细胞生物学的意义篇1
[关键词]整合素α3β1；基质金属蛋白酶-7；食管鳞状细胞癌；免疫组织化学
[中图分类号]R735[文献标识码]a[文章编号]1673-7210（2013）04（b）-0029-03
我国是食管癌高发国家，所有病例中90%以上是食管鳞状细胞癌（esophagealsquamouscellcarcinoma，eSCC），其肿瘤侵袭转移是一个复杂多步骤过程。整合素α3β1作为整合素家族重要成员，参与调节细胞的黏附、增殖、分化、转移、凋亡等生物学行为，具有促进肿瘤进展的作用。基质金属蛋白酶-7（matrixmetalloproteinases-7，mmp-7）能降解细胞外多种基质，亦有促进肿瘤侵袭和转移的作用。本研究采用免疫组织化学方法检测整合素α3β1、mmp-7在eSCC肿瘤组织中的表达情况，探讨其在eSCC的发生、发展中的生物学意义。
1材料与方法
1.1标本来源
收集湖北医药学院附属太和医院及湖北医药学院附属东风医院2000年1月～2005年7月病理科存档的手术切除食管癌石蜡标本，筛选出组织学类型为鳞状细胞癌病例135例为eSCC组，另随机抽取40例正常食管组织做对照组。所有eSCC标本均有完整的临床病理资料。
eSCC组135例，其中男114例，女21例，
1.2主要试剂
羊抗人整合素α3β1多克隆抗体试剂盒、鼠抗人mmp-7单克隆抗体试剂盒及二氨基联苯胺（DaB）显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。以0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pBS，pH7.4）代替一抗作为空白对照。
1.3实验方法
采用免疫组化LsaB法检测eSCC及正常食管组织中整合素α3β1、mmp-7的表达。按试剂盒操作说明对4μm厚石蜡切片进行组化染色，检测eSCC和正常食管组织标本中整合素α3β1（稀释度为1∶40）、mmp-7（稀释度为1∶200）的表达。
1.4实验结果判定
整合素α3β1、mmp-7显色均为棕黄色颗粒，定位于细胞质，根据阳性细胞数和着色深度记分，每例随机计数5个高倍镜（400×）视野，确定每个视野的阳性率，取平均数，按下列记分；阳性表达细胞数
1.5统计学方法
采用统计软件SpSS13.0对数据进行分析，计数资料以率表示，采用χ2检验。相关性分析采用Spearman相关分析。以p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1整合素α3β1、基质金属蛋白酶-7在食管鳞状细胞癌组织和正常食管组织中的表达
整合素α3β1、mmp-7在正常食管组织中的阳性表达率分别为12.50%、5.00%，而在eSCC组织中阳性表达率分别为82.96%、61.48%，均高于正常食管组织，差异有高度统计学意义（p<0.01）。见表1及图1、2。
表1整合素α3β1、基质金属蛋白酶-7在食管鳞状细胞癌组织
和正常食管组织中的表达[n（%）]
注：mmp-7：基质金属蛋白酶-7；eSCC：食管鳞状细胞癌
2.2整合素α3β1、基质金属蛋白酶-7在食管鳞状细胞癌组织中表达的相关性
将整合素α3β1、mmp-7的表达情况行Speraman相关分析，结果显示整合素α3β1与mmp-7在eSCC中的表达呈正相关（r=0.418，p<0.01）。
3讨论
整合素是一类重要的细胞表面黏附分子受体，通过介导细胞与细胞之间细胞与细胞外基质之间的黏附和信号转导，在肿瘤浸润和转移过程中起重要作用[1]。研究证实，细胞恶变后肿瘤细胞表面的整合素表达有所变化，这种变化与肿瘤细胞侵袭性及转移密切相关[2]。整合素α3β1为整合素家族重要成员，由两条跨膜多肽链以非共价方式结合成整合素异二聚体[3-5]，其在不同的肿瘤中有选择的进行表达，它的异常表达与这些肿瘤的形成、复发和转移密切相关[6-8]。目前，对食管癌中整合素α3β1表达情况的报道较少，本研究中，82.96%的eSCC表达整合素α3β1，明显高于正常食管鳞状上皮的表达（12.5%），差异有高度统计学意义（p<0.01），说明整合素α3β1亦参与了eSCC发生、发展的调控。
基质金属蛋白酶（mmps）已被证实参与eSCC等消化道肿瘤的浸润、血管侵犯、淋巴结转移，并与其预后相关[9-12]。mmp-7由肿瘤细胞产生且能活化其他mmps成员如mmp-2、mmp-9等，灭活丝氨酸蛋白酶抑制剂[13]，其在eSCC肿瘤组织高表达，并且与肿瘤浸润深度、临床分期、静脉侵犯及淋巴结转移有关。本研究中同样观察到mmp-7在eSCC肿瘤组织中呈高表达（61.48%），明显高于正常食管鳞状上皮的表达（5.00%），差异有高度统计学意义（p<0.01），表明mmp-7可促进eSCC的进展。
mmps的产生和分泌受多种因素调控，目前研究认为细胞外基质刺激是其重要调节信号之一，而整合素作为介导信号，通过独特的途径传递膜分子信号，参与mmps的调节，影响着肿瘤的生长[14]。mmp-7作为mmps的重要成员之一，其产生和分泌是否也参与了整合素α3β1的表达呢？本研究显示，eSCC中整合素α3β1与mmp-7的表达呈正相关（r=0.418，p<0.01），表明eSCC组织中的整合素α3β1有表达增高，mmp-7有随之高表达的趋势，推测整合素α3β1通过调节mmp-7的表达与激活，从而促进eSCC肿瘤组织的生长、浸润与转移。因此，整合素α3β1可以上调mmp-7的活性，两者的高表达与eSCC的发生发展密切相关。
[参考文献]
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细胞生物学的意义篇2
1材料与方法
1.1细胞系
人膀胱癌株t24常规培养。
1.2寡核苷酸（odns）?脂质体（lip）转染复合物
硫代磷酸修饰的寡核苷酸序列如下：反义序列：5′?cccagccttccagctccttg?3′；正义序列：5′?caaggagctggaaggctggg?3′，均引自genebank。脂质体lipofectamine2000，按转染试剂盒说明配置不同浓度的odns?lip复合物。
1.3westernblot印迹试验
转染48h收集细胞，triton试剂提取细胞总蛋白，紫外分光光度仪测定蛋白含量。调整至蛋白浓度2g/l，取10μl样品加20μl样品处理液，95℃水浴加热4min，冷却至室温。于sds?聚丙烯酰胺凝胶中加样品15μl，指示剂至电泳槽下缘边缘时取出胶版，以电转印仪将蛋白样品转移至硝酸纤维素膜上。以封闭蛋白干粉1g加0.02mol/lpbst100ml，37℃封闭1.5h。用0.02mol/lpbst洗涤硝酸纤维素膜。dab染色，照相。重复8次。
1.4mtt试验
t24细胞起始浓度为1×104/孔。反义odns?lip复合物100、200、400nmol/l为转染组；正义odns?lip复合物400nmol/l和空白作为对照组。作用24h、48h及72h后经酶标分析仪于570nm波长检测吸光度。
1.5流式细胞仪检测细胞凋亡变化
取对数生长期的t24细胞，浓度为2×105个/ml。400nmol/l反义odns?lip复合物进行转染，对照组应用rpmi?1640培养液。流式细胞仪分别于24h、48h及72h进行细胞凋亡检测。
1.6统计学方法
采用imagetool软件分析westernblot图像灰度值，应用单因素方差分析和q检验，p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1westernblot印迹试验
反义复合物处理t24细胞48h，随着浓度增加，survivin蛋白表达水平下降，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（p<0.01）。见表1。表1westernblot印迹试验结果(±s)
2.2mtt法检测细胞抑制率
反义复合物处理t24细胞后，随着浓度与作用时间的增加，细胞生长抑制率逐渐增高，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（p<0.01）。见表2。
2.3流式细胞仪检测细胞凋亡
t24细胞经作用后，流式细胞仪检测出现典型的亚二倍体峰，且亚二倍体峰的峰值随处理时间的延长而增加，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（p<0.01）。见表3。表3400nmol/l反义寡核苷酸作用不同时间后细胞凋亡率
3讨论
survivin是一些恶性肿瘤有潜在价值的诊断标志和预后因子，其存在预示着肿瘤组织分化不良，临床分期高，5年生存率及总生存率下降，无瘤生存时间缩短，复发率增加[3，4]。survivin是肿瘤特异性的凋亡抑制蛋白，在成人大多数肿瘤组织中表达水平异常升高[5]。可采取抑制其表达或干扰其作用的策略来治疗肿瘤，其分子靶向治疗单独或与其他抗癌治疗联合应用，可抑制体外肿瘤的形成及已形成肿瘤的生长[6]。
本研究中westernblot印迹试验表明survivin反义复合物可以下调t24细胞survivin蛋白表达，其表达水平随着反义复合物浓度的增加而进行性下降。提示脂质体的反义转染是成功的，反义survivin复合物可以明显下调t24细胞survivin蛋白的表达，并呈现一定的浓度依赖性。mtt结果显示t24细胞凋亡率随处理时间的延长而呈现增加趋势。流式细胞仪检测出t24细胞经反义surivin复合物处理后出现典型的细胞凋亡亚二倍体峰，且亚二倍体峰的峰值随处理时间的延长而增加。亚二倍体峰的出现与增加是量化膀胱癌细胞凋亡的客观指标，说明经脂质体转染的survivin反义寡核苷酸可诱导膀胱癌细胞发生凋亡，且凋亡细胞率有一定时间依赖性。
研究表明，survivin分子靶向治疗可通过诱发肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管形成的双重机制来发挥抗肿瘤作用[7]。高凋亡指数组患者的5年生存率明显高于低凋亡指数组，说明诱导肿瘤细胞凋亡是一种有效的抗肿瘤治疗手段[8]。本组资料表明经脂质体转染的survivin反义寡核苷酸可诱导体外培养人t24膀胱癌细胞发生凋亡，可能为膀胱癌的综合治疗提供新的方法。
【参考文献】
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细胞生物学的意义篇3
关键词：硫氧还蛋白1：基质金属蛋白酶9；肾小球系膜细胞；瞬时转染
中图分类号：R587.2 文献标识码：a 文章编号：1007-7847(2007)04-0361-06
糖尿病肾病(diabeticnephropathy，Dn)是糖尿病微血管并发症之一，其主要病理特点为肾脏系膜区系膜细胞增生，大量细胞外基质堆积。系膜区变宽或结节形成及肾小管肾小球基底膜增厚等，系膜区系膜细胞增生，细胞外基质(extracellularmatrix，eCm)积聚是Dn的特征性病理改变，近年关于eCm降解异常的研究已开始受到关注，基质金属蛋白酶类(matrixmetalloproteinases。mmps)是参与降解eCm的蛋白酶家族，其表达异常是eCm降解异常的重要原因，mmp9作为一种重要的降解eCm的基质金属蛋白酶已引起人们广泛关注，已有研究报道，细胞内氧化应激水平可影响mmp9的表达水平，硫氧还蛋白1是细胞内一种重要的抗氧化蛋白，具有多种生物学功能，如抗氧化应激、促生长、抑制凋亡等，而关于细胞内抗氧化蛋白对mmp9水平的影响目前尚属空白，本实验拟观察高糖环境下trxl过表达对mmp9表达的影响，为Dn系膜细胞外基质生成的调控研究奠定理论基础，也为其治疗与预防提供新的思路。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1实验细胞株与质粒
大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)购自武汉大学生物保藏中心，人trxl的重组质粒(piReSpur03-sensethioredoxin-1，piReSpur03-antithioredoxin-1)由美国范德堡大学Davidp.Carbone教授馈赠。
1．1．2 试剂
trizol、Rt-pCR试剂盒、Lipofectaminetm2000购自invitrogen公司：抗人trxl多克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体均购自Santacruz公司：辣根酶标记山羊抗兔igG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；eCLplus购自amersham公司：Dmem，Rpmi-1640购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物技术公司；胰酶、明胶(gelatine)购自Sigma公司；其它试剂均为进口或国产分析纯。
1．2 方法
1．2．1 细胞培养
HBZY-1常规培养于10％胎牛血清Rpmi-1640培养液中，培养条件为37℃，饱和湿度5％C02，每2～3d用0.25％胰酶消化传代。
1．2．2 Rt-pCR
trizol一步法从细胞中提取mRna，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定mRna质量，紫外分光光度计测定总mRna的浓度及纯度，取1μg总mRna经Rt-pCR试剂盒逆转录得到相应的cDna，取上述逆转录cDna作模板进行pCR扩增(引物序列见表1)，扩增条件为94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环后于72℃延伸10min，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，紫外凝胶成像系统进行半定量分析。
1．2．3 明胶酶谱分析法
取含10μg蛋白的细胞上清与不含点，巯基乙醇的蛋白上样缓冲液(0.125mol/Ltris-HClpH6.8，10％甘油，2％SDS，0.01％溴酚蓝)混匀，在含0.1％明胶的10％SDS-paGe中分离，以洗胶缓冲；液(2.5％tritonX-100，5mmol/LCaCl2，1μmol/LZnCl2，50mmol/Ltris-HClpH7.4)洗胶1h，后置于反应缓冲液(1％tritonX-100，5mmol/LCaCl2，1μmol/LZnCl2，50mmol/L，Fris，HCipH7.4)中37℃孵育过夜，经0.35％考马斯亮蓝染胶后用脱色缓冲液(甲醇25％，冰醋酸10％)脱色以显色条带，用扫描仪扫描湿胶，以密度分析软件(pDiinc，Quantityone，Version2.5)测定各条带的密度并以此行酶活性分析，实验重复3次。
1．2．4 western印迹
取细胞总蛋白70μg，经15％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳完毕后凝胶上的蛋白以电转移至硝酸纤维素膜，5％脱脂奶粉封闭，一抗37℃孵育1h30min、二抗37℃孵育1h，eCLplus检测，同时以β-actin作内参照，trxl一抗1:1000，二抗1:5000；β-actin一抗1:500，二抗1:5000，实验结果使用BioRaDGS-800系统扫描，并定量分析X光片条带的光密度，实验重复3次。
1．2．5 转染
转染前24h细胞传代。以4×105/mL细胞密度接种于六孔板中，细胞密度达70％～90％时进行转染，用250μL无血清培养基稀释4μg质粒混匀，同时用250μL无血清培养基稀释10μL转染试剂，室温放置5min，将上述两种复合物混合，室温放置20min，将复合物加入到细胞中，轻轻晃动，混匀，6h后换液，48h收细胞。
1．2．6 统计学分析
采用SpSS10.0统计软件进行数据处理，双侧检验以p＜0.05判定差异有统计学意义，组间资料采用配对t检验，所有数据以均数±标准差x±s)表示。
2 结果
2．1 Rt-pCR检测正常糖和高糖环境下mmp-9mRna表达水平
各时间点正常糖组和高糖组mmp9mRna表达结果显示，12h高糖组(HG)是正常糖组(nG)的146±11.3％，差异有统计学意义(*p＜0.05)；
24hHG组是nG组160.9±8.9％，差异有统计学意义(*p＜0.05)；48hHG组是nG组189±13，6％，差异有统计学意义(*p＜0.05)(见图1)，实验结果表明，高糖环境可以引起mmp9mRna表达增高。
2．2明胶酶谱法观察正常糖和高糖环境下HBZY-1培养液上清中mmp-9活性的变化
各时间点正常糖组和高糖组细胞上清中明胶酶mmp9活性显示，12hHG组是nG组的164.75±18.7％，差异有统计学意义(p**＜0.01)，24hHG组是nG组的163.58±12.4％，差异有统计学意义(p**＜0.01)，48hHG组是nG组的136.96±9.7％，差异有统计学意义(**＜0.01)，结果表明，48h内高糖环境可诱导明胶酶mmp9活性增强(见图2)。
2．3 HBZY-1细胞中正义和反义trxl质粒转染
2．3．1 Rt-pCR检测转染正义和反义trxl质粒
Rt-pCR结果显示：以β－actin为内参照，转染正义trxl和反义trxl组，在421bp处均有明显的条带，此条带与人trxl吻合，正常对照组此处无条带(图3)，实验结果表明。HBZY-1成功转染正义和反义trxl质粒。
2．3．2 westernblotting检测转染正义和反叉7rxl质粒
westernblotting结果显示：以β-actin为内参照，正义trxl组与反义trxl组和正常对照组比较，trxl蛋白表达明显增高(见图4)，实验结果表明，正义trxl质粒在HBZY-1中已表达trxl蛋白。
2．4 trxl过表达对HBZY-1中mmp9表达水平的影响
2．4．1 trxl过表达对HBZY-1中mmp9mRna水平的影响
以β－actin为内对照，在转染正义trxl质粒的细胞中(1组，2组)，HG组mmp9mRna表达水平和nG组差异无统计学意义(p＞0.05)；在转染反义trxl质粒的细胞中(3组，4组)，HG组mmp9mRna表达水平是nG组的163±12.7％，差异有统计学意义(p**＜0.05)；在未转染的细胞中(5组，6组)，HG组mmp9mRna表达水平是nG组的134±13.7％，差异有统计学意义(p**＜0.05)，且在正常糖环境下，1、3和5组mmiomRna表达水平差异无统计学意义(p**＞0.05)(见图5)，实验结果表明，正义trxl蛋白可以抑制高糖环境诱导的mmp9mRna水平的增高。
2．4．2 明胶酶谱法检测trxl过表达对正常糖和高糖环境下mmp-9活性的影响
转染正义trxl质粒细胞上清中，HG组mmp9酶活性是nG组的103±13.5％，二者差异无统计学意义(p＞0.05)；转染反义trxl质粒细胞上清中，HG组mmp9酶活性是nG组的137.13±11.6％，差异有统计学意义(p**＜0.01)：未转染组细胞上清中，HG组mmp9酶活性是nG组的122±14.2％，二者差异有统计学意义(p**＜0.01)(图6)，在正常糖环境下，1、3和5组mmp-9酶活性，差异无统计学意义(pb＞0.05)。实验结果表明，正义trxl抑制高糖诱导的mmp9酶活性增高。
3 讨论
Dn关键病理过程为系膜细胞增生，细胞外基质积聚和基底膜增厚，系膜基质的成分与含量取决于基质合成与降解之间的平衡，早先的研究主要集中在系膜基质合成方面，而降解能力下降在Dn发病中的重要作用近期才开始受到关注，mmps是一组能降解eCm的锌依赖Ⅱ型蛋白酶，对eCm有广泛的降解作用。是调节eCm动态平衡的最重要的一大酶系，mmp9是参与血管基底膜主要结构成分Ⅳ型胶原降解的蛋白酶，与糖尿病肾病关系密切，已有文献报道，持续高糖环境，系膜细胞mmp9活性升高而后下降，而mmp9活性的变化直接影响Ⅳ型胶原的表达，eCm积聚，系膜基质环境紊乱，所以，推测高糖环境下mmp9早期变化可能是系膜基质成分失衡的观测靶点。
本实验结果表明，HBZY-1在高糖环境48h内mmp9的活性明显增加，mmp2活性无变化，此结果说明，高糖环境可以影响系膜细胞内mmp9的活性。Hirakawa报道，mmp-9启动子序列中Ca重复序列与Dn的关系密切：最近ShiroUemura报道，高糖环境下细胞外抗氧化剂(n-乙酰半胱氨酸)可以使mmp9启动子活性减弱，并且这种减弱是通过抗氧化剂降低细胞内活性氧生成增多、减轻细胞氧化应激实现的，
trxl是细胞内广泛分布的一种抗氧化蛋白，具有一个高度保守的活性中心位点序列CGpC(-Cys32-Gly-pro-Cys35)，通过活性中心催化细胞内氧化还原反应，trx直接的抗氧化作用主要清除体内的自由基，最新的研究表明trx系统在机体抗氧化方面起着不可忽视的作用。trx在糖尿病方面的研究报道，高糖环境下，细胞内活性氧、trx和trx相互作用蛋白(VitaminD3up-rc8ulatedprotein-l，VDUportXnip)体系与p38信号传导途径密切相关，Kobayashi还报道，高糖环境下基因微点阵分析，系膜细胞内trx相互作用蛋白表达增高，且这种表达趋势的变化与细胞外基质增多密切相关，但高糖环境下，系膜细胞中trxl表达水平的改变，以及这种变化是否能影响降解细胞外基质的主要酶-mmp9的表达，目前尚无相关报道。
细胞生物学的意义篇4
细胞衰老是细胞不可逆的失去增殖能力的过程，被认为是机体抑制肿瘤发生的重要屏障[2]。但是也有研究表明衰老细胞可以通过分泌表型促进肿瘤发生。因此，细胞衰老与肿瘤之间的关系还需要进一步的研究。而对细胞衰老发生的分子机理的理解，有助于我们开发新的肿瘤治疗策略。目前已经发现多种基因毒性刺激都能诱发细胞发生早熟性细胞衰老，如端粒缩短、原癌基因激活、辐射损伤、活性氧损伤等，这些刺激都能引发Dna损伤[3]。
细胞衰老存在于多学科中，属于交叉学科，它自产生就与抽象、深奥的哲学紧密联系、相互促进。
一、细胞衰老学说的研究，离不开哲学思维的发展
哲学的发展来源于人类在探索世界时候的不断反省，通过对生命的意义的思索，促进着自然科学的发展。20世纪60年代，Hayflick和moorhead等人[4]在体外培养人正常成纤维细胞时发现：多株体外培养的正常人成纤维细胞，在经历多次细胞分裂之后，并没有无限制的增殖，而是发生了增殖失败现象。当排除了因细胞体外培养和营养需求改变等因素的影响后，他们确定这是细胞固有的一种生理状态。而与此现象相佐证的是：胚胎来源的成纤维细胞的增殖能力要比成体来源的成纤维细胞的增殖能力更强。这种现象使得他们提出了细胞衰老（Cellsenescence）的概念，并认为这种细胞增殖失败的现象与器官的老化是相关联的[5]。西方医学的很多发展都源于哲学的进步，他们观察自然和人类生活的变化，产生哲学思辩，从而研究物质存在的机制。西方的哲学发展较快，较为进步，正式哲学的发展促进了其他学科的发展，哲学思维给予了医学正确看待生命与健康的理论指导。医学家在哲学世界观与方法论的指导下，从事基础医学研究，推动着医学进步发，促进了基础医学的进步。
二、细胞衰老学说研究要靠实践的唯物主义哲学思想
细胞衰老机制研究是一门医学基础的研究，归从于细胞生物学研究，必须通过反复的实验进行验证。而细胞衰老对于机体器官的衰老，机体本身的衰老都是其研究的基础，是其理论基础，哲学思想充斥在科学实践与理论思维之中。细胞衰老机制研究是一个基础认识过程，由感性认识到理性认识，从机体自然界的生老病死的现象，使人类产生研究其基本结构单位细胞的想法，对细胞衰老的机制研究，进一步解开人类机体衰老的奥秘，从认识到实践，实践再进一步指导认识，实现科研造福于人类的意义。
三、细胞衰老学说研究依靠哲学思维发挥出社会效应，实现价值
哲学对医学的发展具有世界观的理论指导意义，细胞衰老学说的发展也不例外。列文虎克发明第一台显微镜,初步认识了微生物，人类就开始了细胞学说的研究。从细胞的大体结构，细胞壁、细胞器、细胞核的研究，到微细的细胞结构中细胞各组织结构的功能，细胞内信号的传导、物质的代谢，再到细胞生长、增殖、衰老、凋亡机制的研究，所有这些都离不开哲学的指导需要哲学思维价值观来指导任一学科的发展，同时细胞衰老学说的研究，必然伴随社会价值的体现，人类向往永生，向往肌肤的永生，甚至生命的永生，所以哲学承担起揭示医学科学社会效应的责任，指导细胞衰老的研究来充分发挥出其社会效应，这涉及人的出现，生存、发展等一系列哲学问题。离开了哲学，科学的理论基础就将崩塌。物理学家玻恩曾经说“每个现代科学家，都深刻地意识到自己的工作是同哲学思维错综地交织在一起，要是没有对哲学文献的充分认识，他们的工作会是无效的”[6]。细胞衰老学说的研究不是独立的个体，它是普遍联系的，将之与环境问题，经济问题，社会人文问题、法律问题等等综合研究才能真正实现社会价值，为社会的发展，社会的前进起到应有的作用。
四、细胞衰老学说离不开哲学思维的唯物辩证法
科学研究中的哲学思维是与一般科研思维融入一体，真正的唯物主义哲学并不认为假说是唯心的，需要通过不断地提岀新的假说或假设，然后通过构建科学技术，进不去证明。假说或假设是科学无法存在的基础，是科学向前发展的动力。这就是科学的理性主义态度或方法论。用胡适先生说科学的态度或方法就是“大胆地假设，小心地求证”[7]。假设-验证是医学科学家常常使用的思维方式。细胞衰老学说就是首先通过假设，然后通过实验的不断证实进行的，只有不断的假设，不断的通过基础实验去验证，才能使衰老学说的机制得到很好的验证，才能不断的进步，不断的探究，更好的使用在机体衰老机制的研究。
五、正确认识事物的逻辑方法
细胞生物学的意义篇5
[关键词]巴戟天醇提物；D-半乳糖；免疫功能；刺激指数；白介素-2；CD28
[中图分类号]R393[文献标识码]a[文章编号]1673-7210（2013）02（a）-0017-03
近年来，我国人口老龄化趋势明显呈上升趋势，随之而来的因衰老引起的社会和医学问题严重困扰着广大学者，因此，关于如何延缓衰老的问题成为了目前生命科学工作者所关注的热点。研究表明，衰老是机体随着年龄的增长而出现的多种器官、组织等发生的退行性改变，属于一种自然生理现象，衰老的形成受多种因素的影响，机体所表现出来的体征等也多种多样，例如行动迟缓、记忆力下降以及免疫功能降低等[1]。
巴戟天最早是作为一种壮阳中药应用于一些基础研究和临床的，后来研究发现其具有补肾壮阳、增强、抗肿瘤、缓解抑郁症状以及抗衰老等多种作用，作为提取自巴戟天的巴戟天醇提物也具有类似的作用[2-3]。以往的研究证实，巴戟天醇提物通过抗氧化以及抗凋亡而发挥其抗衰老作用的[4]，而关于其对衰老大鼠免疫功能的影响尚未有报道。因此，作者旨在通过将巴戟天醇提物应用于D-半乳糖致衰老大鼠模型来探讨其对衰老大鼠免疫功能的影响。
1材料与方法
1.1试剂
巴戟天醇提物提取自巴戟天（一等品，广东省德庆县药材公司，河南省食品药品检验所鉴定）；脂多糖（lipopolysaccharide，LpS）、刀豆素（canavalin，Cona）（批号：20120203、201200123，美国Sigma公司）；大鼠白介素-2（iL-2），定量酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，eLiSa）试剂盒（批号：20120417，美国RD公司）；pe-兔抗大鼠CD28单抗（批号：12-0280-81，美国eBioscience公司）；考马斯亮兰试剂盒（批号：20120509，南京建成生物工程研究所）。
1.2仪器
CaSteaX2100型全自动酶联免疫分析仪（美国Beckman公司）；FaCSCalibur流式细胞仪（美国BectonDicknson公司）。
1.3实验动物
健康雄性wistar大鼠，4月龄，体重200～245g，平均（223±12）g，由河南省实验动物中心提供。
1.4分组及处理
50只大鼠随机均分为空白对照组、模型对照组、维生素e组、巴戟天高剂量组、巴戟天低剂量组，每组各10只，各组大鼠常规分笼饲养。模型对照组及巴戟天高、低剂量组大鼠均每天皮下注射质量分数5%D-半乳糖1mL/kg；空白对照组大鼠均每天皮下注射质量分数0.85%氯化钠溶液1mL/kg；维生素e组大鼠每天在给予D-半乳糖的同时，给予维生素e50mg/（kg·d）灌胃；巴戟天高、低剂量组大鼠在每天给予D-半乳糖的同时，分别给予巴戟天醇提物2.1、0.7g/（kg·d）灌胃。所有大鼠均连续给药8周，之后进行免疫功能相关指标的检测。
1.5大鼠脏器指数的检测
首先对每只大鼠进行称重，并记录，然后常规解剖，无菌条件下取出脾脏、胸腺进行称重，计算脏器指数，公式如下：脾脏指数或胸腺指数=（脾脏重量或胸腺重量/大鼠体重）×100%。
1.6淋巴细胞转化试验
末次给药后次日，将取出的部分脾脏制成脾细胞悬液，调节细胞浓度至1×107/mL，然后加入96孔培养板，每孔200μL，再加入20μg/mLCona（用于t淋巴细胞转化试验）或LpS（用于B淋巴细胞转化试验），并设对照孔以及Cona刺激孔或LpS刺激孔。置于37℃、5%Co2培养箱中孵育72h，并采用mtt法测定570nm处oD值，根据oD值计算t、B淋巴细胞刺激指数，计算公式如下：刺激指数（Si）=（刺激孔oD值/对照孔oD值）×100%。所有实验重复3次，每次设3个复孔。
1.7iL-2表达检测
末次给药后次日，将取出的部分脾脏与0.85%氯化钠溶液制成10%脾脏组织匀浆，采用双抗夹心eLiSa法定量检测iL-2，具体操作步骤参考试剂盒说明书。
1.8CD28表达检测
末次给药后次日，从取出的脾脏中取1mm3脾脏组织剪碎，制成脾细胞悬液，取脾细胞悬液100μL用红细胞裂解液裂解红细胞直至液体变成无色透明，然后3000r/min离心3min，磷酸盐缓冲液（pBS）洗涤2次，调脾细胞浓度至2×106/mL，取其中40μL加入试管，同时往试管中加入异硫氰酸荧光素（FitC）标记的CD28单抗10μL，震荡混匀，并于4℃冰箱中孵育30min，pBS洗涤，3000r/min离心3min，然后细胞定容至0.5mL到专用试管，上流式细胞仪进行CD28阳性淋巴细胞检测。
1.9统计学方法
采用统计软件SpSS17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1巴戟天醇提物对大鼠脏器指数的影响
模型对照组胸腺指数、脾脏指数明显低于空白对照组，差异有统计学意义（p<0.05）。与模型对照组比较，维生素e组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组胸腺指数、脾脏指数明显升高，差异有统计学意义（p<0.05）。维生素e组、巴戟天高剂量组胸腺指数、脾脏指数比较，差异无统计学意义（p>0.05）；巴戟天低剂量组胸腺指数、脾脏指数低于维生素e组、巴戟天高剂量组，差异均有统计学意义（均p<0.05）。见表1。
2.2巴戟天醇提物对大鼠淋巴细胞的影响
模型对照组t淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数明显低于对照组，差异有统计学意义（p<0.05）。与模型对照组比较，维生素e组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组t淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数明显升高，差异有统计学意义（p<0.05）。维生素e组、巴戟天高剂量组t淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数比较，差异无统计学意义（p>0.05）；巴戟天低剂量组t淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数低于维生素e组、巴戟天高剂量组，差异有统计学意义（p<0.05）。见表2。
2.3巴戟天醇提物对大鼠iL-2及CD28的影响
模型对照组iL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数明显低于对照组，差异有统计学意义（p<0.05）。与模型对照组比较，维生素e组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组iL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数明显升高，差异有统计学意义（p<0.05）。维生素e组、巴戟天高剂量组iL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数比较，差异无统计学意义（p>0.05）；巴戟天低剂量组iL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数低于维生素e组、巴戟天高剂量组，差异有统计学意义（p<0.05）。见表3。
3讨论
衰老的发生机制众多，诸如自由基过剩导致衰老理论、衰老的细胞凋亡学说、衰老的免疫功能障碍学说等，随着衰老相关机制的研究进展，衰老的免疫学说的地位越来越高。越来越多的研究表明，免疫功能下降是机体出现衰老的征兆和重要因素[5-6]，随着增龄化的进展，机体免疫器官老化，免疫细胞、免疫相关因子的数量和功能发生明显变化，从而导致了感染性疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病的发病率上升。D-半乳糖是一种常用的致衰老药物，其制作的模型已经被广泛应用于实验研究。研究表明，D-半乳糖致衰老模型其各种免疫功能相关指标的变化与自然衰老一致[7]，例如免疫器官老化、淋巴细胞转化能力减弱、机体iL-2水平降低、胸腺指数及脾脏指数降低等。因此，本研究选择D-半乳糖致衰老模型代替自然衰老模型是切实可行的。本研究结果也提示，D-半乳糖能够降低大鼠胸腺指数、脾脏指数，t、B淋巴细胞Si，iL-2水平，以及体内CD28阳性淋巴细胞数量，进一步验证了机体免疫功能的衰退是导致衰老发生的重要因素。
胸腺是免疫调节的中枢器官，主要用于为t淋巴细胞的分化、成熟提供场所，对于机体的细胞免疫功能以及免疫反应的发生具有重要作用。而脾脏是最大的外周免疫器官，其为各种成熟的淋巴细胞提供定居场所以及发生免疫应答。胸腺和脾脏均会随着机体的增龄化进程，质量变轻，功能下降[8]。本研究结果提示，高、低剂量的巴戟天醇提物与阳性对照药物维生素e相似，均具有提高衰老大鼠脏器指数的作用，且两种剂量的巴戟天醇提物的作用不同，低剂量者作用较弱（p<0.05）。
t、B淋巴细胞在机体发生特异性免疫应答中发挥重要作用。其中t淋巴细胞主要介导细胞免疫，其杀伤作用及分泌免疫相关因子能力的下降导致机体自身免疫性疾病、恶性肿瘤等发生，随着年龄的增大，t淋巴细胞的数量和功能均会下降[9]。B淋巴细胞主要参与机体的体液免疫，通常通过分泌细胞因子进行免疫调节，且这种分泌作用于年龄的增长呈负相关[9-10]。本组实验结果提示，巴戟天醇提物与维生素e一样能够有效提高衰老大鼠降低的t、B淋巴细胞转化能力，从而促进这些细胞的增殖，且巴戟天高剂量组作用强于低剂量组（p<0.05）。
iL-2主要由活化的t淋巴细胞分泌，特别是辅t淋巴细胞分泌能力更强。iL-2具有较强的免疫调节作用，能够促进t淋巴细胞的增殖、分化，增强t淋巴细胞及nK细胞的活性，同时还可以通过促进干扰素合成而增强细胞杀伤力。iL-2随年龄增加分泌减少被认为是衰老的免疫学说的主要分子机制[11]。本实验结果显示，巴戟天醇提物与维生素e一样能够提高衰老大鼠iL-2表达水平，从而促进t淋巴细胞及nK细胞的的增殖及杀伤作用等，且巴戟天高剂量组作用强于低剂量组（p<0.05）。
CD28分子是广泛表达于t淋巴细胞表面的共刺激分子，为t淋巴细胞的活化提供第二信使，从而发挥重要作用[12]。另外，CD28还参与免疫维持及下调免疫功能，在免疫功能平衡与稳定过程中发挥重要作用。随着机体的老化，CD28分子信号转到能力下降，进而导致t淋巴细胞的增殖活化受阻，同时iL-2等细胞因子分泌减少，以致机体的细胞免疫和体液免疫均呈现衰退和紊乱，这也导致了机体的衰老[13]。本组结果显示，巴戟天醇提物与维生素e一样能够提高衰老大鼠CD28阳性淋巴细胞数量，且巴戟天高剂量组作用强于低剂量组（p<0.05）。
综上所述，巴戟天醇提物能够下调D-半乳糖致衰老大鼠的胸腺指数、脾脏指数，t、B淋巴细胞转化能力，iL-2水平，以及CD28阳性淋巴细胞数量，从而提高衰老机体的免疫力，可能具有一定的延缓衰老的作用。
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细胞生物学的意义篇6
关键词：自然铜；鹿衔草；肺癌；骨转移；抑制
中图分类号：R285.5文献标识码：a文章编号：1673-7717(2012)01-0137-03
inhibitoryactionofpyriteandpyrolaonnudemousewithBonemetastasisinLungCancer
CaoZhaowen1,YUanGZhengzhong2,YeRen2,XUXiaofeng2，SHanZesong2
(1.wenzhoumedicalCollege,wenzhou325000,Zhejiang,China;
2.theFirstaffiliatedHospitalofwenzhoumedicalCollege,wenzhou325000,Zhejiang,China)
abstract:objective：todiscusstheinhibitoryactionofpyriteandpyrolaonbonemetastasisinlungcancer.methods：take15～20gnudemice,inject0.1mLa549cellsuspensionintomarrowcavityoftibiaofeverynudemouse,after14days,establishthemodelsofbonemetastasisinlungcancer.thentheywererandomlydividedintoChinesemedicinegroup,positivedruggroupandmodelcontrolgroup.theChinesemedicinegroupwereadministeredthepyriteandpyrolawith6gkg-1intostomacheveryotherday.positivedruggroupwereinjectedintoenterocoeliawithpamidronate.Disodium10mgkg-1everyweek.afterthreeweeks,theywereexecutedandweighedtomeasurethetumorvolumeandcalculatethetumor-suppressingrate.Usetheflowcytometertodetectapoptosisrate,bloodbiochemistryanalyzertocalcium,phosphorus,alkalinephosphatase,hepatic/renalfunctionandsoon.Results：Comparedtothemodelcontrolgroup,inChinesemedicinegroupandpositivedruggroup,thetumorvolumehasshrinked,calciumandalkalinephosphatasereduced,apoptosisrateincreasedandureanitrogendecreased.andtheweightofpositivedruggroupdescended,aStincreased;bycomparison,inChinesemedicinegroup,theweightelevated,thetumorbulklessened,apoptosisrateincreased,Ca,aSt,aLtallfelldownandtheureanitrogenhasgoneup;thedifferencesofserumphosphorusandcreatinineamongthethreegroupshavenostatisticalsignificance.Conclusion：pyriteandpyrolacansafelycontrolbonedestructioncausedbybonemetastasisinlungcancer.
Keywords:pyrite；pyrola；lungcancer；bonemetastasis；inhibitoryaction
肺癌晚期常会出现各种部位的转移,其中以骨转移最为常见,骨转移的发生率为20%～40%。如果病变不有效控制，又会进一步加重病情，甚至发生病理性骨折。中医药通过活血化瘀，扶正固本等方法进行治疗[1-3]。鹿衔草被历代医家称为补虚之珍品，能够提高机体的免疫功能达到正胜邪退的目的。自然铜能够促进骨折愈合。临床上常把两药用于治疗肺癌骨转移，对于延缓病情的发展，改善患者的临床症状，提高生活质量等具有较好的疗效。通过此实验研究，探讨自然铜和鹿衔草抑制骨转移瘤的效果及作用机制：
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1动物BaLBC裸鼠，30只，由上海斯莱克动物有限公司提供，许可证SCXK（沪）2007―0005，鼠龄4周，雌雄各半，体重15～20g,在SpF环境中饲养。
1.1.2材料a549细胞株由温州医学院附属第一医院龙湾医科所惠赠。Rpmi-1640培养基干粉、胰蛋白酶和二甲基亚枫购自Gibco公司。小牛血清购自杭州四季青生物工程公司。annexinV凋亡试剂盒购自杭州联科生物科技有限公司。
1.1.3药物自然铜和鹿衔草的免煎颗粒购自深圳三九现代中药有限公司，1g免煎剂等于10g生药量。自然铜和鹿衔草用0.9%生理盐水稀释，每只裸鼠每次按6g•kg-1给药0.5mL。注射用帕米磷酸二钠购自瑞士诺华制药有限公司,用0.9%生理盐水稀释，每只裸鼠每次按10mg•kg-1给药0.16mL[4]。
1.1.4仪器Jw2502电子分析天平:上海天平仪器厂产品。olympusCKX41-32倒置显微镜:日本olympus光学公司产品。mCo-175Co2培养箱:日本三洋公司产品。流式细胞仪美国Beckman公司产品，型号：FaCScalibur。
1.2肺癌骨转移动物模型建立[5]
a549单细胞悬液用1640培养基(pH7.0)加15%小牛血清于37℃5%二氧化碳培养箱中培养，注射前pBS洗净，并调节细胞浓度到1×107个•mL-1。裸鼠戊巴比妥腹腔注射麻醉后用75%酒精消毒股骨及胫骨处皮肤，取19G针头直接于骨性粗隆上刺透骨皮质，然后将针尖插入骨干内注入0.1mL的单细胞悬液。注射完后饲养于动物实验中心SpF环境中，14天后用于实验。
1.3分组
随机分为3组，每组10只。模型对照组：隔日灌胃生理盐水0.5mL，隔7天腹腔注射生理盐水0.16mL;阳性对照组：隔日灌胃生理盐水0.5mL，隔7天腹腔注射帕米磷酸二钠0.16mL;中药组：隔日灌胃自然铜和鹿衔草0.5mL，隔7天腹腔注射生理盐水0.16mL。
1.4观察内容
各组裸鼠给药3周后，用摘眼球法采取血液样本，此后断颈处死，剥离肿瘤组织。
1.4.1肿瘤组织病理特点
肿瘤组织置于脱钙液中3天后，于4%多聚甲醛中固定24h，石蜡包埋，组织切片。He染色后，观察肿瘤组织镜下特点，并以免疫组化确诊。
1.4.2体重
实验前测量各组的体重，处死前再次测量体重。
1.4.3测量肿瘤的长短径按以下公式计算出抑瘤率[1]：
肿瘤体积(mm3)=π/6×a×b2(a为长径,b为短径)；抑瘤率=(V1-V2)/V1×100%(V1为对照组肿瘤体积，V2为实验组肿瘤体积)。
1.4.4肿瘤细胞凋亡
肿瘤组织采用eDta螯合法制备成单细胞悬液后pi(浓度为100mg•L-1)染色，流式细胞仪作细胞凋亡分析。
1.4.5血清钙、磷、碱性磷酸酶及肝肾功能
摘眼球后，采血0.3mL放入采血管中离心，分离出血清用全自动血生化分析仪器检测。
1.5统计学处理
所有数据采用±s表示，数据采用SpSS13.0统计软件进行t检验或方差分析。
2结果
2.1肿瘤组织病理特点
He染色后，镜下可见：肿瘤细胞呈腺管状、实性排列，瘤内见坏死；部分肿瘤细胞有黏液变性；肿瘤细胞侵及肌肉、骨组织（图1）。免疫组化结果：ttF-1+、CK+++（强阳性）、Ki67+70%、Cga-、nSe-、Cea-。
2.2体重变化
各组裸鼠在给药前和处死前的体重情况，见表1。
由表1可见，给药前各组体重无显著性差异；处死前，中药组体重降低于模型对照组，但差异无统计学意义，而阳性组体重低于模型组，差异有统计学意义（p
2.3肿瘤体积及抑瘤率
根据测量肿瘤的长短径计算得出各组裸鼠肿瘤体积和抑瘤率，见表2。
由表2可见，中药组和阳性药物组肿瘤体积小于模型对照组，差异有统计学意义（p＜0.01），而且中药组肿瘤体积小于阳性药物组，差异有统计学意义（p＜0.05）；中药组抑瘤率高于阳性药物组，差异有统计学意义（p＜0.01）。
2.4血清钙、磷、碱性磷酸酶
各组裸鼠血清钙、磷和碱性磷酸酶的量，见表3。
由表3可见，中药组血钙低于模型对照组和阳性药物组，差异有统计学意义（p＜0.01，p＜0.05）；阳性药物组血钙低于模型对照组，但差异没有统计学意义。3组血清磷比较，差异无统计学意义。中药组和阳性药物组碱性磷酸酶均低于模型对照组，差异有统计学意义（p＜0.05），中药组碱性磷酸酶低于阳性药物组，差异无统计学意义。
2.5肿瘤细胞凋亡率
各组肿瘤细胞凋亡率结果，见表4。
由表4可见，中药组和阳性药物组肿瘤细胞凋亡率高于模型对照组，差异有统计学意义（p＜0.05，p＜0.01），中药组肿瘤细胞凋亡率低于阳性药物组，但是差异无统计学意义。
2.6肝肾功能
给药后，各组裸鼠肝肾功能的结果，见表5。
由表5可见，中药组天冬氨酸氨基转移酶高于模型对照组，差异无统计学意义，但低于阳性药物组，差异有统计学意义（p＜0.01）；阳性药物组天冬氨酸氨基转移酶高于模型对照组，差异有统计学意义（p＜0.01）。中药组丙氨酸氨基转移酶低于模型对照组，差异无统计学意义，也低于阳性药物组，差异有统计学意义（p＜0.01）；阳性药物组天冬氨酸氨基转移酶高于模型对照组，差异有统计学意义（p＜0.01）。中药组和阳性药物组尿素氮低于模型对照组，差异有统计学意义（p＜0.01，p＜0.01）；中药组尿素氮高于阳性药物组，差异有统计学意义（p＜0.01）。中药组和阳性药物组肌酐低于模型对照组，差异无统计学意义。
3讨论
《灵枢•百病始生》云:“留而不去传舍于胃肠之外,募原之间,留着于脉,稽留而不去,息而成积。”留者,瘤也。肺癌骨转移中医古代典籍未载其名，一般将其称为“骨瘤”、“骨蚀”、“骨漏疮”、“骨疽”。主要病机是肺肾两虚，瘀血阻络。自然铜：味辛苦，功能散瘀止痛，现代药理表明自然铜能提高骨折组织钙、磷水平，促进骨折愈合[6]。鹿衔草：味甘，归肝肾经，功能补虚益肾、强筋骨，现代药理研究发现鹿衔草能提高机体的免疫能力[7]。两药合用，“一补一通”，“通补结合”很好的契合了肺癌骨转移的病机。
肺癌骨转移绝大多数表现为溶骨性骨转移。肺癌骨转移主要包括4个步骤：①肺癌细胞的脱落与外侵②肺癌细胞的趋化与迁移③肺癌细胞的黏附④溶骨性骨破坏。正常的骨骼包括两种细胞成骨细胞和破骨细胞，两者之间的平衡和耦联维持着骨代谢的平衡。在溶骨性骨破坏过程中，破骨细胞是主要效应细胞，在巨噬细胞集落刺激因子，细胞核因子KB配基受体激活剂细胞因子及骨基质生长因子的诱导激活下，导致了溶骨性骨破坏的形成。临床上常用血清钙，磷，碱性磷酸酶做为肺癌骨转移血清学指标之一［8］。
中药自然铜联合鹿衔草可以缩小肺癌骨转移裸鼠模型的肿瘤体积，提高抑瘤率，降低血清钙和碱性磷酸酶，提示二者不仅能够抑制肿瘤生长，而且可以缓解溶骨性骨破坏。二药联合可以提高瘤细胞凋亡率，提示二药的疗效机制之一是促进肿瘤细胞凋亡从而抑制肿瘤的生长。此外，通过体重、肝肾功能等比较，表明常规剂量下二药联用比较安全。
肺癌骨转移主要治疗的方法有：外科手术、局部放疗、全身化疗和二磷酸盐类药物治疗等，中医药治疗作为综合治疗的方法可以于这些方法结合，从而提高临床疗效，造福患者。
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细胞生物学的意义篇7
【关键词】细胞膜的结构；细胞膜功能；合作探究；小组合作
我今天说课的内容是人教版必修一第三章第一节细胞膜的结构和功能。高中生物必修课本一共三册书，必修一分子与细胞是其中的基础，而必修一中细胞的结构和功能为基础中的基础，前面学习了构成生物体的物质基础：元素和化合物，接下来又学习元素和化合物构成的结构基础细胞。只有这部分知识的熟练掌握才能更好地理解和学习后面的细胞的增殖，分化，衰老，癌变；必修二的减数分裂；必修三的兴奋地传递和激素的功能特点。同时高一的学生刚刚进入高中阶段的学习对高中的学习方法和技巧没有更多的深入，而且初三没有学习生物学科，我在上课的过程中注意学生生物学科的学习方法和技巧的培养，培养学生的生物学思维和生物学的学习方法，例如让学生多参与实验，设计实验，体验生物学科是实验科学；为学生尽可能多地提供动脑动手的机会，培养学生的发散思维、想象力，初步培养科研的思维。
一、课堂前教案分析
（一）教学目标
知识目标：了解细胞膜的成分、结构和功能。能力目标：进行用哺乳动物红细胞制备细胞膜的实验；体验制备细胞膜的方法；探讨在建立生物膜模型的过程中，实验技术的进步所起的作用。情感态度目标：认同细胞膜作为系统的边界对于细胞这个生命系统的重要意义；探讨建立生物膜模型的过程如何体现结构与功能相适应的观点。
（二）教学重点与难点
教学重点主要包括以下几点：细胞膜的成分和功能；细胞膜对于细胞这个生命系统的重要意义。教学难点：用哺乳动物红细胞制备细胞膜的方法。细胞膜对于细胞这个生命系统的重要意义。建立生物膜模型的过程如何体现结构与功能相适应的观点。
（三）教学方法
教学方法有很多种，本次主要是运用以下的一些方法：引导探究，模型制作，小组合作，小先生讲课，通过这些方法能很好地引导学生尽快地进入课堂氛围，而且能够亲自参与到课堂教学中，增加同学们的学习兴趣。
二、课堂教学过程设计
通过做一个演示实验：两个烧杯分别装凉水和开水，同学上来操作，分别放入等量的玫瑰花瓣，用玻璃棒搅拌，请同学们观察有什么现象？得出什么结论？通过这个观察到的现象从而引出细胞膜的功能，锻炼和培养学生的观察和分析的能力，此部分大约用时5—8分钟。
细胞膜的这么重要的功能，与什么有关？究竟又怎样的结构决定的呢？首先要制备出真正的生物膜才能够是由有说服力。此处是一个很重要的实验，鉴于实验材料和器材的显示采用的方法是理论实验，培养学生自己在脑中先预设实验，用问题串的形式将该实验需要的所有问题都引导出来。
我们选择什么样的材料来做这个实验呢？（动物细胞，植物细胞，细菌类细胞，哺乳动物的成熟的红细胞）你为什么选择这样的实验材料，依据是什么？
你选择了哺乳动物的成熟的红细胞，接下来你如何操作能够制备细胞膜呢？为什么要这样操作？
细胞破裂后，如何才能将细胞膜取出来呢？用到了其他学科的什么知识？
制备了细胞膜，究竟含有哪些化合物？我采用的方法是沿着科学史的步伐，根据曾经的科学家们的实验，看看同学的分析能力。
细胞膜的化学组成为：磷脂分子，蛋白质分子，多糖分子。这些化合物用什么样的方式结合起来，能够满足我们前面分析的细胞膜的功能？提供材料：塑料板，磷脂模型，蛋白质模型，多糖模型。
分组：同学们六人一组，进行拼图实验，看看你做的模型怎样才能满足细胞膜的功能。
在这个过程中，学生会存在这样那样的问题，你的设计，为什么这样设计，有不同意见的同学起来反驳，你的反驳理由是什么？这样设计对不对，为什么？应该怎样设计呢？边设计边订正，到最后同学自己说服自己，制作出真正正确的磷脂双分子层的流动镶嵌模型。能够让学生充分理解为什么细胞膜要有这样的结构，同时还锻炼了学生设计实验的能力，科学辩证的思维能力。
课堂快结束的时候，让同学起来总结一下这节课你学习了什么？知识方面的收获还有其他的收获吗？为了满足不同层次的学生的需求，采用分层次布置作业，基础的部分+能力提高部分。有兴趣的同学上网查资料，细胞膜上的甲胎蛋白与人体健康。
三、小结
高中生物教学方法多种多样，本文旨在对学生生物学科的学习方法和技巧的培养，培养学生的生物学思维和生物学的学习方法，为学生尽可能多的提供动脑动手的机会，培养学生的发散思维、想象力，初步培养科研的思维。
【参考文献】
［1］冯文琪.浅谈如何在高中生物教学中培养学生的探究能力[J].新课程（中），2011（2）.
细胞生物学的意义篇8
【关键词】紫杉醇;食管癌;凋亡;fadd
食管癌是常见消化道恶性肿瘤之一，其发病隐匿,确诊时大多已属于中晚期，使很多患者在手术前后需要接受化学治疗,以确保手术效果，同时化疗也为很多失去手术机会的患者提供了治疗的机会。紫杉醇品名为taxol，最早是wall和wani于1963年从太平洋红豆杉的皮中提取得到［1］，经过临床试验后近年来已经广泛应用于临床包括食管癌在内的多种肿
瘤的化疗中。紫杉醇可作用于细胞凋亡受体途径的fas/fasl通路或激活凋亡启动途径的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶系统(caspases),诱导细胞凋亡［2,3］，而fadd是fas/fasl凋亡系统中的必需分子，不仅参与细胞凋亡过程的发生，还与细胞周期的调节有关。研究［4］证实从食管正常黏膜到不典型增生的组织中，fadd蛋白及mrna表达呈现显著下降趋势。已有临床研究［5,6］表明紫杉醇联合顺铂、奈达铂、氟尿嘧啶等药物治疗食管癌,可以提高其总有效率,且毒副作用无明显增加，患者耐受性较好，表明紫杉醇在食管癌治疗中具有很高的临床应用价值。同时紫杉醇对人食管癌细胞的生长有明显的抑制作用,使细胞分裂阻滞于g2-m期,并诱导肿瘤细胞凋亡［7］。但现有研究并没有对这一过程中食管癌细胞中fadd的表达变化情况作进一步研究。
作者通过检测不同浓度紫杉醇诱导人食管鳞癌细胞株ec-109细胞凋亡,并检测细胞表达fadd蛋白的变化情况，探讨紫杉醇抑制人食管癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的分子机制,为临床应用提供实验依据。
1材料和方法
1．1试剂与药物泰素(紫杉醇的商品名,由百时美施贵宝公司惠供,6g/l,分子质量8539u)，rpmi1640培养液、005%的胰蛋白酶及小牛血清为hyclone产品,annexinv（fitc）/pi凋亡检测试剂盒购于杭州隆基生物工程研究所,蛋白提取液购于pierce公司，兔抗人fadd单克隆抗体及鼠抗人β-actin单克隆抗体购于santacruz公司，考马斯亮蓝试剂盒购于南京建成生物科技有限公司。
1．2细胞与细胞培养人食管癌细胞株eca-109（atcc）由上海麦莎生物科技有限公司代购。细胞接种于含10%小牛血清的rpmi1640培养液培养,生长于37℃含5%的co2孵箱中,待细胞生长至对数生长期开始实验。胰蛋白酶消化细胞后培养基重悬，调整细胞数为5×10.5/ml接种于6孔培养板进行培养，24h后更换新鲜培养液，同时实验组培养液中分别加入终浓度为5、10、20、50nmol/l泰素，对照组不加药物，每个浓度设3个复孔，培养24h后收集各组细胞。
1．3凋亡检测
收集每组细胞后pbs洗涤离心，细胞重悬于300μlbandingbuffer中，加入5μlannexinv-fitc混匀，室温避光孵育15min，再加入5μlpi，室温避光孵育5min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率，同时以不加annexinv-fitc及pi的一管作为对照。
14westernblotting分别收集每组细胞，pbs洗涤离心后，加入含蛋白酶抑制剂的蛋白提取液，提取细胞总蛋白并调整蛋白浓度后100℃煮沸变性。取适量蛋白进行sds-page电泳，半干法转膜，封闭，按1：1000分别孵育兔抗人fadd单克隆抗体及鼠抗人β-actin单克隆抗体，4℃过夜后洗膜，按1：1000分别孵育羊抗兔及羊抗鼠二抗，洗膜，化学发光底物显影照相后进行图片分析及数据采集。
1．5统计学方法
以上实验均重复3次，实验数据采用spss130软件分析处理，统计学方法采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，p<005表示差异有统计学意义。
2结果
21紫杉醇诱导人食管癌细胞株eca-109凋亡检测实验结果显示，实验组细胞凋亡率显著高于对照组，实验组中紫杉醇药物浓度5nmol/l组与10nmol/l之间差异无统计学意义，药物浓度升高至20nmol/l和50nmol/l后细胞凋亡率显著升高，与5nmol/l组和10nmol/l之间差异有统计学意义，见图1。
22细胞表达fadd蛋白水平检测检测结果显示，所有实验组中eca-109细胞表达fadd蛋白水平较对照组均有升高，见图2，a。但仅紫杉醇药物浓度为20nmol/l组和50nmol/l组中细胞表达
fadd蛋白水平与对照组差异有统计学意义，见图2,b。
3讨论
研究结果显示，紫杉醇能诱导人食管癌细胞株eca-109细胞凋亡，当紫杉醇浓度达到20nmol/l和50nmol/l时，细胞凋亡率显著升高。这一研究结果提示，只有紫杉醇达到一定血药浓度后，才会对食管癌细胞产生抗癌作用。低浓度紫杉醇作用可能只会抑制细胞增殖，并不一定能引起食管癌细胞的凋亡。fadd是fas受体和部分tnf死亡受体家族成员介导信号通路中的胞质死亡信号衔接蛋白，其羧基端的死亡结构域dd与fas分子胞浆段内的dd结合，当fas与fasl结合导致fas胞内的死亡域形成三聚体而活化,并引起与之结合的fadd构象改变,使caspase-8前体集聚、断裂和激活,产生有活性的caspase-8,从而激发一系列下游的caspase-3等级联反应,诱发细胞凋亡［8］。检测结果显示，当紫杉醇诱导人食管癌细胞株eca-109细胞凋亡时，细胞表达fadd蛋白水平显著升高，而低浓度组之间差异无统计学意义。这表明紫杉醇可能通过fas/fasl途径在食管癌治疗中起作用，一定剂量的紫杉醇可以诱导食管癌细胞fadd表达水平的升高，促进癌细胞凋亡。这也提示在抗肿瘤治疗过程中，紫杉醇的用量也是关键。
食管癌的治疗是一个综合治疗的过程，化疗只是所有治疗方法中的一种。紫杉醇虽然在食管癌临床治疗中已经显现出一定的价值，但仍无法彻底改变食管癌疾病的预后。作者也仅仅选用了食管癌中的鳞癌细胞株作研究，还不能代表食管癌所有病理类型，将进一步深入研究，以期能为食管癌的治疗提供更为有价值的理论基础。
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细胞生物学的意义篇9
[关键词]青光眼；小梁网细胞；内质网应激
[中图分类号]R775[文献标识码]a[文章编号]1673-7210（2016）01（c）-0114-04
expressionandclinicalsignificanceofGRp78inhumantrabecularmeshworkcells
CHaiFang1ZHUoYehong2YanGXinguang1
1.Departmentofophthalmology，Xi'anno.4HospitalophthalmicmedicalCenterofShaanxiprovinceGuangrenHospitalaffiliatedtoSchoolofmedicine，Xi'anJiaotongUniversity，Shaanxiprovince，Xi'an710004，China；2.ZhongshanophthalmicCenter，SunYat-SenUniversityStateKeyLaboratoryofophthalmology，Guangdongprovince，Guangzhou510060，China
[abstract]objectivetodetectproteinandmRnaexpressiondifferencesofGRp78inhumantrabecularmeshworkcellsofnormaleyes（ntm）andpoaGpatients（Gtm）invitro.methodsHumantrabecularmeshworkcellsfromntmandGtminvitroweredividedinto3groups：tunicamycin（tm）group，Staurosporine（StS）groupandcontrolgroup.Real-timeRt-pCRandwesternblotwereusedtodetecttheexpressionofmRnaandproteinofGRp78intrabecularmeshworkcellsafter6，24htreatment.ResultstheexpressionofGRp78inprimarycultureGtmcellswassignificantlylowerthanthatinntmcells，withstatisticallysignificantdifference（p<0.05）.tmcouldincreasetheexpressionofGRp78inntmandGtmcells，theexpressioninGtmcellswaslowerthanthatinntmcells，withstatisticallysignificantdifference（p<0.05）.theresponseofGtmcellsforStSwasbiggerthanntmcells.ConclusionGtmsshowedinsensitivityreactionswhenstimulatedwithinducerofendoplasmicreticulumstress，reducetheexpressionofGRp78，leadtotheincreasedsensitivityofGtmstodamagestimulus.GRp78mayplayacytoprotectiveroleintheapoptosisintrabecularmeshworkcellscausedbyendoplasmicreticulumstress.
[Keywords]Glaucoma；trabecularmeshworkcells；endoplasmicreticulumstress
青光眼为全球主要不可逆性致盲眼病，原发性开角型青光（primaryopen-angleglaucoma，poaG）是青光眼中的常见类型，其发病机制未明[1]。内质网应激（endoplasmicreticulumstress，eRS）是近年新崛起的青光眼发病机制研究热点。葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulatedprotein78，GRp78）作为eRS的关键伴侣蛋白，其高表达是细胞对病理应激的重要防御机制之一[2-3]。近几年国内外广泛开展针对GRp78的作用机制研究，提出2型糖尿病、肿瘤患者细胞内GRp78呈高表达[4-6]。同时研究表明，GRp78对敏感神经元、缺氧晚期心脏组织具有保护作用，可抑制肝细胞内脂肪合成等[7-8]，其功能研究已引起生物学家们的广泛重视。本研究通过体外培养正常人小梁网细胞（ntm）及poaG患者小梁网细胞（Gtm），采用衣霉素（tunicamycin，tm）、十字孢碱（Staurosporine，StS）药物处理细胞，运用Real-timepCR、蛋白质印迹（westernblot）等方法检测GRp78mRna及蛋白的表达，发现Gtm细胞中GRp78表达下调，对eRS的反应能力下降，对损伤性刺激的敏感性增强，最终导致功能异常和细胞凋亡。现将结果报道如下：
1材料与方法
1.1药品与试剂
Dmem/F12培养基购于Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DmSo）、衣霉素（tunicamycin，tm）、十字孢碱（Staurosporine，StS）购于美国Sigma公司，逆转录试剂盒购于Fermentas公司，westernblot检测试剂盒购于CellSignaling公司。
1.2实验分组
收集健康供体及青光眼患者小梁网组织进行原代培养并进行传代[9]。将第3代小梁网细胞接种于25cm2培养瓶底，Dmem-F12培养液（含质量分数15%胎牛血清，60mg/L青霉素，100mg/L链霉索）培养。将ntm、Gtm细胞接种于培养瓶，待细胞完全融合后，分别加入含有1μmol/Ltm培养液、0.1μmol/LStS培养液和不含上述任何药物的培养液，分为tm组、StS组、对照组，每天换液，处理6～24h。采用Real-timepCR、westernblot方法检测药物处理6、24h后小梁网细胞中GRp78mRna及蛋白的表达。
1.3Rna提取和Rt-pCR
样品总Rna提取：培养瓶中加入trizol，吹打后移入离心管，振荡器混匀。加入氯仿，混匀、静置分层后，离心转上清于另一离心管中，加等体积异丙醇，离心后弃上清，加预冷的75%乙醇，再次离心后弃上清，ddH2o溶解沉淀。取Rna样品，检测Rna在230、260、280nm处的吸光度，确定其质量、浓度；再进行琼脂糖电泳，检测Rna完整性；依Fermentas逆转录试剂盒程序进行逆转录。将上述逆转录所得Dna进行扩增，得到目的片段，从而在mRna水平检测小梁网细胞GRp78的表达。采用Dna琼脂糖凝胶电泳，用四星图像分析系统对凝胶各泳道中的目的条带和内参条带进行光密度扫描，定量分析。实验重复3次。
1.4westernblot检测
根据westernblot检测试剂盒说明提取细胞膜蛋白进行10%聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，依次将maker、各蛋白样品加入梳孔内，maker上样量为5μL，其余每孔上样量为20μL（含总蛋白30μg），电压为恒压200V，待溴酚兰指示剂跑至分离胶下缘时，停止电泳，再经转膜、封闭，一抗、二抗封闭后进行曝光检测，最后再入定影液10min，清水漂洗，晾干。用四星图像分析系统对免疫印迹结果进行定量分析。
1.5统计学方法
应用SpSS16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；相关性分析用pearson检验；以p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1GRp78mRna在人眼小梁网细胞中的表达
结果显示，Gtm细胞GRp78mRna表达水平较ntm细胞低，经tm、StS药物处理后，表达差异仍有统计学意义（p<0.05）；tm处理后，ntm、Gtm细胞内GRp78mRna表达水平均上调，并且上调呈时间依赖性，最高表达量出现在tm刺激24h后；StS处理细胞后，ntm细胞内GRp78mRna表达水平在6、24h均上调，而Gtm细胞内GRp78mRna表达水平在6h上调，24h下调。tm、StS药物处理后，细胞内GRp78表达变化量与对照组比较差异均有统计学意义（p<0.05）。见表1、图1。
表1各组GRp78mRna相对表达量比较（x±s）
注：与ntm比较，*p<0.05，与对照组比较，#p<0.05；tm：衣霉素；StS：十字孢碱；ntm：正常人小梁网细胞；Gtm：患者小梁网细胞
2.2GRp78蛋白在人眼小梁细胞中的表达
结果显示，各组小梁细胞均有GRp78蛋白表达，Gtm较ntm细胞表达水平低，经tm、StS药物作用24h后Gtm细胞GRp78蛋白的表达量明显较ntm细胞低（p<0.05）；tm处理细胞后，ntm、Gtm细胞内GRp78蛋白表达量均上调，并且呈时间依赖性，最高表达量出现在tm刺激24h；StS处理细胞后，ntm细胞内GRp78蛋白在药物处理6h时上调，在药物处理24h时下调；而Gtm细胞内GRp78蛋白表达量均下调，下调量在StS刺激细胞24h时表达最明显。tm、StS药物处理细胞后，GRp78蛋白表达变化量与对照组比较差异均有统计学意义（p<0.05）。见表2、图2～3。
表2各组GRp78蛋白相对表达量比较（x±s）
注：与ntm比较，*p<0.05，与对照组比较，#p<0.05；tm：衣霉素；StS：十字孢碱；ntm：正常人小梁网细胞；Gtm：患者小梁网细胞
3讨论
poaG占所有青光眼的85%～90%，小梁网部位房水外流阻力增大所造成的病理性眼压升高是引起青光眼视神经损害的重要原因。小梁网细胞的丢失势必影响小梁网的结构和功能，从而影响房水流出的效率，因而关于小梁网细胞凋亡的研究已成为探索开角型青光眼发病机制和治疗手段的有效方法之一[10-12]。
eRS是细胞内质网稳定失衡、生理功能发生紊乱时，细胞为维持细胞内环境稳定而保持细胞生存启动的自我保护反应机制[13-15]。eRS可促进内质网腔中未折叠或错误折叠蛋白质的加工处理，通过减少新生蛋白质、降解未折叠蛋白及维持细胞内钙的平衡，从而促进细胞内环境稳态的恢复，保持细胞的正常功能和维持细胞存活。当eRS过强过久时可启动凋亡通路引发细胞功能异常，最终导致细胞死亡；当eRS能力低下时，有效的细胞保护机制减少，细胞对损伤性刺激因素的敏感性增加而导致或加速细胞的死亡[16-17]。
GRp78位于真核生物细胞的内质网膜上，与热休克蛋白70（Hsp70）家族具有高度同源性，被认为是Hsp70家族的成员之一。GRp78的表达变化被认为是eRS未折叠蛋白质反应的标志；在低糖、低氧、低Ca2+等应激反应调节时其基因的转录活性可提高10～25倍，表达量显著增高，从而维持了内质网钙稳态及内环境的稳定。因此，近年来认为细胞受刺激时GRp78呈高表达并合成GRp78的反应，可能是细胞的一种重要防御机制，该机制对细胞有保护作用从而延长在各种不利因素刺激下的细胞生存期[18-20]。然而，本研究通过Real-timepCR、westernblot检测在ntm细胞及Gtm细胞内GRp78mRna及蛋白的表达，结果显示各组小梁网细胞均有GRp78表达，GRp78在Gtm细胞内的表达水平较ntm细胞表达水平低。
tm是细胞产生eRS的诱发因素。为了进一步证实Gtm细胞内GRp78表达下调是由于细胞对eRS反应能力低下，本研究给予tm药物处理，结果显示：ntm、Gtm细胞经tm处理后，GRp78mRna及蛋白质表达量显著增加；Gtm细胞GRp78表达水平的增加量明显低于ntm。该结果表明ntm及Gtm细胞在eRS刺激下均能产生相应的应激反应，然而，后者对eRS刺激的反应能力明显低于前者。
StS以0.1μmol/L的浓度培养细胞6～24h，结果显示：ntm、Gtm细胞内GRp78蛋白表达量均下调；Gtm细胞GRp78表达下调明显大于ntm。以上结果提示，Gtm细胞由于保护性GRp78蛋白下调，细胞内促生存因素下降，自身内质网防御功能被破坏，进而导致细胞对凋亡刺激敏感性增大。
目前的研究已经明确了GRp78的生物学特性和细胞保护作用，GRp78的表达多少对决定应激细胞的结局，如抵抗、适应、损伤或凋亡等有重要作用，所以这方面的研究无论在科学理论还是在应用前景上都具有重大意义。本实验结果显示，Gtm细胞内GRp78表达下降且对eRS的反应低下，表明其防御体系被破坏，增加了细胞对损伤性刺激的敏感性，可能加速或导致小梁细胞的死亡，为poaG的后期干预治疗提供了有效靶点。
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细胞生物学的意义篇10
[关键词]食管肿瘤；细胞周期；核增殖抗原；生长激素，人
[中图分类号]R735.2；R969 [文献标识码]a[文章编号]1671―7562(2007)05―0370―05
生长激素(growthhormone，GH)具有直接的代谢调理作用，能促进蛋白质合成，维持氮平衡，增加脂肪氧化分解和糖异生。近年来，重组人生长激素(recom-binanthumangrowthhormone，rhGH)已经在改善高分解代谢状态患者的营养状况、纠正负氮平衡方面得到广泛应用。鉴于其可能的促增殖作用，rhGH尚未能够在恶性肿瘤高分解代谢状态患者的治疗中得到应用。本实验旨在通过体外细胞培养观察rhGH对人低分化食管鳞癌细胞株eC109生长的影响，初步探讨rhGH的肿瘤相关安全性。
1 材料与方法
1．1 主要试剂
人低分化食管鳞癌细胞株eC109购自上海中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，rhGH为瑞士雪兰诺大药厂馈赠的思真(saizen)，奈达铂(nDp)为南京东捷药业有限公司馈赠的捷佰舒，Rpmi1640培养液(美国GiBCo公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，mtt(amresco公司)，二甲亚砜(Dm-So，SiGma公司)，酶联免疫检测仪(Bio-RaD550，美国伯乐公司)，流式细胞仪(FaCScalibur型，美国BD公司)，Ki-67抗体、即用型Sp免疫组化试剂盒及DaB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术公司。
1．2 实验分组
本实验共分为4组，分别为对照组(等体积Rpmi1640培养液)、奈达铂(nDp40mg-L-1)组、rhGH组和rhGH+nDp组，后两组根据rhGH浓度不同分为rh-GHi、rhGH2、rhGH3、rhGH44个亚组，rhGH浓度依次为50、100、200及400ng-ml-1。
1．3细胞培养
eC109细胞在含10％小牛血清的Rpmi1640完全培养液(含青霉素100u・ml-1，链霉素100u・ml-1)中，于37℃含体积分数为5％Co2、95％空气的培养箱中培养。取对数生长期细胞用0.25％胰蛋白酶1～2ml(50ml培养瓶)消化，用4g・L-1苔盼蓝染色后计算细胞存活率，细胞存活率达99％时进行细胞计数，调整细胞悬液浓度至1×105个・ml-1备用。
1．4 mtt比色法检测癌细胞活性
将单细胞悬液接种于96孔板，200μl・孔-1，每组设3个复孔。24h细胞完全贴壁后吸出各大孔培养液，加入受试药物，置于培养箱中培养48h以检测各组细胞抑制率，另用同样方法培养0、24、48、72h以绘制细胞生长曲线。实验终止前4h加入mtY液20μl・孔-1(终浓度为5mg・ml-1)，实验结束后倾去药液及培养液，每孔加入150μlDmSo，平板震荡仪震荡10min，用酶联免疫检测仪于570nm波长处测定各孔吸光度oD值。然后按下式计算细胞抑制率和生长率：抑制率=(1-实验组平均oD值／对照组平均oD值)×100％，生存率=实验组平均oD值／对照组平均oD值×100％。
1．5 流式细胞术检测各组细胞周期及细胞增殖指数(pi)
各组细胞培养24h后，用0.25％胰酶1-2ml(50ml培养瓶)消化，完全培养液终止消化、吹打后离心，然后加入pBS冲洗、离心，反复2次，获取细胞，细胞浓度高于1×106个・ml-1。将收集的标本荧光素(碘化丙锭)染色20min，用激发波长为488nm，接收波长为575nm的流式细胞仪行细胞周期分析。根据细胞周期分析结果计算pi，pi=(S期细胞数+G2～m期细胞数)／(G0～G1期细胞数+S期细胞数+G2～m期细胞数)×100％。
1．6 免疫细胞化学检测各组细胞核增殖抗原Ki-67表达
将经酸处理的盖玻片放入24孔养板，取对数生长期的细胞消化后接种至24孔板中，细胞悬液浓度为l×105个・ml-1，每孔加入500μl，培养24h，待细胞在盖玻片上贴壁生长后吸去培养液，加入各组受试药物，培养48h取出玻片。pBS冲洗2次浸入冷丙酮中固定10min，每张玻片pBS冲洗3次后加入50μl3％H2o2，室温15min；pBS冲洗3次后加入50μl正常鼠血清工作液，室温30min，将玻片上鼠血清工作液倾去，玻片不洗；加入50μl的一抗(Ki-67抗体)，4℃过夜；pBS冲洗3次后每张玻片加入50μl生物素标记的二抗工作液，37℃孵育30min；pBS冲洗3次后加人50μl辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液，37℃孵育30min；冲洗后DaB显色，苏木素复染，中性树胶封片。根据阳性细胞着色面积和着色强度积分，应用image-proplus4.5图像分析软件进行分析，每组选取10个高倍镜视野，用平均光密度值(ioD)表示Ki-67相对表达量。
1．7 统计学处理
所有资料均用SpSS13.0统计软件进行统计学分析。数据用x±s表示，计量资料的组间比较采用单因素方差分析，p
2 结果
2．1细胞抑制率及细胞生长曲线
2．1．1细胞抑制率。rhGH组与对照组、rhGH+nDp组与nDp组、rhGH组内及rhGH+nDp组内比较细胞抑制率和生存率差异均无统计学意义(均p>0.05)；rhGH+nDp组、nDp组与对照组比较细胞生长抑制率明显增加，生存率明显下降(均p
2．1．2 细胞生长曲线。对照组与rhGH组比较生长曲线无明显变化，各rhGH组间、各rhGH+nDp组间生长曲线比较亦无明显变化；而对照组与nDp和rhGH+nDp组比较其生长曲线明显抬高，见图1、2。
2．2 细胞周期和pi
各组细胞培养24h后，rhGH+nDp组与nDp组细胞周期发生明显变化。rhGH+nDp组、nDp组与对照组比较，G0～G1期细胞增殖百分数明显增加，而S期细胞增殖百分数及pi明显下降(p
2．3 Ki-67表达强度
Ki-67以细胞核呈棕黄色或细胞核、细胞浆同时呈棕黄色为阳性，以单纯的细胞浆着色而细胞核无着色或细胞核、细胞浆均无着色为阴性。rhGH组与对照组比较Ki-67表达差异无统计学意义(p>0.05)；rhGH2组与rhGH3组、rhGH2+nDp组与rhGH3+nDp组比较Ki-67表达强度差异亦无统计学意义(p>0.05)；而nDp组、rhGH+nDp组与对照组比较其Ki-67表达强度差异有统计学意义(p
3 讨论
生长激素具有直接的代谢调理作用，能促进蛋白质合成，减少蛋白质分解，维持氮平衡；增加脂肪氧化分解，增加糖异生，提高糖利用，提高营养物质的转换率；能提高1，25(oH)2D3水平，增加肠道对钙、磷吸收和增强免疫防御功能。目前rhGH主要应用于侏儒症、慢性肝病、turner综合征、慢性肾衰、烧伤、大手术后恢复和不育症等方面。恶性肿瘤患者大多存在不同程度的营养不良，晚期常发展成恶病质，全胃肠外营养(tpn)的应用虽然在一定程度上缓解了患者的营养不良状况，但不能使大多数接受抗肿瘤治疗的患者从中获益。而GH作为营养调节剂具有明显的促进蛋白质合成作用，二者合用能迅速纠正负氮平衡，改善营养状况，提高机体的细胞免疫和体液免疫功能，使患者能耐受各种抗肿瘤治疗。
由于rhGH可能会促进肿瘤细胞增殖分裂，使得肿瘤患者能否应用rhGH至今仍存在争议。Snibson等研究发现GH转基因小鼠中高表达的GH通过刺激肿瘤细胞增殖，可协同性地促进致癌物诱导的肝癌形成。ergun-Longmire等对缺乏GH的肿瘤患儿给予GH治疗，经随访发现，治疗组患者患二次肿瘤的风险高于未治疗组。Fiebig等发现体外实验中生长激素对七种不同人肿瘤细胞(结肠、胃、肺、乳腺、黑色素瘤、卵巢和前列腺癌)无显著的促增殖分裂作用。石毅等研究显示GH对人胰腺癌实体瘤无明显促生长的作用。已有的临床病例分析认为，GH的应用不会增加肿瘤复发或二次肿瘤的危险性，说明肿瘤患者使用GH是安全的。但该类研究大多肿瘤类型单一，随访时间不够长，有待更广泛、长期的临床研究。
Ki-67是全面反映细胞群体活性的良好标记物，它比增殖细胞核抗原(pCna)更为直接地反映细胞的增殖情况，它可以识别除G0期以外处于其他增殖周期的细胞，用于判断细胞的增殖活性。本实验通过使用免疫细胞化学的方法比较不同组间Ki-67表达差别，间接反映rhGH是否对食管癌细胞具有促增殖作用。
nDp名为顺式-乙醇酸-二氨合铂，是日本盐野义制药公司开发的新一代铂类注射制剂，1995年6月在日本获准上市。它的英文名字为ne-daplatin，商品名为nedaplait、aqupla，因为其易溶于水(aqua)和铂类(platin)化合物而命名。nDp对头颈部肿瘤、肺癌、食管癌、宫颈癌等均有明显作用，其中对食管癌的有效率超过40％；毒副作用小，胃肠道、肾毒性、耳毒性、神经毒性低；与顺铂、卡铂无完全交叉耐药性。因此，nDp是一种广谱、高效、低毒的新一代铂类抗肿瘤新药。
本实验通过体外药物浓度筛选得出nDp对该细胞株的iC50约为40μg・ml-1。rhGH体外实验的浓度，大多数文献报道用量为50ng・ml-1或100ng・ml-1。根据临床应用状况我们设置了200ng・ml-1次高浓度及400ng・ml-1高浓度组。本研究结果显示，rhGH组与对照组、rhGH+nDp组与nDp组比较在细胞抑制率、细胞周期中各期细胞数量和pi差异及Ki-67表达水平差异均无统计学意义(p>0.D5)，提示rhGH对体外培养的食管癌细胞无促进增殖的作用。
rhGH的作用机制从受体学说来看，GH通过与生长激素受体(growthhormonereceptor，GHR)结合后才能产生各种生物学效应，结合后通过一系列信号通路刺激胰岛素样生长因子-1(insulinlikegrowthfactor-1，iGF-1)的合成，从而形成GH-iGF轴。生长激素绝大部分是通过GH-iGF轴发挥作用的，但其本身也可与组织的生长激素受体结合直接产生iGF非依赖的促细胞生长的作用。
众多研究都表明在正常组织和肿瘤组织中，GHR的表达存在着不同程度的异常，这些异常和肿瘤的发生、发展及转移都有着密切关系。另外，GH与催乳素受体(pRLR)关系密切，GHR和pRLR都属于细胞因子受体超家族。GH和pRL有各自的受体，但灵长类动物GH也可以作用于pRLR并发挥作用。因此，在研究GH的作用时很难区分是GHR介导的还是pRLR介导的。