞质中，3dZo-1表达在细胞质、细胞核以及细胞膜上，细胞核内染色较强，细胞膜上表达较弱，7dZo-1主要表达在细胞间隙和胞膜上，细胞核及细胞质中表达极弱
图4共培养组和RmeC组中RmeCZo-1蛋白表达变化ap
3讨论
建立接近生物体功能的iBRB模型，首先是要获得高纯度的RmeC和müller细胞，既往的国内外iBRB模型研究中RmeC来源主要是牛[7]和猪[8]，而且纯度不一，或是采用某种内皮细胞系，如eCV304[9]和tR-iBRB2[5，10]等，由于纯度和细胞特性改变，会造成所建的模型和体内屏障通透性偏差较大。由于正常大鼠视网膜可提供的RmeC数量较少，并且有多种易混杂的细胞，所以要获得高纯度的RmeC有较大困难[11]。采用前面所描述的免疫磁珠结合的方法培养出高纯度的大鼠来源RmeC，为iBRB模型的建立提供了良好细胞来源。常用微孔膜有0.4μm和3μm两种常用孔径[12]，对于0.4μm孔径的微孔膜选择我们基于2种考虑：①前期研究证实部分内皮细胞胞体可以穿过3μm微孔，迁移到背侧；②我们的预实验研究发现RmeC在3μm的微孔膜上形成的屏障teR值远低于0.4μm微孔膜，可能是由于细胞与微孔贴附的紧密程度有关，如果贴附不紧密，会造成相当于细胞外间隙的空间增大，会造成大量离子的流动，导致teR降低。
对于通透性测定有两种常用方法，一种是teR测量，另一种是对于不同分子量的物质通透系数的测量，teR是一种间接体现屏障功能的方法，一般来说，成熟的模型中大动脉内皮teR＞微血管内皮teR＞静脉内皮teR，我们的模型teR结果与部分研究报道的teR结果一致，tretiach等[4]报道通过牛的RmeC和RmGC建立模型的teR值为70Ω·cm2，但Gillies等[12]报道teR值高于400Ω·cm2，我们认为这主要是细胞来源不同造成的。teR的大小可作为内皮细胞在损伤因子作用下的通透性发生改变的难易程度，例如RmeC的teR为100Ω·cm2左右，而脑微血管内皮细胞的teR＞400Ω·cm2，所以糖尿病患者更易发生视网膜微血管病变。此外，我们培养的RmeC还存在聚集特性，细胞消化后，往往不能完全成为单细胞悬液，而是聚集成细胞团存在，这可能与细胞表面存在的某些黏附分子有关，在用吸管吹打数十次后，还有部分细胞团存在，如一个细胞团接种于膜上，不是细胞团中所有的细胞都会存活和伸展，再培养数天后，局部会出现“破孔”，可能会导致teR值的下降。在细胞接种后12d左右，部分细胞活力下降，不能继续贴壁，会导致模型的屏障功能下降，此时teR＜30Ω·cm2，不宜继续进行实验。
Zo-1是膜相关的鸟苷酸激酶家族的成员之一，并介导细胞间接触位点的信号转导。我们在本实验中发现在模型屏障功能形成之前，有一段时间会在细胞核中表达，在融合之后表达在细胞膜上。这与Gottardi等[13]研究结果一致，他们认为在融合前，细胞间接触没有完全形成，此时膜相关的鸟苷酸激酶产生信号，核内转录作用加强，造成核内Zo-1的一过性堆积。
许多研究表明，RmGC在RmeC由非屏障细胞向屏障细胞转变的诱导和维持中扮演着积极的角色。在血脑屏障中，应用星形细胞特有的胶质纤维酸性蛋白和谷氨酸合成酶抗体标记定位分析的一系列研究发现：星形胶质细胞能促进毛细血管内皮细胞膜上多种酶活性的增强，并能明显促进内皮细胞间紧密连接的数量、长度及连接复合体的增多[14]。我们也证实，RmGC能加强RmeC的屏障功能。具体表现在同一时间点共培养RmeC层的teR值高于独立RmeC层，Zo-1的表达也高于独立RmeC层。RmGC作为iBRB的重要成分，除了在屏障的诱导生成和形态维持上发挥重要作用，还能够释放多种化学成分短时间内调节内皮细胞的通透性。在内皮分化和诱导的过程中，RmGC胞外基质起到了很重要的调节作用，tGF-β，GDnF，bFGF，iL-6和一些类固醇物质参与了这一过程[15]。igarashi等[16]利用免疫组化法在GFap阳性的细胞中检测到GDnF(胶质细胞源性神经营养因子)，ntn(neurturin)及二者的受体(GFRα1及GFRα2)，这两种营养因子均可增强RmeC的屏障功能，调节BRB的通透性。所以目前认为RmGC可能是诱导血管内皮间紧密连接和维持iBRB的结构基础。
RmGC和RmeC在微孔膜的两侧能否存在形态上的直接联系呢？模拟血脑屏障的研究中，有人将两种细胞培养在生长膜的不同侧，发现胶质细胞可以伸出伪足与毛细血管内皮细胞形成玫瑰花结样结构联系[17]。我们在本实验中没有找到产生直接的联系的依据。此外，在这种RmGC和RmeC三维培养模型中，RmGC可以诱导RmeC相互间形成紧密连接，并有紧密连接蛋白表达和高teR等特征，但是在体内，BRB的两侧液体成分是不同的，包括蛋白质和离子浓度不同，而且还具有细胞的极性[18]，而我们的BRB模型中细胞两侧的液体是相同的，并且缺乏细胞极性，所以，该模型只具有部分屏障功能，只适合于一些物质通透性的研究。
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12GilliesmC，Sut，naidooD.electricalresistanceandmacromolecularpermeabilityofretinalcapillaryendothelialcellsinvitro.CurreyeRes，1995;14(6):435-442
13GottardiCJ，arpinm，FanningaS，LouvardD.thejunction-associatedprotein，zonulaoccludens-1，localizestothenucleusbeforethematurationandduringtheremodelingofcell-cellcontacts.procnatlacadSciUSa，1996;93(20):10779-10784
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单细胞生物的共同点篇10
【摘要】目的观察p27mt基因对宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用。方法mtt法检测p27mt基因和放射线对Hela细胞的增殖抑制作用，绘制抑制率曲线图研究p27mt基因与放射联合应用时的作用特点；流式细胞法检测细胞周期和凋亡。结果单纯照射对宫颈癌增殖有抑制作用，但有平台效应；p27mt基因对Hela细胞增殖具有明显的抑制作用，并呈时间和浓度依赖性；照射联用p27mt基因可进一步增强对宫颈癌的杀伤效应；单独照射和p27mt基因均能使细胞周期阻滞于放射敏感时相G2/m期，诱导细胞凋亡，联用效果更加显著。结论p27mt基因可通过阻滞细胞周期于G2/m期对宫颈癌Hela细胞产生放疗增敏作用。
宫颈癌是我国也是本地区最常见恶性肿瘤，放射治疗是重要治疗手段，目前多采用同步放化疗综合治疗模式，即通过同步应用小剂量化疗药物在不增加甚至降低射线剂量的基础上达到增强放射线对肿瘤细胞的杀伤作用[1]。
p27基因是细胞周期素依赖性激酶抑制因子（CDKi）家族成员之一，是一类重要的细胞周期调控基因，可广泛抑制细胞周期素（cyclin）和细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK）复合物的活性对细胞周期进行负性调控[2]。Jean等[3]将p27第187位苏氨酸置换成丙氨酸（t187a）转染HeyC2细胞，发现细胞生长明显抑制，证实突变p27（p27mt）比野生型p27抑制作用更强。p27mt对宫颈癌放疗作用如何未见有人报道，本文对此进行了研究。
1材料与方法
1.1材料
人宫颈癌Hela细胞株和p27mt由湖北医药学院临床研究所惠赠；Clinac600C/D加速器（美国Varian公司）；流式细胞仪（美国BeckmanColuter公司）。
1.2方法
1.2.1细胞培养宫颈癌Hela细胞培养于含10%新生牛血清的1640中，并置于含5%C02的37℃孵箱中常规培养，每2-3d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2照射方法在室温下采用6mV-X线照射，照射野10×10cm，剂量率40cGy/min，源皮距为100cm，分别一次性给予各实验组6、8、10、12、14、16Gy剂量。
1.2.3放射线对Hela细胞增殖的影响取对数生长期Hela细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，参照文献按辐射剂量分为6、8、10、12、14、16Gy共6组，每组设5个复孔，给予一次性射线照射12、24、48h后，每孔加入20μLmtt（5g/L），继续孵育4h，弃各孔液体，每孔加入150μL二甲基砜，低速震荡10min，酶标仪检测各孔在562nm波长处吸光度值，计算抑制率，求出辐射剂量坪值，即细胞增殖抑制率达最高的射线剂量。细胞抑制率=（1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值）×100%。
1.2.4mtt法测定p27mt的辐射敏感性取对数生长期细胞制成单细胞悬液，分为空白组、单药组、单放组、药放组。空白组只加细胞与培养液；单放组剂量取上述实验的坪值；单药组p27mt基因终浓度参照文献[4]确定为10、20，30，40，50moL（感染复数）共5组，药放组辐射剂量和药物浓度分别同单放组剂量和单药组浓度，共5组，每组设5个平行样本，测定各组吸光值后通过公式计算细胞抑制率。
1.2.5细胞周期分析及凋亡检测细胞分组及处理同1.2.4，取处理完毕的4组细胞各1×106个，pBS洗2次，加入70%冷乙醇4℃固定过夜，清除固定液，加入pBS100μl混匀细胞，再加入10g/LRnaase2μl充分混匀，置37℃水浴锅中加温30min，加入碘化丙啶（pi）染色液（20μg/ml），常温避光30min后，流式细胞仪检测，multicycle软件分析，拟合计算出细胞各时相百分比和凋亡率。
1.3统计学分析所得数据以均数±标准差（x±s）的形式表示，SpSS17.0软件模拟生存曲线并进行单因素方差分析（两两比较采用S-n-K法），以p
2结果
2.1Hela细胞对射线照射的敏感性射线照射对宫颈癌细胞增殖可产生明显的抑制作用，在射线剂量12Gy以内时，随着射线剂量的加大和照射后作用时间的延长，对细胞增殖的抑制率也明显增加，呈现出一定的量效和时效关系。在12Gy处出现坪值，故选用12Gy加药物进行后续的增敏实验。
2.2p27mt基因对Hela细胞增殖的影响经不同浓度p27mt作用24、48、72h后，Hela细胞增殖均受到不同程度的抑制，并呈时间，浓度依赖性。各浓度姜黄素作用48h，细胞增殖抑制率在6%-78%之间，与对照组比较，20moLp27mt基因即可产生有统计学差异的抑制作用（p
2.3p27mt基因对Hela细胞的放射增敏作用选取12Gy剂量射线加不同浓度p27mt基因作用于Hela细胞结果显示出细胞增殖抑制率可进一步随药物浓度的增加而升高，当浓度大于40moL时曲线趋于平坦。药物加辐射后，其24h细胞增殖抑制率均较单纯辐射或单纯药物组有统计学差异（p
2.4细胞周期分析及凋亡检测流式细胞仪检测细胞周期和凋亡结果表明，与空白组比较，单纯放射或药物均能提高G2/m期细胞比例，诱导细胞出现凋亡（p
3讨论
重组腺病毒作为一种高效基因转移载体被广泛用于将外源基因导入哺乳动物细胞，原因是腺病毒本身分子稳定，基因组不会发生重排，插入的外源基因也相当稳定，腺病毒允许插入的外源基因容量可达7.5Kb，不仅感染分裂期细胞，也可感染静止期细胞，感染率几乎100%。另外，它不与宿主基因组整合，没有基因毒性，比较安全。因此本研究拟通过腺病毒将突变型p27基因和X射线联合作用宫颈癌Hela细胞株模型，通过检测其放射敏感性及细胞周期及凋亡的改变，探讨p27基因放射增敏的作用及机制，为在临床上将突变型p27做为宫颈癌放疗增敏剂提供理论依据。研究结果显示，单纯应用p27mt，细胞增殖抑制率与药物浓度的增加成正比；单纯应用放射线照射，细胞抑制率也随射线剂量的增加而增加，但当辐射剂量达到12Gy时细胞增殖抑制率达到坪台期，不再随射线剂量的加大而增加。在此基础上，选用12Gy放射线联合不同浓度的p27mt做进一步的观察，结果显示，在单纯辐射剂量已达到“阈值”的情况下，联用p27mt仍可使细胞增殖抑制效果得到进一步的提高，且对细胞增殖的抑制率高于单纯放射组和单纯药物组（p
为初步探明增效机制，笔者进一步检测了p27mt同步放疗后对宫颈癌细胞凋亡和细胞周期的影响，结果发现，单独p27mt、单独射线均能对细胞产生诱导凋亡和G2/m期阻滞的作用，而联合应用后作用效果更为显著，这说明p27基因可能通过阻滞细胞周期于对G2/m期达到放疗增敏的作用。
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