细胞实验方案篇1
【关键词】间变性大细胞淋巴瘤（又称恶性组织细胞病）药物疗效
1资料与方法
1.1临床资料25例均为该院的门诊和住院患者，其中男14例，女11例，20-71岁，平均52岁。首发症状发热占90%以上，肝脏肿大14例，脾脏肿大9例浅表淋巴结肿大2例。
1.2实验室检查①血常规：采用血细胞分析仪检查，并用手工法复查。②骨髓细胞学检查：骨髓取自髂骨或胸骨，常规涂片染色。③单克隆抗体免疫学分型：采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（apaap）免疫组化法测定。应用的单克隆抗体有（CD3、CD5、CD7，CD38、CD23、CD14、CD15、CD19、CD20、HLa-DR）等。
1.3治疗方法患者确诊后即采用CHop方案化疗，具体方法如下，环磷酰胺（CtX）400mg/㎡，阿霉素（adr）或表阿霉素（epi）25mg/㎡，长春新碱（VCR）1.4mg/㎡，均静脉滴注，强的松1mg(kg·d)，口服1-5天。如有效，间隔半月后重复，每21天为一疗程。同时常规加强支持治疗，如输血，应用抗生素控制感染等。
1.4疗效评价[1]完全缓解（CR）：症状及不正常体征均消失，血象Hb≥100g/L，wBC≥4.0*109/L，血小板≥100*109/L，骨髓涂片找不到异常组织细胞；部分缓解（pR）：自觉症状基本消失，体温下降或稳定一段时间，肿大的肝脾淋巴结明显缩小，血象接近正常但未达到CR标准，骨髓涂片中异常组织细胞和血细胞被吞噬现象基本消失或只有极少量。
2结果
2.1血常规检查发现wBC减少14例，血小板减少16例，贫血患者8例，三系均减少9例，但随着疾病的发展全部患者表现为全血细胞减少。多数患者的中性粒细胞nap积分减低，但合并感染者可增高。肝功能异常13例。
2.2组织细胞形态学检查多呈恶性形态，少见嗜血细胞现象。细胞双核或多核，形态不规则，胞浆着色较深，与反应性组织细胞增多症组织细胞的形态学有明显区别。
2.3免疫学表型25例患者表达t细胞标记18例，免疫表型为CD5、CD38、CD37等，7例患者表达CD14标记，而t、B淋巴细胞标记却为阴性。
2.4临床疗效25例患者中，CR4例，pR15例，无效（死亡）6例，总有效率（CR+pR）为76%。在有效病例中，最明显的指标为高热消退，绝大多数病例均在应用CHop方案次日后，体温逐渐降至正常，随后肿大的肝脾淋巴结也开始缩小，黄疸逐渐消退，近期疗效明显。25例患者中，除早期死亡的6例外，余19例存活时间均超过3个月，3例至今已分别存活40个月及30个月，占有效病例的15.8%。
2.5副作用CHop方案的副作用与其他化疗方案一样，主要为消化道反应及白细胞与血小板减少，未见明显毒副作用。
3讨论
mH是一种病理上以恶性组织细胞异常增生，临床上以持续性高热、进行性衰竭，肝脾淋巴结肿大，全血细胞先后或同时减少，并侵及多器官系统为特点的高度恶性疾病。本组患者多以高热发病，表现为两系或三系血细胞减少，严重的肝功能损害多出现在疾病的晚期，虽然在恶组患者nap积分减低，但合并感染时nap积分可以升高，应加以注意。血细胞吞噬现象虽然多见于反应性组织细胞增多症，但在部分mH患者也可以出现。mH细胞在形态上多表现为多核或双核，形态不规则，胞浆着色较深，与反应性组织细胞增多症组织细胞的形态学有明显区别。
2001年wHo造血和淋巴组织肿瘤分类方案中，将“恶组”主要归类为间变性大细胞淋巴瘤。CHop方案为治疗淋巴瘤的经典方案。在本研究中，对诊断为mH的患者也采用了此方案治疗，取得了明显的临床疗效。近期有效率为76%，表明CHop方案治疗mH的有效性。
mH是临床预后极差的一种疾病。临床诊断时一定要结合临床表现，实验室检查，疾病进程，骨髓穿刺及髓外浸润部位穿刺液的细胞学检查是非常必要的，一旦确诊，应尽早应用CHop方案化疗，以减轻临床症状及延长病人生存期。
细胞实验方案篇2
【摘要】目的观察粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒-巨噬细胞集落刺激因子（Gm-CSF）单独、同时或序贯联合应用动员小鼠外周造血干细胞时，外周血t细胞亚群的变化。方法72只BaLB/c小鼠随机分成a、B、C、D、e、对照组6组，皮下注射：a组，重组人（rh）G-CSF400μg·kg-1·d-1；B组，rhGm-CSF400μg·kg-1·d-1；C组，rhG-CSF200μg·kg-1·d-1+rhGm-CSF200μg·kg-1·d-1；D组，rhGm-CSF400μg·kg-1·d-1（前3天）＋rhG-CSF400μg·kg-1·d-1（后2天）；e组，rhG-CSF400μg·kg-1·d-1（前3天）＋rhGm-CSF400μg·kg-1·d-1（后2天）；对照组，生理盐水0.2ml，连续注射5天。动态观察外周血白细胞计数，同时通过流式细胞仪测定外周血t细胞亚群的变化。结果rhG-CSF与rhGm-CSF联合方案动员外周血白细胞计数较高；动员后各实验组CD+3细胞、CD+3CD+8细胞、CD+3CD-4CD-8细胞增加，CD+3CD+4/CD+3CD+8比值下降，Gm-CSF明显提高了CD+3CD-4CD-8细胞比例。结论G-CSF和Gm-CSF动员小鼠外周血造血干／祖细胞过程中对t淋巴细胞亚群的数量和比例有一定的影响，其可能有免疫调节作用。
【关键词】外周血干细胞动员粒细胞集落刺激因子粒-巨噬细胞集落刺激因子t淋巴细胞亚群
abstract：objectivetoobservethechangesoftcellsubsetsintheperipheralbloodofmiceafterthemobilizationofhematopoieticstemcellswithgranulocytecolonystimulatingfactor（G-CSF）andgranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactors（Gm-CSF）givenalone，concurrently，orinsequentialcombination.methods72BaLB/cmicewerepidedinto6groups（n=12each）:groupsa，B，C，D，e，andthecontrolgrouptoproceedwiththefollowingregimensformobilizationrespectively:groupa.rhG-CSF400μg·kg-1·d-1alone;B.rhGm-CSF400μg·kg-1·d-1alone;C.concurrentcombinationofrhG-CSF200μg·kg-1·d-1andrhGm-CSF200μg·kg-1·d-1;D.sequentialcombinationofrhGm-CSF400μg·kg-1·d-1for3daysfollowedbyrhG-CSF400μg·kg-1·d-1for2days;e.sequentialcombinationofrhG-CSF400μg·kg-1·d-1for3daysfollowedbyrhGm-CSF400μg·kg-1·d-1for2days;andcontrolgroup.subcutaneoussaline0.2mlfor5successivedays.thewhitebloodcells（wBC）werecountedundermicroscope;thepercentilechangesoftcellsubsetswereassayedbyflowcytometryatserialtimepoints.ResultstheyieldsofwBCweresignificantlyhigherafterthecombineduseofG-CSFandGm-CSFformobilizationthanthoseaftertheuseofrhG-CSForrhGm-CSFalone.Comparedwiththatinthecontrolgroup，thepercentagesofCD+3，CD+3CD+8andCD+3CD-4CD-8tcellswereallincreased，andtheratioofCD+3CD+4/CD+3CD+8wasreducedintheexperimentgroups.theuseofGm-CSFcausedmarkedincreaseintheproportionofCD+3CD-4CD-8.Conclusionintheprocessofmobilizationofhematopoieticstemcells，G-CSFandGm-CSFwillalterthenumberandtheproportionoftcellsubsets，possiblythroughanimmunoregulatoryfunction.
Keywords:mobilization;granulocytecolonystimulatingfactor;granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor;tlymphocytesubsets
近年来外周血干细胞移植（pBSCt）技术正越来越多地应用于恶性肿瘤尤其是恶性血液病的治疗。与异基因骨髓移植（allo-Bmt）相比，异基因外周血干细胞移植（allo-pBSCt）后造血重建和免疫重建速度均较快，虽然allo-pBSCt输注的移植物中淋巴细胞数量显著高于allo-Bmt，但急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发病率并没有明显增加，而移植物抗肿瘤（GVt）效应则有所增强，无病生存率提高［1~3］。目前，allo-pBSCt多采用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒-巨噬细胞集落刺激因子（Gm-CSF）的动员方案，因此人们除了重视G-CSF和Gm-CSF的动员效应以外，也日益重视其在干细胞动员过程中对免疫细胞的作用。我们在比较G-CSF和Gm-CSF单独、联合应用动员小鼠外周血造血干细胞效果的同时，对t淋巴细胞亚群的变化进行了初步研究，现报道如下。
1材料和方法
1.1实验动物BaLB/c小鼠72只，雌雄各半，体重18～22g，为清洁级近交系小鼠，鼠龄10～14周，购自徐州医学院实验动物中心，按清洁级标准饲养。
1.2主要药品试剂和仪器重组人（rh）G-CSF购自杭州九源基因工程有限公司；rhGm-CSF购自厦门特宝生物工程有限公司；CD45-pC5、CD34-pe、CD38-FitC单抗购自BD公司；培养基imDm购自Hyclone公司；流式细胞仪（BeCtonDiCKinGon公司）；Co2培养箱（FoRma公司）。
1.3分组与给药方法BaLB/c小鼠72只，随机分成6组，每组12只。a组：rhG-CSF400μg·kg-1·d-1；B组：rhGm-CSF400μg·kg-1·d-1；C组：rhG-CSF200μg·kg-1·d-1+rhGm-CSF200μg·kg-1·d-1，a、B、C各组连续皮下注射5天。D组：前3天皮下注射rhGm-CSF400μg·kg-1·d-1，后2天皮下注射rhG-CSF400μg·kg-1·d-1；e组：前3天皮下注射rhG-CSF400μg·kg-1·d-1，后2天皮下注射rhGm-CSF400μg·kg-1·d-1；对照组：连续5天皮下注射生理盐水0.2ml。
1.4检测指标
1.4.1外周血白细胞计数分别于0~6天连续取小鼠尾静脉血5μl，加入预先配置的3%的稀盐酸中，混匀后，利用细胞计数板在显微镜下进行白细胞计数。
1.4.2外周血t淋巴细胞亚群检测3~6天取小鼠尾静脉血50μl，加入CD4-Cy单抗5μl，CD8-pe单抗5μl，CD3-FitC单抗5μl混匀，室温下避光20min进行单抗标记，加入2ml溶血素后避光8min，pBS洗涤2次，1000r/min离心2min，即上机测定。用流式细胞仪（FCm）检测CD+3细胞、CD+3CD+4细胞、CD+3CD+8细胞、CD+3CD-4CD-8细胞、CD+3CD+4细胞和CD+3CD+8细胞比例。
1.5统计学处理所有数据应用SpSS11.0软件进行数据处理，采用方差分析和t检验。
2结果
2.1动员前后小鼠外周血白细胞的变化除对照组外，各实验组在注射后24h白细胞升高幅度最大，随用药时间延长白细胞数进一步升高，各组均在第5天达高峰，明显高于对照组和用药前（p﹤0.01）。第5天达高峰时，a、C、D、e各组白细胞数均显著高于B组（p﹤0.01），而a、C、D、e各组间相比较无显著性差异（p﹥0.05），动员剂停用后24h各实验组白细胞数均开始下降。提示单用G-CSF或G-CSF与Gm-CSF联合的动员方案较单用Gm-CSF组白细胞升高更明显（表1）。表1不同动员方案各时间点外周血白细胞计数
2.2动员前后外周血t细胞亚群变化动员第5天，白细胞升高达高峰时，各实验组外周血CD+3细胞比例均显著高于对照组（p﹤0.001），各实验组间对比CD+3细胞比例无显著性差异（p﹥0.05）。CD+3CD+4细胞、CD+3CD+4CD+8细胞比例，各实验组与对照组相比无明显差异（p﹥0.05）。外周血CD+3CD+8细胞比例，各实验组明显高于对照组（p﹤0.05），各实验组间比较CD+3CD+8细胞比例无显著性差异（p﹥0.05）。动员高峰期各实验组CD+3CD+4/CD+3CD+8比值较对照组（p﹤0.05）降低，各实验组间无显著性差异（p﹥0.05）。a、B、C、D、e各实验组CD+3CD-4CD-8细胞比例在动员高峰期明显高于对照组（p﹤0.001），CD+3CD-4CD-8细胞增高顺序依次为实验B组﹥D组﹥C组﹥e组﹥a组。提示：动员后CD3+细胞、CD3+CD8+细胞增加，CD4+/CD8+比值下降，各实验组间无显著差异。CD+3CD-4CD-8细胞比例增高以单用Gm-CSF组最高，单用G-CSF组最低（表2）。表2不同动员方案各时间点外周血t细胞亚群变化
3讨论
t淋巴细胞亚群在移植免疫中发挥着重要作用，异基因造血干细胞移植（allo-HSCt）后的aGVHD及自体造血干细胞移植后免疫功能的恢复均与其密切相关。已有研究发现经G-CSF和Gm-CSF动员pBSC的过程中t细胞亚群的比例、数量产生了相应的变化，如th0向th2、tc2细胞分化，而th2、tc2亚群比例增高，th1、tc1亚群降低，从而导致allo-pBSCt后GVt作用增强，aGVHD发生率及严重程度并未增多，而慢性GVHD的发生有增高趋势［1~5］。我们的实验结果显示在G-CSF和Gm-CSF动员pBSC的过程中，随着白细胞计数的增高，不同的动员方案对t淋巴细胞亚群产生了不同影响。
在稳定的生理状态下，存在于骨髓中的免疫细胞为较不成熟的免疫细胞，而外周血中存在的是成熟的、经过胸腺选择的并具有各种功能的效应细胞。研究发现，G-CSF动员后引起t细胞黏附分子L-选择素的表达降低，从而阻碍了t淋巴细胞穿越血管内皮细胞进入淋巴组织或其他血管周围组织，这样t细胞在血管循环池中发生积蓄而使得外周血t细胞数量在动员后大量升高［6-7］。大量动物实验发现，G-CSF动员能够极化t细胞所分泌的细胞因子，使t淋巴细胞亚群发生变化，iL-4、iL-6、iL-10等Ⅱ类细胞因子分泌增加，而促发GVHD发生的iL-2、tnF-α、iFn-γ等Ⅰ类细胞因子分泌减少，aGVHD的发生率和严重程度降低［4-5，8］。本实验结果表明，细胞因子在动员小鼠pBSC的同时，改变了小鼠外周血t淋巴细胞的数量及比例，各实验组CD+3细胞、CD+3CD+8细胞比例明显高于对照组，CD+3CD+4/CD+3CD+8比值低于对照组，初步提示免疫应答的负调节占优势，具体的免疫调节机制需进一步分析CD+3CD+4、CD+3CD+8细胞分别向th1、th2、tc1、tc2分化的能力。
转贴于
在t淋巴细胞的分化过程中，最先出现的是CD+3CD-4CD-8细胞，在经过胸腺的过程中进行阳性选择及阴性选择后，细胞表达CD+3CD+4CD+8，当此种细胞经过胸腺髓质的过程中，CD+3CD+4CD+8细胞进一步分化为CD+3CD+4细胞和CD+3CD+8细胞，进入外周血循环并执行其生理功能。研究结果显示，在G-CSF/Gm-CSF动员小鼠pBSC的同时，CD+3CD-4CD-8细胞在外周血的比例明显增高。CD+3CD-4CD-8细胞为外周血成熟t细胞的前体细胞，动员后明显上升，说明t淋巴细胞与造血干细胞迁移具有较好的一致性。CD+3CD-4CD-8细胞又称为自然抑制细胞，能够抑制混合淋巴细胞反应中的增殖反应并可抑制CD+3CD+4、CD+3CD+8细胞对异体细胞的细胞毒作用，从而降低了allo-pBSCt后aGVHD的发生率［9-10］。亦有研究发现CD+3CD-4CD-8细胞是通过抑制CD+3CD+8细胞的活化、增殖，并通过Fas-FasL途径破坏已激活的CD+3CD+8细胞、CD+3CD+4细胞而实现免疫抑制作用［11~13］。因此，细胞因子动员后CD+3CD-4CD-8细胞的过度表达可能有利于抑制aGVHD，对t细胞增殖、分化功能的改变起着协同作用。从不同动员方案CD+3CD-4CD-8细胞数量变化中也说明Gm-CSF或Gm-CSF与G-CSF联合的方案较单用G-CSF方案有可能降低GVHD发生，促进细胞免疫功能发挥。基于此，目前国内在进行非血缘或半相合allo-HSCt时已将G-CSF/Gm-CSF动员后的骨髓＋外周血造血干细胞作为移植物可减轻GVHD的发生而保留GVt效应并取得了较好的移植效果［14］。
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细胞实验方案篇3
生物教学自主探究互动模式
《生物课程标准》提出：要培养学生不断获取和运用生物学知识的自学能力；培养学生观察能力、实验能力和思维能力；培养学生的探究能力和科学素质。为落实新一轮课程改革，体现新教材教学理念，适应社会发展对人才的要求，应在中学生物教学中构建自主探究教学模式。
一、自主探究教学模式实施的过程
1.情境导入
教师用生活中学生熟悉的例子导入：
（1）当你把白菜剁碎准备做馅时，常常要放一些盐，稍等一会儿就会就可见到有水分渗出，这些水分是从哪里来的？
（2）萎蔫了的青菜叶放入清水中浸泡一段时间后，又重新恢复了硬挺，如何解释？
（3）对农作物施肥过多，会造成“烧苗”现象，为什么？学生们踊跃发言，纷纷说出是植物细胞吸水或失水引起的，自然而然地进入本节课的学习。
2.质疑思考
在细胞的吸水和失水问题上，为什么植物细胞会吸水和失水？是通过什么结构来实现的？这就需要探究活动来解决了，进而引导学生进入探究。
3.探究建构
（1）提出问题
让学生结合上面的例子，再提出想探究的问题，确定本小组要探究的问题，将问题用文字表达出来，并简要说明与该问题有关的背景知识。学生可以根据对植物细胞的结构的认识和渗透实验提出这样的问题：“植物细胞的原生质层相当于一层半透膜吗？”
（2）作出假设
根据已有的知识和生活经验，对提出的问题作出假设，并说明作出假设的依据。学生作出的假设是：“植物细胞的原生质层相当于一层半透膜”。理由是植物细胞膜和液泡膜都是生物膜，它们具有与红细胞的细胞膜基本相同的化学组成和结构；做菜馅时因为放了盐，菜中的水分大量流出，这与红细胞失水很相似。
（3）设计实验
假设是否正确，还需要用实验来检验。学生从实验材料用具、方法步骤几方面自主设计实验方案，各小组完成设计方案后，教师组织全班进行交流，各组根据讨论意见完善自己的设计方案。如某组学生的设计方案如下：
材料用具：紫色洋葱鳞片叶、刀片、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸、显微镜、质量浓度为0.3g/ml的蔗糖溶液、清水。
方法步骤：
①制作洋葱鳞片叶外表皮的临时装片。
②用低倍显微镜观察洋葱鳞片叶表皮细胞中紫色的中央液泡的大小，以及原生质层的位置。
③从盖玻片的一侧滴入蔗糖溶液，在另一侧用吸水纸吸引。这样重复几次，盖玻片下面的洋葱鳞片叶表皮就浸润在蔗糖溶液中。
④用低倍显微镜观察，看细胞的中央液泡是否逐渐变小？原生质层在什么位置？细胞大小是否变化？
⑤从盖玻片的一侧滴入清水，在另一侧用吸水纸吸引。这样重复几次，盖玻片下面的洋葱鳞片叶表皮就浸润在清水中。
⑥用低倍显微镜观察，看中央液泡是否逐渐变大？原生质层在什么位置？细胞大小是否变化？
设计出实验方案后，教师要指导学生对实验结果作出预期。
（4）进行实验
学生分组进行实验，仔细观察，认真记录，将实验结果填入表格。
（5）得出结论
各小组对自己组的实验结果进行分析，得出结论。在0.3g/ml蔗糖溶液中植物细胞的中央液泡会变小，发生质壁分离，细胞大小基本不变；在清水中植物细胞的中央液泡会变大，发生质壁分离复原，细胞大小基本不变；水分子可以自由透过原生质层，而蔗糖分子则不能。因此得出结论：植物细胞的原生质层相当于一层半透膜。
（6）表达与交流
学生分组派代表向全班同学汇报本组的探究方案、实施过程、探究结果以及获得的经验和教训，共享成果。某小组发言时，其他组可以提问或提出建议。如全班学生围绕“若开始使用0.8g/ml的蔗糖溶液，很快就观察到了质壁分离，但后来加清水怎么也不能使细胞发生质壁分离复原，如何解释？”进行讨论和交流，得出因为蔗糖浓度过高，导致细胞失水过快而死了。从而加深对“质壁分离和质壁分离复原是活细胞的重要特征”的理解。
4.深化迁移
本节内容的教学完成后，让学生利用植物细胞质壁分离和复原的原理，思考：如何测定洋葱鳞片叶表皮细胞液的浓度？实现学生知识向能力的迁移。
二、生物教学中自主探究教学模式实施的思考
通过自主探究，学生主动获取知识，体验知识形成过程，学生的科学素养和学习能力得到了提高。但从实际教学活动来看，“自主探究”教学模式在生物教学中的实施还面临着一些困难，主要体现在以下几个方面：
1.教学时间问题
教学中大量的课堂讨论、实验探究、理论探索需要很多时间，也就是现在的2节课时间比较好。另外，在保证教学进度的前提下，正常的课时量，也不允许经常搞探究教学。建议将实验室对学生开放，利用课余时间引导学生进行实验探究，并将课外探究出现的问题和结果带入课堂进行讨论，这是解决课时问题的办法之一。
2.探究内容的选择问题
探究内容是教师组织和实施探究教学活动的主要依据。生物探究内容的选择应当遵循难度适中、激趣引题、易操作等基本原则，具体应注意以下几个方面：
（1）探究内容不能过于复杂，要与学生已有的知识经验相联系，符合学生的认知发展水平，是学生根据已有的知识和能力所能解决或基本解决的。当然也不能太容易，否则会因缺少悬念和挑战而失去探究的价值。
（2）探究内容的选择应尽量具有趣味性，做到激趣引题，使引题起着影响全局、辐射全课的作用。
（3）探究内容的选择应遵循可操作性原则，确定探究的问题要使学生经过若干步骤活动探索之后，最终可以得出答案。
3.课堂控制问题
在自主探究学习过程中，往往会出现两个极端：一是学生自由探究，教师不加控制、干涉，但最终学生的学习却走到了教学预期的反面；另一个极端是因为害怕学生的思维走得太远，于是处处干预和提防，束缚了学生自主探究学习的灵活性和趣味性。因此，教师不仅要关心课堂“开放得如何”，学生“自主得如何”，还要关心课堂是“如何开放”的，学生又是“如何自主”的。为了较好地控制课堂，教师需要对教学活动精心设计。
4.教和学的评价问题
细胞实验方案篇4
关键词动物细胞工程;开放实验教学;教学模式;西南科技大学
abstracttheopeningexperimentteachingmodeinanimalcellengineeringexperimentofbioengineeringspecialtywasdiscussedinthispaper.fiveteachinglinkssuchasexperimentprojectdesign,projectdiscussion,experimentoperation,experimentreportandexperimentsummarywereactualized.theteachingeffectwasturnedoutfine.while,existingproblemsandimprovementmeasuresaboutthisteachingmodewerepointedouttoprovidereferenceforbetteropeningexperimentteaching.
keywordsanimalcellengineering;openingexperimentteaching;teachingmode;southwestuniversityofscienceandtechnology
西南科技大学地处四川省绵阳市,是中国西部的一所重点建设学校。www.133229.Com西南科技大学生命科学与工程学院现共有7个专业,其中包括生物工程专业。由于生物工程专业是一门实验性、实践性非常强的学科,对该专业人才培养的要求是要具有较深厚的理论基础和较宽广的知识面,较强的实验、实践能力和创造能力。因此,笔者在优化理论教学的同时,也在积极思考如何加强生物工程专业的实验教学,强化实验与实践能力的训练,培养学生的动手能力,激励学生学习兴趣和创新精神,提高学生综合素质。传统的生物科学专业实验项目大多属于单一的验证性实验,且内容多是依附于各门课程的理论授课而开设,实验方法刻板,学生上实验只是被动应付、机械操作。这种“照方抓药”的实验形式极不利于学生智力的开发,限制了创造性思维的发展,不能充分调动学生的积极性和能动性。因此,生物工程专业的实验体系改革势在必行。近年来,西南科技大学加大了对本科教育的实验建设投入,大大改善了本科生实验条件。2010年,生命学院抓住学校迎接本科教学水平评估的契机,根据实际情况,申报了一个实验室建设项目“生物工程实验室建设”,得到了学校的批准并立项。在项目的实施过程中,不仅考虑了实验室软、硬条件的改善,同时也把实验教学模式的改革放到了重要的位置[1-2]。
1课程简介
《生物工程大实验》是生物工程专业的一门必修实验课,主要包括发酵工艺学、植物细胞工程、动物细胞工程3部分,在课程的教学过程中,动物细胞工程的实验周期相对稍短一些,同学们对动物细胞工程兴趣会更浓一些,因此,在动物细胞工程实验教学上应率先进行开放教学模式摸索。
2教学形式
教学共分为5部分内容,包括实验方案设计、方案讨论、实验操作、实验论文报告、实验总结。
2.1实验方案设计
笔者在进行《动物细胞工程》理论教学中,发现学生对动物细胞培养特别感兴趣。利用学生的这种好奇心理,在课程结束时,安排学生做了一个实验方案设计——小鼠××细胞系的建立,该设计既是理论课程的一个结课报告,也是本实验的一个实验指导。为节省材料,将学生分成几个大组,每个大组8个人,然后每个大组再分成4个小组,每小组2个人。每个大组发放1只小白鼠,每个小组的学生根据自己的兴趣,可自由选择目的细胞,包括肌肉细胞、肾脏细胞、肝脏细胞、肺细胞、骨髓干细胞等。这样在一个大组内就可做不同的细胞,便于同学之间的相互交流和学习,同时也节约了材料。
该次实验方案是一个完整的有关动物细胞系建立的具体方案,包括实验准备工作、培养基的配制、原代细胞培养、细胞的纯化与传代、细胞生长曲线的测定、细胞的冻存与复苏。在方案中,要求学生详细写出实验目的、实验原理、实验材料、方法与过程及注意事项,这就要求学生认真思考自己所需要的材料,因为每组学生所做的细胞不同,采用的培养及纯化方法也不相同,所需要的材料也不相同,包括需要哪些药品、试剂怎样配制、需要多少吸管,甚至连废液缸都要考虑到。这样培养了学生的主动思考能力和积极参与性,而不再像以前一样由老师准备好所有器材,自己只需要按照老师指定的步骤,将老师已准备好的试剂一一的加进去即可。
2.2方案讨论
方案设计好以后,教师进行修改,主要指出一些原则上的错误,让学生进行改进,然后进行交流。挑选一个比较典型的小组,向大家汇报,让同学来指出其设计上的不足,再在老师的指点下,比较自己的方案,这样在讨论中让学生对自己的目的和要求更加清晰。最后,给大家播放有关动物细胞培养方面的教学录像,详细介绍在操作中的注意事项,特别是一些细节问题,让同学们事先有所了解。
2.3实验操作
大家的方案在讨论和看完录像后再一次进行修改,经老师修订同意后就可进行实验操作环节。学生按大组领用所需的器材,自己进行清洗、包装和灭菌处理,配制所需的试剂,按照设计的实验方案进行实验操作。在实验过程中,由于细胞生长的进度不同,同学们需要在不同的时间来进行处理。为解决这个矛盾,实验室采取了全天开放、学生预约登记的形式,保证学生可以在预定的时间进行实验。在实验进行过程中,要求学生每天来观察细胞生长情况。
2.4实验论文报告
该实验报告采用科技论文报告的形式代替传统的实验报告,要求学生严格按照科技论文格式写出题目、前言、材料与方法、结果与分析、讨论与建议。前言部分要求学生简单介绍实验的原理与目的,由于动物细胞原代培养与细胞纯化的方法很多,多种方法大多可以使用,学生甚至可以同时使用不同的实验方法进行,但要求必须写出选择此方法的依据。材料与方法部分要尽可能详细,以锻炼学生自己动手准备实验的能力。实验结果要实事求是地记录下来。讨论为重点部分,要求结合理论知识对实验结果进行分析、综合、归纳和推理。若结果与预期不符,应分析原因,列出改进措施。最后,要求学生对此次实验教学提出自己的看法和意见。
2.5实验总结
课程结束后要对此次实验的情况进行总结,对出现的一些典型的情况进行分析。比如染菌严重等。分析其可能的染菌环节,及操作上的一些不正确的地方,让学生明白自己的不足之处。
3教学效果
此次开放实验教学,总体来说还是取得了较为满意的效果,与以前传统的实验教学方式相比,该教学主要达到了以下目的[3-4]:
3.1真正做到了理论和实践相结合
由于《动物细胞工程》是一门理论与实践结合非常紧密的课程,在课程讲授过程中,会涉及到许多与实验操作有关的知识,而学生以前并没有相关知识的积累,讲解起来非常空洞。比如,在讲授原代细胞的制备方法中,会包括酶消化法和组织块法2种方法,这2种方法有何优缺点,应怎样根据实际情况进行选用等,这类知识教师通常在课堂讲授时只讲一些基本的理论知识,而具体情况需同学们通过自己的实践和相互交流就得到深刻的认识。
另外,由于要求学生自己动手设计实验方案,而方案的设计必须建立在踏实的理论知识基础上,这就要求学生在实验方案设计的同时,必须理清楚方案设计的理论依据,同时也培养了同学们查阅资料、阅读文献的能力。
3.2有效培养了学生的动手能力、思维能力,训练了从事科研工作的基本功
由于实验带教老师仅指出实验的名称,提供与本实验相关的实验器材、试剂、动物等,其余由学生通过阅读教材、查阅资料,明确实验目的、实验方法与步骤、注意事项等内容,并在此基础上按步骤进行操作。在教学过程中,学生始终处于主体位置,教师则处于主导位置。学生在实验中必须充分应用所学的理论和已掌握的技能,完成整个实验,包括实验的设计、操作的步骤、仪器和材料的选择、结果的分析等。其中每一步骤对学生来说都是全新的,充满了挑战性,试验结果不是预先知道的,学生必须对实验中出现的异常现象及时分析,并提出相应解决办法,这就要求学生要有严密的实验思路和严谨的科学态度,调动学生的主动性。比如器材的清洗、包装、灭菌等工作,平时大家都不太重视,而通过实验,就有了切身体会,有的同学在做过滤除菌制备培养基时,由于无菌工作未作好,导致培养基染菌变浑浊而只能重做。由于各小组的实验材料和结果都不相同,也进一步拓宽了学生的知识面,充分挖掘了学生的创造才能,促进学生科学素质的提高,培养学生的综合能力。
实验结束后要求学生按照论文的格式和规范撰写实验报告。对于普通高校的大多数学生来说,撰写论文是一件遥不可及的事情,现在他们具有了论文的素材,就可以模仿科技论文的写作要求去完成,使学生获得了撰写科研论文的训练,掌握了从事科研工作的基本功。
3.3加强了老师和学生之间的交流,增进了师生感情
由于学生频繁出入实验室,与老师接触的时间增多,师生之间可广泛的进行交流,可以加深学生对老师的理解、对教师行业的尊重。
3.4培养了责任心和科学态度,提高了兴趣,增强了自信心
实验分小组,做到任务到人,每个人对自己培养的细胞都爱护有加,这种负责任的心态是在做别的实验时看不到的。与以往实验不同,同学之间是用自己的劳动成果做比较,都格外努力。成功的同学根据自己的想法做设计、做实验,获到了很好的结果,会产生一种自豪感和自信心。而失败的同学虽然有一些丧气,但在认真总结教训和向成功同学取经的基础上,在第2次实验中还是会得到满意的结果。另外,由于实验过程中需要同学之间相互合作、协调进行,增进了同学的团结、互助、协调的精神。
3.5提高了师资队伍水平和实验教学质量
开放式教学中一些实验内容反映了当代科学技术的发展水平,涉及的知识面广。教师不仅要有本学科扎实的理论基础、较好的实验技能,还要加强业务学习,不断更新自己的知识,这在新实验开设和学生科技创新活动中显得尤其重要。可以说开放教学提高了师资队伍业务水平。从传统的实验教学到开放性实验教学的转变不仅对教学双方产生巨大影响,对提高实验室的建设和管理水平也会起到不可估量的作用,这种改革无疑会使实验室的各项工作发生质的飞跃。开放实验维护了学生的原创精神,能使学生在宽松的实验环境中实现从被动学习到主动学习的转变。可以说开放实验是实验教学中实现因材施教的必由之路,是培养学生创新能力的必备条件。
4存在的问题与改进措施
4.1实验室配套设施不完善
由于实验人数剧增、延续时间较长,仪器设备接待能力明显不足。因为细胞培养严格要求无菌操作,所以,大部分操作都在超净台上进行,这样就造成对超净台需求的矛盾。而且,因为同学们大多是新手,操作时非常小心、谨慎,这样也常常导致不能按照预定的时间结束实验,设备流动速度慢,同学们等待时间较长。另外,由于学生人数多,人流量大,导致无菌室有名无实,也由此使一些同学的实验材料被污染。
4.2增加了教师的实际工作量
设计性实验教学比单项实验教学工作量大、持续时间长。为了充分利用设备,缓解实验室设备紧张的压力,在一个规定的时间段,采用了学生预约、全天开放的实验模式。为了做好实验,同学们无论中午、晚上,只要有时间就可以到实验室做实验,由于学生以前没有受过这样的训练,教师必须随时在场给学生提供帮助,这就要求教师做出更多的奉献。另外,由于学生采用了各种各样的材料,教课老师需要查阅大量的资料,自己做一些预备实验,这样才能更好地指导学生。
4.3加大了实验费用开支
实验要求学生自己准备实验材料和试剂,这比教师统一准备要消耗更多的实验试剂和材料,从而加大了实验费用开支。而且由于大家所采用的实验材料不一致,虽然老师在审阅设计方案时,取消了一些耗费较大的项目,但是仍然需要准备各种实验相关试剂和材料,也造成了实验开支的大大增加。
5结语
与课堂理论教学相比,实验教学更有利于培养学生的创新能力,实验室是让学生学会从实践中发现问题、解决问题和将所学知识运用到实际中去的重要场所,是培养具有创新能力的科学研究和应用人才的实践基地。而要真正上好实验课并非易事,综合性、设计性实验教学仍有待进一步完善。
6参考文献
[1]常东胜,李涛,李静平.开放式实验教学模式的探讨[j].齐齐哈尔医学院学报,2005,26(7):810-811.
[2]李江滨,黄迪南,侯敢.生物化学实验教学改革探讨——论文式实验报告[j].卫生职业教育,2005,23(15):100-101.
细胞实验方案篇5
一、改革的具体内容
（一）教学内容改革
1.理论教学内容的转变。由原来的该门课程全部章节讲解，转变成重点学习该门课程的最基本和核心知识内容，以动物细胞培养作为重点知识内容讲授，授课内容不再是面面俱到。2.实验教学内容的转变。由原来零星的涉及每个章节的实验内容，转变为系统性逻辑性强的“生物大实验”，具体内容包括：细胞培养实验前准备、小鼠胎儿成纤维细胞原代培养、细胞计数、细胞活性鉴定、小鼠胎儿成纤维细胞传代培养、细胞冷冻保存，及细胞解冻复苏培养，等等。3.增加自主学习内容。在理论课题上没有涉及的章节，让学生在课外自主学习，以课堂讨论形式出现。
（二）教学方案改革
1.理论教学改革方案。内容为课程核心内容、精髓的内容，内容包括动物细胞培养、干细胞和胚胎工程的相关知识，其中以动物细胞培养作为重点知识内容讲授。以教师精讲为主，但在内容的侧重点上，以及教学方法的多样性上有所改变。方式以教师ppt讲授为主，并适当提问，结合视频播放。课时安排，以本校教学安排为例，在32个总课时量中，理论教学部分安排12―14个课时。2.实验教学改革方案。由于该课程操作性强，较为抽象，在学生掌握一定的理论知识后，可安排进行实验教学，学生需要通过实验操作可继续维持该课程兴趣，并提高对该课程的理解力。实验是由若干个逻辑性和系统性较强的小实验串联成一个系统性的大实验，具体内容包括：细胞培养实验前准备、小鼠胎儿成纤维细胞原代培养、细胞计数、细胞活性鉴定、小鼠胎儿成纤维细胞传代培养、细胞冷冻保存，及细胞解冻复苏培养，等等。3.增加自主学习环节。该课程内容其余章节，包括单克隆抗体、组织工程、试管婴儿、克隆动物、多倍体与转基因动物、诱导性多潜能干细胞等，也可以是本课程相关延伸部分。采用学生自主学习方式，但每组学生只需重点学习其中的一个方面内容即可，如有的同学选择最近比较热点的“3D打印在生物医学中的应用”、“诱导性多潜能干细胞的安全及应用”作为主题内容。学生在自主学习完成后，以学生课堂讨论的形式出现，安排2―4学时，5人一小组，全班共分6组。各小组以ppt形式讲解，限定时间7―9分钟，讲解完成后，其他小组同学有提问或反驳，教师进行总结。通过设定相关标准，每个小组组长，依据课题讨论内容的难度、深度、熟练度、ppt的制作精美度、回答问题情况等指标给每个小组打分，计入期末总成绩。每个小组可通过其他小组的讲授而了解相关的知识内容。
（三）考核方式改革
考核内容上分期末理论考核、实验考核和讨论，期末总成绩可依据实际情况调整考核比例。
二、改革取得的成绩及存在的问题分析
（一）取得的成绩。依据对学生的调研及反映，目前该课程改革取得了一些成绩，使学生系统地掌握了动物细胞培养的基本技能及相关理论知识，符合了应用型人才培养的要求；借助多种学习模式，在一定程度上提高了学生的思维能力、学习效率和学习兴趣；弱化书面作业和考试等记忆性成绩所占比重，强化讨论、提问、实验操作、综合分析等锻炼思维能力成绩比重；学生课程考核更趋合理。
细胞实验方案篇6
关键词：脱落细胞学；实验教学；pBL教学模式
脱落细胞学是采集人体各部位，特别是管腔器官表面的脱落细胞，经染色后用显微镜观察这些细胞的形态，并作出诊断的一门临床检验学科，又称诊断细胞学、细胞病理学。脱落细胞学实验课是临床检验基础教学的主要内容之一，传统的脱落细胞实验课主要是老师主宰的填鸭式授课，实验内容和过程均由教师确定，学生主要是接受，实验课上大家不能探讨，各看各的片子，枯燥乏味，不能调动学生的积极性和创造性。pBL是基于问题的一种学习方法，1969年由美国神经病学教授Barrows在加拿大麦克马斯特大学首创的，强调以学生主动学习为主，提倡以问题为基础的讨论式教学和启发式教学[1]。与传统教学授课为基础的学习有很大的不同，更有利于提高学生自主学习和独立思考的能力，分析及解决问题的能力以及逻辑思维能力。
1资料与方法
1.1一般资料以本校2010级本科医学检验专业的62名学生作为研究对象，其中一班31名学生实施传统实验教学为对照班；二班31名学生，采用pBL实验教学法为实验班，随机分班，两个班所用理论教材和实验教材均相同。
1.2对照班实施传统实验教学方法上课前段由实验教师讲解本次脱落细胞实验课内容、实验原理、目的、操作、注意事项等，复习理论课讲解的各种脱落细胞诊断标准，然后学生进行操作实验，在显微镜下观察辨认本次实验课要掌握的脱落细胞涂片，再逐个给学生答疑。
1.3实验班实施pBL教学方法
1.3.1实验课前准备从临床整理出教学大纲要求的相关病例及患者脱落细胞涂片，病例要求典型，难度适中，临床资料属实主要以住院患者为主（内容包括患者的病历、各项辅助检查结果及穿刺涂片、脱落细胞涂片及各种化学染色涂片等）。
1.3.2结合临床病例将前面整理好的临床病案提前一周给学生，同时提出思考题，例如，学生在学妇产科时学过子宫颈癌，它的好发部位在哪里？大家都会想到，宫颈移行带，大多数学生同时会联想到，老师提出这个问题的目的就是说满意的标本取材一定要在移行带，反映到细胞学涂片上呢？就是在镜下看到移行带的细胞，移行带上都有什么细胞呢？两种细胞，宫颈鳞状上皮细胞和柱状上皮细胞。几个问题下来，学生就自己找到了答案，这样的方法比直接告诉学生知识要点的效果要好得多。再比如，明确淋巴结肿物良性病变还是恶性病变，通过临床淋巴结肿物针吸穿刺，依据细胞学类型及形态特征诊断为化脓性炎性反应、结核性、淋巴结恶性肿瘤或淋巴结转移癌，确诊该疾病还需做哪些辅助检查，同时和哪些疾病鉴别等。
1.3.3实验班分组将实验班学生分成五组，每个小组一份临床病历，每组自己组织复习理论知识，去图书馆及网上查找相关中外文资料和文献，培养团队协作精神及分析问题和解决问题的能力。
1.3.4开放实验室学生利用业余时间随时去实验室进行实验操作，通过显微镜阅片，实验室内多媒体电脑内存有大量典型的脱落细胞图片（包括正常脱落细胞形态、炎症增生脱落细胞形态、肿瘤脱落细胞形态）。阴道、痰液、浆膜腔积液、消化道、泌尿系统、溢液等脱落细胞图像通过多媒体实验教学的引入，能够生动逼真地演示这些图像，使这些图像变抽象为形象、静态为动态、微观为宏观、复杂为简易，更好的演示区分了各部位的鳞癌、腺癌、未分化癌的特点。
1.3.5讨论小组自己组织讨论总结分析达成一致结果得出每组的结论。
1.3.6实验课堂总结每组学生派代表把各自的结论说出来，然后全体讨论，各抒己见，最后由教师做最后总结，把思路和结果详细讲给学生。
1.4学习效果评价
1.4.1问卷调查对实验班进行不记名表格形式调查。
1.4.2综合考核理论考核、实验技能考核、镜下1分钟脱落细胞单个辨认、病例分析成绩。
2结果
2.1问卷调查对pBL实验班学习的31名学生每人一份调查表，发放31份，回收31份，见表1。
2.2考核成绩实验班实验报告、单个脱落细胞1分钟辨认成绩、实验考试成绩、病案分析成绩都高于对照班（p
3讨论
pBL教学作为以问题为中心的教学模式打破了传统的以学科为基础、以教师为中心、以课堂教师讲授为主的实验教学模式[2]。其特点是结合临床病例开展以问题为基础、学生为主体、教师为导向的小组讨论式教学方法，以塑造学生独立自主性，培养学生创新思维、理解获取新知识、有效运用知识、解决新问题能力、表达交流能力和团队精神为教学目标[3]。本实验研究实验班问卷调查表1显示，87.1%同学喜欢pBL实验教学模式，得到了绝大多数同学认可，教师由传授知识转向引导学生主动自学、独立思考、增加了学习乐趣；97%同学认为提高了查阅资料和中外文献的能力；90.3%同学认为培养了团队协作，互帮互学能力；87.1%同学认为提高了病案分析能力；结合小组讨论提高了学生的逻辑思维和创新能力，通过反复小组讨论力求答案更加全面和合理，生动易懂，同组的同学们主动踊跃参与讨论，学生的思考和表达能力得到了提高。考核结果表2显示，实验报告成绩、单个脱落细胞1min辨认成绩、实验考试成绩、病例分析成绩都高于对照班（p
综上所述，脱落细胞实验课是一门实践性很强的学科，是高等医学检验专业必修的核心课程，有着及其重要的地位，通过此次pBL实验教学提高了学生主动学习兴趣，开阔了学生视野，活学活用，培养了创新思维和科研能力，但pBL实验教学作为一种新的教学模式在实施中需要克服一些困难，随着我们的努力和实践经验的积累，前景是美好的，pBL教学法是值得推广的，通过不断改善，建立一套更加完善的脱落细胞pBL实验教学体系。
参考文献：
[1]车春莉，郭庆峰，张一梅，等.pBL教学模式在中国高等医学教育中应用的思考[J].中国高等医学教育，2010，（1）：126-127.
细胞实验方案篇7
关键词：表柔比星；奥沙利铂；氟尿嘧啶；细胞株HepG2
1资料与方法
1.1细胞细胞株HepG2上海美轩生物。将细胞株置于10%胎牛血清Rpmi1640（美国GiBCo）培养液（内含0.1%青霉素、链霉素），并于培养箱37℃、5%二氧化碳内培养。
1.2药物表柔比星：浙江海正药业；5-氟尿嘧啶：上海旭东海普；奥沙利铂：江苏恒瑞。
1.3用mtt法检测药物对细胞的促凋亡作用将对数生长期制成细胞悬液，浓度为2×105个/mL，并置于96孔板内培养，每孔200ul，加人药物20ul。并分组：空白组、对照组和药物实验组，5-FU为9.375ug/ml、18.75ug/ml、37.5ug/ml、75ug/ml、150ug/ml、300ug/ml、600ug/ml；L-oHp为0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5
mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml、8.0mg/ml表柔比星为2.5ug/ml。根据SpSS17.0回归分析iC30，药物浓度为药物的iC30，有研究证实以抑制率大于30%为最佳敏感界值。
1.4药物联合作用筛选出5-FU的iC30为84.0ug/ml，L-oHp的iC30为86.4ug/ml。采用5-FU的终浓度为84.0ug/ml（全量）和42.0ug/ml（半量）L-oHp的终浓度为86.4ug/ml（全量）和43.2ug/ml（半量）。药物实验组又分为：①单药组5-FU（全量84.0ug/ml和半量42.0ug/ml）、L-oHp（全量86.4ug/ml和半量43.2ug/ml）、表柔比星（2.5ug/ml）；②两药联合组，包括两药同步化疗（5-FU+LoHp、5-FU+表柔比星、L-oHp+表柔比星）和两药序贯化疗（5-FU84.0ug/mlL-oHp86.4ug/ml、5-FU42.0ug/mlLoHp43.2ug/ml、L-oHp86.4ug/ml5-FU84.0ug/ml、L-oHp43.2ug/ml5-FU42.0ug/ml）；③三药联合组，包括三药同步化疗（5-FU84.0ug/ml+L-oHp86.4ug/ml+表柔比星、5-FU42.0ug/ml+L-oHp43.2ug/ml+表柔比星）和三药序贯化疗（表柔比星+5-FU84.0ug/ml表柔比星+L-oHp86.4ug/ml、表柔比星+L-oHp86.4ug/ml表柔比星+5-FU84.0ug/ml、表柔比星+5-FU42.0ug/ml表柔比星+L-oHp43.2ug/ml、表柔比星+L-oHp43.2ug/ml表柔比星+5-FU42.0ug/ml）。每一个组都设计为四个复孔。单药组直接加入各浓度药物100ul；两药同步联合时采用1：1方案，将药物浓缩一倍，后各加50ul。这样每一孔内的药物浓度、体积和总量未发生改变；三药同步联合时，应用1：1：1方案，先将药物浓缩2倍，再各加25ul，同样为保证药物浓度和总量不变，之后应补加25ul的培养基。序贯化疗时，细胞株按着序贯方案中的顺序先接受前一种药物持续作用24h，之后小心弃除含药培养液，加入含后一种化疗药物的培养液，并持续作用24h，期间保持培养液总量不发生变化。置于培养箱（37℃、5%Co2）培养48h后，离心弃上清，加入200ul不含血清的培养液及20ul5mg/mlmtt，继续培养4h，之后再弃去培养液，加人200ulDmSo，并振荡5min后用自动酶标读数仪测oD值，进行药物作用效应计算。
抑制率=[（对照组吸光值（a）-实验组吸光值（a））÷对照组吸光值（a）]×100%。
1.5两药联合疗效评价采用fractionalproductconcept（fp值）[3]来评价两药相互作用的性质，fp值：i1+2/（i1+i2-i1*i2），其中i1+2：两药联合作用平均抑制率，i1和i2：两药单独作用平均抑制率；fp值>1，两药作用性质为协同；fp值=1，两药作用性质为相加；fp值
1.6统计学方法用SpSS17.0统计软件处理，结果资料采用方差分析和t检验。
2结果
2.15-FU、L-oHp对肝癌细胞HepG2的抑制作用通过测定稀释至不同梯度浓度的5-FU和L-oHp对细胞株HepG2生长的抑制作用，得出两种药物对HepG2的iC50值约为228.940ug/ml、2737.328ug/ml。
2.2表柔表星、5-FU及L-oHp不同方式的联合用药对肝癌细胞HepG2的抑制作用。
2.2.1单药对肝癌细胞株HepG2的作用表柔比星、5-FU及L-oHp单独作用时，均能显著的抑制肝癌细胞HepG2的生长（p
2.2.2两种药物以不同序贯联合顺序应用时对HepG2的生长抑制作用各组药物都可以有效抑制肝癌细胞HepG2（p
2.2.35-FU、L-oHp及表柔比星三药联合应用三种药物共同作用于肝癌细胞HepG2时，能明显的降低其生存率（p0.05）；在三药不同序贯联合时，表柔比星+L-oHp表柔比星+5-FU与同步联合比较无显著性差异（p>0.05），且均显著高于表柔比星+5-FU表柔比星+L-oHp序贯组（p
3讨论
肝癌的发病率在全世界范围内不断升高，运用多种治疗手段综合治疗是肝癌目前的主要治疗原则。化疗在晚期肝癌治疗中占据重要地位，但由于肝癌细胞对化疗药物不敏感及耐药的问题，使得肝癌的化疗效果不理想。目前，经研究证实较为有效的药物有多柔比星类、5-FU类、铂类。其中多柔比星在肝癌的治疗中效果最优，有研究证实表柔比星与其效果相近，它们均属于抗生素类抗肿瘤药。奥沙利铂属新合成的3代铂类药物，与5-Fu有协同作用，以两种药物为主的FoLFoX4化疗方案已于2011年被我国原发性肝癌诊疗规范推荐用于肝癌的姑息治疗中。将以上三种药物应用于本实验中，通过观察它们不同联合及序贯应用时的最大抑制率，以筛选出最优的联合方案，为临床治疗提供一定的实验依据。
本实验中我们探讨了不同剂量的5-氟尿嘧啶、奥沙利铂分别与表柔比星组成的不同的联合或序贯方案对细胞抑制率的影响，从中可以看到含表柔比星组的两药联合方案的抑制作用显著高于不含表柔比星组，表明与含表柔比星的联合方案相比，5-氟尿嘧啶联合奥沙利铂并未显示明显的优势。另外在三药联合应用时对细胞的抑制率达到最高，表明三药联合相对于单药、两药而言为效果最优的化疗方案。并且表柔比星同步奥沙利铂到表柔比星同步氟尿嘧啶时的序贯联合与三药同步联合时比较差异无统计学意义，表明此种序贯不仅没有降低疗效，而且同样可以达到三药同步时的药效，为临床寻找最优的序贯方案提供一定的实验依据。另外当存在药物剂量（全量、半量）不同时，其结果比较差异亦无统计学意义，表明全量应用与半量应用的疗效相当，所以在保证疗效不变的前提下，可以降低剂量，从而降低药物的毒副作用，使其能更好的应用于临床。
由上述得出，表柔比星+L-oHp到表柔比星+5-FU的序贯联合应用具有高效协同抑制人肝癌细胞株HepG2的作用，可以作为临床应用的实验依据，并为肝癌患者的化疗及小剂量序贯化疗提供参考。但本实验为体外干预实验，其结果有待于进一步的临床验证。
参考文献：
[1]高勇，刘扬清，易竹筠，等.伊立替康、奥沙利铂及氟尿嘧啶对人大肠癌LoVo细胞株作用的实验研究[J].临床肿瘤学杂志，2008，13（3）：217-221.
[2]刘家贺.于全成奥沙利铂联合表柔比星经导管肝动脉化疗栓塞介入治疗原发性肝癌临床分析[J].现代医药卫生，2014，30（05）：743-744.
[3]马瑜瑾，李世朋.沙利度胺对肝癌细胞HepG2化疗的增敏作用[J].中国临床药理学杂志，2014（07）：597-600.
细胞实验方案篇8
关键词：细胞免疫；化疗；肺癌；治疗效果
肺癌是临床上常见的疾病，这种疾病发病率较高，且随着人们生活节奏的加快其发病率出现上升趋势。患者发病后临床上主要以咳嗽、胸痛、咳血为主，影响患者生活质量[1]。目前，对于肺癌医学界缺乏理想的治疗方法，常规方法主要以化疗等为主，这种方法患者治疗预后较差，耐药性也比较差，影响患者治疗预后。近年来，细胞免疫联合化疗在肺癌患者中使用相对较多，且疗效显著[2]。为了探讨细胞免疫联合化疗治疗肺癌临床疗效，对2013年4月至2014年4月我院收治的80例肺癌患者资料进行分析，报告如下。
1.资料与方法
1.1一般资料
对我院进行治疗的80例肺癌患者资料进行分析，根据不同护理方案将患者分为对照组和实验组，实验组有患者40例，男26例，女19例，年龄为（31～78）岁，平均年龄为（54±0.8）岁，患者从发病到入院治疗时间为（1.1-5.9）月，平均病程为（3.2±1.1）月；对照组有患者40例，男20例，女20例，患者年龄为（30～76）岁，平均年龄为（53±1.3）岁，患者从发病到入院治疗时间为（1.2-5.8）月，平均病程为（3.4±1.6）月。患者对治疗方案、护理措施等有知情权，患者性别、年龄等差异不显著（p>0.05），具有可比性。
1.2方法
对照组采用化疗治疗，根据患者临床症状、病史等采用ep方案进行化疗，患者用药1-3天静脉滴注100mg/m2依托泊苷（三九集团昆明白马制药有限公司，国药准字H53021646）[3]；同时，用药第一天静脉滴注75mg顺铂（云南个旧生物药业有限公司，国药准字H53021740），必要时联合胸部同步放射治疗。实验组联合细胞免疫治疗，方法如下[4]：根据患者临床症状、病史等在治疗第一天采集体外周血单个核细胞，在体外进行培养扩增，培养14天后输入患者体内，输入的细胞主要包括：nK细胞、CiK以及γδt细胞，连续回输6天，连续治疗21天[4]。
1.3疗效标准
根据wto实体瘤相关标准[6]，完全缓解（CR）：患者疼痛等临床症状消失，实验室指标正常；部分缓解（pR）：患者临床症状、体征等症状得到缓解，病情和入院前相比好转；稳定（SD）：患者临床症状、体征等症状稳定，实验室指标异常。无效（pD）：患者病情没有明显变化或死亡。
1.4统计学方法
相关数据进行SpSS16软件分析，计数资料采用卡方检验，并采用n（%）表示，p
2.结果
本次研究中，实验组75%治疗效果理想，高于对照组（27.5%）（p
本次研究中，实验组中位生存期为（10.63.6）月、远期生存人数为15例，远期生存率为37.5%，显著高于对照组（中位生存期为（8.41.5）月、远期生存人数为8例，远期生存率为20%）（p
本次研究中，实验组治疗后3例出现不良反应，不良反应发生率7.5%，显著低于对照组（7例发生不良反应，不良反应发生率为17.5%）（p
3.讨论
肺癌是临床上常见的疾病，这种疾病发病率较高，且多数患者一旦确诊已经是中晚期，错过了最佳治疗时机。虽然肺癌对初始治疗的敏感性较高，但是复发率较高，转移等，影响患者治疗预后[7]。同时，化疗可以打破人体免疫抑制状态，不仅降低肿瘤的负荷，同时也增加了促炎介质的产生，如：热休克蛋白、尿酸损伤等，影响患者正常工作和生活。因此，肺癌患者中研究积极有效的治疗方案具有重要意义[8]。
近年来，细胞免疫联合化疗肺癌患者中使用较多，且效果理想，本次研究中，实验组75%治疗效果理想，高于对照组（27.5%）（p
综上所述，肺癌患者治疗过程中实施细胞免疫联合化疗效果理想，能够提高临床疗效，发挥不同治疗方案优势，改善患者生活质量，值得推广使用。
参考文献：
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细胞实验方案篇9
免疫毒理学是毒理学的一个重要分支，是研究外源性化学物、物理因素及生物因素对机体免疫系统不良反应及其机制的一门学科。在某些情况下，免疫系统是容易受到攻击的靶器官，在其他器官系统尚未观察到毒作用时，免疫系统可能已经受到损害，如免疫病理学改变、细胞免疫异常、体液免疫异常、特异性免疫改变或宿主抵抗力下降等。因此，免疫系统的效应变化是某些危害的毒理学安全性评价中较为敏感的指标，而选择敏感的生物标志物检测早期健康危害效应将会极大的提高安全性评价工作的科学性和效率。例如，美国有毒物质和疾病登记局(agencyfortoxicsubstanceanddiseaseregistry，atSDR)在制订砷、狄氏剂、镍、1，2-二氯乙烷、2，4-二氯酚的安全限量时，就采用了免疫毒理学的安全性评价结果。20世纪80年代初，许多国家的相关部门相继尝试制定免疫毒性的评价策略。其中有关杀虫剂和药物的免疫毒性评价方案最早出台。欧洲(欧盟、荷兰等)和美国(美国环境保护署epa、美国国家毒理学规划ntp和美国食品药品管理局FDa等)都进行了早期的免疫毒性试验指南的制定。但由于免疫系统组成和功能的高度复杂性，以及免疫毒物毒作用的靶细胞和靶分子的多样性，目前尚未有一种免疫毒理学试验方法能够从整体、细胞和分子水平全面反映外源性化学物对整个免疫系统的影响，因此国际上一般采用一组试验多项指标来进行综合评价。而且分级筛选的试验方案也逐渐被多家国际机构所认可，成为免疫毒理学安全评价的精髓，目前各国将免疫毒理学安全评价方法的重点放在分级试验策略的优化和国际间的协调统一上。
1美国的免疫毒性评价程序
1.1美国FDa的免疫毒性评价指南
1982年美国FDa颁布了红皮书i，就免疫毒性评价而言，内容仅涉及在一般毒理学试验中进行血液学指标、血生化指标以及免疫器官脾的组织病理学检测。考虑到所要监管的产品可能具有免疫毒性，1993年FDa颁布的红皮书ii《直接食品添加剂和着色剂的毒理学安全评价指南》中将免疫毒理学安全评价方法纳入其中。2007年修订的红皮书2000中免疫毒理学安全评价方法继续采用1993年版的内容。该指南适用于食品添加剂、药品、生物制品及医疗器械等的免疫毒理学安全性评价。在具体实施过程中，推荐采用个案处理原则。制定了标准试验，同时建议根据具体情况选择其他合适的试验或指标。试验分为两个水平:水平i，无需向动物注射抗原，可以采用标准的毒理学试验进行免疫指标的测定;水平ii是免疫功能试验，通常需要多个系列组，每个系列组用来进行不同的试验。水平i包括基础指标和扩展指标，基础指标通过标准的动物短期和亚慢性毒性试验测得(主要的免疫毒性指标包括血液学指标:白细胞数及其分类;血生化指标:血清总蛋白，白/球蛋白比;组织病理学:淋巴器官如脾、胸腺、淋巴结、骨髓等)，以及啮齿类动物发育毒性试验(包括:a.母体发病率和死亡率;b.组织病理学:胎体的肝脏、胸腺和脾脏;c.F1和F2代的血液学指标、血生化指标、组织病理学、器官重量和体重等);扩展指标:血液学指标中外周血或脾脏B淋巴细胞数、t淋巴细胞数和t淋巴细胞亚群分析;血生化指标如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、补体、血清细胞因子如iL-1、iL-2和γ-干扰素、血清自身抗体水平等;组织病理学:动物脾脏以及淋巴结B淋巴细胞和t淋巴细胞的免疫组化，脾脏生发中心和动脉周围淋巴鞘的精密测定，淋巴结中淋巴滤泡和生发中心的精密测定，胸腺皮质和髓质的形态学测定。体外免疫细胞的功能测定:nK细胞活性测定;B淋巴细胞和t淋巴细胞增殖试验;巨噬细胞功能试验;骨髓干细胞测定。水平ii也包括基础指标和扩展指标，基础指标包括t细胞依赖性体液免疫应答、t细胞非依赖性体液免疫应答、迟发型变态反应等，扩展指标包括宿主抵抗力(pYB6肿瘤细胞、细菌、病毒、真菌和寄生虫等)。
1999年美国FDa的医疗器械和放射健康中心(CenterforDevicesandRadiologicalHealth，CDRH)颁布了免疫毒理学试验指南，这一指南用于指导医疗器械及组成成分的免疫毒理学评价，提出最佳的试验方案。包括一个流程图和三个表格。流程图用于决定是否进行免疫毒性试验(G95-1/iSo10993)，如果某种医疗器械与已合法上市的医疗器械的材料、与人体接触方式、剂量和接触时间一样，或其有长时间使用历史但无毒性结果，或文献报道其无毒性，则不需进行免疫毒性试验。如通过流程图建议进行免疫毒理学试验，则通过三个表格的指示来进一步选择所要进行的免疫毒性试验，对免疫抑制、慢性炎症、超敏反应、免疫刺激和自身免疫进行评价。表格1列出根据医疗器械的材质、类型、与人体接触途径和时间选择不同的免疫毒性试验;表格2包括关键指标和非关键指标，组织病理学是炎症和自身免疫的关键指标，而是免疫抑制、超敏反应和免疫刺激的非关键指标;体液免疫是免疫抑制、超敏反应、免疫刺激和自身免疫的关键指标，而是炎症的非关键指标;t淋巴细胞免疫分析均为关键指标;nK细胞活性和宿主抵抗力仅是免疫抑制的关键指标;表格3则列举了表格2中关键或非关键指标的具体方法。2002年美国FDa的药物评价与研究中心(CenterforDrugevaluationandResearch，CDeR)公布了审查新药的免疫毒理学评价行业指南。该指南较为全面和详细，涵盖了免疫毒性概念中的所有内容如免疫抑制、免疫原性、超敏反应、自身免疫和不良免疫刺激。免疫抑制筛选试验首先进行标准毒性试验，通过动物重复剂量试验测定血液学指标、血生化指标(血清白蛋白和白/球比)、组织病理学(脾、胸腺、淋巴结和骨髓)、免疫器官重量和脏体比以及动物感染和肿瘤发生率;扩展试验对免疫功能进行测定如对绵羊红细胞的初级免疫应答、对绵羊红细胞的次级免疫应答、nK细胞活性测定、细胞毒性t细胞杀伤试验、迟发型变态反应试验、宿主抵抗力试验、骨髓祖细胞功能试验、巨噬细胞功能测定、中性粒细胞功能测定、免疫细胞表型及标志物。免疫原性用于测定药物引起免疫反应的可能性，但采用非临床毒理学试验手段仍困难重重，因此CDeR未推荐明确的方法。超敏反应分为i型-iV型，该指南主要针对小分子药物进行评价。
i型超敏反应的评价方法包括:主动皮肤过敏反应试验、被动皮肤过敏反应试验、主动全身过敏反应试验。但上述方法对于确定是否具有潜在的i型超敏反应仍十分有限，并未正式推荐使用。目前尚无标准的非临床试验可以很好预测ii型和iii型超敏反应，但CDeR认为如果病理学检测结果显示可能异常即推荐按照“个案处理原则”进行深入研究。iV型超敏反应推荐的方法包括:Buehler封闭斑贴试验＞豚鼠最大值试验(Guineapigmaximizationtest，Gpmt)＞局部淋巴结试验。目前尚未制订标准的试验方法用于测定药物的自身免疫毒性和不良免疫刺激。该指南同时提供了一个流程图用于指导免疫毒理学评价方法的选择，主要考虑了药物的给予途径、免疫抑制方面的证据、针对人群、针对的疾病、药物代谢物是否在免疫系统有蓄积等因素。
1.2美国epa的免疫毒性评价指南1982年，美国epa最早出台了农药免疫毒性评价指引，要求对新农药按照两级筛选程序进行评价。但当时该指引所推荐的方法和动物模型没有被标准化和验证，是不成熟的。之后的十多年时间里多次对早期版本进行了修订，曾先后提出了opptS800.3550、880.3800和870.7800等指南用以指导免疫毒性评价。1996年美国epa修订了免疫毒性试验指南opptS800.3550，该指南主要针对农药和有毒有害物质的免疫毒理学安全性评价。尽管超敏反应、免疫刺激和自身免疫也是免疫毒性的重要内容，但该指南仅限于免疫抑制。作为受试物免疫毒理学安全评价的i级筛选试验，包括标准毒性试验和免疫功能试验。标准毒性试验即进行动物重复剂量毒性试验，小鼠和大鼠是首选试验动物，可选择单一性别的动物，但必须保证该性别动物对受试物更为敏感，每组动物至少10只，连续给予受试物至少30天。试验设阴性对照组，阳性对照组，低、中、高3个受试物剂量组和1个卫星试验组。测定血液学指标(白细胞数及其分类、红细胞数、血小板数、血红蛋白、红细胞压积)，血生化指标(血糖、谷丙转氨酶、尿素氮、白蛋白、总蛋白等)，组织病理学(脾、胸腺、淋巴结、骨髓、肝、肺、肾、肾上腺、脑垂体、性腺)，免疫器官重量及其脏体比，脾、胸腺和骨髓细胞数和细胞存活率。免疫功能试验中体液免疫包括抗体空斑形成细胞试验、血清免疫球蛋白测定;细胞免疫包括混合淋巴细胞试验、迟发型变态反应、细胞毒性t细胞杀伤试验;非特异性免疫毒性试验包括nK细胞活性测定、巨噬细胞活性测定。如果以上试验出现一项阳性结果、结果无法解释、有资料显示该受试物具有免疫毒性或与其结构相关产品具有免疫毒性，均需进行ii级筛选试验。
随后美国epa公布了opptS880.3800，本指南为ii级筛选试验，如果opptS800.3550i级筛选试验中细胞免疫或体液免疫出现异常则必须进行宿主抵抗力试验，另外可采用其他的试验如血清补体、抗体对t细胞非依赖抗原反应、t淋巴细胞和B淋巴细胞亚群分析、粒细胞功能测定、骨髓功能测定、细胞因子测定、空斑形成细胞反应、淋巴细胞对有丝分裂原的增殖反应、体内注射异源淋巴细胞后腘窝淋巴结增大反应、激素、免疫系统发育、巨噬细胞发育及其功能试验。
1998年美国epa制订了opptS870.7800，该指南主要针对农药和有毒有害物质重复暴露的免疫抑制评价。并且引入限制试验的概念，即如果受试物经口摄入量至少1000mg/kg或经呼吸摄入量达到2mg/L仍未观察到毒性反应，则不需设计3个剂量，只需依据人体暴露量进行较高剂量的试验即可。小鼠和大鼠为首选试验动物，可选择单一性别的动物，但必须保证该性别动物对受试物更为敏感，每组动物至少8只，连续给予受试物至少28天。试验设阴性对照组、阳性对照组和低、中、高3个受试物剂量组。进行免疫功能试验如抗体空斑形成试验、免疫球蛋白(SRBC免疫动物后4天测定血清igm)、nK细胞活性测定、血液或脾t淋巴细胞和B淋巴细胞亚群分析等。
1.3美国npt的免疫毒性评价指南
1988年LUSteR等提出外源性化学物和药物小鼠免疫毒性评价方案，被美国多家毒理学机构及实验室采用。此方案分两级，第一级筛查可能的免疫毒性物质，包括七类十余项指标;第二级包括四类八项指标，对于第一级试验中的一个或多个试验有影响的化合物需进行进一步的试验研究。
1.4美国nRC推荐的人群免疫毒性检测方案
人群免疫毒性检测对于确定外源化学物对人体健康危险度评价有十分重要的意义。上世纪80年代由美国国家研究委员会(nationalResearchCouncil，nRC)提出的人群免疫毒性检测方案分为三级，所有接触免疫毒物的人均需进行一级检测，在一级检测中发现有异常的所有人或选择部分接触人群进行二级检测，如发现异常则需进行三级试验。
2欧洲的免疫毒性评价指南
1983年欧盟首次提出对新医疗产品进行免疫毒性评价的意义和必要性，虽存在很多的不足，其仅对免疫器官进行组织病理学检测，但引发了学术界和官方管理机构对新医疗产品的非临床免疫毒性评价的广泛关注。欧洲医药评价署(europeanagencyforevaluationofmedicalproduct，emea)的专卖医药委员会(Committeeforproprietarymedicinalproducts，Cpmp)在1998年首次引入免疫毒性的新概念，即免疫毒性评价的重点不再局限于免疫抑制，明确强调药物诱导的自身免疫和超敏反应也是免疫毒性评价的重点内容。2000年Cpmp了重复剂量毒性试验指南，其中第6部分对上述免疫毒性指导原则进行了更新，可适用于人用药物如生物技术衍生物、疫苗、抗癌药物等的毒性评价。一般选用两种哺乳动物进行试验，其中必须有一种为非啮齿动物。试验设阴性对照组、阳性对照组和受试物3个不同剂量组，试验周期为28天。初级筛选试验中进行血液学检测、免疫器官重量及其脏体比、免疫器官组织病理学检测、骨髓细胞数、淋巴细胞亚群分析和nK细胞活性测定。如任一结果呈阳性，则需进行体内或体外免疫功能扩展试验如迟发型变态反应、淋巴细胞对有丝分裂原刺激的增殖反应、巨噬细胞功能试验、对t细胞非依赖抗原的抗体反应以及宿主抵抗力试验。
emea更名为欧洲医药署(europeanmedicinesagency，ema)于2005年加入了“人用药物免疫毒性研究iCHS8”，并于2006年实施。
该指南用于对人用药物的非临床免疫抑制和免疫刺激的评价，而不包括自身免疫和超敏反应。值得一提的是，该指南并不适用于iCHS6所评价的生物技术衍生药物和其他生物制品。试验包括标准毒性试验和追加试验。2008年ema下属的人用医药产品委员会(CommitteeforthemedicinalproductsforHumanUse，CHmp)的“基因治疗药物临床使用前的非临床研究指导原则”也指出，有些基因治疗药物可能携带可编码对免疫系统具有影响的生长因子、细胞因子或大分子的基因，要评价其免疫原性和免疫毒性需进行体液和细胞免疫功能试验。
3日本的免疫毒性评价指南
在欧洲医药署和美国FDa的指导原则出台之后，日本厚生劳动省(mHLw)于2004年了免疫毒性评价指南草案，基于这两家机构的指导原则，mHLw也采纳了分级筛选的评价策略。首先进行标准毒性试验，通过动物重复剂量试验测定动物体重及脏器重量(脾、胸腺、肾上腺)、组织病理学(脾、胸腺、淋巴结和骨髓)。如在常规免疫毒性试验或其他研究中发现毒性时，需要在开始i期临床试验前进行初级抗体反应试验并选择性进行nK细胞活性试验。如出现阳性结果时对免疫毒性进行深入研究，包括骨髓细胞计数，免疫细胞表型分析，血清免疫球蛋白，免疫组织化学，抗体水平，nK细胞活性，淋巴细胞增殖反应，细胞毒性t细胞杀伤试验，血清补体，细胞因子，巨噬细胞或中性粒细胞功能试验，迟发型变态反应，宿主抵抗力试验，关节腔淋巴结反应(lymphnodereactionofarticularcavity)，速发型超敏反应，自身抗体，尿蛋白。mHLw也提出超敏反应的检测方法包括Gpmt、贴片试验(patchtest)和Buehler试验，可根据具体情况选择不同的试验组合:Draize试验、佐剂和斑贴试验(adjuvantandpatchtest)和Buehler试验;弗氏完全佐剂试验(Freund’scompleteadjuvanttest)、开放皮肤试验(opencutaneoustest)、最优化试验(optimisationtest)和裂口辅助试验(splitadjuvanttest)。
4国际组织的免疫毒性评价指南
4.1iCH的免疫毒性评价指南
1997年国际协调委员会(internationalConferenceofHarmonisation，iCH)制订了人用药物登记技术要求的生物技术衍生药物的临床前安全性评价指南S6［18］，其中涉及免疫毒性效应的有免疫抑制、免疫原性、自身免疫。考虑到药物对人体产生免疫原性的可能性，应进行抗体反应试验、抗体水平测定、补体活性试验、免疫器官的组织病理学检测。常规毒性试验不足以对生物技术衍生药物的免疫毒性进行评价，还应涵盖体液免疫、细胞免疫等方面的内容。但这一指南并未系统提出免疫毒性评价的具体方法。2005年9月15日，iCH了专门针对免疫毒性评价的iCHS8指导原则即“人用药物免疫毒性研究”，对于国际免疫毒理学来说是一个极具里程碑的事件。iCHS8将欧洲医药署(emea)、美国FDa药品评价和研究中心(CDeR)以及日本厚生劳动省(mHLw)三方关于免疫毒性评价的观点中一致的方面统一起来，即关于免疫抑制和免疫刺激的评价。该指南主要用于人用药物的免疫抑制或免疫刺激评价，但不适用于iCHS6中涉及的生物技术衍生药物和其他生物制品的评价。初始筛选试验包括对啮齿类动物的标准毒性研究和非啮齿类动物的慢性毒性重复试验，试验方法涉及血液学(白细胞数及其分类)、血生化(球蛋白和白/球比)、免疫器官重量和组织病理学、血浆免疫球蛋白、感染和肿瘤发生率。然后对初始筛选试验结果、药物药理学特性、潜在目的人群、与已知免疫毒性物质的结构相似性、药物在人体的分布以及临床信息等因素进行权重分析，决定是否进行追加试验。追加试验包括t细胞依赖性抗体反应(tDaR)、免疫细胞表型分析、nK细胞功能、宿主抵抗试验、巨噬细胞和中性粒细胞功能试验以及迟发型变态反应(DtH)等。新的iCHS8指导方针指出如果恰当的评价标准试验终点，可以检测到大多数药物的潜在免疫抑制作用。iCH三方关于免疫毒性指导原则的进度和方式各有不同。对于是否在常规的标准毒理学试验中加入免疫功能性试验存在争议，只有emea要求常规筛选试验中应包括淋巴细胞亚群分析和nK细胞活性的测定。2010年初iCH又了iCHm3，即“药物在人体临床试验和上市授权前的非临床试验指引”，该指引在欧洲、美国和日本之间达到共识，并且希望能对药物的非临床试验方法达成国际间协调，尽量减少各国和地区间的分歧。对免疫毒性评价仍采用个案处理的原则，并依据iCHS8指导原则进行。
4.2oeCD的免疫毒性评价指南
目前为止，经济发展和合作组织(organizationforeconomicCooperationandDevelopment，oeCD)尚未单独制订免疫毒理学安全评价指南，但在后期修订的一些非啮齿类或啮齿类动物28天经口毒性试验、啮齿类和非啮齿类90天经口毒性试验、慢性毒性试验和致癌试验等指南中阐明应观察免疫系统的毒性反应。对免疫器官脾、胸腺和淋巴结要进行组织病理学检测，这是免疫毒理学安全评价的一大进步，但遗憾的是缺乏必要的免疫功能检测，而后者在预测免疫毒性方面更为敏感。
细胞实验方案篇10
关键词]儿童白血病研究进展
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李娟 顾龙君200127上海第二医科大学附属新华医院上海儿童医学中心
aLLBFm为德国柏林法兰克福蒙斯特(BerlinFrankfurtm櫣nster,BFm)急性淋巴细胞性白血病(acutelymphoblasticleukemia,aLL)研究协作组的简称。这一协作组在过去的20～30年间对儿童aLL进行了大量的临床研究,提出了早期治疗反应的预后意义,对儿童aLL的治疗做出了巨大贡献。aLLBFm对儿童aLL治疗的研究进展大致可分为以下几个阶段:20世纪70年代的早期试验性研究、aLLBFm81方案、aLLBFm83方案、aLLBFm86方案、aLLBFm90方案、aLLBFm95方案、aLLBFm2000方案。这些方案对儿童aLL的诊断和治疗作了一系列调整,现将其演变和进展作一综述。一、诊断主要根据FaB形态学分型和细胞化学综合分析结果[1],确诊aLL的依据是外周血涂片发现幼稚淋巴细胞或骨髓中幼稚淋巴细胞不少于25%。确诊中枢神经系统白血病(centralnervoussystemicleukemia,CnSL)则需符合下列条件之一:脑脊液中白细胞计数>5个/μl和涂片镜检发现幼稚淋巴细胞,或Ct发现颅内浸润[2]。免疫分型主要依据欧洲白血病免疫分型协作组(europeanGroupfortheimmunologicalCharacterisationofleukaemias,eGiL)的建议[3]。细胞遗传学发现不仅有助于诊断,而且可以提供某些预后信息。aLLBFm协作组也相继开展了细胞遗传学研究。提出t(9;22)和t(4;11)等异常核型的预后意义。幼稚淋巴细胞的Dna指数(Di)为白血病细胞G0/G1期细胞同正常细胞的比率,以Di=116为界用于评估预后[4]。1992年12月,在各实验中心开展了逆转录聚合酶链反应(RtpCR)技术用于检测BCRaBL融合基因以来[5],通过2年随访发现BCRaBL(+)患儿的2年无事故生存(eventfreesurvival,eFS)为53%,BCRaBL(-)患儿为76%,两者差异有显著性。二、临床分型1.BFm危险因子(riskfactor,RF):aLLBFm协作组在1976年首次提出RF这一概念,用以衡量aLL初诊时白血病细胞负荷并进行危险程度分型。该方案规定RF用统一公式计算表示:RF=0.2×log(血中幼稚细胞数/μl+1)+0.06×肝cm+0.04×脾cm(均为肋下cm数)[6]。2.泼尼松治疗试验:泼尼松治疗试验这一概念最初在aLLBFm83方案中形成[7]。aLLBFm83方案对全部aLL患儿进行泼尼松治疗反应试验:以泼尼松单药治疗7天,并在泼尼松治疗的第1天给予氨甲喋呤(methotrexate,mtX)鞘内注射1次。为了防止急性肿瘤溶解综合征的发生,应根据白细胞计数,肾功能指标及各项机体代谢参数,将泼尼松剂量逐渐增加至60mg/(m2·d)。根据治疗第8天(d8)外周血幼稚细胞绝对计数进行评估:如幼稚淋巴细胞计数≤1000/μl为泼尼松敏感(prednisonegoodresponse,pGR);如幼稚淋巴细胞计数>1000/μl为泼尼松不敏感(prednisonepoorresponse,ppR)。aLLBFm83方案的研究结果进一步表明:泼尼松治疗试验能揭示白血病细胞的内在耐药性,并与预后相关。3.临床分型体系的演变:20世纪80年代之前,儿童aLLBFm协作组对aLL尚无系统的临床分型体系。aLLBFm81方案中根据RF将患儿分为三组,规定:标危(SR)RF<1.2,中危(mR)RF为1.2～1.7,高危(HR)RF≥1.7。aLLBFm83方案中,进一步将标危患儿分为低标危组(LSR)RF<0.8,高标危组(HSR)RF为0.8～1.2,中、高危分组与aLLBFm81方案相同。因aLLBFm83方案中发现了泼尼松治疗试验的重大意义,故aLLBFm86方案和aLLBFm90方案,主要根据RF和泼尼松治疗反应进行临床分型。aLLBFm86方案具体危险分组如下:标危组(SRG):RF<08,pGR,无中枢神经系统受累,无纵隔肿物;危险组(RG):RF≥0.8及pGR,或pGR伴中枢神经系统受累或纵隔肿物;试验组(eG):ppR,或诱导治疗第40天未达完全缓解(completeremission,CR)[8]。aLLBFm90方案危险分组基本同aLLBFm86方案;不同之处:用taLL因素取代纵隔肿物因素,高危组增加ph+染色体这一高危指标[9]。aLLBFm95方案在以往研究基础上,临床分型体系较以往体系(主要依据RF和泼尼松治疗反应)更为准确。SRG患儿必须满足以下条件:pGR;诱导治疗第33天(d33)骨髓达CR;不存在t(9;22)易位或BCRaBL融合基因,无t(4;11)易位或mLLaF4基因重组;wBC<20000/μl及年龄≥1岁、<6岁;非taLL。中危组(mRG)除符合前3个条件外还具有下述表现之一:wBC≥20000/μl;年龄<1岁或≥6岁。但高危组(HRG)患儿只需符合下列条件之一:ppR;d33骨髓未达CR;t(9;22)易位或BCRaBL融合基因;t(4;11)易位或mLLaF4融合基因。显然,该方案提供了一种严格的临床分型体系,尤其是SRG与mRG的分组。1991年以来,一些BFm研究小组采用灵敏的实验技术检测白血病的微量残留(minimalresidualdisease,mRD),如检测t细胞受体基因重排、免疫球蛋白重链(igH)基因重排[10]。研究结果表明,在化疗期间的特定时间点mRD的检测能够提供特殊的预后信息;但检测mRD技术要求较高,因此这种技术不能普遍开展。在1998年,BFm和意大利儿童血液肿瘤协会(italianassociationofpediatricHematologyandoncology,aieop)联合制定一个新的方案。该方案主要根据治疗反应将患儿进行临床分型,而不再依赖于诊断时存在的一些危险因素,诸如年龄、白细胞总数、免疫分型等。三、治疗1.主要硕果:儿童aLLBFm在一系列临床试验中,主要对以下四个方面有逐步的较深入的认识:(1)强化治疗为化疗的一个必要组成部分;(2)预防性头颅放疗(cranialradiotherapy,CRt)将照射总剂量降低至12Gy,以改善长期存活者的生存质量,如果早期给予全身强烈化疗和较强烈的氨甲喋呤+阿糖胞苷+地塞米松(mtX+arac+Dex)“三联”鞘内注射治疗(按脑脊液容量计算足量给予),可以不进行预防性头颅放疗;(3)维持治疗24个月比18个月全身复发率低;(4)ppR患儿全身复发率较pGR患儿高,在aLLBFm90研究中报道pGR患儿8年eFS为80%[9]。2.关键性药物和(或)成分的调整:(1)蒽环类药物:它作为aLLBFm方案中诱导治疗及强化治疗的主要药物之一。早在aLLBFm79方案中,诱导治疗柔红霉素(daunomycin,DnR)的剂量为25mg/(m2·次)×4次,强化治疗阿霉素(adriamycin,aDR)剂量为25mg/(m2·次)×4次。aLLBFm81方案与之相比,两者剂量均调整至30mg/(m2·次)×4次。aLLBFm86方案进一步将DnR剂量增加至40mg/(m2·次)×4次,aDR剂量同前。蒽环类药物的主要毒副作用为心脏毒性,并与该类药物的累计剂量相关。aLLBFm86方案已发现一部分患儿心功能受到影响(当累计剂量达280mg/m2时)。因此aLLBFm90方案中DnR与aDR剂量均减少到30mg/(m2·次)×4次,将累计剂量减少25%(累计剂量240mg/m2)。现在的aLLBFm方案中蒽环类药物累计剂量为240mg/m2。(2)左旋门冬酰氨酶(Lasparaginase,LaSp):LaSp亦作为诱导缓解的主要药物之一。诱导治疗阶段,在aLLBFm83方案以前LaSp用法为5000U/(m2·d),iv,d121;aLLBFm83、86、90方案,采用隔天1剂10000U/(m2·d),iv,共用8次,起始用药时间3个方案分别是d26、d19、d12;aLLBFm95方案采用5000U/(m2·次),iv,共用8次,隔天1剂,始于d12。强化阶段给予10000U/(m2·d),iv,每周2次×2周。当来源于e.coli的LaSp发生过敏反应时,可尝试用来源于erwinia的LaSp替代之。(3)mtX:最初在aLLBFm81方案中,随机对标危患儿采用中剂量的mtX[05g/(m2·24h)],共4个疗程,2疗程间间隔2周。以评价其在预防CnSL的作用。aLLBFm83方案对全部患儿采用中剂量mtX(0.5g/m2×4)。aLLBFm86、90、95方案中采用大剂量mtX(HDmtX)[5.0g/(m2·24h)],共4个疗程,2疗程间隔2周。同时行“三联”鞘内注射,aLLBFm86方案已证实HDmtX能够有效地预防髓外白血病,减少做CRt的比率。(4)头颅放疗:在应用中、大mtX预防白血病髓外复发的这一治疗措施之前(1982年前),在诱导缓解治疗的第二阶段,是采用CRt预防CnSL的复发,单CRt不能预防白血病(testicleleukemia,tL)的复发及其他髓外复发。aLLBFm83方案以后CRt用于强化治疗结束后,但在标危患儿中就不再使用放疗。CRt剂量自aLLBFm81方案以后,由18Gy减至12Gy。3.各阶段治疗方案的调整:aLLBFm早在20世纪70年代的试验性研究中采用8种药物诱导治疗8周,称方案Ⅰ(阶段a:泼尼松、长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶四药联合化疗;阶段B:环磷酰胺、阿糖胞苷、6巯嘌呤及鞘内注射mtX联合化疗),阶段B给予CRt,该方案将5年eFS提高至(55±6)%。此方案开创了aLL联合化疗和中枢神经系统放疗取得长期无病生存的新纪元[11]。但是,这种方法不能治疗诊断时白细胞计数很高的患儿,因此,1976年提出方案Ⅱ作为早期强化治疗,其组成成分基本为原诱导方案中的药物[阶段a:地塞米松、长春新碱、阿霉素、左旋门冬酰胺酶;阶段B:为环磷酰胺(只在方案Ⅱ使用)、阿糖胞苷、硫鸟嘌呤、鞘内注射mtX],结果明显提高HR患儿的治疗效果[12]。aLLBFm在其一系列临床试验中有3种强化治疗方案,即方案Ⅱ、方案Ⅲ、方案Ⅳ。方案Ⅲ:与方案Ⅱ不同之处在于阶段B不用环磷酰胺;方案Ⅳ只在aLLBFm81方案HR患儿中使用,其特点是采用阿糖胞苷联合足叶乙甙化疗8周。以上各强化方案在aLLBFm一系列方案中分别体现。在aLLBFm81方案中,围绕2个问题进行了一系列的临床试验研究[13]。(1)SR患儿中,比较预防性CRt与静脉用中剂量mtX[0.5g/(m2·24h)]联合鞘内注射mtX,结果提示两者在预防CnSL方面无明显差别;(2)将维持治疗由24个月缩短至18个月,旨在探索较长的维持治疗可否提高无病生存率和降低复发率。结果提示维持治疗24个月的结果优于18个月;此外,将蒽环类药物剂量增加。因长春新碱和泼尼松冲击治疗在维持治疗中疗效甚微,故不再使用,而用mtX[20mg/(m2·周),口服]和6mp[50mg/(m2·d),口服]作维持治疗。aLLBFm83方案中,在不同危险分组中进行了对照性临床试验。(1)在LSR患儿中随机对照强化方案Ⅱ的疗效,结果表明,在巩固治疗后,适当延迟强化治疗也能取得良好的疗效,更重要的是降低了化疗的不良作用。(2)在HSR患儿中比较12Gy与18Gy的CRt是否一样有效,结果发现放疗剂量对中枢神经复发率无影响。(3)进一步探讨维持治疗时间,在aLLBFm81和83方案中共有764例患儿随机参加该试验,结果表明:维持治疗24个月的8年无病生存率(diseasefreesurvival,DFS)为(77.3±2.3)%,18个月者为(712±2.4)%;两者中枢神经系统复发无差别,但对其他髓外和血液学复发来说,24个月的维持治疗复发较少。aLLBFm86方案始于1986年10月,来自德国、奥地利的61个临床中心参加了该试验,主要探讨以下几个问题:(1)强化治疗的重要性:SRG患儿中对照比较强化治疗对eFS的影响,结果发现,行强化治疗的患儿较不行强化治疗的患儿eFS高。因此强化治疗对提高aLL儿童eFS意义重大,5年eFS可达75%。(2)HDmtX的作用:HDmtX作为巩固治疗,可有效预防髓外白血病复发。HDmtX维持24h输注时,脑脊液中可达稳定的细胞毒浓度,同时鞘内注射mtX进一步加强了这一作用[14,15]。结果表明,全部患儿只有1.8%的患儿单独出现中枢神经系统复发。大多数无CnSL的患儿接受HDmtX后可不行CRt;但早期治疗反应差的患儿仅接受HDmtX而不行中枢神经系统CRt,还有可能发生CnSL。(3)蒽环类药物的剂量:将蒽环类药物的累计剂量增加至280mg/m2,一部分患儿发生心功能失常可能与之有关[16]。eG组患儿采用米托蒽醌,结果发现它对骨髓抑制明显从而阻碍了化疗的继续,同时心脏毒性增加,有3例eG组患儿死于心肌病变。另外,该研究方案提高了taLL的疗效,这可能与HDmtX有关。最近一项研究表明,HDmtX可成功治疗t细胞非霍奇金淋巴瘤[17]。aLLBFm90方案根据患儿对早期治疗的反应[9],对患儿进行临床分型,进一步调整治疗方案。(1)轮换应用化疗药物,以免早期发生继发性耐药,提高诱导治疗强度:提前应用LaSp(aLLBFm83方案d26、aLLBFm86方案d19、aLLBFm90方案d12);在诱导早期增加两次鞘内注射“三联”。(2)mRG患儿(随机化研究)在巩固治疗中使用LaSp(25000U/m2×4次)。结果显示,用LaSp和不用LaSp两者eFS差异无显著性。关于实验中应用e.coliLaSp(德国,medac产品)对治疗有否影响,研究者仍存在争议。欧洲癌症研究组织(oeRtC)报道LaSp的制剂类型可能影响eFS[18]。(3)HRG患儿中采用新的巩固、强化治疗方案,即在短期的诱导治疗(5周)之后,用3种不同组合的大剂量化疗方案,每方案由HDmtX(5g/m2,iv,维持24h)和大剂量阿糖胞苷[2g/(m2·次),iv,每12小时1次]与地塞米松、长春新碱、柔红霉素、异环磷酰胺、阿糖胞苷、6巯嘌呤进行不同的组合而成。但是这种调整并未改善ppR的预后,有人认为可能与方案中减少烷化剂药物(异环磷酰胺累计剂量较aLLBFm86方案减少4倍之多,不使用环磷酰胺)有关。统计结果显示,aLLBFm90方案全身复发率较高,6年单独骨髓复发率为(427±4)%;6年eFS为(34±3)%,较aLLBFm86方案的(47±5)%低。(4)降低化疗药物的毒副作用,在mRG患儿中减少蒽环类药物的剂量和累积剂量。统计发现,6年eFS为(78±1)%,较aLLBFm86方案高,而且降低了药物的心肌毒性。因此,目前aLLBFm蒽环类药物累积剂量为240mg/m2。(5)在mRG和HRG患儿中将CRt剂量减少至12Gy,结果发现其中枢神经系统相关的复发率并未升高。aLLBFm95方案是在以往aLLBFm方案的基础上发展而来,它首先提供了一种新的更为准确的临床分型体系,该方案对治疗的调整部分已通过临床试验得出结论。(1)在SR组中,将蒽环类药物剂量减少25%,心脏毒性降低,但疗效未降低,5年eFS为(89±2)%。(2)在mRG中,常规剂量阿糖胞苷[200mg/(m2·次)]24h持续静脉输注,联合HDmtX作为巩固治疗,结果该方法无优越性。(3)在mRG中(除taLL外),作了回顾性比较,不行预防性CRt;对初发时累及中枢神经系统的患者,放疗剂量减少至12Gy。统计结果提示,减少放疗未导致整体复发率的增加,CnSL复发率略有增加。(4)在HRG中,通过强化治疗(含有更多的烷化剂药物)提高治疗强度,使ppR患儿的5年eFS[(49±0.4)%]比aLLBFm90方案高。(5)在mRG中,增加地塞米松和长春新碱冲击治疗,能否提高疗效,目前尚无结论。另外研究中发现:第15天(d15)的骨髓象能够提供关于早期治疗反应的新信息;HRG中,d15的骨髓象可提供高复发可能的信息,因此它可作为造血干细胞移植的参考指标之一。随着分子生物学技术的提高,t(9;22)或t(4;11)易位检出率增加,这些患儿归为HR组。但在本方案中其治疗结果无明显改善。四、结语为迎接新世纪的挑战,aLLBFm协作组联合aieop提出aieopBFmaLL2000方案。该方案采用新的临床分型体系,几乎全部基于患儿对治疗的反应:(1)泼尼松治疗试验:如果患儿化疗d8外周血幼稚细胞>
1000/μl(ppR),则归为HR组。(2)诱导治疗d33骨髓缓解的程度:如果d33骨髓未达m1状态(骨髓增生,幼稚细胞<5%),归为HR组。(3)mRD反应,用半定量克隆技术检测化疗d33的mRD,以评价白血病细胞增殖动力学对治疗的反应,如d33的mRD>104,为治疗反应不佳,应归入HR组。该方案的研究内容主要为:通过敏感的mRD检测将患儿严格分型,调整治疗强度,提高疗效;降低个体复发风险,减少毒性;进一步探索新的评估信息,探讨定量检测化疗d15和d52的mRD。参考文献1BennettJm,CatovskyD,Danielmt,etal.proposalsfortheclassificationoftheacuteleukaemia.FrenchamericanBritish(FaB)cooperativegroup.BrJHaematol,1976,33:451458.2vanderDoesvandenBerga,BartramCR,BassoG,etal.minimalrequirementsforthediagnosis,classification,andevaluationofthetreatmentofchildhoodacutelymphoblasticleukemia(aLL)inthe‘BFmFamily’CooperativeGroup.medpediatroncol,1992,20:497505.3BenemC,CastoldiG,Knppw,etal.proposalsfortheimmunologicalclassificationofacuteleukemia.Leukemia,1995,9:17831786.4HarbottJ,RitterbachJ,LudwigwD,etal.Clinicalsignificanceofcytogeneticstudiesinchildhoodacutelymphoblasticleukemia:experienceoftheBFmtrials.RcecntResultsCancerRes,1993,131:123132.5SchliebenS,Borkhardta,Reinischi,etal.incidenceandclinicaloutcomeofchildrenwithBCRaBLpositiveacutelymphoblasticleukemia(aLL).aprospectiveRtpCRstudybasedon673patientsenrolledintheGermanpediatricmulticentertherapytrialsaLLBFm90andCoaLL0592.Leukemia,1996,10:957963.6LangermannHJ,HenzeG,wulfm,etal.estimationoftumorcellmassinchildhoodacutelymphoblasticleukemia:prognosticsignificanceandpracticalapplication.Klinpadiatr,1982,194:209213.7RiehmH,Reitera,Schrappem,etal.Corticosteroidtependentreductionofleukocytecountinbloodasaprognosticfactorinacutelymphoblasticleukemiainchildhood(therapystudyaLLBFm83).Klinpadiatr,1987,199:151160.8Reitera,Schrappem,LudwigwD,etal.Chemotherapyin998unselectedchildhoodacutelymphoblasticleukemiapatients.ResultsandconclusionsofthemulticentertrialaLLBFm86.Blood,1994,84:31223133.9Schrappem,Reitera,LudwigwD,etal.improvedoutcomeinchildhoodaLLdespitereduceduseofanthracyclinesandofcranialradiotherapy:resultsoftrialaLLBFm90.Blood,2000,95:33103322.10nealeGa,menarguezJ,KitchingmanGR,etal.Detectionofminimalresidualdiseaseintcellacutelymphoblasticleukemiausingpolymerasechainreactionpredictsimpendingrelapse.Blood,1991,78:739.11RiehmH,GadnerH,welteK,etal.thewestBerlintherapystudyofacutelymphoblasticleukemiainchildhoodreportafter6years.Klinpadiatr,1977,189:89102.12RiehmH,GadnerH,HenzeG,etal.theBerlinchildhoodacutelymphoblasticleukemiatherapystudy,19701976.amJpediatrHematoloncol,1980,2:299306.13Schrappem,BeckJ,Brandeiswe,etal.treatmentofacutelymphoblasticleukemiainchildhoodandadolescence:resultsofthemulticentertherapystudyaLLBFm81.Klinpadiatr,1987,199:133150.14milanoG,thyssa,SerreDF,etal.CSFdruglevelsforchildrenwithacutelymphoblasticleukemiatreatedby5g/m2methotrexate.eurJCancer,1990,26:492.15Hryniukwm,BertinoJR.treatmentofleukemiawithlargedosesofmethotrexateandfolinicacid:clinicalbilchemicalcorrelates.JClininvest,1969,48:2140.16LipshultzSe,ColanSD,GelberRD,etal.Latecardiaceffectsofdoxorubicintherapyforacutelymphoblasticleukemiainchildhood.nenglJmed,1991,324:808815.17Reitera,Schrappem,LudwigwD,etal.intensiveaLLtypetherapywithoutlocalradiotherapyprovidesa90%eventfreesurvivalforchildrenwithtcelllymphoblasticlymphoma:aBFmgroupreport.Blood,2000,5:416421.18ottenJ,SuciuS,Lutzp,etal.theimportanceofLasparaginase(a’ase)inthetreatmentofacutelymphoblasticleukemia(aLL)inchildren:resultsoftheeoRtC58881randomizedphaseⅢtrailshowinggreaterefficiencyofescherichiacoli(e.coli)ascomparedtoerwinia(eRw)a′ase[abstract].Blood,1996,88(Suppl1):669a.中华儿科杂志2002年10月第40卷第10期