细胞生物学常用研究方法篇1
细胞衰老是细胞不可逆的失去增殖能力的过程，被认为是机体抑制肿瘤发生的重要屏障[2]。但是也有研究表明衰老细胞可以通过分泌表型促进肿瘤发生。因此，细胞衰老与肿瘤之间的关系还需要进一步的研究。而对细胞衰老发生的分子机理的理解，有助于我们开发新的肿瘤治疗策略。目前已经发现多种基因毒性刺激都能诱发细胞发生早熟性细胞衰老，如端粒缩短、原癌基因激活、辐射损伤、活性氧损伤等，这些刺激都能引发Dna损伤[3]。
细胞衰老存在于多学科中，属于交叉学科，它自产生就与抽象、深奥的哲学紧密联系、相互促进。
一、细胞衰老学说的研究，离不开哲学思维的发展
哲学的发展来源于人类在探索世界时候的不断反省，通过对生命的意义的思索，促进着自然科学的发展。20世纪60年代，Hayflick和moorhead等人[4]在体外培养人正常成纤维细胞时发现：多株体外培养的正常人成纤维细胞，在经历多次细胞分裂之后，并没有无限制的增殖，而是发生了增殖失败现象。当排除了因细胞体外培养和营养需求改变等因素的影响后，他们确定这是细胞固有的一种生理状态。而与此现象相佐证的是：胚胎来源的成纤维细胞的增殖能力要比成体来源的成纤维细胞的增殖能力更强。这种现象使得他们提出了细胞衰老（Cellsenescence）的概念，并认为这种细胞增殖失败的现象与器官的老化是相关联的[5]。西方医学的很多发展都源于哲学的进步，他们观察自然和人类生活的变化，产生哲学思辩，从而研究物质存在的机制。西方的哲学发展较快，较为进步，正式哲学的发展促进了其他学科的发展，哲学思维给予了医学正确看待生命与健康的理论指导。医学家在哲学世界观与方法论的指导下，从事基础医学研究，推动着医学进步发，促进了基础医学的进步。
二、细胞衰老学说研究要靠实践的唯物主义哲学思想
细胞衰老机制研究是一门医学基础的研究，归从于细胞生物学研究，必须通过反复的实验进行验证。而细胞衰老对于机体器官的衰老，机体本身的衰老都是其研究的基础，是其理论基础，哲学思想充斥在科学实践与理论思维之中。细胞衰老机制研究是一个基础认识过程，由感性认识到理性认识，从机体自然界的生老病死的现象，使人类产生研究其基本结构单位细胞的想法，对细胞衰老的机制研究，进一步解开人类机体衰老的奥秘，从认识到实践，实践再进一步指导认识，实现科研造福于人类的意义。
三、细胞衰老学说研究依靠哲学思维发挥出社会效应，实现价值
哲学对医学的发展具有世界观的理论指导意义，细胞衰老学说的发展也不例外。列文虎克发明第一台显微镜,初步认识了微生物，人类就开始了细胞学说的研究。从细胞的大体结构，细胞壁、细胞器、细胞核的研究，到微细的细胞结构中细胞各组织结构的功能，细胞内信号的传导、物质的代谢，再到细胞生长、增殖、衰老、凋亡机制的研究，所有这些都离不开哲学的指导需要哲学思维价值观来指导任一学科的发展，同时细胞衰老学说的研究，必然伴随社会价值的体现，人类向往永生，向往肌肤的永生，甚至生命的永生，所以哲学承担起揭示医学科学社会效应的责任，指导细胞衰老的研究来充分发挥出其社会效应，这涉及人的出现，生存、发展等一系列哲学问题。离开了哲学，科学的理论基础就将崩塌。物理学家玻恩曾经说“每个现代科学家，都深刻地意识到自己的工作是同哲学思维错综地交织在一起，要是没有对哲学文献的充分认识，他们的工作会是无效的”[6]。细胞衰老学说的研究不是独立的个体，它是普遍联系的，将之与环境问题，经济问题，社会人文问题、法律问题等等综合研究才能真正实现社会价值，为社会的发展，社会的前进起到应有的作用。
四、细胞衰老学说离不开哲学思维的唯物辩证法
科学研究中的哲学思维是与一般科研思维融入一体，真正的唯物主义哲学并不认为假说是唯心的，需要通过不断地提岀新的假说或假设，然后通过构建科学技术，进不去证明。假说或假设是科学无法存在的基础，是科学向前发展的动力。这就是科学的理性主义态度或方法论。用胡适先生说科学的态度或方法就是“大胆地假设，小心地求证”[7]。假设-验证是医学科学家常常使用的思维方式。细胞衰老学说就是首先通过假设，然后通过实验的不断证实进行的，只有不断的假设，不断的通过基础实验去验证，才能使衰老学说的机制得到很好的验证，才能不断的进步，不断的探究，更好的使用在机体衰老机制的研究。
五、正确认识事物的逻辑方法
细胞生物学常用研究方法篇2
关键词：细菌生物被膜；浮游细菌；定性方法；定量方法
中图分类号：Q939.1文献标识码：a文章编号：0439-8114（2016）09-2177-04
细菌生物被膜是细菌将其自身包裹在其分泌物内形成的一种特殊复合体，具有不同于浮游细菌的一些特殊性质，如生物被膜形成后造成细菌对外界环境的抵抗能力增强，在临床上形成对常用抗菌药物的耐受性，使得细菌性感染疾病迁延不愈和持续反复发作，给疾病治疗带来一定的难度。随着研究方法的发展和多学科研究领域的交叉和拓宽，近年来细菌生物被膜的定量和定性研究方法越来越完善，这些方法根据原理大致可分为三类：①基于生物被膜胞外基质和生物被膜内的总细胞数量（包括活细胞和死亡细胞）的定量试验：⑦基于活细胞的活菌计数试验：③基于生物被膜胞外基质成分的定量试验。在相关研究中，研究者对生物被膜的结构、活性和细菌组成动态变化规律等方面研究取得了很大的进展，尤其是无损伤的、原位的和在线的技术能够提供自动的、快速的和实时的信息，为生物被膜的研究提供了新的思路和方法。本文分析和比较了几种常用生物被膜定性和定量方法在生物被膜生物量研究中的优缺点，以期评价各方法在生物被膜研究中的适用性。
1常用生物被膜定性研究方法
生物被膜定性研究方法主要借助各种染色方法（如银染法）、光学和光谱学方法（如光学和电子显微镜技术等）进行生物被膜检查和监测，尤其是显微检查技术在观察选取生物被膜细菌群体的结构参数和构效关系方面具有明显的优势。在生物被膜定性研究中，最常用的方法有以下几种。
1.1快速银染法
快速银染法主要用于细菌生物被膜的初步研究。其基本原理是通过快速银染法能够将细菌生物被膜中的多糖蛋白复合物染成灰褐色或灰黑色，通过银染能够初步判断不同培养阶段生物被膜中多糖蛋白复合物的动态变化规律，其操作步骤具体包括10个操作步骤：①基质材料表面浮游菌去除：②戊二醛固定；③蒸馏水漂洗；④氯化钙结合；⑤蒸馏水漂洗；⑥硝酸银染色；⑦对苯二酚显色；⑧蒸馏水漂洗：⑨硫代硫酸钠固定：⑩蒸馏水漂洗。
1.2玻璃试管法
其原理是根据气-液界面形成染色环状物的颜色深浅来判定细菌生物被膜的形成能力。常用的染料有结晶紫和刚果红等，由于该方法存在一定的主观误差，因此主要用于生物被膜形成能力的初步筛选。
1.3基于电子显微镜的定性方法
借助原子力显微镜、透射扫描电镜和激光聚焦显微镜等对细菌生物被膜进行观察，能够对生物被膜的立体结构进行定性分析。尤其是相关染料与激光共聚焦显微镜相结合，能够实现对生物被膜中细菌生理状态的定性和定量分析。相关电子显微镜定性研究方法的缺点是实验条件要求较高，实验设备较贵重，因此不常用于常规检测和研究。随着电子显微镜技术的发展，近年来，在实际的科研中。电子显微镜相关技术常与染色技术和分子生物学技术结合，广泛应用于细菌生物被膜的定性和定量研究。
2生物被膜定量研究方法
2.1琼脂平板菌落计数法
琼脂平板计数法是一种最基本的菌落计数法，在实际的实验操作过程中不仅劳动强度大，而且费时，同时误差较大，不适宜大样本观察。虽然可以通过多次计数求平均值的方法来减小实验误差，然而这样无疑会增大工作量和强度，因此在实际实验中很少单独采用，常常结合其他方法对细菌生物量进行定量研究。在生物被膜细菌计数过程中，需要辅助手段将生物被膜中的细菌游离，辅助手段对被膜细菌的影响也制约着琼脂平板菌落计数法的重复性。
2.2结晶紫（CV）染色法
结晶紫是一种碱性染料，能够结合生物被膜表面带负电荷的表面分子和胞外基质中的多糖成分，通过测定吸光度来对细菌生物被膜形成能力进行鉴定和分型。由于生物被膜中的胞外基质成分和细菌本身（包括活细胞和死亡细胞）均能被结晶紫染色，因此改良结晶紫方法尤其不适合用于对抗菌药物或者其他化学物质对生物被膜内细菌杀伤效果的评价。在研究中常用来对细菌生物被膜下次形成能力进行初步筛选和鉴定。
1985年Christensen等首次采用结晶紫染色方法对非黏液性链球菌生物被膜进行了定量分析，2000年，Stepanovic等对结晶紫方法进行改进，增加了结晶紫染色方法对细菌生物被膜定量的准确性，其能够对微孔板生物被膜生物量进行较为全面的量化。然而，结晶紫染色方法在铜绿假单胞杆菌生物被膜定量中具有较大的批内和批间误差，其原因可能与铜绿假单胞杆菌含有较多的水通道导致其生物被膜固定不充分有关。
2.3Syt09/pi染色法
Syto9是一种能够对核酸进行染色的荧光染料.能够通过被动扩散的方式实行细胞膜与细菌菌体（包括活细胞和死亡细胞）的Dna结合。由于死亡细胞的细胞膜通透性改变和碘化丙啶（pi）只能穿过不完整的细胞壁的特点，pi可以进入死细胞实现对死亡细胞的染色。由于Dna也是胞外基质的一部分，因此可以通过对Dna的结合间接反映生物被膜总生物量的变化规律。
随着科研仪器的发展，尤其是激光共聚焦显微镜（CLSm）的应用之后。除了对生物被膜组成成分和形态学的研究外，Syto9/pi还常常用于细菌和酵母菌生物被膜生物量的研究。需要指出的是，在进行Syto9/pi染色时，为获取稳定的荧光信号。在测定之前需对菌株进行一段时间的孵育，而且孵育时间对不同的菌株影响较大。
2.4mtt/Xtt试验
许多四唑盐类染料如5-氰基-2，3-二-（p-苄基-四唑氯化物）（CtC）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（mtF）、2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐（CCK-8）和3，3’-[1-（苯氨酰基）-3，4-四氮唑]-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸钠（Xtt）均能够实现对生物被膜中活细胞进行相对的定量，而且能够区别生物被膜中活细胞和死亡细胞。其中mtF/Xtt试验是以活细胞的代谢能力为基础的定量化技术，是行之有效的方法之一。
活细胞线粒体中含有的琥珀酸脱氢酶能将加入的mtF/Xtt代谢成为化合物甲月赞，利用酶标仪在570nm处测定细胞上清液的吸光度来反映活细胞的代谢能力，因此可根据光密度oD值推测出活细胞的数目，已经被广泛应用在悬浮细胞的定量化以及细菌和酵母生物被膜的定量研究中。然而由于其自身不可避免的种内和种间变异较大的缺点限制了其在实际中的应用，只能用来检测细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数，因此在利用酶标仪检测结果的时候必须保证试验结果在线性范围内。此外，由于Xtt水溶液不稳定，因此最好低温保存或现配现用。
2.5试卤灵试验
刃天青又称阿尔玛蓝。是一种蓝色的化合物，可以被活细胞代谢成具有荧光活性的粉红色的试卤灵（Resorufin）。这种方法主要用于哺乳动物细胞的活性分析，也被广泛应用于真菌、结核杆菌、表皮葡萄球菌和变形链球菌的药敏试验。
2.6荧光二乙酸（FDa）试验
活的微生物细胞能够利用其自身非特定内源性和外源性酯酶将无色的、非荧光特性的荧光二乙酸（FDa）转化成黄色的、高荧光特性的荧光物质。FDa已广泛用于土壤和垃圾中总微生物的活性监测，也广泛应用于生物被膜生物量的定量研究。
需要指出的是，在荧光二乙酸钠（FDa）试验中，为了增加生物被膜中活细胞的荧光强度，必须通过降低对照孔的荧光信号干扰来实现测定结果的最优化。此外，在利用该方法对不同种属细菌生物被膜生物量进行定量分析时，营养条件和菌株的生理特征等因素都会影响其灵敏度和重复性，因此需要建立标准曲线来校正。
2.71，9-二亚甲基蓝（DmmB）试验
生物膜的一个重要组成部分――胞外基质的定量也越来越引起大家的关注。研究表明，染料1，9-二亚甲基蓝（DmmB）能够和生物被膜胞外基质的硫酸聚糖络合形成一种不溶性的复合物，通过添加一种解聚试剂来间接测定和衡量生物被膜中硫酸多糖的含量。DmmB最初用于软骨细胞培养液中硫酸多糖的定量研究和金黄色葡萄球菌生物被膜胞外基质的定量研究。
2.8多糖蛋白复合物（GLX）的测定――色氨酸定量试验
国内外学者采用色氨酸定量试验对生物被膜中的多糖蛋白复合物进行测定，利用酶标仪读取光密度值后求得多糖蛋白复合物的相对含量。生物被膜的形成不仅仅与自身的遗传因素有关，各种培养条件对细菌生物被膜胞外多糖分泌量的影响也表现出不同的结果，这也充分证实了环境条件对其也起着重要的作用。
3小结
细胞生物学常用研究方法篇3
诱导多能干细胞只是干细胞的一种，但是，可以绕开使用胚胎干细胞的伦理限制，而且具有丰富的来源，因此被视为再生医学和器官移植的重要突破。此后，研究人员就希望能用诱导多能干细胞在实验室中培养和生成各种器官、组织和细胞，用以治疗更多疾病。现在，研究人员发现，诱导多能干细胞确实能培养并生成有生理功能的多种器官、组织和细胞。
诱导多能干细胞培育出肝脏
英国《自然》杂志2013年7月3日报道，日本横滨市立大学谷口英树研究小组与美国西奈山医学院研究人员合作，利用人类诱导多能干细胞培育出微小肝芽，然后移植到小鼠体内，结果这些肝芽成功生长成微型人类肝脏或称“迷你肝脏”，并像健康器官一样具有正常的肝功能。这是世界上首例用诱导多能干细胞培养的立体肝脏。在此之前，已经有研究小组能够用诱导多能干细胞培养出肝细胞，但是还不能培养出可以在人体内发挥功能的立体结构肝脏。
日本和美国研究人员利用人类诱导多能干细胞培养的肝脏从严格意义上来说还不是肝脏，但是可以看成是微小肝脏，它们的直径只有4毫米～5毫米，却表现出了肝脏的生物活性和生理功能。
研制的过程是，将人类皮肤细胞重编程为诱导多能干细胞，并且让其分化成表达肝脏基因的早期肝细胞。然后在培养基中加入从脐带血中提取的内皮细胞和制造骨骼、软骨和脂肪的间充质干细胞，内皮细胞的作用是指挥血管排列和生成。此后，这些细胞在培养基中自行成长为球状的细胞团，如同人类胚胎中肝脏最初的发育一样。两个月后，这些细胞团快速生长成直径为4毫米～5毫米的微小肝脏，研究人员再把这种微小肝脏移植到小鼠的皮肤下。此后，微小肝脏与小鼠的血管慢慢连接起来，最终发育成类似成体肝脏的器官。这种微小肝脏还接管了小鼠肝脏的一些正常的工作。
为了验证这种微小肝脏是否有生理功能，研究人员对小鼠注射了两种药物，以检查肝脏是否有代谢药物的功能。这两种药物是抗炎药酮洛芬和治疗高血压的药物异哇胍。结果发现，小鼠的血液中产生了通常来自人类肝脏的代谢产物而非小鼠肝脏的代谢产物。这说明移植进小鼠体内的微小肝脏发挥了作用。
同时，研究人员还做了一个对照研究，以检测微小肝脏是否有解毒功能，以便帮助肝功能衰竭的小鼠存活。实验用了两组小鼠，一组小鼠的每一只体内都植入了12个诱导多能干细胞培养的微小肝脏，另一组小鼠作为对照组，未植入微小肝脏。研究人员对两组小鼠都注射白喉毒素。结果，移植了微小肝脏的一组小鼠有近1/3存活超过了40天，而对照组小鼠在10天内都死亡了。
此外，研究还发现，诱导多能干细胞生成的微小肝脏能够分泌肝脏的特异性蛋白，也能清除血液中的毒素，并且产生人类特异性代谢物。诱导多能干细胞生成的微小肝脏最为重要的特点是，它很快就能与附近的血管融合，从而获得受体血液系统的支持。这是器官移植最重要的一步，因为有了受体血液系统的支持，而且不受到受体免疫系统的排斥，移植的器官就会持续生长，成为受体体内的一员。因此，尽管这种能首次连接到受体血液系统的具有复杂生理功能的器官还比较微小，但已经是再生医学的一个重要里程碑。
当然，未来如果能进一步表明诱导多能干细胞培养的微小肝脏移植进人体后不受人的免疫系统排斥，那么微小肝脏就可以移植给人体，至少可以取代成人30%的正常肝脏功能。这对于挽救肝功能衰竭的患者具有重要的意义。当然，如果诱导多能干细胞培养肝脏的技术进一步成熟和有效，则有可能培养出像成人肝脏那么大的肝脏，器官移植将会获得突破性进展，因为病人再也不用长时间等待供体器官了。但是，要达到这一步可能还要等上较长时间。
培育简单器官和组织更容易
由于肝脏具有较为复杂的多种生理功能，如解毒功能、代谢功能、分泌胆汁、免疫防御功能等，这就意味着用干细胞培育肝脏更具挑战性和复杂性。因此，在用干细胞培育较为简单的器官方面，应当更有收获。事实也完全证明了这一点。
现在，多个国家的研究人员已经能用诱导多能干细胞培育多种简单的器官，如血管、肌肉、毛囊等。
美国麻省总医院史迪尔肿瘤生物学实验室主任雷克思·杰恩等人利用人类诱导多能干细胞衍生的血管前体细胞，在小鼠身上培育成了有生理功能的血管，而且这些血管维持活性长达280天。
用人类诱导多能干细胞培育的血管主要可以用于治疗心血管病和糖尿病导致的血管损害。比如，糖尿病晚期常导致病人的大血管并发症，如动脉粥样硬化、冠状动脉狭窄（可导致冠心病甚至心肌梗塞）、供应大脑的血管狭窄（可导致脑缺血甚至脑梗塞）、供应下肢的血管狭窄（可导致下肢的疼痛和坏疽），这时就可以用再造血管的方法来治疗晚期糖尿病人。同时，还可以用新血管为新生组织提供血液供应。
过去的一些研究显示，利用人类诱导多能干细胞能生成构建血管所需的内皮细胞，但是，将这些细胞导入到小鼠身上却无法形成持久的血管。于是，麻省总医院的研究人员利用来自健康成人以及1型糖尿病病人的人类诱导多能干细胞，在小鼠大脑外表面和皮肤下生成了血管。研究小组采用了一种最初用于人类胚胎干细胞衍生内皮细胞的方法，以此来扩大和培养人类诱导多能干细胞，然后让这些细胞群生成能够形成血管的内皮细胞。
随后，研究人员把这些内皮细胞与间充质前体细胞（可生成必要的结构细胞）一起移植到小鼠大脑的表面。在两周内，移植细胞形成了血液灌注的血管网络，它们与邻近的天然血管一样发挥了功能，并在小鼠体内持续发挥功能长达9个月。此外，研究人员也用同样的方法在小鼠皮肤下移植内皮细胞与间充质前体细胞，结果也生成了功能性的血管。但是，在皮肤下的移植需要移植更多的细胞，约为移植到大脑的5倍以上，并且生成的血管的寿命比在大脑生成的血管寿命短。
这项研究还表明，来自健康人的细胞和患1型糖尿病患者的人类诱导多能干细胞衍生的内皮细胞都可以生成能长期维持功能的血管。但是，不同的人类诱导多能干细胞和包括来自同一患者的不同细胞系在生成血管的潜力上有差异，因此，还需要更深入地了解干细胞生成血管的更多机理，而且需要找到更好的方法来操控生成特定器官所需的特异内皮细胞类型。
当然，由人类诱导多能干细胞生成的血管是否能应用于糖尿病病人，还需要在安全性和实用性方面进行更深入的研究，但毕竟这项研究已经让人们看到了一些希望。
另一方面，用干细胞培养成熟的心肌也有了新的突破。过去，在培养基中培养的心肌细胞并不像人体心肌细胞那样具有生理功能，例如传导生物电信号和收缩。为了解决这些问题，美国杜克大学生物医学工程系的尼纳德·伯萨克等人采取了一种新的方法来培育心肌，即用胚胎干细胞来培养心肌。胚胎干细胞不同于诱导多能干细胞，可能会受到伦理制约，而且所能获得的胚胎干细胞也有限，当然其全能分化和生长的效果优于诱导多能干细胞。
研究人员在实验室中把人胚胎干细胞分化得到的心肌细胞放入三维水凝胶中。此后，心肌细胞自行组装成心肌束，形成了纤维细胞在外、内皮细胞穿插其中的三维结构。而且，这种组织并非是心肌细胞的堆积，而是一块8毫米×8毫米的心肌组织，并且达到了与体内心肌细胞类似的功能指标。通过注入不同的药物可以检测心肌电传导性能的变化和检测药物对心肌收缩能力的影响。由此证明，这种由胚胎干细胞培养的心肌组织不仅可以传导生物电流，而且可以自主搏动。
研究人员认为，这种心肌组织的结构和功能都超过了以前的人工心肌，也是迄今为止和人体组织最接近的人造心肌薄片。虽然这是依靠胚胎干细胞培养的，但是，通过仔细总结培养的机理，未来可以通过提取心脏病人的皮肤细胞以获取诱导多能干细胞，再由后者来培养特异的心肌组织或心脏，如此，则可以修补病人的坏死心肌，或者直接为病人移植用其自身的皮肤细胞培养的心脏。
培育血细胞
诱导多能干细胞还能培育更多的血细胞，以用于输血、诊断和治疗疾病。
人的血液由血浆和血细胞组成。血浆相当于结缔组织的细胞间质，为浅黄色半透明液体，其中除含有大量水分以外，还有无机盐、纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白、酶、激素、各种营养物质、代谢产物等。血细胞则分为红细胞、白细胞、血小板。人的血细胞总是在不断地新陈代谢。红细胞的平均寿命约120天，有粒白细胞和血小板的生存期限一般不超过10天。淋巴细胞的生存期长短不等，从几个小时到几年。一般而言，血细胞及血小板来自造血器官，红细胞、有粒白细胞及血小板由红骨髓产生，无粒白细胞则由淋巴结和脾脏产生。但是，由于疾病和造血功能异常会导致一些血液方面的疾病，如贫血。
贫血是指人体外周血液中红细胞容量减少并低于正常范围下限的一种疾病，但是由于红细胞容量测定较复杂，临床上常以血红蛋白（Hb）浓度来代替。在中国一般把成年男性Hb
因此，贫血的根本原因是红细胞减少，因而导致血红蛋白减少，血液携氧供氧能力下降，这就会对全身造成不同程度的影响。例如，造成神经系统的损害，表现为头昏、耳鸣、头痛、失眠、多梦、记忆力减退、注意力不集中等；贫血更影响呼吸循环系统，表现为气急或呼吸困难，并且有心悸、心律失常和心功能不全；贫血也影响消化系统，因为贫血时消化腺分泌减少甚至腺体萎缩，进而导致消化功能降低、消化不良，出现腹部胀满、食欲减低、大便规律和性状的改变等。
长期以来，治疗慢性贫血的效果并不如意。研究人员也在寻找新的方法，例如输血和单独输入红细胞。但是，输血和输入红细胞也可能发生排异反应和输血反应，甚至染上其他传染性疾病。如果能用病人的皮肤细胞产生诱导多能干细胞，再由后者生成红细胞，就可以把红细胞输入病人体内，治疗贫血。
现在，美国波士顿大学医学院的乔治·墨菲与波士顿大学公共健康学院的戴维·希尔领导的研究团队采用一种新的方法，对诱导多能干细胞进行分化，在试管内制造出了大量的人类红细胞和血小板。这些红细胞有望用于治疗贫血和诊断疟疾、镰状细胞贫血，而血小板则可用来检查心血管病和治疗凝血障碍。
细胞生物学常用研究方法篇4
【关键词】骨关节炎;细胞凋亡;软骨细胞;细胞代谢
骨性关节炎(osteoarthritis,oa)是一种以关节软骨退行性变和关节周围骨质增生为病理性特征的慢性进行性骨关节病。随着人口的老龄化,骨性关节炎已成为及常见的疾病。多年的研究提示,在诸多因素影响下,关节软骨细胞外成分的合成减少与降解增加,是造成骨性关节炎软骨变形的重要因素之一。
oa是由于机械性和生物性因素相互作用,使关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨合成与分解的正常进程失去平衡的结果。成人正常关节软骨中,软骨细胞占整个软骨体积的2%以下,其余为大量的细胞外基质,主要由胶原(大部分为ii型,其他型胶原较少)和蛋白聚糖组成,蛋白聚糖主要以软骨聚集蛋白聚糖的形式存在。正常情况下,软骨基质的分解与软骨细胞合成基质的速率保持平衡,是软骨的形态和功能得以维持。由于机械性磨损或理化因素致使软骨破坏或降解加快,或者因软骨细胞合成基质收到抑制或其他因素的影响,使软骨修复能力下降后,最终可导致骨关节炎形成。
目前针对骨关节炎的体外研究,主要集中在兔关节软骨细胞的培养及诱导成模,动物的软骨细胞往往增生活跃,并且由于种属间差异,只能从一定程度上说明研究的意义。而直接从临床上获得的人关节软骨细胞,尤其是骨关节炎软骨细胞在体外研究中更能说明问题,因为它更符合实际生理状态,研究结果更可信,对临床上防治oa有直接指导作用。
1骨性关节炎(oa)的发病机理研究探讨
在oa的病理过程中,关节软骨细胞及滑膜细胞分泌过量的基质金属蛋白酶,打破了mmp-timp(组织金属蛋白酶抑制剂)的平衡,造成对关节软骨eCm的国度降解,是软骨逐渐出现腐烂、溃疡、缺失等一系列退行性变的重要原因。mmps可降解软骨关节eCm中的ii型胶原、弹力纤维和蛋白多糖等。前者使软骨的拱形纤维结构破坏而受损,蛋白多糖的降解测试软骨失去弹性,其包绕胶原纤维的分子筛滤过作用下降从而导致关节软骨更易受到降解酶的作用而破坏。
机制金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,mmps)是一组锌依赖性的蛋白水解酶,能够特异性的降解细胞外基质(extracellularmatrix,eCm)、蛋白质的组成部分和裂解信号蛋白质。主要参与细胞外基质代谢,与正常组织塑性和病理状态下细胞外基质退变有关。mmps以无活性酶原形式出胞,在各种炎症介质调控下被激活,导致细胞外基质的降解,同时它们能被特定的蛋白抑制物(如timp)所抑制。
mmps在骨关节炎关节软骨的退变中起着重要的作用。酶和酶抑制物水平失调是oa的可能致病机制,在oa中的软骨关节内存在mmps及其抑制物之间的不平衡,关节软骨的破坏程度与软骨降解酶的含量呈正相关。根据作用底物,mmps可分为胶原酶、明胶酶和间充质溶解酶等,而在oa病理生理中,研究较多的是mmp-1(胶原酶-1)和mmp-13(胶原酶13)。它们对细胞外基质尤其是ii型胶原酶有很强的降解能力,是目前在软骨破坏中研究较多的胶原酶指标。oa时它们可由软骨细胞或滑膜细胞生成,研究表明,在oa关节液以及病变部位软骨中,mmps的活性增高,而且继发于软骨破坏后。
白细胞介素-1(iL-1)、白细胞介素-6(iL-6)与肿瘤坏死因子(tnF-α)是参与oa发病进程中的重要递质,是炎症发病反应的重要调节剂,是调节炎症的始动因素[1]。白介素1(interleukin-1,iL-1)。近年来,人们逐渐认识到白介素1特别是iL1-β在骨关节炎的发病中起着重要的作用,并认为iL-1β水平的不断升高是骨关节炎软骨进行性退行性变的重要原因之一。
有人应用特定的基因转染载体将iL-1受体拮抗蛋白基因转移到存在病变的关节软骨或滑膜组织中,使该基因在关节内大量表达,从而阻断病理状态下所产生iL-1的破坏作用,达到预防、治疗和长期维持骨关节炎缓解状态的目的。Ghivizzani等将iL-1β基因转到兔滑膜组织中,结果诱导出了典型的关节炎改变。iL-1对oa发生的影响是多方面的。白介素-6(interleukin-6,iL-6)是具有多种生物学活性的细胞因子,包括激活B细胞和t细胞,以及产生急性期蛋白[2]。正常及oa软骨中分离的关节软骨细胞都能自发分泌iL-6,而正常人滑膜免疫组化检测不出iL-6的存在,oa滑膜内壁细胞则可以免疫组化显示。
iL-1β是体内广泛存在的与炎性有关的因子,体外培养的正常软骨细胞和滑膜组织细胞都能够产生微量的iL-1β。据报道,iL-1β能明显影响关节软骨细胞合成基质,从而在oa发病过程中扮演重要角色。iL-1β对关节软骨降解作用的主要降解作用的主要机制可能在于促进软骨中mmps合成和分泌,抑制基质金属蛋白酶组织抑制物-2(timp-2)合成,而前者对基质有较强的溶解作用。由此,iL-1β被用于诱导oa模型产生,而iL-1受体阻滞剂(iL-1Ra)也可用于oa模型治疗,并取得初步效果。
肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnF-α)。肿瘤坏死因子-α以旁分泌的方式作用于th细胞,加强其iL-2分泌,提高iL-2受体的表达水平、促进t细胞的活化和扩增。在oa动物模型中,oa关节软骨免疫组化染色其基质及细胞中tnF-α及受体均呈阳性反应,且强度、范围与oa严重程度相平行。
细胞凋亡和骨关节炎的发生发展较为密切,Hashimoto等研究发现正常关节软骨可出现细胞凋亡,但检出率低,主要位于表层,oa患者出表层的数量增加外,中增均有凋亡细胞存在。Blanco等认为关节软骨降解最终完全丧失是骨关节炎的主要病理特征,通过形态学及细胞生化学的方法发现在骨关节炎患者的关节软骨内有凋亡细胞的存在。细胞外基质(extracellularmatrix,eCm)各成分平衡是维持各层软骨细胞活性的重要条件,细胞凋亡与基质崩解密切相关。
切片显示,oa患者关节软骨富含凋亡细胞的区域伴有大量蛋白多糖降解,表层移行软骨细胞凋亡最多,且基质降解最严重。Heraud等观察人的正常和oa股骨头关节软骨发现,oa软骨细胞中有18%～21%软骨细胞表现出调往特征,而正常关节软骨只有2%～5%凋亡细胞.Cao等发现蛋白多糖聚合物的降解产物之一G1结构域由于与透明质酸的结合不易进入循环系统,易在滑液中及软骨中积累,通过降低细胞间粘附诱导软骨细胞凋亡,滑膜是关节滑动结构中的重要组成部分,其中有大量的血液供应和丰富的神经支配,滑膜的分泌吸收和营养代谢是关节软骨维持正常功能的前提。
细胞凋亡是受基因调控的一种细胞主动死亡过程,参与机体许多生理和病理过程,软骨细胞的异常凋亡对骨关节炎的发生于发展起至关重要的作用。近年来的研究证明,软骨细胞调节细胞凋亡有两条通路:no诱导途径和Fas介导途径。Fas又称apo-1或CD95,Fas/CD95介导的凋亡通常包括其死亡区与连接程序分子FaDD(Fas-associatedproteinwithdeathdomain)相连结,以及FLiCe(CD95L白细胞介素-1β转换酶)的募集,继而发动iCe的其他家庭成员蛋白水解酶的激活,如caspase-8和caspase-3,产生caspase家族级联反应,最终导致凋亡发生。已有研究证实,能导致细胞氧化损伤的因素均能引起细胞凋亡,过氧化氢可以引起剂量依赖性细胞死亡,但浓度低于100μmol/L的过氧化氢主要导致细胞凋亡,浓度超过100μmol/L则细胞坏死开始占优势。
oa发病机制中除了酶以及抑制物的代谢失衡外,软骨细胞的凋亡以及自由基也起了重要作用。细胞凋亡(apoptosis)是一种基因控制并依赖atp功能的细胞自主性死亡方式。随着细胞分子生物学的发展,国内外许多学者研究发现软骨细胞凋亡在oa的发生发展中起到关键作用。
2骨关节炎中软骨细胞的研究发现
软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞,软骨细胞在软骨形成、代谢节修复中起着重要的作用。关节软骨细胞增殖和凋亡正常情况下处于动态平衡状态,使关节软骨在总体上保障其细胞数量及形态和功能的稳定。软骨细胞凋亡过盛可能是软骨退变发展成膝关节骨性关节炎的重要原因之一。
刚分离下来的原代软骨细胞呈大小均一的遮光性较强的球形。正常原代软骨细胞48h后完全贴壁,细胞大部分呈圆形、椭圆形或短梭型外观,部分区域软骨细胞呈集落生长,约7d后长满瓶壁,密疏不一,有的区域还可见大量基质包绕的结节样细胞群落;传代后一般24h即可完全贴壁,第二代软骨细胞3d左右即可长满,细胞仍以椭圆形多见,但随着传代次数的增加,细胞中梭型细胞逐渐增多,分泌和增殖能力下降,传代周期延长。而骨关节炎组原代细胞贴壁普遍较晚,细胞形态多不规则,约9d后才能长满瓶壁,多为单层生长,集落样生长和结节样细胞群落少见;传代后贴壁也较晚,第二代软骨细胞需4d左右长满瓶壁,细胞中梭型细胞增多明显,有时可见浮起的死亡细胞,分泌和增值能力下降。
目前原代软骨细胞酶消化分离的方法很多,常用的有Green法和Klagsbrun法等。体外培养观察表明原代正常软骨细胞具有良好的附壁生长和增殖活性,细胞外基质富含ii型胶原和蛋白多糖聚集体,直至传到第4代仍具有较好的软骨细胞生物学特性。相比较而言,骨关节炎软骨细胞的贴壁和增殖较慢,ii型胶原和蛋白多糖的含量也较少,传到第4代软骨细胞生物学特性基本消失。同时,细胞凋亡明显增多,对相同浓度iL-1β的诱导反应更加显著。而iL-1β能促进基质金属蛋白酶(mmps)生成同时降低基质金属蛋白酶抑制剂(timps)的合成,还能够刺激中性蛋白酶和前列腺素e2(pGe2)的产生,加重关节的炎性反应,在软骨细胞的降解、退变过程中起到最重要的作用[3]。
oa中no主要来源于软骨细胞,通过inoS催化生成。研究表明,正常软骨细胞不表达inoS,在oa中,软骨细胞则表达inoS,并产生no参与oa的病变过程。实验表明,iL-1β能通过no介导,抑制软骨细胞蛋白多糖和胶原的合成,诱导基质金属蛋白酶的形成于释放,导致基质降解,还可抑制软骨细胞的增值;同时也参与了软骨细胞的凋亡过程。元建洪等研究了iL-1β对人软骨细胞mmp-13的影响,报道它们存在剂量依赖关系,但未对mmp-1进行研究。
ieda等应用人软骨肉瘤细胞进行实验,发现iL-1β可以通过p38途径影响mmp-1/-13的变化,但并未对两者的不同进行研究[4]。Fas途径。Fas及FasL在细胞表面的表达手细胞密度的影响,低密度区细胞(细胞处于未融合状态)Fas及FasL的表达,要高于高密度去细胞(细胞处于融合状态),但后者被主动性抗体诱导儿凋亡的软骨细胞数目却是前者的15倍,提示在低密度培养时,保护性的抗凋亡机制被激活,使得软骨细胞对Fas途径介导的凋亡敏感性下降。
3药物对骨性关节炎的治疗进展
中药的作用机理引起膝oa军事从软股退化开始,继而发生其骨质和滑膜的改变。随着现代医学的发展,对其病机和中药的作用机制的研究也取得了进展。中医认为本病主要为筋骨失养,是肝肾虚弱所致。这与血瘀气滞病较为相似,因而中药医补肾壮骨和养血柔肝类为主。现代药理研究补益肝肾可改善微循环、防止自由基过量产生、调节内分泌状态、增强免疫功能,使软骨蜕变等表现得到改善和修复,从而达到防治和改善病情的目的。同时配以活血通络、温经止痛之品。它们在改善软骨细胞功能、促进软骨修复、抑制滑膜炎性改变、延缓软骨退变等方面也能起积极作用[5]。
丹参主要成分丹参酮i、ii、iia,主要功效为活血化瘀畅行血脉、通利关节、行血分、苦降开泄以散瘀等。研究发现马钱子及其主要单体成分马钱子碱等对软骨细胞凋亡及合成代谢有较大影响。其对兔膝oa有一定保护作用,对正常软骨细胞有促进增值而无诱导凋亡作用。马钱子及其主要单体马钱子碱在一定剂量时对不同途径下诱导的软骨细胞凋亡有抑制作用,并在抑制软骨细胞凋亡的同时对软骨细胞合成代谢功能有一定的改善作用。
牛维等采用软骨细胞培养技术观察补肾活血方对软骨细胞的增值和细胞总蛋白合成的影响,从细胞分子水平研究该方防治膝oa的作用机制。研究表明该方含药血清可促进软骨细胞的代谢与软骨细胞的增值以及软骨细胞蛋白质的合成。邵敏采用兔软骨细胞培养技术观察补肾活血方对SoD及一氧化氮合酶(noS)的影响,从细胞分子水平研究该方防治软骨蜕变的作用机制。结果表明该方对软骨细胞的保护作用是可提高SoD活性,阻止自由基的生成,抑制noS的活性,减少no的生成,从而阻止no、自由基对软骨细胞结构的损伤和破坏。刘坤等认为不同中药对软骨细胞银子的表达呈现出不同的效应,益肾方和柔肝方能降解血清中透明质酸的水平提高膝关节透明质酸的水平,对延缓软骨退变有重要意义。
殷惠芬等按照Hulth法建立兔膝oa模型,Feulgen染色测定图软骨细胞核Dna含量的图像分析表明,中药复方(独活、威灵仙、萆、鸡血藤、桑寄生、川牛膝)可明显减少兔软骨细胞核内异染色质的数量;末端原位标记法(tUneL法)观察软骨细胞凋亡情况、琼脂糖凝胶电泳观测软骨细胞Dna特征性梯形带,结果显示该中药复方能减轻内源性Dna氧化性损伤,减少Dna键断裂及分子片段数量,减少兔软骨细胞凋亡数目。
抑制炎性细胞因子和no含量;采用石膏管形固定致兔膝oa模型造模方法,测定关节液中iL-1β、tnF-α的含量,结果表明古方莶丸能降低实验动物关节液中iL-1β、tnF-α的含量,具有一定的抗炎作用;光镜和电镜下观察表明莶丸可改善关节固定造成的膝关节面软骨的退行性改变,对处于病变条件下的软骨具有保护作用,对已造成退行性改变的关节软骨有减轻和改善其病变程度的作用。安莉萍采用兔膝关节腔内注射木瓜蛋白酶方法建立兔膝oa模型,放射免疫分析法(Ria)检测血清及关节腔液iL-1β、tnF-α含量,以亚硝酸盐还原酶法测定血清及关节腔液中炎性细胞因子和no的产生,起到减轻膝关节oa兔软骨损伤的作用。
镇痛剂对轻、中度关节炎有效,对乙酰氨基酚是这一类药物的代表药物,是治疗骨关节炎的传统制剂[6]。轻度或中度患者应用对乙酰氨基酚可以取得与应用非甾体抗炎药一样的效果。非甾体抗炎药(nSaiDs)对于退行性骨关节病的疼痛和僵硬是一种常规用药,选择性CoX-2抑制剂塞来昔布和罗非昔布既能消炎镇痛,又极少出现nSaiDs并发的严重胃肠道反应。透明质酸钠是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡糖组成,该双糖单位以糖苷键相结合,并重复连接成链状聚合物。透明质酸钠关节腔内注射治疗骨关节炎与nSaiDs口服疗效相当,起效不如糖皮质激素快,但是维持时间比较长。
4实验性对骨性关节炎(oa)临床研究
4.1对实验性oa血液循环障碍的影响袁忠治选取兔一侧膝关节切断其前交叉韧带,另一侧膝关节作假手术建立兔膝oa模型,观察膝关节大体形态学、测量股骨内髁软骨厚度和面积、测量股骨内髁关节滑膜细胞层厚度,实验表明补肾活血中药(当归、鸡血藤、熟地黄、川芎、丹参、牛膝、红花、益母草、骨碎补、泽兰、丹皮、淫羊藿、车前子)可明显减轻实验性oa关节软骨的缺损。明显增加。
陈述祥采用兔左膝伸直位管型石膏固定8周的方法建立oa动物模型,进行血液流变学检测和滑膜、软骨标本的组织学观察。结果中药复方骨痹灵口服液(鸡血藤、黄芪、骨碎补、肉苁蓉、防风、鹿角胶、怀牛膝、当归、白芍)能够有效改善家兔膝oa模型血液粘滞度,并促进软骨细胞增生、减轻滑膜组织炎症,从而达到治疗oa的目的,其效果优于芬必得胶囊。
高铁祥通过手术结扎右侧股静脉的方法复制右膝关节炎模型,观察中药复方胶囊(熟地、山药、枣皮、泽泻、枸杞等)等的治疗作用。结果中药复方胶囊组的股内压明显降低,心脏全血黏度、血浆黏度显著降低,心脏血中no浓度显著降低。实验表明,中药复方胶囊对实验性oa有抑制作用。杨荣全研究骨脉康胶囊的药理作用,结果骨脉康胶囊能显著减少小鼠皮下血肿模型的血斑面积并显著缩短血斑消失时间,说明它对小鼠皮下血斑吸收有显著的促进作用;在整体动物实验中,说明它对小鼠皮下血斑吸收有显著的促进作用;在整体动物实验中,骨脉康胶囊低、中、高剂量组均有显著的抗血小板聚集功能。上述作用为骨脉康胶囊活血、化瘀、通络作用提供了药理学依据。
4.2对实验性oa关节积液及生理生化指标的影响陈卓夫按照Hulth方法建立兔膝oa模型,参照GotdbrgVm法对膝关节活动进行临床评分,同时进行关节液量的测定、软骨羟脯氨酸及水量的测定、血清碱性磷酸酶与酸性磷酸酶含量的测定。结果中药化痰软坚片(白芥子、天竺黄、乳香、没药、当归、地龙、鹿衔草、鹿角霜、骨碎补、枸杞、黄芪)能够改善oa模型家兔关节炎的临床症状;化痰软坚片中、高剂量组家兔的关节腔内液、关节软骨中羟脯酸及水分含量、血清碱性及酸性磷酸酶均有显著或非显著性改变,低剂量组也有好的趋势,表明化痰软坚片能改善oa模型家兔关节炎症的各种生理生化指标。
4.3骨性关节炎(oa)临床研究骨性关节软骨中虽然软骨细胞只占很少的一部分,但发现它的生存或死亡在oa关节软骨中起重要作用。退化的软骨细胞随oa的严重程度增加而增加。在本研究中显示,oa的关节软骨光镜下软骨细胞数减少,排列紊乱并有成簇现象,细胞核固缩,呈浓密深染状态。软骨细胞在机械、炎症、生化或免疫等损伤条件下发生凋亡、坏死、增殖等反应,亦可通过调控合成基因及分解基因的表达,使合成减少或基质降解。炎症介质与软骨细胞、滑膜细胞的凋亡、坏死之间形成恶性循环,而机械作用是一种起始因素,它们相互渗透,互为因果。
骨和软骨组织、关节软骨中含有多种细胞因子及其受体,可通过自分泌或旁分泌的方式对骨和软骨的形成和修复起局部调节作用,维持关节软骨的正常形态和功能。其活性发生改变,则将导致关节软骨基质成分丢失和进行性破坏。在骨的微环境中,有许多生长因子参与调控成骨细胞的代谢。其中iGFs具有重要调节作用。其中iGF-ii在骨中含量丰富,与骨代谢密切相关。作为一种自分泌调节因子,iGF-ii能有效的促进骨细胞的有丝分裂和成骨细胞的功能分化增强碱性磷酸酶的活性和钙盐沉着,对骨骼体积增大及长度延长均有着重要的作用。
骨性关节炎的发病机制现在还没有完全明确,而骨性关节炎的治疗也是一个棘手问题[7],一般用药对骨性增生改变的疗效并不明显,而关节置换存在着费用大、风险性高、假体容易出现问题等,目前在骨关节炎的基因治疗方面,国际上还处于动物实验阶段,但是软骨细胞凋亡在oa软骨退变发生发展中的如何作用,以及细胞凋亡与药物治疗oa疗效之间的关系如何,是一个值得研究的崭新课题,将来通过对软骨细胞凋亡调控机制的认识,进一步研究中药特别是补肾中药对软骨细胞代谢的影响,将最终为oa防止开辟一条新的途径。
参考文献
[1]任志伟,俞永林,杨丰建,等.iL-1β对兔关节软骨细胞mmp-1/-13mRna表达和no的影响.复旦学报(医学版),2008,35(2)167-170.
[2]郭静,张娜,闫冰,等.mmp-13与iL-6在骨性关节炎相关性表达的研究.华北煤炭医学院学报,2008,10(3):297-299.
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细胞生物学常用研究方法篇5
【摘要】
目的：建立人腺样囊性癌耐药细胞系，为阐明腺样囊性癌的多药耐药机制及逆转耐药提供模型及研究依据。
方法：以长春新碱（VCR）为诱导剂，通过浓度递增间断刺激法对人腺样囊性癌细胞系（aCC）进行体外诱导耐药，建立耐VCR的腺样囊性癌细胞系aCC/VCR。细胞计数法绘制细胞生长曲线，噻唑蓝（mtt）比色法检测细胞对化疗药物敏感性。结果：aCC经体外诱导后，aCC/VCR细胞对长春新碱（VCR）、阿霉素（aDm）和平阳霉素（pYm）的耐药性明显增强，具有交叉耐药，对环磷酰胺（CtX）、氟尿嘧啶（5-FU）和顺铂（DDp）耐药性无明显变化。耐药前后aCC细胞的生长曲线、群体倍增时间和光镜下的形态无明显改变。结论：VCR可诱导腺样囊性癌细胞产生多药耐药。
【关键词】腺样囊性癌 多药耐药 长春新碱
establishmentofmultidrugcelllineofhumanadenoidcysticcarcinoma
abstractaim:toestablishaninvitroresistancemodelofadenoidcysticcarcinomawhichcanprovidetheoreticalinformationforelucidatingthemechanismsofmultidrugresistance(mDR)，improvingthechemotherapyscheme，evaluatingtheprognosisandreservingthemDRinadenoidcysticcarcinoma.metHoDS:theresistancecellline，aCC/VCR，wasinducedintheaCCcelllineinvitrobyprogressiveconcentrationsofvincristine(VCR)，adrugofchoiceinthetreatmentofadenoidcysticcarcinoma.thegrowthcurve，drugsensitivityintheparentalandresistantcelllineswereinvestigatedbycellcountingandmttassay.ReSULtS:aCC/VCRcelllinewascross-resistanttovincristine(VCR)，adriamycine(aDm)andpingyangmycin(pYm)，butnotresistanttoCyclophosphamide(CtX)，fluorouracil(5-FU)andcisplatin(DDp).therewasnosignificantdifferenceinthedoublingtimeandmorphologicalchangesbetweenaCCcelllineandaCC/VCRcellline.ConCLUSion:exposingtoVCRcaninducemDRinadenoidcysticcarcinoma.
·KeYwoRDS:adenoidcysticcarcinoma;multidrugresistance;vincristine
ZhouXD，SongGX，SuiZF，ChangJw.establishmentofmultidrugcelllineofhumanadenoidcysticcarcinoma.intJophthalmol(GuojiYankeZazhi)，2007;7(2):417-419
0引言
腺样囊性癌（adenoidcysticcarcinoma，aCC）是一种高度恶性的上皮性肿瘤，可发生于全身各部位，如涎腺、颌下腺、气管、肺、乳腺、皮肤等，于眼眶则好发于泪腺[1]。目前对腺样囊性癌的治疗以综合治疗为主，其中化疗主要作为新辅助化疗（术前或放疗前化疗）、辅助化疗（手术后或放疗后化疗）、放疗增敏剂和姑息性化疗应用[2]。有的肿瘤细胞在对一种化疗药物耐药的同时，对其他结构和机制不同的化疗药物也产生耐药性，称为肿瘤细胞的多药耐药性(multidrugresistance，mDR)[3]。多药耐药的产生是导致肿瘤产生耐药和化疗失败的重要原因之一。我们通过长春新碱诱导建立腺样囊性癌耐药细胞系，旨在为阐明腺样囊性癌的多药耐药机制，指导多药耐药逆转剂的研究提供模型和研究依据。
1材料和方法
1.1材料人腺样囊性癌(aCC)细胞系购自上海申能公司。Rpmi1640干粉培养基(Gibco公司)，胎牛血清(天津灏阳生物有限公司，56℃40min灭活补体)，青、链霉素(石家庄制药厂)，谷氨酰胺（L-glutamina）(Gibco公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，依地酸二钠（eDta）(广州化学试剂厂)，二甲基亚砜（DmSo）(北京鼎国生物有限公司)，噻唑蓝（mtt）(北京鼎国生物有限公司)，长春新碱（vincristine，VCR）(上海华联制药有限公司)，环磷酰胺(CtX)(上海华联制药有限公司)，阿霉素(adriamycin，aDm)(深圳万乐药业有限公司)，氟尿嘧啶(5-FU)(天津市氨基酸公司人民制药厂)，平阳霉素(pYm)(天津太河制药有限公司)，顺铂(DDp)(山东齐鲁制药厂)。Co2培养箱（Heraeus，德国），倒置显微镜（olympus-1m，日本），生物显微镜（olympusBH-2，日本），紫外分光光度计（UV754，上海分析仪器厂），台式高速离心机（allegra64R，美国Beckman），磁力搅拌器（江苏省金坛市通济仪器厂），酶联仪（DG-3022a，南京电子管厂）。
1.2方法aCC细胞系培养在含100ml/L灭活胎牛血清、100kU/L青、链霉素的Rpmi1640培养液中。培养条件：37℃，50ml/LCo2，每3d换液1次，2.5g/L胰酶、0.2g/LeDta消化传代，约5d传代1次。采用VCR浓度递增间断刺激法选择耐药细胞，具体步骤如下：VCR15μg/L×7d，去药7d，VCR30μg/L×7d，去药7d，VCR60μg/L×7d，去药7d，VCR60μg/L×7d，去药7d，VCR120μg/L×7d，去药7d，VCR120μg/L×7d，去药7d，VCR250μg/L×7d，去药7d，VCR250μg/L×7d，去药7d，无药培养7d后进行实验。取生长状态良好的细胞，2.5g/L胰酶、0.2g/LeDta消化制成细胞悬液，计数，将细胞悬液接种于24孔板，每孔1mL，接种浓度1×107/L，37℃，50ml/LCo2培养。每日取3孔板细胞进行计数，计算均值。连续观察7d，其间培养3d后给未计数的细胞换液。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），在半对数坐标纸上绘制生长曲线，根据公式计算细胞在对数生长期的倍增时间。tD(倍增时间)=t（培养时间h）×lg2/（lgnt-lgn0）。n0，nt：接种后及培养th后的细胞数。mtt比色实验[4]测定化疗药物敏感性：取对数生长期细胞，2.5g/L胰酶、0.2g/LeDta消化，用含100ml/L胎牛血清的Rpmi1640培养液配成5×106～1×107/L的单个细胞悬液；取96孔培养板，每孔加入200μL细胞悬液，37℃，50ml/LCo2培养过夜；更换培养液，并按一系列浓度（终浓度分别为0.01，0.1，1，10，100、1000mg/L）加入抗肿瘤药物，每浓度重复3孔，以不加细胞只加培养液的孔作为空白对照，37℃，50ml/LCo2培养72h；每孔加5g/Lmtt溶液20μL，37℃，50ml/LCo2继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜（DmSo）150μL，振荡10min，使其充分溶解；选择490nm波长，在酶联仪上测定各孔吸光度（a）；按公式计算细胞存活率，以细胞存活率对药物浓度对数作图，求出药物半数抑制浓度（iC50），计算耐药系数（resistancefactor，RF）。细胞存活率（%）=试验组吸光值a/对照组吸光值a×100%，RF=耐药细胞iC50/亲代细胞iC50。
2结果
2.1细胞系的建立aCC细胞系经VCR体外诱导筛选，连续培养4mo，获得了在250μg/LVCR作用下生长良好的耐药细胞系。命名为aCC/VCR。无药培养2mo，对VCR的耐药指数无明显下降，说明已有稳定的耐药性。VCR在体外诱导耐药的培养过程中，加药后细胞出现肿胀，胞浆内颗粒较粗，细胞生长受抑，增殖速度很慢甚至不增殖，随之大量脱壁、数目减少。换用不含VCR的培养液培养，并适当延长传代周期，存活下来的耐药细胞生长分裂加快，形成多个细胞克隆，再逐渐融合成片，但细胞大小不一，排列紊乱，异型性较为明显。然后继续用含VCR的培养液筛选。经过几次筛选后，不耐药或耐药性低的的细胞被排除，余下的是有较高抗药性的细胞。
2.2细胞形态学观察aCC和aCC/VCR细胞在体外均为贴壁生长，在倒置显微镜下为多角形上皮样细胞，大小较为一致，胞质内可见透亮度深浅不等的颗粒，核大，类圆形或不规则形，核/质比例高，核仁2～3个，清晰可见的，并可见巨大融合细胞。细胞分裂相多见，并有多级核分裂，排列紧密时细胞互相镶嵌成铺路石样，密度再增高时可重叠生长，表现为接触抑制消失（图1a，B）。aCC和aCC/VCR细胞在体外增殖速度相似（生长曲线见图2）。群体倍增时间分别为28.32±1.65h和27.55±0.89h，两组间比较无显著性差异（t=1.162，p=0.311）。
2.3耐药谱aCC/VCR不仅对原诱导药物VCR具有耐药性，而且对aDm，pYm有交叉耐药性（表1）。各种化疗药物临床常用量所达血药浓度分别为：VCR0.25mg/L；CtX140mg/L；aDm6mg/L；5-FU50mg/L；pYm20mg/L；DDp5mg/L。
3讨论
近年的研究发现，肿瘤细胞一般多对天然植物碱及其人工半合成衍生物类(如长春新碱、长春花碱、秋水仙碱等、鬼臼乙叉甙等)和抗生素类(如阿霉素、放线菌素D、柔红霉素、光神霉素等)药物易产生耐药和交叉耐药，而且不同组织来源的肿瘤其发生多药耐药的机制亦各不相同[5]。对mDR的研究对于改善肿瘤患者预后，制定合理的治疗方案以防止mDR出现或逆转mDR有重要意义。体外建立耐药细胞系国内外均见报道，常用的方法是浓度递增间断刺激法[6，7]，即通过在体外培养的亲代细胞中逐渐增加某一种化疗药物的浓度，通过药物选择作用获得耐药细胞系，为体外研究多药耐药提供模型。当然，药物在体内的代谢和作用过程远比体外复杂，不应单纯进行体外实验而忽视对临床标本的研究。
有关人aCC细胞体外实验的研究目前国内外多有报道，现已建立有SaCC83，aCC-m等细胞系，并进行了一系列有关药物敏感性测试、放射治疗、生物治疗等方面的实验研究[8，9]。但是，体外环境远不如体内复杂，而且在体外培养过程中，肿瘤细胞的某些生物学特性可能会发生变化，与实际的过程可能有一定出入，因此体外实验得出的结论有时并不能完全解释肿瘤在机体内的生物学行为和病理过程。作为肿瘤细胞，aCC为无限细胞系，在体外可无限传代生长，但培养过程中失去了原有的腺管样排列结构，铺成片状，接近于实性型的细胞排列结构。我们以长春新碱为诱导剂，通过浓度递增间断刺激法在体外对aCC细胞系进行筛选和诱导耐药，建立了耐VCR的腺样囊性癌细胞系aCC/VCR。VCR是目前aCC化疗中最常使用的药物之一，也是化疗药物中最易产生耐药的一种。目前国内外多有建立肿瘤耐药模型的报道，VCR是最常使用的药物之一，浓度递增间断刺激法是最常见的诱导方法，它与临床上化疗药物的使用具有一定相似之处[6]。通过在体外建立耐药模型，可对肿瘤多药耐药机制进行研究，用于解释肿瘤在体内发生耐药的机制，还可以为耐药逆转剂的研究提供基础。aCC和aCC/VCR细胞在生长曲线及群体倍增时间上无明显变化，在倒置显微镜下，细胞形态学亦无明显变化。但有研究表明，在电镜下亲代细胞和耐药细胞存在形态学变化。prados等[10]在研究以放线菌素D（DaC）为诱导剂建立的横纹肌肉瘤耐药细胞系时发现，电镜下耐药细胞出现胞质内肌丝成分聚集、细胞器增多、双叶核等改变，细胞形态学的变化主要体现在超微结构上。
恶性肿瘤的药物敏感性研究一直是肿瘤治疗学研究中的热门问题，准确快速的肿瘤化疗药敏检测对指导临床选择化疗药，提高疗效具有重要意义[11，12]。但目前主要集中在实验室研究，真正进入临床前瞻性研究，指导临床治疗的还很少，尤其是在国内，尚未见进行临床试验的报道。目前对于aCC化疗效果的临床研究看法不一，对于化疗方案的选择差异很大。这可能与肿瘤的生物学特性（组织学分型、分化程度和细胞动力学等）、患者的个体差异（对化疗药物的敏感度和耐受程度）、药物本身的毒性反应等有关。在临床上常常使用同一种化疗方案治疗同一种肿瘤的不同患者甚至是患有不同肿瘤的患者，这显然是不科学的，针对不同患者进行肿瘤药物敏感试验以选择有效的化疗药物，制定个体化的化疗方案，才是今后化疗的发展趋势。我们选取的6种化疗药物，作用机制各不相同，且均是目前临床上比较常用的用于治疗aCC的化疗药物[13]。自1983年mosmann首先利用mtt研究瘤细胞生存状况以来，mtt法药敏试验迅速建立并得到发展[4]。其染色剂是一种能接受氢原子的染料，化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑嗅盐(3-(4，5-dimethylthiazol-2)-2，5-diphenyltetrazo－diumbromide，mtt)，商品名噻唑蓝，简称为mtt。mtt法的特点是灵敏度高、快速、简便、经济，不需放射性同位素，结果重复性好，并可同时对多种药物进行筛选和观察，可适用于所有肿瘤类型，目前美国国立癌症研究所已将其作为筛选化疗药物的常规手段。我们采用mtt法进行体外药物敏感性试验，结果显示，由亲代细胞诱导得来的耐药细胞aCC/VCR不仅对VCR耐药，而且对aDm，pYm发生了交叉耐药。这与目前研究认为多药耐药多见于天然来源的化疗药物的观点相符。通过mtt试验我们发现，化疗药物常规临床用量所达到的血药浓度多数对肿瘤细胞增殖达不到有效的抑制作用，然而通过无限制增加药物用量以达到杀灭肿瘤细胞目的的做法只可用于体外实验，在临床上盲目增大化疗药用量会大大增加对人体的毒副作用，甚至可能带来致命的后果。解决的办法有两个，一是通过逆转耐药剂的研制，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，以减少用药量，减轻毒副作用；二是研发全新的药物剂型，使药物具有靶向性和缓释性的特点，肿瘤组织局部可以达到有效血药浓度而外周血药物浓度很低。例如，研制全新的多药耐药逆转剂，针对已知多药耐药相关基因进行基因治疗逆转耐药[14]，以及用具有缓释作用的纳米粒子包裹化疗药物进行主动靶向治疗的研究[15]，都会是今后化疗研究的新热点。
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细胞生物学常用研究方法篇6
1新型干细胞
1.1诱导多能干细胞(ipS)
2006年日本京都大学Ya-manaka等[1]率先报道了ipS细胞的研究。他把oct3/4,Sox2、c-myc和Klf4这4种转录因子基因克隆入病毒载体,然后引入小鼠成纤维细胞,发现可诱导其发生转化,产生的ipS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似[2]。2007年体细胞转变成“ipS细胞”的成果发表。Hanna等[3]用来自患病小鼠尾巴的皮肤细胞产生了ipS细胞,然后用健康的基因取代了涉及镰刀形红细胞贫血症的基因,研究人员将它们输给供体小鼠,这些细胞在小鼠身上开始产生健康的血细胞,这些小鼠的疾病症状因此有了改善。将实验鼠皮肤细胞改造成ipS细胞,然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞[4]。2009年,中国科学家利用ipS细胞克隆出活体实验鼠,首次证明ipS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性[5]。因干细胞技术和体细胞核移植技术不同,ipS技术不使用胚胎细胞或卵细胞,因此没有伦理学的问题。利用ipS技术可以用患者自己的体细胞制备专用的干细胞,因此不会有免疫排斥问题。然而,ipS的研究还只是起步阶段,有许多技术难题有待解决。例如现在的ipS技术主要采用病毒载体引入细胞因子,这些病毒随机插进基因组后存在着激活致癌基因或抑制抑癌基因的可能性,许多方法中还使用了c-myc原癌基因,因此存在较大的致瘤风险。
1.2Sp细胞
利用Hoechst染料进行造血干/祖细胞的流式细胞仪分析时,常会发现一群分布特殊的细胞,经过紫外激发后用双波长(450nm和675nm以上波长)监测,观察到这群细胞发出微弱的蓝色和红色荧光,在流式二维分析点阵图上,呈彗星状分布在造血干/祖细胞主群的一侧,因此被称为侧群(Sp)细胞。随着对Sp细胞研究的不断深入,人们对Sp细胞的分布、生物学特征、表型标记、信号转导机制及其与肿瘤发生的关系等方面的认识都取得了较大进展。近年来大量研究显示,除了造血系统和血液外,Sp细胞在人和动物的许多重要组织器官,如肝、肺、脾、肾、脑、神经等均有广泛分布,其功能除了参与造血系统的重建外,还与相应组织更新与再生、器官系统的自我重建以及成体干细胞的多器官可塑性有关。Sp细胞作为干/祖细胞的一种特殊类型,其发育和分化状态可能介于胚胎和成体干细胞之间,因此仍具有很强的多向分化潜能和增殖特性;同时,由于Sp细胞广泛分布于各种组织器官中,含量丰富,又具有较明确的表型标记和分离纯化方法,所以较好地解决了其来源问题,这对推动干细胞理论研究与发展具有重要的意义,可在应用研究方面为组织工程和细胞治疗提供新的干细胞材料来源,也为组织再生修复与原位重建提供了新思路。
1.3muse细胞
日本学者出泽真理和藤吉好泽率领的研究小组发现的新型干细胞被命名为“muse细胞”[6]。由于这种干细胞是天然细胞,所以不容易癌变,安全性高于培养时需要植入基因的ipS细胞。存在于成人皮肤和骨髓组织中,含有“SSea-3”蛋白质的细胞,它们能够发育成神经、平滑肌、骨骼肌、肝脏等各种组织。将这种细胞移植到实验鼠受损的皮肤和肝脏以后,这种细胞就与患部结合,成长为受损组织特有的细胞。具有多潜能细胞的特性,但其增殖性不高。这些细胞保留体内的分化能力,与胚胎干细胞不同的是,对免疫缺陷小鼠不构成睾丸畸胎瘤。因为这些细胞很容易获得,能进入细胞的分化与所有三个胚层的特性,而不需要导入外源基因。因此,对这些细胞为基础的治疗和生物医学研究具有巨大潜力。
2新型干细胞在心血管疾病方面的应用
2001年有学者首次报道将骨髓干细胞移植到梗死小鼠的心脏中,局部骨髓干细胞能够分化产生新的心肌细胞,提高心脏功能。随后有学者报道将骨髓单个核细胞移植到梗死缺血的心脏上,可以提高心肌梗死(mi)患者的心脏功能。此后,心肌再生疗法治疗成为当今全球的主要热点。
2.1治疗冠心病
干细胞疗法为mi的治疗带来了希望。在过去10年进行临床前和临床试验表明,几种类型的干/祖细胞可以减少梗死面积,改善心脏收缩功能。其机制包括:(1)新血管的形成,(2)介质的释放有利于血管生成和抗炎因子的释放,(3)心肌细胞功能恢复。心脏祖细胞和多能干细胞具有不容置疑的分化成心肌细胞和其他相应细胞的能力。因此,以促进细胞的存活及体内植入的干细胞疗法是极其重要的发展战略。目前已完成两种细胞类型的Ⅲ期临床试验:即骨骼肌成肌细胞和骨髓单核细胞(Bm-mnCs)。在前者,由于骨骼肌成肌细胞增加了心律失常的风险,使得它的益处受到影响。多数研究表明,Bm-mnCs治疗组对照组比较疗效显着。ipS细胞被广泛地应用于各种疾病的研究。由于它具有胚胎干细胞的特性,所以可以被诱导分化为心肌细胞,血管内皮细胞甚至是窦房结细胞。Gai等[7]报道,将人皮肤中成纤维细胞进行基因编程后制作出ipS细胞,在活体上形成与胚胎干细胞一样的能够跳动的心肌细胞。ipS细胞可以从患者自身提取,可将基因重新编程,因此对于基因遗传性心脏病,如心肌病、长Qt综合征、Brugarda综合征等疾病重新编程,从而治疗该类疾病。它的应用不受伦理限制,无免疫排斥反应,具有其他移植细胞不具备的优点。但由于是病毒载体转染基因,有可能将病毒转染到宿主细胞,引起宿主病毒感染,甚至有畸胎瘤的风险。目前ipS细胞还用于基础研究中,尚未在临床应用。心脏Sp细胞(CSp)可分为SCa1(+)/CD31(-)和SCa1(+)/CD31(+)Sp细胞。利用荧光激活细胞分选,逆转录聚合酶链反应,检测细胞的增殖、分化和迁移等方法,在小鼠mi模型上SCa1(+)/CD31(+)CSp细胞表达干细胞和血管内皮细胞的特定基因,并驻留在血管中。这些细胞在体外和体内均能够增殖、分化、迁移和血管化。SDF-1α体外诱导这些细胞的迁移。更重要的是,mi后,SCa1(+)/CD31(+)Sp细胞可以从非缺血区迁移到缺血区心肌,并形成筒状血管的结构[8]。研究结果表明,SCa1(+)/CD31(+)的心脏Sp细胞能够从非缺血性心脏部位迁移到受损的心肌急性缺血性损伤的心肌细胞。SDF-1α/CXCR4系统可能会在这些细胞的迁移中发挥的重要作用[9]。
2.2治疗心力衰竭
目前心力衰竭的治疗方法有限,细胞疗法是一种很有前途的战略。心肌干/祖细胞具有的各种潜力,修复受损的心脏组织,包括更换(组织移植)、恢复(激活原位心肌祖细胞,旁分泌作用)和再生(干细胞植入形成新的细胞)。治疗心力衰竭的目的是补充收缩失败的心肌单元,但能够被成功诱导出cardiomyogenesis的数量有限,因此改善心功能程度较小,此时旁分泌机制可能更重要。目前对于治疗最有效的细胞类型仍不清楚,ipS细胞具有很大的潜力。宿主心肌细胞融合和结合的途径仍然有争议。作用机制、细胞类型或交付方式,时间效力和细胞治疗,药物治疗或辅助治疗剂量,以及最佳的细胞类型等还需要更多的研究。有研究表明,啮齿类动物和人类骨髓来源的Sp细胞均能够在心肌上存活,人类骨髓衍生的Sp细胞在增强左室收缩功能方面优于普通骨髓单个核细胞[10]。有关Sp细胞的研究目前还在基础研究中,其是具有研究和开发潜力的一类新型干细胞。
2.3治疗心律失常
起搏生物基因疗法治疗病态窦房结综合征,心脏传导阻滞等缓慢性心律失常已经取得了长足进步[11-12]。此外,人类ipS细胞已被核实为药物筛选有用的工具。很多个体对心脏活性药物的反应有差异,利用eS细胞源性心肌细胞或ipS细胞来源的心肌细胞,筛选出个性化定制的抗心律失常药物,可以个体化治疗心律失常患者。
2.4心脏瓣膜的组织工程
组织工程心脏瓣膜的三大要素有种子细胞,细胞支架材料和细胞支架的复合,重构。应用生物可降解聚合物支架构建组织工程心脏瓣膜,已在动物实验中取得初步结果,为心脏瓣膜研制开辟了新途径。用于组织工程心脏瓣膜的种子细胞有内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞以及eS细胞。组织工程心脏瓣膜研究已经取得了很大进展,但是还有很多问题尚待解决和克服。如如何进一步提高种子细胞与支架的黏附力,干细胞定向分化中是否会引起基因突变和肿瘤等问题。然而,随着干细胞技术和组织工程技术的日益发展,这些难题终将得到解决。
2.5治疗肺动脉高压
细胞生物学常用研究方法篇7
关键词：哺乳动物细胞；培养制备；充足蛋白质药物；进展分析
1前言
在近年生物制药发展中，利用哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质已经成为了重要的发展方向。研究表明，哺乳动物细胞培养制备的蛋白质，无论是在制备质量上，还是在蛋白质含量上，都达到了药用标准，并且在性能上也与天然蛋白质较为接近。基于这一优势和特点，关于哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物的研究得到了有效开展，并取得了积极的研究效果。结合目前关于哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物的现状，该研究在重组细胞系、重组表达载体和生物制备过程中取得了积极进展。
2哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组细胞系中取得的进展
CoS细胞曾是进行外源基因表达研究中用途最广的宿主，但由于其严重的贴壁作用，限制了大规模悬浮培养的实际应用。目前哺乳动物细胞生产重组蛋白中，常用的细胞系有CHo和HeK293两大类细胞。CHo是目前生物工程上广泛使用的细胞。该细胞属于成纤维细胞，本身很少分泌内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利，是表达复杂生物大分子的理想宿主。工业生产上应用较多的是CHo-K1细胞及CHo/dhfr-细胞，被广泛地用于重组Dna蛋白的稳定表达生产。HeK293细胞是转染腺病毒e1a基因的人肾上皮细胞系，它易于转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。利用瞬时基因表达方法，采用悬浮培养系统，可以快速、方便地获得mg级蛋白。
目前还有一些哺乳动物细胞株正在进行大规模培养生产的研发中，如来源于madiin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株（mDCK）、红系细胞株、以及人的胚胎干细胞等。由于不同重组细胞系表达的重组蛋白其稳定性和糖基化类型不同，需要根据目的蛋白选择最佳的重组细胞系。
从上述研究成果来看，哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组细胞系中取得了积极进展，其产生的影响主要表现在两个方面：一.哺乳动物细胞系的分类越来越清晰，主要分为CHo和HeK293两大类细胞。二.哺乳动物细胞系在培养生产中种类得到了拓展，对推动哺乳动物细胞系研究具有重要作用，满足了哺乳动物细胞系研究需要。
3哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在重组表达载体中取得的进展
外源基因可以通过病毒载体感染或质粒载体转染等方式进入宿主细胞。病毒载体是通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等，近几年杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达也越加受到重视。
质粒载体与病毒载体不同，它是借助于物理或化学的作用导入到细胞内。人工构建的哺乳动物细胞质粒表达载体一般为穿梭载体。含有原核基因序列，便于载体在原核细胞中扩增和大量制备，另外含有能使外源基因在哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子元件，以及终止子和加polya信号序列等。invitrogen公司的pcDna系列载体是实验中常用的哺乳动物细胞表达载体。
外源基因能否在宿主细胞中获得高效表达主要取决于表达载体上启动子和增强子的强弱、二者之间的搭配、以及它们与宿主细胞类型的兼容性。目前常用表达载体的启动子包括人巨细胞病毒早期启动子（CmV-ie）、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉瘤长末端重复序列。近年来新发现的强启动子如人编在蛋白（ubiquitin）C基因启动子以及一些新构建的杂合启动子不仅具有更高的活性，而且具有更广阔的宿主细胞范围。
上述研究表明，不断地筛选改造载体上的表达结构元件是优化表达载体、提高蛋白质药物在哺乳动物细胞中表达量的不变的方向。
4哺乳动物细胞制备充足蛋白质药物在生物制备过程中取得的进展
哺乳动物细胞大规模培养的工业化生产过程绝大多数是在生物反应器中进行的单细胞悬浮式培养，反应罐的体积可达20吨。为了节约成本，减少动物血清对产品的污染，现在主要采用无血清培养基，目前有多家商业公司提供适用不同细胞株和不同生产工艺的无血清培养基，如UltraCulture，proCHo，pro293等。
考虑到制药过程的现实需要，提高生物制备能力是保证蛋白质药物制备取得实效的关键。从目前的研究过程来看，提高生物制备能力的研究成果主要表现在以下几个方面：
4.1培养方式可以为单细胞悬浮式培养。这样可以减少培养基，提高培养效果，降低培养过程成本。
4.2反应罐的体积可以达到20吨以上。现有的培养实验将反应罐的体积设定在20吨，并取得了良好的培养效果。因此在蛋白质制备过程中，可以根据实际需要扩大反应罐的体积，满足蛋白质制备需要。
4.3培养中使用无血清培养基。既降低培养基成本，又减少了血清中动物成分的污染可能。
5结束语
通过本文的分析可知，结合生物制药的研究与发展形势，哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物已经成为了可能，从目前的研究来看，哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得了积极进展，在重组细胞系、重组表达载体和生物制备过程中都取得了进展和突破。为此，我们应积极推动哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物的研究，为生物制药发展提供有力支持。
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细胞生物学常用研究方法篇8
[关键词]毛囊干细胞；鉴定；分离培养
[中图分类号]R329.2[文献标志码]a[文章编号]1008-6455（2015）19-0077-04
thecultivationandidentificationofhairfolliclestemcells
XiaoFeng1，tanJun2
（DepartmentofplasticandLaseraestheticSurgery，people'sHospitalofHunanprovince，Changsha410000，Hunan，China）
abstract：Hairfolliclestemcellsaretheidealseedcellsforskintissueengineering，whichhasbecomeahotresearchtopicinrecentyears.isolationandidentificationisthebasisoftheresearch.theauthorwillanalyzeandsummarizeseveralmethodsofisolationandcultureofhairfolliclestemcellsinrecentyears.itwillprovideasolidfoundationforthefurtherstudyofhairfolliclestemcells.
Keywords：hairfolliclestemcells；identification；cultivation
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，存在于胚胎及成体内。在一定条件下，干细胞可以无限增殖而保持未分化状态，也可以分化成多种功能细胞。20世纪，Cotsarelis、taylor等[1]通过相关研究发现，在毛囊上部由外根鞘形成的明显突起，即隆突区域也有干细胞的存在，这些干细胞被定义为毛囊干细胞。毛囊干细胞与其他成体干细胞一样拥有强大的增殖能力及多向分化潜能[2]。毛囊干细胞能通过自身的分裂增殖产生各种机体所需的细胞，以补充脱落和缺失的细胞；毛囊干细胞不仅能够向下转移到毛囊根部生成毛囊，而且还能从毛囊外根鞘向上迁移，生成表皮和皮脂腺，并且能分化形成骨及脂肪[3-4]。近年来，毛囊干细胞的研究备受关注，已成为研究热点之一。目前，存在多种毛囊干细胞的分离培养及鉴定方法，为毛囊干细胞的深入研究提供了坚实的基础，作者就毛囊干细胞常用的分离培养及鉴定作一简要综述。
1毛囊干细胞的分离纯化
此前，已有许多研究者采用不同的方法来分离毛囊干细胞，并成功地进行传代培养，进行后续更深入的研究。目前对毛囊干细胞分离纯化常用的有以下几种方法：
1.1组织块培养法
取含有毛囊的皮肤样本，清洁干净，酒精消毒后用pBS液冲洗，将皮肤切成小块，表皮朝上贴于加入适量培养基的培养器皿中，置于5%Co2培养箱中，37℃，饱和湿度条件下培养。组织块培养法分离的干细胞能持续保持增殖趋势，没有明显的平台期，并且随着不断传代纯化，此方法获得的毛囊干细胞纯度明显增加。但是组织块培养法分离获取毛囊干细胞的效率较低。史明艳等[5]使用该方法成功获得毛囊干细胞，并分析指出该方法的优势在于组织块培养时从组织块中迁移出来其他细胞为毛囊干细胞创造了一个类似于体内的微环境，使毛囊干细胞能最大程度地保留增殖分化能力。
1.2显微分离技术
取含有毛囊的皮肤样本，清洁干净，除去皮下脂肪，酒精消毒后，使用含高浓度青、链霉素的pBS液反复冲洗3次；在超净工作台内，显微镜下显微镊钝性分离单个毛囊组织，收集形态完好且处于生长期的毛囊。收集滤液离心（1500r/min）10min，弃去上清，加入含培养基培养皿，于37℃、5%Co2孵箱中培养。显微分离技术能从样本直接选取毛囊干细胞相对富集区域，有利于后续进一步的纯化[6]。王祝迁等[7]使用此方法成功分离出大鼠毛囊干细胞，但单纯应用显微分离技术获取高纯度的毛囊干细胞需花费大量的时间和精力，效率偏低。
1.3酶消化法
取含有待培养毛囊的皮肤样本，清洁干净，酒精消毒后用含双抗pBS液冲洗，将皮肤样本剪成小块，置于中性蛋白酶Ⅱ（0.25g/l）中，37℃摇床消化2h。取出组织用pBS冲洗3遍，置于胰蛋白酶（质量浓度为2.5g/l）和乙二胺四乙酸（0.2g/l）1∶1消化液37℃摇床消化1h后，过200目钢网。收集滤液离心（1500r/min）10min，弃去上清，加入细胞培养液培养。此方法获得的毛囊干细胞克隆形成能力强，获取效率高。郑宣等[8]用此法获得较纯的毛囊干细胞，但获得的毛囊干细胞经历增殖期后生长速度逐渐减慢，且细胞存活率下降，可能与酶消化法破坏了毛囊干细胞生长微环境有关。
1.4差数贴壁法
将收集的细胞接种于Ⅳ型胶原包被的培养皿中，静置20min后，收集上层未贴附角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞于另一培养皿中，贴附皿底的毛囊干细胞，置于体积分数为5%Co2、37℃孵箱中培养，每3d换液一次。与单纯使用某种毛囊干细胞分离方法相比较，联合差数贴壁法将更进一步纯化，获得纯度更高的毛囊干细胞。彭等[9]使用酶消化法联合差数贴壁法获得了形态典型且均匀一致的毛囊干细胞。目前此方法已被广泛使用。
1.5免疫磁珠法
免疫磁珠法主要用来纯化分离培养获得的毛囊隆突区细胞中某种标记物阳性的细胞。首先制作细胞悬液，并加入FitC标记的某种标记物单抗，室温孵育30min，离心后弃上清中未结合的抗体，加入磁珠分选缓冲液重悬细胞，再次离心后弃上清，pBS缓冲液清洗2次，取重悬后细胞与免疫磁珠混合，室温反应30min。磁珠分离器分离8min，去除未与磁珠结合的细胞。将结合了靶细胞的免疫磁珠用磁珠分选缓冲液洗5次。体积分数为5%Co2、37℃孵箱培养48h，使细胞与磁珠分离，即可获得较纯的毛囊干细胞。谭挺等[10]用此法获得高纯度毛囊干细胞，他们指出此方法与显微分离技术连用有单次操作分离细胞数量大且纯度较高、能与细胞培养、流式细胞术、荧光显微镜等分子生物学技术兼容等特点。黄恩毅等[11]用此法有效分离并成功培养CD34+毛囊干细胞，发现分选后的细胞仍具有较好的活性，且增殖速度快，增殖期长。卢葳等[6]通过实验证实，免疫磁珠分选后毛囊干细胞活力较好，分离获得的毛囊干细胞适合用于细胞培养、诱导等后续试验。
1.6流式细胞仪分选法
通过毛囊干细胞表达的某些特异性标记物，利用流式细胞仪可以将目的活细胞从异质性细胞群中分离出来，获得较高纯度的特异性细胞。常用的是荧光激活细胞分选器。卢葳等[6]使用流式细胞仪分选CD34+毛囊干细胞，获得的毛囊干细胞纯度很高、污染机会小，但是分选过程费时，细胞分选后活力稍差。此方法适合于需要做免疫组化，蛋白质组织学等对细胞纯度要求高的实验。
2毛囊干细胞的鉴定
干细胞的鉴定一直是干细胞研究的难点，常用干细胞的标记物辅助方法进行鉴定。毛囊干细胞有多种明确的分子标记物，如CD34、K15、K19[12]。
2.1角蛋白家族
角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于生物体的组织结构中。在表皮细胞中，它们以微丝的状态在细胞内形成广泛的网状结构。在上皮组织中有20多种不同种类的角蛋白表达。在表皮细胞中，随着分化程度的不同其所表达的角蛋白也不相同，因此角蛋白常作为毛囊干细胞的鉴定手段。1998年，lyle等[13]通过表达克隆发现K15是毛囊干细胞表面标记之一，此后K15一直被当做较为公认的毛囊干细胞标记物。20世纪末，有研究者通过实验发现滞留细胞所在的毛囊隆突部细强表达K19[14]；同时有实验发现毛囊隆突部K19高表达细胞缺乏特异性分化标志，进一步证实K19高表达细胞为毛囊干细胞，因此，认为K19也可作为毛囊干细胞表面标记物[15]。在毛囊干细胞分化过程中，K15表达减弱较K19早，K19表达阳性而K15阴性的细胞仍有可能为处于早期阶段的增殖细胞，因此推测，检测毛囊干细胞时K15更准确[13]。
2.2钙黏蛋白家族
钙黏蛋白是一种同亲型结合、Ca2+依赖的细胞黏着糖蛋白，对胚胎发育中的细胞识别、迁移和组织分化以及成体组织器官构成具有重要作用。不同细胞及发育不同阶段其细胞表面的钙黏蛋白的种类与数量均有所不同，目前已经发现几十种钙黏蛋白。CD34抗原是钙黏蛋白中的一种，是一种高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，为阶段特异性白细胞分化抗原，CD34表达于人类造血干细胞，CD34是目前公认的造血干细胞标志物。ohyama等[16]通过对鼠毛囊的研究，发现鼠毛囊中CD34阳性细胞与毛囊隆突部滞留细胞和K15阳性细胞在毛囊处位置一致，提示CD34可能也是可靠的毛囊干细胞标记物。trempus等[17]通过动物实验首次证实了CD34表达于小鼠毛囊干细胞。但CD34在人毛囊干细胞不表达，ShuJiang等[18]通过对人头皮进行原位免疫组化和多色免疫荧光标记，发现CD34特异性表达于毛囊间表皮基底部。
2.3整合素家族
整合素是机体重要的黏附分子，是广泛存在于动植物细胞表面的一类细胞跨膜蛋白，在细胞与细胞外基质间及细胞与细胞间起黏附作用，整合素是由α和β两个亚单位组成的异源二聚体，它们按不同的组合构成20余种整合素。目前，整合素也被广泛用于毛囊干细胞的鉴定，常用的整合素为整合素β1。1995年，Jones等[19]根据表皮细胞表达整合素β1的水平将其进行分组培养，结果发现整合素β1高表达的表皮细胞比低表达者具有更高的增殖及克隆形成能力。1998年，watt等[20]发现，富含整合素β1的皮肤基底细胞比整合素β1含量少的皮肤基底细胞能更快速的黏附细胞外基质蛋白，并具有更高的克隆形成能力，上述发现均为整合素β1作为毛囊干细胞特异性表面标记物提供有力支持。
3结论
综上，目前常用的分离培养方法主要包括：组织块培养法、显微分离技术、酶消化法、差数贴壁法、免疫磁珠法、流式细胞仪分选法，每种方法均有各自的优势及缺陷；组织块培养法简单，但是分离纯度不高，分离效率低下；显微分离技术相对其他方法而言，分离纯度高，但是分离过程比较费时费力；酶消化法效率高，但是酶消化过程同时会破坏细胞微环境，影响细胞存活率；差数贴壁法一般联合其他分离纯化方法，能进一步纯化所获毛囊干细胞；免疫磁珠法获得的毛囊干细胞纯度高、活性强，但是分离方法较复杂；流式细胞仪分选法所获得毛囊干细胞纯度高，但细胞活性低。因此，在选择毛囊干细胞分离培养方法时一定要根据实验的特殊要求及实验条件选择合适的方法。毛囊干细胞的鉴定方法常用的包括：角蛋白家族、钙黏蛋白家族、整合素家族；实验条件允许的情况下，同时检测两种以上的标记物来鉴定毛囊干细胞是较为准确的一种方法。
毛囊干细胞具有其他干细胞的共同特征，具有多向分化潜能。目前，已有实验证实毛囊干细胞能用于尿道缺损、神经损伤的修复；能够分化成为脂肪细胞和成骨细胞[1，21-22]；能有效促进创面愈合，将其作为工程皮肤中的种子细胞，有利于表皮细胞及汗腺、毛囊等附属器官的形成。另外，最新研究表明毛囊干细胞有利于瘢痕的修复，但该研究仍处于起步阶段，相信经过研究者们的不懈努力，其必将为瘢痕治疗这一世界性难题提供一种有效的新方法。
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细胞生物学常用研究方法篇9
关键词：细胞凋亡；检测方法；分析评价
细胞凋亡（apoptosis）是细胞在一定的生理或病理状态下，遵循自身的程序，自己结束自己生命的过程。细胞凋亡不受到外部损伤因素直接导致的被动改变而属机体自身的生理活动，是由基因控制的、高度有序的细胞主动死亡过程，即程序性细胞死亡（programmedcelldeath，pCD）[1]。它贯穿从受精、发育、成熟、衰老的整个生命过程，近年来一直是生命科学和医学领域各专业的研究热点。随着研究细胞凋亡的方法不断涌现和深入，分析手段日趋完善和成熟。现将细胞凋亡检测方法归纳如下。
1形态学检测
细胞凋亡是形态学名称，其特征性改变包括细胞浆固缩、体积缩小、细胞皱缩以及细胞核致密等。一般认为形态学变化是判断有无细胞凋亡的基础[2]。根据凋亡细胞固有形态特征，人们设计了多种不同的细胞凋亡形态学检测方法，常用的有：普通显微镜观察、荧光显微镜观察、共聚焦激光扫描显微镜观察、透射电子显微镜规察。普通光学显微镜只可以观察到细胞凋亡的大体形态胞膜起泡现象和凋亡小体。但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构，因此用光镜观察难以令人满意。通过电镜可以观察到有典型的凋亡细胞出现，其特征是细胞核体积缩小，染色质浓缩致密，并沿核膜分布形成新月体状，细胞膜微绒毛消失，但细胞浆内的各种细胞器基本正常。凋亡细胞的典型形态改变在透射电镜下能够得到最佳的体现，为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。电镜检测细胞凋亡的缺点是：只能定性，不能定量；样本制作处理过程复杂，设备相对昂贵，对检查者的技术水平要求较高[3-4]。
2Dn段化检测
2.1Dna琼脂糖凝胶电泳检测法细胞凋亡时，Dna在内源性核酸内切酶的作用下.在核小体间被切割成180～200bp整数倍的单核苷酸片段。Dna裂解是标志细胞最终走向死亡的不可逆的重要过程。正常活细胞的Dna凝胶电泳为一条区带；而当细胞凋亡时，由于Dna被裂解成单核小体和寡聚核小体，电泳时呈现特征性的"阶梯状"（1adder）条带；而坏死细胞的Dna断裂为无特征的杂乱片断，利用此特征，既可确定细胞的凋亡，又可与坏死细胞区别。因此Dna凝胶电泳一度被认为是判定细胞凋亡的金标准之一[5]。这种检测方法简便宜行，成本低。但缺乏定位性特征，灵敏性不高，但在作群体细胞凋亡分析时具有一定意义。本方法被广泛应用于作群体细胞凋亡分析中[6]。
2.2eiLSa法分析组蛋白细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割Dna，产生180bp～200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2a、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗Dna和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。此法具有需要设备简单.敏感性高，所需细胞个数少等优点。其缺点是不能精确测定凋亡发生绝对量和提供细胞的组织学定位。试验过程中如果裂解细胞的时间过长可能导致细胞核中的Dn段也被计算在内，进而导致结果偏高，因此不同的细胞系需要经过数次摸索才能确定最佳检测条件[7]。
2.3Dn段原位标记法
2.3.1.原位缺口转移（insitunick-translation，iSnt）技术细胞发生凋亡时，核酸内切酶在Dna分子中导入切口，Dna多聚酶在切口部位表达外切酶活性，使核苷酸自5'向3'方向切去；同时以切口部位末端核苷酸的3'一oH为引物，利用Dna多聚酶i的聚合活性将未标记的核苷酸用标记的核苷酸进行置换，切口沿Dna分子移动，同时水解5'末端，以修复Dna原位切口平移技术将标记的核苷酸引入凋亡细胞的Dna，据此可检测凋亡细胞。
3流式细胞仪检测法
流式细胞仪（FCm）是将流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术等集为一体，用于细胞定量分析和进行细胞分类研究的工具。此方法系通过荧光素如pi、hoechst等亲Dna的特性，分析悬浮细胞中Dna含量的直方图来判断细胞凋亡。①pi染色法：凋亡细胞经pi染色、流式细胞仪检测，在正常细胞G1期的峰前增加1个特异性亚二倍体峰（sub-G1峰）俗称"凋亡峰"。通过FCm测定Dna的含量还可以研究凋亡细胞的周期特异性。此方法的优点是可定量检测，灵敏度高。缺点是不能观察S期和G2期凋亡的细胞，不能区别坏死细胞和凋亡细胞。②Hoechst-pi法：此法可克服pi法的不足。hoechst被活细胞摄取后与Dna结合呈蓝色荧光；pi使坏死细胞呈红色荧光。因此，在直方图上可根据红蓝两种荧光判断3种细胞：正常细胞呈弱蓝、弱红光；凋亡细胞呈强蓝、弱红光；坏死细胞呈弱蓝、强红光[9]。③annexinV/pi法：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（ps）迁移至细胞膜外侧。pS发生的变化即外露早于Dna断裂，早于染色质凝集及凋亡小体的形成，外露后成为免疫系统识别的标志，能与高亲和力的钙依赖性的磷脂结合蛋白annexinV结合，将annexinV进行荧光素（FitC、pe、eCFp）标记可以检测细胞凋亡，是最敏感的指标之一，但坏死细胞ps亦暴露于外表使annexinV结合阳性，因此使用annexinV这一参数不能区分坏死或凋亡，必须同时结合pi进行凋亡细胞双染后用流式细胞仪即可将凋亡细胞以及坏死细胞区分开来。结果判断正常活细胞anmxin-V、pi均低染；凋亡细胞anmedn-V高染、pi低染；坏死细胞anmxin-V、pi均高染。利用annexinV/pi法，是目前检测细胞凋亡最理想的方法。
4细胞凋亡相关物质的检测
4.1酶学检测
4.1.1半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases-3）活性检测细胞凋亡过程中有许多蛋白酶参与并相互协调以促进凋亡的发生。在凋亡的起始和执行过程中起关键作用的是半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspases）。大多数凋亡都涉及Caspase-3的活化，它是关键的凋亡执行分子.Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡早期阶段被激活它通过分解去除Dna酶的一个负调节亚基而问接使之活化，实现了Dna的片段化，最终发生细胞凋亡。常采用荧光分光光度计检测其活性。因活化的Caspase-3能够特异切割Die2V3D4-X底物，水解D4-X肽键，故设计出荧光物质偶联的短肽ac_DeVDamC。短肽被水解后释放出的amC能被激发发射荧光。根据释放的amC荧光强度大小，可测定Caspase-3活性，从而反映Caspase-3的活化度，以判断细胞凋亡程度[10]。
4.1.2乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，aChe）是主要存在于神经系统的一种水解酶，其经典功能是水解神经递质乙酰胆碱从而终止神经冲动的传递[11]。张学军等[12]发现乙酰胆碱在细胞凋亡追踪起重要作用，他们以人肺成纤维细胞株、niH/3t3小鼠、HeL、pC-3和牛肉皮细胞等为材料，用衰老凋亡或化疗药物诱导法诱导细胞凋亡，综合流式细胞术、Dna电泳、形态学及tUneL等方法检测凋亡细胞，发现各类细胞在正常状态下无ache活性反应。一旦发生凋亡，均具有ache活性反应，从而建立了这一检测凋亡细胞的新方法[13]。酶学检测简单、快速、方便，适合大量培养细胞的凋亡检测，但不能定量和定位。
4.2细胞凋亡相关基因水平的检测在细胞凋亡时有些基因表达异常，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas蛋白结合受体后形成死亡介导信号复合体（DiSC），能诱导癌细胞中的细胞毒性t细胞等靶细胞调亡[14]。Bcl-2和Bcl-XL作为抗凋亡的调节物，它们的表达水平比例决定细胞是凋亡还是存活[15]。现多采用northern杂交和Rt-pCR对它们进行检测，随着近年来荧光定量pCR技术的发展，用定量pCR来检测基因表达水平较前者更快更准确。
总之，目前检测细胞凋亡的方法很多，但都有其自身的优点和局限性。应充分了解各种检测方法的原理及应用范围，根据标本综合选择几种适当的方法进行检测，常可得到较准确结果。在进行细胞凋亡检测的时候，要几种方法进行检测，避免使用单一方法。例如：电镜观察仍是确定凋亡的最具权威的标准.因此在凋亡定量控测之前应先行电镜观察定性；pi染色流式细胞检测法漏检率及错检率均高.不适于凋亡定量观察.但其方法简便、价廉，适用于大批标本的筛选预试验；tUneL法是目前最常用的凋亡检测技术.为避免坏死细胞的影响，应先用荧光镜检以保证tUneL染色细胞不存在坏死细胞，否则应另选其它检测方法。
综上所述，只有几种不同的检测方法进行综合检测得到的结果，才能真正的反映细胞发生凋亡的情况，进而准确的对其凋亡进行定性和定量判定。相信伴随着人类对凋亡机制更加深入的了解，操作简单、敏感性高、成本低廉的细胞凋亡检测方法会越来越多，也将对基础细胞生物学，生物医学及临床某些疾病的诊断及治疗产生深远影响。
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细胞生物学常用研究方法篇10
【关键词】亚细胞定位；特征信息提取；预测算法
亚细胞定位是指某种蛋白或某种基因表达产物在细胞内的具体存在部位，即根据所给出的蛋白质序列来预测其所在的亚细胞位置。蛋白质是基因功能的执行者，机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有它的参与，正是由于它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质，越来越多的生物学、生物信息学研究者开始对蛋白质的功能预测及分析进行了研究。然而，蛋白质只有经分选信号引导后运输到特定的细胞器中，才能参与细胞的各种生命活动，执行它的功能，如果其运送位置发生偏差，将会影响细胞功能甚至整个生物体。因此，蛋白质在细胞中的正确定位是细胞系统高度有序运转的前提保障。研究细胞中蛋白质定位的机制和规律，预测蛋白质的亚细胞定位，对于了解蛋白质结构、性质和功能，了解蛋白质之间的相互作用，研究疾病机理和发展新药物以及探索生命的规律和奥秘具有重要意义。
随着核酸和蛋白质序列等生物数据的高速膨胀，单纯以传统实验方法来确定蛋白质亚细胞定位具有成本高、实验时间长，预测精度不理想，会耗费大量的人力和物力等缺点，已经无法满足生命科学研究的需要。因此，需要寻找一种快速、有效、准确的计算方法来预测蛋白质亚细胞定位。近年来，生物信息学在这方面开展了广泛的研究并且取得一系列很有意义的成果，数据库的构建和亚细胞定位分析及预测加速了蛋白质结构和功能的研究。一方面，生物信息学研究可以对大规模的实验数据进行分析和提取生物学信息，同时可以根据现有数据对一些目前还未知的蛋白质做出预测；另一方面，不断增长的亚细胞定位数据也可以用来验证并改进预测结果。目前，利用生物信息学方法进行蛋白质亚细胞定位预测已经成为了一个研究热点。
从20世纪90年代初至今，蛋白质亚细胞定位预测一直是生物信息学研究的热点问题之一。通过分析国内外研究者的研究方法，不难发现这些方法的主要不同在于两个方面：第一，蛋白质特征信息的提取，主要是指将蛋白质相关特征信息提取出之后转化成高维的特征向量，作为预测的输入。蛋白质序列特征信息主要包括氨基酸顺序相关性、氨基酸在蛋白质中出现的频率、氨基酸物理化学性质等。第二，预测算法的设计，根据提取的特征向量集，利用有效的算法预测蛋白质的亚细胞定位。算法影响亚细胞预测精度的重要因素，现有预测算法中，统计学和机器学习方法使用的最为广泛。
利用计算方法来预测蛋白质亚细胞定位属于统计模式识别中的模式多分类问题。问题的研究一般包括以下四个步骤：（1）具有客观代表性的蛋白质数据集的构建；（2）蛋白质序列的特征提取，即蛋白质序列编码，从蛋白质中提取特征参数，实现字母序列到数值特征的转换；（3）预测算法的选取，即如何根据提取的特征参数，设计有效的分类或识别模型类；（4）对预测结果进行评估，即预测模型的测试与检验以及结果性能的评估。
1数据集的构建
研究蛋白质亚细胞定位的数据集基本来自SwiSS-pRot数据库。该数据库建于1986年，是目前世界上存储蛋白质序列最主要的一级数据库之一。利用这个数据库研究蛋白质的亚细胞定位时，需要对其中的数据进行筛选。通常的筛选标准有：（1）针对研究对象，挑选特定物种的相关蛋白质序列；（2）在构建数据集时，需要知道每个蛋白质序列所在的亚细胞位置，所以只有包含明确的亚细胞定位信息的序列才被选入数据集中；（3）序列长度不能太短；（4）数据冗余度，要求同源性低；（5）排除样本量太少的亚细胞类别。
除了利用SwiSS-pRot数据库外，还有LoCate、targetp家族数据集等。近年来，随着研究的不断深入，蛋白质序列数据集越来越复杂，目前最复杂的数据集是酵母蛋白质序列数据集，包含22种亚细胞蛋白质。
2蛋白质特征信息的提取
蛋白质序列特征提取的目的是，从蛋白质序列中提取特征信息，并用适当的数学方法来描述或表示这些信息，使之能正确反映序列与结构或功能之间的关系，这于蛋白质亚细胞定位是至关重要的，也是研究蛋白质功能结构的关键。根据提取特征信息的不同，可以归纳为3类。
2.1基于氨基酸的组成和性质
氨基酸组成是一种最基本的序列特征，也是亚细胞定位预测中使用得最为普遍的一种蛋白质特征信息。蛋白质一般有20种氨基酸组成，氨基酸组成将每种氨基酸在蛋白质序列中出现的频率抽取出来作为一个20维的向量。1994年，nakashima和nishikawa最早通过利用氨基酸组成进行了蛋白质亚细胞定位预测，对细胞内和细胞外蛋白质定位分别取得了88%和84%的预测准确率。
2.2基于蛋白质序列的n端分选信号的方法
一般认为蛋白质在合成的过程中，其n端包含一些特殊的分选信号，这些信号能够指导新合成的蛋白质分选到特定的亚细胞中，包括信号肽、线粒体转移肽、叶绿体运输肽、核定位信号、类囊体腔转移肽和过氧化物酶体定位信号等。这种信息的有效性取决于蛋白质序列完整性，一旦蛋白质序列的n端信号不完整或者丢失，预测结果就可能失效。
2.3基于功能域和基因注释的方法
蛋白质序列在长期的进化过程中，某些特定位点上的氨基酸残基具有高度的保守性，这些位点称为功能域。2002年功能域组分的概念首次被用于蛋白质亚细胞定位，这种方法显著提高了亚细胞定位的质量。2006年，引入Go注释来预测人类蛋白质的亚细胞位置。但是，基于功能与和基因注释的方法对于数据库功能注释信息的完善程度依赖性较大，如果数据库中没有足够的功能域或基因注释条目，那么将无法确定蛋白质的亚细胞定位。
由于不同的特征从不同的角度刻画蛋白质序列，目前没有一种特征能够很好地刻画蛋白质的亚细胞定位特征，单独利用某种特征难以在预测效果上取得大的突破。将多种特征提取方法组合起来已经成为亚细胞定位预测中最为普遍的一种方法。
3蛋白质亚细胞定位预测算法
蛋白质亚细胞定位预测中另一个重要因素是识别算法，成功的分类算法应该是能够高效、正确的将不同亚细胞位置的蛋白质分开。在蛋白质亚细胞定位预测方面，主要的算法包括5类：基于简单选择判别规则的方法；基于距离度量的近邻方法；基于人工神经网络的方法；基于马尔可夫模型的方法；基于向量机的方法。常用预测方法有神经网络、支持向量机、最邻近算法三种。
（1）神经网络。神经网络是一种模仿动物神经网络行为特征，进行分布式并行信息处理的算法数学模型。这种网络依靠系统的复杂程度，通过调整内部大量节点之间相互连接的关系，从而达到处理信息的目的。神经网络具有良好的鲁棒性和容错性，因此，不仅在蛋白质亚细胞定位领域受到青睐，在模式识别的其他领域也得到了广泛的应用。
（2）支持向量机。支持向量机是一种基于统计学习理论分类技术，它在蛋白质特征向量映射到的高维空间中，找到一个使（下转第32页）（上接第12页）分类误差最小的最优分类面。由于支持向量机具有较好的推广能力，许多学者选择它作为蛋白质亚细胞定位预测的首选分类器。
（3）基于距离的近邻方法。基于距离的近邻方法原理是根据某种距离度量方法来度量样本之间的相似性，距离越近则两样本有可能出现在相同细胞器中。随后的研究中，研究者将基于距离的近邻方法做了推广，如模糊K近邻方法，加权模糊K近邻方法等。基于距离的近邻方法，不需要人为的选择参数，适合求解大规模问题，运算速度较快。
随着研究的不断深入，将多种算法进行融合，来预测蛋白质亚细胞定位已经逐渐成为研究的趋势。2010年，赵禹等用离散增量结合支持向量机方法预测蛋白质亚细胞定位。多种算法的融合，在提高蛋白质亚细胞定位预测的精度和加快算法运行速度方面取得了良好的效果。
4预测算法的检验和评估
选用适当的预测算法之后，需要对算法进行评估，即检验出算法的准确率，它是评价一个分类算法性能好坏的重要指标，也是与其它分类预测算法比较的依据。预测算法的检验方法主要有自身一致性检验、独立性检验、留一法检验三种[29]。
留一交叉验证（1eave-one-outcross-validation，LooCV）每次取出数据集中的一条蛋白质序列作为测试样本，而剩余的蛋白质序列作为训练集对测试样本的亚细胞进行定位预测。直到所有样本序列都被测试一遍为止。LooCV的缺点是计算成本高，费时，但是其结果更加严格可靠，已经在很多方法中得到了应用。
评估预测算法常用的算法评价指标有：敏感性、特异性和matthew相关系数。敏感性指标是指每类样本中被正确识别的比例，反映了预测成功率；特异性指标是指被判别为第i类的样本中真正属于第i类的比例，反映了预测的可信度。
Sensitivity（i）=■×100%
Spencificity（i）=■×100%
matthews相关系数mCC可以对算法的准确率进行评估。
mCC（i）=■
其中，tp（i）是第i类样本中被预测正确的数目，fn（i）是第i类样本被错误的判别为其他类别的数目，fp（i）是非第i类样本但被预测为第i类样本的数目，tn（i）是非第i类样本中被预测正确的样本数目。mCC指标取值0至1，取值越高说明分类器的性能越好，当mCC取1时，所有样本均被正确识别；当mCC取0时，分类器的判别效果与随机指派的结果一样，这样的分类器是最差的。
【参考文献】
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