微生物组学研究篇1
关键词：功能基因组；高通量数据；生物信息学
中图分类号：Q933文献标识码：a文章编号：1671-2064（2017）10-0190-01
功能基因组学（后基因组学），是在结构基因组所提供的丰富的高通量信息资源以及大量各类生成产物的基础上发展起来的基因组学的子学科。其通过在功能基因组水平或功能系统水平上全面地分析基因的功能，发展和提出了多种实验手段和分析方法，使得生物学的研究对象由单一基因或蛋白质转为多个基因或蛋白质组成的系统，进而得到关于基因表达、调控、功能以及生物的生长、发育的相关规律。
1差异显示反转录pCR技术
差异显示反转录pCR（DDRt―pCR）技术是由Liang和pardee等提出的，以pCR和聚丙烯酞胺凝z电泳为基础的功能基因组学的传统方法。该方法的基本原理是：以1对细胞（或组织）的总Rna反转录而成的cDna为模板，利用pCR的高效扩增，通过5’端和3’端引物的合理设计和组合，将细胞（或组织）中表达的基因片段直接显示在Dna测序胶上，从而找出1对细胞（或组织）中表达有差异的cDn断。DDRt―pCR具有周期短，功能多，灵敏度高，所需Rna的量较少并且重复性较高等优点。但是，在实际施行过程中，DDRt―pCR技术存在着假阳性率高、凝胶中单条cDna带成分不均一、所获cDna仅代表mRna3’UtR（非翻译区）、一些低拷贝数mRna不能有效呈现等问题。[1]
2基因表达序列分析
基因表达序列分析（SaGe）是Velculescu等人建立的一种快速高效地分析转录物的实验方法。其理论依据是：基因组中95%的基因可以由来自cDna3’端特定位置的一段9―11bp长的序列加以区分。这一段特异的基因序列被记作SaGe标签。基因表达序列分析通过对cDna制备SaGe标签，然后将这些标签串联起来并对其进行测定，可以显示出各SaGe标签所代表的基因在特定的组织中是否有表达，同时还可以将SaGe标签所出现的频率作为其所代表的基因表达程度的指标。但是，应用SaGe技术有一个重要前提条件：GenBank中必须有某一物种足够多的Dna序列的资料（特别是eSt序列的资料）。[2]
3微阵列分析
Dna微阵列（microarrayassay）技术包括cDna微阵列和Dna芯片（Dnachip）两种方法，这两种方法的原理相同。首先是在固相表面合成成千上万个寡核苷酸“探针”（cDna、eSt或基因特异的寡核苷酸），该过程会用到光导化学合成、照相平版印刷和固相表面化学合成等技术。接着将寡核苷酸“探针”与来自不同细胞、组织或整个器官的用放射性同位素或荧光物标记的Dna或mRna反转录生成的第一链cDna进行杂交。最后对每个杂交点进行定量分析。定量分析的结果可以用于Dna测序、Dna突变和多态性分析以及对同一组织细胞在不同状态下或在同一状态下多种组织细胞基因表达水平的差异的检测，还可以发现新的致病基因或疾病相关基因等。微阵列分析的优点是可以同时对大量的基因，甚至是整个基因组的基因表达进行对比分析，并且在核苷酸杂交技术的各个方面应用。其在同时比较同一组织在不同状态下或各组织之间Dna序列分析以及基因的表达状况等方面具有极大的优越性。
4反义Rna分析
反义Rna是能与靶Rna互补配对的，用来定点分析某一段Dn段（基因）功能的小分子Rna。反义Rna分析即是利用反义Rna来进行功能基因组分析的方法。该方法首先分离基因片段的mRna，合成其mRna的互补Rna（反Rna）。然后给反Rna加上基因表达必需的元件（如启动子等），接着插入t-Dna。将其转化到植株中，那么合成的基因就会在植株中表达，并表现出相应性状。因为反义Rna与靶Rna碱基配对的结合方式，反义Rna可以在Dna复制、转录和翻译水平上对基因表达加以调控。
5蛋白质组分析
蛋白质组分析方法主要涉及两个步骤：蛋白质的分离和蛋白质的鉴定。用于蛋白质分离的技术主要是双向凝胶电泳（2-dimensionalgelelectrophoresis，2-De），其原理是细胞抽提物在电泳过程中蛋白质个体首先依据所带电荷然后依据分子大小被分离。这种方法的最大缺点是重复性差，使得几乎不能同来自其他实验室的资料进行比较。
6生物信息学
生物信息学将Dna和蛋白质作为研究对象，以计算机等计算工具为基础，发展更新各种软件，收集、整理和储存Dna和蛋白质的序列和结构数据，并加以分析进而发现藏在基因序列中的规律。应用生物信息学可以对功能基因组研究过程中产生的高通量，高维度的数据进行处理，应用数理统计的方法，以计算机的快速运算能力，找到功能基因组的相关信息。常应用生物信息学将未知Dna序列与数据库中收集的Dna序列进行同源性比较，或应用相关软件进行核苷酸及氨基酸序列的同源性比较，以此来获得未知Dna序列的功能信息。[3]
7小结与展望
随着发展，基因组学由结构基因组学向功能基因组学发展，由此也产生了大量应用于功能基因组研究的工具和方法。这些方法从不同的角度和方向挖掘基因本身蕴含的丰富信息资源。功能基因组学无论是应用于获取大量基因功能信息，亦或是针对特定基因的研究都取得了突破性的进展，发展速度迅速。但随着各类研究的不断深入进行，这些方法的精确性和准确性会渐渐不再满足条件，同时各项技术尚未解决的一些问题也会被放大，单个方法或技术可能难以对新的问题有较好的应用。结合各种方法，扬长避短，综合应用各种技术可以对功能基因组有更全面、深入的研究。[4]
功能基因组学的应用十分广泛，从动物、植物到微生物群落分析都可以取得较好的研究成果，也可以应用于医药、毒理等领域。随着计算机技术的发展，将生物信息学应用于功能基因组学，借助计算机强大的计算能力，功能基因组学将能取得更大的突破。
参考文献
[1]赵锦荣，阎小君，苏成芝.差异显示反转录pCR技术研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2000，27（1）：28-32.
[2]常青山，余增亮.基因表达分析方法及其研究进展[J].生物技术通报，2002，（6）：27-31.
微生物组学研究篇2
论文摘要：代谢组学是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想,对生物体内所有代谢物进行定量分析,并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式。本文在介绍代谢组学基本含义的基础之上，对代谢组学的研究方法及其在环境微生物领域的研究进展进行了评述。
一、代谢微生物概述
代谢组学(metabonomics/metabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想,对生物体内所有代谢物进行定量分析,并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式,是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。化学分析技术中最常用的是1H核磁共振(1HnmR)以及色谱(毛细管电泳)-质谱联用(X-mS)。目前代谢组数据处理的主要方法是:应用主成分分析(pCa)等将从原始图谱信息或预处理后的信息进行归类,并采用相应的可视化技术直观地表达出来;建立类别间的数学模型,使各类样品间达到最大的分离,并利用建立的多参数模型对未知的样本进行预测;最终建立可利用的该领域的应用数据库和专家系统。应用代谢组学可进行疾病诊断、对药物进行毒性评价和研究植物细胞代谢等。
二、代谢组学的研究方法
代谢物组学分析中,对于不同类型的代谢产物,往往要采取不同的分析方法进行研究。目前,代谢物组学通常采用红外光谱法(infraredspectroscopy,iR)、核磁共振(nuclearmagneticresonance,nmR)、质谱(massspectrometry,mS)、高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,HpLC)以及各种技术的耦联,如气象色谱耦联质谱(gaschromatography2massspectrometry,GC/mS)和液相色谱耦联质谱(liquidchromatography2massspectrometry,LC/mS)来分析研究代谢物并为其绘制图谱。这些技术的耦联可以提高对样品的分辨率、敏感性及选择度,有利于对更多的生物体系内的代谢物绘制图谱。一般来说,选择代谢物组学分析方法时,其原则是要同时考虑仪器和技术的检测速度、选择性和灵敏度,找到一种最适合目标化合物的方法。
三、代谢组学在微生物领域的研究进展
(一)微生物分类,突变体筛选以及功能基因研究
经典的微生物分类方法多根据微生物形态学以及对不同底物的代谢情况进行表型分类。最近,随着分子生物学的突飞猛进,基因型分类方法如16SrDna测序,Dna杂交以及pCR指纹图谱等方法得到了广泛应用。然而,某些菌株按照基因型与表型两类方法分类会得出不同的结果。因此,根据不同的分类目的联合应用这两类方法已成为一种趋势。BioLoG等方法在表型分类中应用较为广泛,但是,代谢谱分析方法(metabolicprofiling)异军突起,逐渐成为一种快速、高通量,全面的表型分类方法。采用代谢组分类时,可以通过检测胞外代谢物来加以鉴别。常用的胞外代谢物检测方法为样品衍生化后进行GC2mS分析、薄层层析或HpLC2mS分析,最后通过特征峰比对进行分类。Bundy等采用nmR分析代谢谱成功地区分开临床病理来源以及实验室来源的不同杆菌(bacilluscereus)。除了表型分类外,代谢组学数据可以应用于突变体的筛选。在传统研究中的沉默突变体(即未发生明显的表型变化的突变体)内,突变基因可能导致了某些代谢途径发生变化,通过代谢快照(metabolicsnapshot)可以发现该突变体并研究相应基因的功能。
(二)发酵工艺的监控和优化
发酵工艺的监控和优化需要检测大量的参数,利用代谢组学研究工具可以减少实验数量,提高检测通量,并有助于揭示发酵过程的生化网络机制,从而有利于理性优化工艺过程。Buchholz等采用连续采样的方法研究了大肠杆菌在发酵过程中的代谢网络的动力学变化。他们在葡萄糖缺乏的培养液培养的大肠杆菌中加入葡萄糖,并迅速混匀,按每秒4～5次的频率连续取样。利用酶学分析、HpLC/LC2mS等手段监测样品中多达30种以上的代谢物、核苷以及辅酶,从而解析了葡萄糖以及甘油的代谢途径和底物摄取体系。通过统计学分析建模,发现在接触葡萄糖底物后的15～25s范围内,大肠杆菌体内发生的葡萄糖代谢物变化与经典生化途径相符,但随后的过程则与经典途径不符,推测可能存在新的未知调控步骤。takors认为,通过上述代谢动力学研究,掌握代谢途径及网络中的关键参数,将直接有利于代谢工程的优化,包括菌株的理性优化以及发酵参数的调控。
(三)环境微生物研究
微生物降解是环境中去除污染物的主要途径。深入了解污染物在微生物内的代谢途径,将有助于人们优化生物降解的条件,从而实现快速的生物修复。这些代谢中间体大都通过萃取、分析方法进行逐个研究,并借助专家经验拟合出代谢途径,其动力学过程亦很少触及。代谢组学方法的采用有可能改变这一现状。Boersma等采用代谢组学方法研究氟代酚的微生物降解途径。氟代化合物具有特殊的19F核磁共振属性,19F的核磁共振灵敏度与1H核相近;由于生物体内无内源性19F核磁信号,因而无本底干扰。所有19F核磁信号均可归结于异生素及其代谢物。19F核的化学位移值宽,约为700ppm(1H为15ppm,13C为250ppm)。较宽的化学位移导致19F在不同取代物的峰图不易产生重叠。因此,借助核磁共振技术可以更方便地研究含氟化合物的代谢中间体。Boersma等根据总代谢物的核磁共振图谱,推测出红球菌内羟化酶在不同的取代位(1,2,3三种不同的取代数量)羟基化氟代酚,然后再通过儿茶酚内位双加氧酶开环形成氟代粘糠酸的代谢过程。此外,他们还首次检测到开环后的下游代谢物,即通过氯粘糠酸异构酶生成氟代粘糠酸内酯以及氟代马来酸等中间代谢物。根际(rhizosphere)空间在植物2微生物相互作用中发挥着重要的作用。narasimhan等利用根际代谢物组(rhizospheremetabolomics)方法,阐释了植物分泌物对根际微生物降解多氯代酚(pCB)的作用机制。然而,在采用拟南芥突变体(产生较少的phenylpropanoids)的对照组中,降解菌的数量较低,降解率也仅达50%。结果表明植物根际分泌的次级代谢物促进降解菌的繁衍增殖,从而促进了污染物的降解。
此外,微生物代谢组学还应研究如何改进样品的制备方法。例如,在代谢组研究中,为了中止细胞代谢反应采用冷淬火(coldquenching)方法,将细胞样品迅速置于低温(液氮或-70℃甲醇中),这会导致许多微生物发生冷休克(cold2shock),释放出大量的胞内物质,引起代谢组学定量研究发生偏差。
参考文献：
[1]周宏伟,谭凤仪,钟音,栾天罡.代谢组学及其在微生物领域的研究进展[J].分析化学.2007(2).
微生物组学研究篇3
如果有人向你提出这个奇怪的问题，你也许会不假思索地回答：人类就是人呀！然而生物学家会告诉你，我们人类，就是人与寄存在人体躯壳内的大量微生物共生的一个小小的生态系统。
通过基因测序研究人体微生物
早在300多年前，显微镜被发明后不久，科学家已观察到人体内存在微生物。然而，由于检测、分析技术等的限制，人们无法大规模地获取人体微生物群的构成、功能等详细信息，更无法进一步了解这些数量庞大的微生物群与人体是如何相互作用的。
从人类基因组的破译开始，人们才真正对这些微生物有了比较深入的了解。2000年6月26日，当美国总统克林顿与英国首相布莱尔共同宣布人类基因组计划工作草图完成时，整个世界都为之轰动。围绕着破译“生命密码”的研究，引起公众的广泛关注和讨论。很多人曾认为，只要读懂人类基因组代表的“生命密码”，人类的所有健康问题将会迎刃而解。然而，越来越多的科学家发现，人体除受自身基因的调控外，还受到人身上大量的共生细菌的影响。
2007年底，美国国立卫生研究院正式启动为期5年的“人类微生物组计划”，共投入经费1.4亿美元。该计划是继“人类基因组计划”完成之后一项规模更大的Dna测序计划，也被称为“人类第二基因组计划”。其目标是探索研究人类微生物组的可行性。通过绘制人体不同器官中微生物元基因组图谱（包括细菌、病毒等微生物），解析微生物群结构变化对人类健康的影响。同时，为其他科学研究提供信息和技术支持。我国作为参与者也一直积极推动初期研究工作。
欧盟也有类似的研究项目，例如，作为人类元基因组第七框架项目的子项目，人类肠道宏基因组计划就主要研究人类肠道中的所有微生物群落，进而了解人肠道中细菌的物种分布，最终为后续研究肠道微生物与人的肥胖、肠炎等疾病的关系提供非常重要的理论依据。中国深圳华大基因研究院承担了该计划中的200多个欧洲人肠道微生物样品的测序及后续生物信息分析工作。
这一系列研究项目正在揭开人体微生物神秘的面纱。例如，研究发现肠道菌群结构的改变与失衡除了会导致肠道疾病外，还与糖尿病、肥胖等很多慢性全身性代谢性疾病有密切关系，甚至还与癌症有关。微生物甚至还影响着机体免疫系统的发育成熟。越来越多的研究提示，人类健康与人体微生物息息相关，随着人体与微生物之间的关系不断得到阐明，人们对于人体本身的认识、对于健康和疾病的认识以及医疗模式都有可能随之发生根本的改变。
研究发现微生物与人体健康息息相关
2010年3月4日，欧盟于2008年1月1日启动的人类肠道宏基因组计划的研究小组公布阶段性重大成果，引起世界的关注。该项研究成果收集了124个来自于欧洲人肠道菌群的样本，采用了新一代大规模高通量的测序技术进行深度测序，产出近6千亿的碱基序列。经过序列组装和基因注释分析，从中获得330万个非冗余的人体肠道宏基因组的参考基因，大概是人自身基因的150倍。这个基因集中包含了绝大部分目前已知的人体肠道微生物基因，但更多的是目前未知微生物的基因。从这个基因集中可以估计人肠道中存在1000种至1150种细菌，平均每个人体内含有约160种优势菌种，并且这些细菌是绝大部分个体所共有的。也就是说，我们每个活着的人体内都有大约100万亿个微生物细胞，总重量约1.5千克。微生物细胞的数量是人体细胞的10倍，在人体的独特基因中占99.9%。它们的构成在很大程度上决定着人体的运转以及机能正常或失常。
美国人类微生物组计划在2012年集中公布了第一批研究数据，来自多个国家的超过200名科研人员报道了他们5年来的研究成果。他们分析了242个美国健康志愿者微生物基因组，获得了近800个菌种的基因参考序列。他们发现，来自牙齿和粪便的微生物样本其类型和遗传多样性是最强的;来自皮肤和脸颊内侧样本的多样性次之;而来自阴道样本的多样性是最低的。
科学家们还发现，不同国家人群中的肠道微生物存在很多差异，差异最显著的是微生物的多样性程度。例如，印第安人和马拉维人的肠道微生物组比美国人的肠道微生物具有更大的多样性。有观点认为，微生物多样性程度越高，人体越健康。该研究还发现，尽管来自三种不同地域人群的肠道微生物组存在很多差异，但它们之间也存在惊人的相似性。例如，三个不同国家的婴儿微生物组形成过程具有共同的模式，即婴儿需要6个月至9个月的时间来获得第一组600～700个细菌，然后再经过几年的时间才能获得成人的微生物组。该研究还发现了一个非常有趣的现象，即肠道微生物组的构成会随年龄增长而发生改变，而这一变化恰恰适应了不同年龄段人体的需求。
同时，人体微生物还与免疫系统有着密切的关系。2012年4月，日本科学家在《科学》报告，发现一种免疫抑制性受体控制着肠道菌群的构成，如果这种受体缺失，肠道内的微生态环境就会紊乱，会导致全身免疫系统过度活跃，进而有可能出现自身免疫性疾病等病态变化。研究者认为，这些新发现有望帮助开发预防或缓解自身免疫性疾病症状的新方法。同期《科学》的另一项研究也提示，在生命早期接触微生物可以减少哮喘或炎症性肠病等疾病的发生。
人类肠道菌群与肥胖
随着科学家们研究的深入，我们对人类体内的微生物，尤其是肠道内的菌群，有了更多的了解。人类的消化系统实际上是一个复杂的生态系统，成百上千种细菌在那里开展各种活动，比如，让未消化的碳水化合物发酵、提供维生素，等等。它们还能调节你身体储存的脂肪量。
不过，并非每个人都有同样的肠道菌群。而且，有趣的是，菌群的组成与肥胖有关。当然，这种关系可能很简单，胖人的饮食不同，所以，他们的肠道菌群也不同。
2013年《科学》杂志发表的一项研究表明，这种因果关系也有可能颠倒过来。研究人员从一些双胞胎小鼠身上取出细菌，双胞胎中有一只肥胖，另外一只不胖。然后，他们将细菌移植到不同的小鼠身上。接受了肥胖双胞胎菌群的小鼠体重增加了，其他小鼠则不然。这些小鼠的进食没有增加：是它们的新陈代谢变化导致了体重增加，即使摄入的热量不变。
那么，是什么决定了你的肠道菌群呢？有可能是抗生素、环境毒素或食品的加工方式。《新英格兰医学杂志》上发表的一项研究表明，肥胖似乎能在社交网络中“传染”，让朋友和邻居感染上肥胖。我们以前一直认为，那是物以类聚、人以群分的结果―这也确实是部分原因。不过，会不会是肠道菌群也可以在非常亲密的人之间传播，所以，肥胖或许真的可以传染？
生物因素和行为因素之间往往存在相互作用，比如流感的传播就跟我们是否勤洗手关系巨大。同样地，这项对细菌的研究也发现，只有当小鼠的饮食中含有大量饱和脂肪时，“肥胖肠道菌群”才会起到作用。
最有趣的大概是，改变生物因素甚至可以改变人的欲求。一些生物学家推测，我们的肠道细菌其实驱动了我们对某些不健康食品的渴求。所以，重视生物因素并不等于淡化行为因素，而是意味着从更多的维度理解它。
我们身上的微生物正在发生变化
关于人类和与人类共存的微生物，正在发生一些值得我们忧虑的变化。就像全世界的生态系统一样，人类微生物菌群正在失去它们的多样性，以至于可能会损害它们所寄居的主体的健康。
纽约大学医学院传染病专家、人类微生物组计划负责人马丁・J・布拉泽博士在过去30多年间，一直研究细菌在疾病中发挥的作用。除传染病外，他的研究范围还囊括了自体免疫疾病，以及其他在世界范围内急剧增加的疾病。
布拉泽在他的新书《消失的微生物》中表示，微生物组多样性的减少导致我们更容易感染严重且通常都是慢性的疾病―从过敏、乳糜泻到一型糖尿病和肥胖症。布拉泽及其他人认为，这主要是由抗生素造成的。
布拉泽表示，抗生素很早就开始对微生物多样性产生破坏。普通的美国儿童在出生的头两年要接受大约3个疗程的抗生素，在接下来的8年里，要再进行8个疗程。很短疗程的抗生素治疗就能致使人体的微生物环境发生长期转变，比如，被广泛使用的阿奇霉素。
抗生素并不是破坏平衡的唯一因素。布拉泽接受采访时表示，近几十年，选择剖腹产的人激增，剖腹产促使婴儿内脏中的微生物来自母亲的皮肤，而不是产道。
微生物组的变化能够改变婴儿的新陈代谢和免疫系统。最近，研究人员查阅了15项共涉及16.3796万个分娩案例的研究，结果发现，与顺产的婴儿相比，剖腹产婴儿成人后超重的几率要高26%，肥胖的风险要高22%。研究人员发现，人的胎盘有自己的微生物组，这个微生物组可能也有助于婴儿的内脏健康，减少由剖腹产引发的微生物损耗。
其他研究发现了正常体重者与肥胖者肠道中微生物的主要差异。虽然这些研究不能说明最先出现的是那个问题―体重问题或微生物组的变化，但研究说明，肥胖的老鼠体内存在能够更好地从食物中吸取热量的肠道菌群。与肥胖相关的进一步证据来自农场里的动物。在美国出售的抗生素中，大约有3/4都用在牲畜身上。这些抗生素改变了动物的微生物菌群，加快了它们的生长速度。布拉泽说，当我们把用于牲畜的抗生素用在老鼠身上时，它们的新陈代谢就会发生改变，并促使它们的体脂增加。
更严重的是，如今有越来越多严重的功能失调都与人类内脏的微生物平衡被破坏有关。其中，有多种功能失调在发达国家中变得越来越常见，如克隆氏症、溃疡性结肠炎和乳糜泻胃肠疾病等;心血管疾病;非酒精性脂肪肝;慢性反流症等消化失调问题;多发性硬化和风湿性关节炎等自体免疫性疾病以及哮喘和过敏。
有些研究人员甚至推断，内脏微生物菌群失调是造成乳糜泻的原因，所以，甚至连没患这种病的人对无麸质食物的需求也会激增。乳糜泻旧称非热带脂肪泻，又称乳糜腹泻、麦胶引起的肠病（简称麦胶肠病）。乳糜泻是一种具有遗传性的发生于小肠的自身免疫性疾病，从婴儿到各年龄段的人都会罹患。乳糜泻的症状包括慢性腹泻，生长迟滞（儿童）和疲劳，但有些人症状不明显。在北美、北欧、澳大利亚发病率较高，我国国内很少见。
布拉泽和其他研究人员，还有来自瑞士和德国的一组研究人员也认为，哮喘患病率的大幅上升与“幽门螺杆菌从西方社会快速消失有关”。众所周知，幽门螺杆菌是一种长期寄存在人类胃里的细菌性病原体。曾几何时，几乎每个人体内都有这种细菌，欧洲研究者已经证明，它能防止老鼠出现过敏性哮喘的症状。在人生命的早期阶段，幽门螺杆菌的存在能促使血液中产生t细胞。布拉泽表示，压制过敏反应就需要这种细胞。他的研究表明，虽然有些类型的幽门螺杆菌与消化性溃疡和胃癌有关，但其他类型则具有保护作用。布拉泽和同事的研究进一步表明，胃部的幽门螺杆菌能够防止胃食管返流疾病、巴雷特氏食管（食管下端有不正常的柱状上皮覆盖，称之为巴雷特氏食管。普遍认为是后天获得的，并与反流性食管炎密切相关，并有发生腺癌的可能）和食道癌。
研究者不是总能说明肠道菌群紊乱会在人们生病之前还是之后出现。不过，对实验室动物的研究往往表明，菌群紊乱会发生在生病之前。
微生物组学研究篇4
关键词普洱茶；发酵；微生物
中图分类号S571.1文献标识码a文章编号1007-5739（2016）21-0253-03
普洱茶是以云南大叶种晒青毛茶为原料经后l酵加工而成紧压茶或散茶，普洱茶又按照其加工工艺将其分为普洱生茶和普洱熟茶。普洱熟茶是晒青毛茶经潮水、渥堆，经渥堆过程中物质变化是由微生物、酶、湿热、氧化等综合作用的结果，因其经过人工后发酵以区别于普洱生茶。
近年来，随着对普洱茶的深入研究，证实了普洱茶具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂和降血糖等功效[1-4]。晒青毛茶不经过微生物的发酵难以形成普洱熟茶所特有的香气和汤色，一般认为微生物或微生物酶的湿热作用对普洱茶品质的形成起着决定性作用[5-7]。
1普洱茶加工方式与微生物
普洱茶鲜叶采摘经萎凋后，进行杀青，再揉捻，后晒干制得晒青毛茶。再由晒青毛茶加工得到普洱茶，其具体制作工艺流程如图1所示。
将晒青毛茶经人工增湿渥堆快速发酵而制成普洱熟茶[8]。普洱熟茶的加工方式借鉴于安化黑茶，但又不同于安化黑茶。其主要的不同在于普洱茶经过晒青毛茶这一步，而安化黑茶从揉捻到后发酵不经过干燥过程，再焙火干燥[9]。
普洱茶与红茶的发酵方式相比，普洱茶的发酵与红茶有些相似，都有茶多酚经氧化生成茶红素和茶褐素的过程，不同之处在于红茶发酵仅需要3～4h，而普洱茶发酵所需时间较长，渥堆时间至少需要3～4周。因为红茶发酵时间短，所以微生物作用较少，主要是生物酶的作用，而普洱茶的发酵与微生物的作用是分不开的。
普洱原料晒青毛茶就有大量的内生菌，晒青毛茶又长期暴露在空气中，在研究中发现很多发酵过程中的微生物都在普洱茶鲜叶中[10]和茶园空气中[11-12]都有发现。普洱茶渥堆时，刚开始温度由室温缓慢升高，其潮水量常达到40%左右，堆温一般保持在28～55℃，非常适合微生物的生长。在发酵过程中，肉眼可见真菌菌丝。一般认为，普洱茶的加工过程离不开微生物的作用，普洱茶的品质与微生物的消亡有密切关系。
2参与普洱茶发酵过程的微生物研究方法
2.1微生物的传统分离鉴定
研究微生物学的传统方法是将茶叶与无菌水按一定比例进行均质，然再做梯度培养，以此来初步了解渥堆发酵中普洱茶中微生物数量，然后对分离得到的微生物进行纯培养，以更好地进行菌种鉴定或保藏。鉴定方法主要为形态学鉴定或根据生理生化性状，一般将结果与标准分类系统中微生物形态或生理生化性状进行对比[13]。该方法是研究微生物的主要方法，已成功证实普洱茶中确实存在细菌、酵母、霉菌和放线菌[14-28]。
2.2微生物自动鉴定系统
鉴于微生物传统鉴定方法的缺陷如工作量大，不利于操作，还受限于鉴定者的专业知识和认知能力。传统鉴定方法还常常受培养条件的限制，很多微生物不能在培养基上被分离培养出来，造成了鉴定种群不够完整，使得人们无法全面了解普洱茶发酵过程中的微生物种群情况，多数只是鉴定到了优势菌种或是在一定的培养条件下表现为优势的菌群。
近年来微生物快速鉴定仪更多地应用到微生物鉴定工作来，该系统是将微生物与底物反应的生化类型与已知建立的数据库中的类型比较，使微生物鉴定更加快速、准确。mo等[20]利用apiiD32C和apiiD50CHL微生物快速鉴定系统对普洱茶发酵过程中的微生物进行鉴定，发现了多种酵母和细菌。但由于该系统是根据现有数据库中所提供的背景资料进行微生物鉴定，数据库资料会影响微生物鉴定的种类及准确性。
2.3分子生物学方法
paCenR的研究表明，传统分离方法鉴定的微生物只占环境微生物总数的0.1%～10.0%[29]，传统鉴定方法还常常受培养条件的限制，很多微生物不能在培养基上被分离培养出来，造成了鉴定种群不够完整，使得人们无法全面了解普洱茶发酵过程中的种群情况，多数只是鉴定到了优势菌种或是在特定的培养中为优势的菌群。日本学者m.abe等[30]应用pCR变性梯度凝胶电泳（pCR-DGGe）技术研究普洱茶发酵过程中微生物群落结构，对不同发酵阶段的普洱茶中微生物种群进行了研究，发现普洱茶2种优势种群，同时在用孟加拉红培养基，pDa培养基在30℃培养时也证实了这一结论，进一步说明了将分子生物学方法用于普洱茶发酵过程中微生物学研究是可行的[30]。
剂量组也对普洱茶鲜叶中的内生菌[10]进行了研究，普洱茶渥堆发酵微生物的研究以及普洱茶区空气微生物[11-12]的研究中都分别采用了pCR，polymeraseChainReaction（聚合酶链式反应）分子生物学的方法，扩增细菌的16SrDna和真菌的itS序列测定分析或pCR-变性梯度凝胶电泳（pCR-DGGe）对参与或有可能参与普洱渥堆发酵的微生物进行了鉴定。
吕昌勇[31]利用宏基因组学高通量测序研究方法认为，细菌是普洱茶渥堆发酵过程中的主要菌群，占总微生物的76.26%；真核生物次之，占16.35%。目前应用高通量测序在普洱茶渥堆发酵微生物的研究中很少涉及，赵明等[32]在利用高通量测序方法研究普洱茶发酵过程中的微生物，对参与普洱茶渥堆发酵微生物种群作了初步的鉴定。weiZhang等[33]通过实时定量pCR研究认为，烟曲霉、微小根毛霉、热带假丝酵母菌、镰刀菌、thermomyceslanuginosus、aspergillusniger、blastobotrysadeninivorans、Rasamsoniaemersonii、asper-gillustubingensis、Rasamsoniacylindrospora、Rasamsoniabyss-ochlamydoides等嗜热菌在普洱茶渥堆发酵过程中起着重要的作用。
3普洱茶发酵微生物研究进展
3.1普洱茶微生物种群
陈宗道等[14]从20世纪80年代开始研究普洱茶中的微生物以来，已经证实细菌、酵母、霉菌和放线菌都参与了普洱茶的发酵。
周红杰和赵龙飞等[6，18]先后从普洱茶和普洱茶翻堆样品都分离得到了黑曲霉、酵母菌、米曲霉、根霉、灰绿曲霉和极少的细菌。方祥等[23]，m.abe等[30]以及杨瑞娟等[34-35]从不同年代的普洱茶和渥堆发酵的普洱茶中分离得到了霉菌（黑曲霉、微小根毛霉、牛根毛霉）、酵母、细菌（芽孢U菌，Bacilluscoagulans，球菌，无芽孢短杆菌，乳酸菌，植物乳杆菌，类乳酸片球菌和大量嗜热细菌）、放线菌。吕昌勇[31]认为，普洱茶发酵初期的优势细菌是变形菌门（proteobac-teria），随后厚壁菌门（Firmicutes）上升成为优势菌，放线菌门（acti-nobacteria）与Firmicutes在发酵后期繁成为共同优势菌。原料的优势真菌归类为no-rank-Fungi（65.39%），发酵过程中，曲霉属（aspe-rgillus.sp）真菌一直处于优势；发酵中期环境中的根毛霉属（Rhizomucor.sp）先升高后降低。
3.2优势菌种与普洱茶品质的关系
近年来，关于普洱茶与微生物关系研究更多地集中在优势菌种对普洱茶品质影响的研究，多数是将分离纯化后的微生物再接种到普洱茶中，用来研究普洱茶品质改变情况。陈秀燕等[36]将灰绿曲霉和青霉接种到普洱生饼茶和散茶中，能明显加速普洱茶陈化的作用，且能提高茶汤的香气。研究表明，灰绿曲霉和青霉接能加速茶叶中纤维和果胶的降解，使普洱茶更加甘滑、醇厚。董文明等[27]认为，普洱茶发酵过程中，黑曲霉产淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶，酵母菌产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶，细菌只产淀粉酶、蛋白酶。经过这些酶的作用后普洱生茶形成了普洱熟茶甘厚浓醇的品质特征。周才碧等[28]利用优势菌株黑曲霉纯种对普洱茶进行发酵试验，得到的茶样香气浓纯、汤色呈黑褐色、滋味较平和，且茶色素发生明显变化，表明黑曲霉可以作为发酵用菌种，适于普洱茶的渥堆发酵。康燕山等[37]对普洱茶在普洱茶发酵过程中添加外源酶和接种酵母，其结果表明，使用外源酶可增加普洱茶所含水溶性总糖及游离氨基酸的含量，接种酵母可明显加速普洱茶茶多酚的转化。
4普洱茶发酵过程中微生物学研究存在的不足及展望
4.1存在的不足
目前对参与普洱茶发酵微生物的研究都集中在优势菌和能培养的微生物上，对于非培养微生物研究仍然很少涉及，对于这些微生物在普洱茶渥堆发酵中的作用研究就更无从谈起。对于普洱茶发酵微生物对普洱茶品质的转化作用及其机制研究首先就要解决非培养的微生物鉴定工作。目前关于普洱茶中微生物发酵的研究已经日趋成熟，宏基因组学[38]也更多地应用于普洱茶发酵微生物研究中来，多数都是停留在第一代测序研究上。关于微生物对普洱茶品质的影响，更多的是在于研究接种某一种或多种优势微生物或酶对发酵品质的影响，而忽略了普洱茶发酵微生物群落对普洱茶发酵的影响。
4.2展望
微生物第二代测序技术在环境微生物的研究方面已经非常成熟，已经广泛应用于环境微生物的研究[39-40]，而对普洱茶发酵中的微生物的研究结果却少之又少。吕昌勇[31]和赵明等[32]利用高通量测序方法对普洱茶渥堆发酵中的微生物进行了研究，这一技术的应用为普洱茶中非培养微生物的研究提供了新的可能。高通量测序技术在环境微生物的研究中常比pCR-DGGe法检测灵敏度高3.8～39.4倍[41]。
利用高通量测序技术将普洱茶从鲜叶到普洱熟茶成品的微生物组成作出系统研究，并总结出这些微生物生长和消亡规律，对普洱茶鲜叶、干茶、渥堆的每个时期和成品的微生物生态系统作出系统的研究，探明这些微生物在每个时期的组成情况如何，以使人们能更好地探明普洱茶在发酵中是否有有害微生物的参与，为明确这些微生物在发酵过程的作用提供更为全面而系统的研究对象，从而有利于更好地了解普洱茶发酵中微生物的消亡规律和其对普洱茶品质的影响。
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微生物组学研究篇5
传统的功能微生物鉴定方法是在含有特定碳源培养基上对目标微生物进行富集、分离与纯化，由于实验室可培养的微生物只占微生物总数的0.1~1%[1]，因此以纯培养技术为代表的鉴定方法存在很大局限性。20世纪后半叶，以分子生物学为特色的现代土壤微生物研究方法取得突破性进展，包括以磷脂脂肪酸（pLFa）技术为代表的生物化学方法，以BioLoG技术为代表的生理学方法和基于Dna多态性的微生物群落结构和功能多样性的分子生态学技术，如变性梯度凝胶电泳（DGGe）、限制性片段长度多态性（RFLp）、末端限制性酶切片段长度多态性分析（t-RFLp）和实时荧光定量pCR技术（Rt-pCR）等。上述技术提高了人们对土壤微生物群落结构组成的认识，但仍难提供有关微生物间相互作用及代谢功能微生物的直接信息[1-2]。例如，DGGe和t-RFLp等分子指纹图谱方法只能检测环境样品中的优势微生物群落，但具有特定生态和环境功能的微生物通常在数量上并不占优势[3]。因此，功能微生物很难被这些分子指纹图谱方法所鉴别[2]。据估算，每克土壤含有约100亿个微生物个体，包括100万种不同的微生物种群。利用上述技术，从这些难以计数的土壤微生物中原位鉴别特定生态过程的微生物驱动者是难以想象的[4]。近年来得到广泛关注的稳定性同位素探针技术与现代分子生物学相结合，可以在相对未受干扰的环境样品中培养功能微生物，利用稳定性同位素示踪复杂环境中的功能微生物核酸（Dna/Rna）或pLFa[5]，在分子水平鉴定生态系统重要过程的微生物驱动者。其基本原理是在土壤中添加含有稳定性同位素标记的代谢底物，土壤中利用该标记底物的微生物细胞在其生长繁殖过程中同化合成含标记元素的生物标志物。通过对生物标志物进行提取、分离、鉴定和比对分析，鉴别土壤中驱动特定生态过程的功能微生物。该方法可以准确获得功能微生物的目的基因，避免了从浩瀚基因库里一个个筛选目的基因的烦劳工作，已成为原位鉴定功能微生物的重要手段。1土壤功能微生物Sip鉴定技术流程Sip技术是耦合微生物遗传多样性与代谢多样性最有力的工具之一，该技术以复杂的原位或微宇宙土壤样品为研究对象，采用稳定性同位素原位标记土壤样品定微生物的Dna、Rna或pLFa。目前绝大多数研究采用13C标记底物培养土壤，利用13C-底物的微生物细胞不断分裂、生长、繁殖，合成含13C标记的Dna或Rna等生物标志物。提取土壤样品中13C-核酸和12C-核酸总混合物，用超高速离心技术将13C-核酸与12C-核酸分离，利用分子生物学手段对生物标志物进行分析，以鉴别土壤功能微生物。近年来，以15n和18o为基础的Sip技术也被成功应用于微生物驱动的土壤生态过程研究[6]。1.1土壤Sip技术前处理方法选择Sip技术前处理包括标记底物的培养和特定微生物核酸或磷脂脂肪酸提取两个步骤。培养方式主要包括添加营养液富集培养和仅添加标记底物培养等方式。添加营养液富集培养法可以为微生物生长提供相对稳定的环境，并促进微生物的生长，以获得足够的核酸或磷脂脂肪酸提取量[7]。土壤Dna/Rna的提取方法主要包括试剂盒提取法和液氮研磨法等。试剂盒法操作简单，提取纯度高，但提取量较低，费用高。液氮研磨法可以较好保证Dna/Rna的完整性，提取量相对较高，且操作费用低，时间短，但需纯化后才能满足Rt-pCR等后续分子生物学要求[8]。土壤pLFas提取方法主要为两种：一种是pLFas法，即先通过氯仿-甲醇单相萃取浸提土壤微生物脂肪酸，再经硅胶柱纯化以及酯化作用得到活体细胞膜结合态Fame，提取的脂肪酸种类仅有el-脂肪酸，多为细菌所特有。另一种是tSFames法，即通过碱甲醇分解法提取总土壤Fames。提取的脂肪酸种类包括酯连接和非酯连接pLFas，多为真菌所特有[9]。1.2土壤Sip技术中生物标志物的选择土壤Sip技术定微生物的生物标志物为pLFa、Dna和Rna3种。pLFa-Sip法是将pLFa从重稳定性同位素（如13C）标记过的环境样品中提取出来，通过pLFa图谱分析微生物群落的结构和多样性，再通过气相色谱-燃烧-同位素比率质谱联用法测定各种pLFa中13C的丰度[7]。pLFa-Sip的标记底物浓度要求较低，灵敏度较高，但存在一些缺点：（1）对于未知pLFa分子图式的不可培养微生物，或者土壤中的某种特殊脂肪酸无法与特定种类的微生物相对应，该方法就无法鉴定功能微生物。（2）该方法在很大程度上依赖于标记脂肪酸来确定土壤微生物群落结构，标记上的变动将导致群落估算上的偏差。（3）细菌和真菌生长条件的改变或环境胁迫都能导致脂肪酸类型的改变[9]。同pLFa-Sip法相比，Dna-或Rna-Sip可获得更直接的功能微生物遗传信息。Dna-Sip的优点是：标记的13C-Dna一定来自新产生的子代微生物细胞，是证明微生物原位生长并驱动生态过程的最直接证据。另外，Dna完美的双链结构保证了遗传物质的稳定[10]。Dna-Sip的缺点是：自然环境中能被微生物利用的底物浓度通常很低，微生物大量分裂繁殖的可能性低，常需使用较高浓度的标记底物来刺激目标微生物的分裂繁殖，可能导致研究结果与原位自然环境的实际情况不相吻合[6,11]。Rna-Sip在一定程度上能克服上述缺点。自然环境定功能微生物发挥作用的同时，即使没有大量增殖生长，但具功能基因得到表达并在核糖体内合成蛋白质，获得标记的13C-Rna则表明微生物可能具有较强的活性。因此，Rna-Sip能够采用更低的标记底物浓度培养环境样品，研究结果更接近原位状况[12]。但因mRna半衰期短、降解速度快，mRna-Sip的实际应用仍存在较大的技术难度[13]。Dna-Sip和Rna-Sip的结合将会大大提升Sip技术的潜力。1.3土壤Sip分离后的分析方法13C-核酸与12C-核酸分离后，可以利用分子生物学手段对功能微生物的Dna/Rna进行分析，以鉴别土壤中重要生态过程的微生物驱动者。目前的主要分析方法包括分子指纹图谱法、实时定量pCR法和454高通量测序法等。（1）分子指纹图谱法是目前进行功能微生物的Dna/Rna分析的广泛使用的快捷方法，但分子指纹图谱分析方法的灵敏度较低。环境样品中微生物通常数以百万计，采用古菌或细菌通用引物的DGGe和t-RFLp只能检测环境样品中数量上占优势的微生物[14]。具有较为重要的生态和环境功能目标微生物通常在数量上不占优势。因此，目标微生物同化利用13C-底物后发生的微小变化很难被分子指纹图谱法所鉴别。（2）实时定量pCR法直接针对目标微生物的功能基因，采用高度灵敏的实时定量pCR测定不同密度层级中目标微生物的数量，显著提高了Sip技术的可靠性。然而，采用特异引物定量研究目标微生物存在一定难度。土壤中数量众多的微生物基因组Dna可能被13C标记，很难采用单一的功能基因或16SrRna基因特异引物，同时研究众多目标微生物在不同密度层级中的分布规律。我们无从得知哪一种微生物可能利用稳定性同位素标记底物，无法设计特异的功能引物，只能通过选择性定量目标微生物，明确目标微生物在不同密度层级中的分布规律，同时判定Sip技术的可靠性[13，15]。（3）454高通量测序法是通过检测各浮力密度层中微生物16SrRna基因组成，分析目标标记微生物占该层总微生物的比例，从而鉴别前所未知的重要功能微生物。该技术可规避pCR扩增，直接对标记13C-Rna测序，每次分析可获得大约100万16SrRna基因序列，显著增强了重浮力密度层中13C-标记微生物Dna序列的检测灵敏度。高通量测序可全面分析微生物群体的物种、基因功能组成，最大程度地认识未培养微生物的遗传组成和生命活动，是目前最准确的方法[16]。但该方法目前测试费用较高，后续数据处理复杂，但随着技术发展必将成为功能基因组学研究的主流技术。#p#分页标题#e#1.4构建克隆文库超高速密度梯度离心分离并鉴别13C-Dna/Rna后，通常采用建立基因克隆文库，构建遗传系统发育树的方法分析13C-Rna和12C-Rna的微生物群落组成，并比较二者的差别，鉴定被13C底物所标记的微生物群落。2Sip技术在土壤功能微生物鉴定中的应用目前Sip技术在土壤分子生态学研究领域主要应用在原位鉴定介导有机污染物生物降解和碳氮循环过程的功能微生物方面。有机污染物生物降解研究多集中于单环芳烃、paHs和pCBs的研究，碳氮循环研究多集中于植物-微生物相互作用对陆地生态系统中碳氮转化、土壤中碳氮周转速率、稻田产甲烷机理及产甲烷菌的研究。2.1Sip技术在土壤有机污染物生物降解研究中应用在有机污染物生物降解的微生物生态学研究中，Sip技术可以帮助了解在复杂原位土壤环境中，参与各个降解过程和途径中功能微生物种类。Hanson等首次使用pLFa-Sip技术研究甲苯的生物降解，总共提取发现的59种pLFas中有16种出现13C标记[17]。Christopher等在对农田土壤中苯酚降解菌的研究中，对13C标记苯酚的Dna进行18S-28S内转录间隔区的pCR扩增，t-RFLp分析，成功分离出一种白色细状的真菌，并证实该真菌能加速苯酚的降解[18]。Sueoka等[19]利用Rna-Sip技术对13C标记苯酚的Rna反转录pCR和t-RFLp分析，新发现了3种苯酚降解菌。罗春玲、Xie等[20-22]利用Dna-Sip技术研究了甲苯、苯和间二甲苯的降解菌，对分离出的13C-Dna进行t-RFLp分析、克隆文库的构建，获得了相应的降解菌，并首次报道了tm7门对甲苯具有降解作用。woods等使用H218o-Dna-Sip技术鉴定甲苯退化细菌，鉴定出一株已知的甲苯降解菌RHa1[23]。padmanabhan等在Collamer地区的田间试验中，向受试的粉砂壤土供应13C标记的葡萄糖、咖啡因、萘和苯酚，通过GC/mS监控土壤中释放的13Co2浓度，以此估测底物降解速率，并将分离得到13C-Dna用通用引物对16SrRna基因进行pCR扩增，最终得到29个完整的Dna序列[24]。maiysha等利用Dna-Sip技术，研究了土壤中具有降解萘、菲和芘等6种多环芳烃功能的微生物群落，将13C作为标记元素，构建13C-Dna的16SrRna克隆文库和Rt-pCR分析，结果表明不可培养菌pG2不仅可以降解芘，还能降解荧蒽和苯并[a]蒽，从而说明pG2菌对四环paHs有着良好的降解效果[6]。tillmann等设计了一个pLFa-Sip微宇宙实验，将pCBs高度污染土壤暴露于13C-2,-2′-二氯联苯中，采用GC-C-iRmS测定不同pLFa13C的丰度，结果表明非优势菌在pCBs好氧降解过程中的主导作用[25]。Shahid等在对五氯酚降解菌的研究中，比较了Dna/Rna-DGGe和Dna/Rna-Sip-DGGe技术的鉴定效果，结果表明Rna-Sip技术可以更好反映功能微生物群落的变化趋势[11]。Sul等将Dna-Sip和宏基因组技术结合，对13C-联苯-Dna中芳烃双加氧酶基因片段pCR扩增，得到两串与bpha相似的序列组，构建1568粘粒克隆文库，发现除含bphae基因外，还含有属于γ-变形菌纲的未知基因片段，该片段的G+C含量和bphae相近，可能由于bphae基因水平转移而形成的[26]。2.2Sip技术在土壤C循环中的应用土壤C转化是微生物主导的生物地球化学过程，Sip技术能够很好地将微生物群落与其功能联系起来，加深人们对陆地生态系统重要C循环过程的认识。Boschker等最先使用pLFa-Sip技术进行甲烷营养菌的研究[7]，随后，Dna-Sip技术被用于研究土壤中甲烷氧化菌的活种群。Hutchens等在微宇宙中用13CH4对取自罗马尼亚movileCave地下水系统的样品进行短期培养，以Dna-Sip技术为前提确定了3类含有编码甲烷单氧化酶基因的甲烷营养菌，并通过与非甲烷营养菌比对证明了交叉取食的存在[27]。Cebron等在研究养分添加对甲烷营养菌多样性的影响时，人工添加养分在一定程度上可避免交叉取食，改进了Dna-Sip方法[28]。Bengtson等研究了松树林土壤中的甲烷营养菌群落结构组成与CH4氧化率的联系，并简短讨论了Dna/Rna-Sip的局限性[29]。Borodina等用Dna-Sip法考查了英国不同陆地生态系统土壤中氯化甲烷营养菌的多样性，通过与培养分离法的结果比较，揭示出土壤中仍存在大量不可培养的卤化甲烷营养菌，并将卤化甲烷的全球循环同一组目前已知的卤化甲烷营养菌特征群联系了起来[30]。Radajewski等最先使用Dna-Sip技术进行甲醇营养菌的研究，通过13CH3oH培养森林土壤，证明被13C标记的细菌16SrRna基因序列与已知可培养的甲醇营养菌及嗜酸甲烷氧化菌相似，首次表明此类细菌还存在于森林土壤中[6]。Feng等利用Dna-Sip技术证明了稻田土壤中，甲酸盐中的C首先被光营养的初级和次级生产者利用，随后产生的有机物被其他微生物利用[31]。陆雅海等用13Co2对水稻进行脉冲标记培养，利用Rna-Sip技术与t-RFLp分析，获得水稻根际的产甲烷菌，并通过厌氧和好氧条件的对比，表明根际环境和降解过程的多相性[32，13]。该团队还利用pLFa-Sip描述了水稻根际微生物活性的空间变化，提出在根际革兰氏阴性菌和真核微生物在同化根派生碳过程中最活跃，同时描述了围绕根际的活性群落的空间系统变化[9]。2.3Sip技术在土壤n循环中的应用15n作为生物体内大分子合成的组成元素，可结合Sip技术研究土壤中氮循环过程的各类微生物功能群及其相互作用。Georg等利用标记和未标记的n进行纯微生物培养，结果显示15n-Dna-Sip技术是可行的，但存在一定局限性，如可视条带需要大量的Dna，15n-Dna的理想丰度要求大于50%等[33]。Buckley等通过改变基因G+C含量来增加15n-Dna的浮密度，增加了15n-Dna的分离强度，为原位追踪利用n的微生物群落提供了新的研究方法，并采用15n2-Dna-Sip原位鉴定了独立生存的固氮微生物，通过分析15n标记Dna的16SrRna，发现了3组新固氮微生物[34-35]。贾仲君等采用Sip技术示踪农田土壤氨氧化微生物Dna，发现相对于古菌，细菌是土壤硝化过程的主要驱动者[36]。贺纪正等对农田土壤生态系统中氨氧化古菌（aoa）和氨氧化细菌（aoB）进行一系列研究，得出二者在根际土壤中的丰度、组成对环境的响应占主导作用[37]，并发现土壤中硝化作用伴随着古菌amoa的基因丰度和多样性变化，进一步证明了氨氧化古菌可同化Co2，属于自养型微生物[38]。Jennifer等结合Rna-Sip和Dna-Sip技术，再次证明aoa可通过两种途径固定Co2，并在泉古菌（Crenarchaeota）中得到验证，进而强调了aoa在硝化和Co2固定过程中的重要性[39]。Karen等以北美黄松林为研究对象，应用H218o-Sip技术调查土壤中氨氧化微生物的生长与死亡情况，发现人工添加氨可刺激aoB的生长，与此同时aoa的死亡数量增加，而aoB则不受影响[40]。ishii等在研究n2o在水稻土中的消减过程时，用13C标记的琥珀酸盐作为电子供体，鉴定了同化琥珀酸盐的微生物，指出大多数n2o消减微生物属于草螺菌属和固氮螺菌属。并证明前者消减速度大于后者，在水稻土n2o的减少过程中发挥重要作用[41]。#p#分页标题#e#3研究展望Sip技术能有效降低环境微生物群落分析的复杂度，获得功能微生物的目的基因，已成为原位分离功能微生物的重要手段。随着新一代454高通量测序技术的发展，Sip技术可最大程度地认识不可培养微生物的遗传组成和生命活动，获取其功能基因，优化并人工合成在原位环境中具有高效同化或降解作用的新基因。结合土壤化学等方面知识，共同探讨土壤环境中功能微生物的代谢途径和同化过程，挖掘微生物基因资源，鉴别土壤关键元素循环的微生物驱动机制等，将是未来研究发展的热点和重点。
微生物组学研究篇6
关键词：pBL教学法；生物医学电子显微技术；研究
生物医学电子显微技术是将生物医学与电子显微技术学相结合的一门综合性学科。它是以电子显微技术为研究手段对生物医学进行研究和应用。基于问题式学习(problem-basedlearning,pBL)法是一种兴起于医学教育领域的教学模式,目前在西方教育界非常兴盛,被誉为当前国外教学改革的浪潮中“多年来专业教育领域最引人注目的革新”[1-2]。在我校教学改革浪潮的推动下，我室将pBL教学模式引入到生物医学电子显微技术教学课程当中，旨在改进传统的教学理念，改革陈旧的教学方法；探索培养学生问题意识和创新精神的途径和方法，以达到教与学的最优化效果。
1研究目的
本课题的研究目的是突破传统的陈旧教学观念，提高创新教育意识，创建有利于发挥学生自主能动性、启发学生独立思考、培养学生团队合作精神的教学模式。从而提高本学科的教学质量，为今后从事医疗工作及科学研究打下坚实的基础。
2研究对象
2013年选修《医学电子显微技术》课程的研究生和2014年选修《医学电子显微技术》课程的研究生。
3研究方法
2013年选修学生为实验组，2014年选修学生为对照组。学生均来自不同专业随机分组。实验组引入pBL教学模式：①课前数日由教研室全体教师精心选择临床病案，设计相关问题，然后打印出来发给学生，使学生对每堂课的学习内容有一个初步了解，明确每堂课的教学目标及要解决的问题。②自学讨论，让学生有针对性的学习基础教材及相关参考资料,通过个人自学、小组讨论,深层次理解知识。③归纳总结，每堂课讨论之后由教师进行归纳总结。目的是帮助学生抓住重点和及时作出课堂小结。教师根据自学情况进行评价,对讨论结果加以概括。对照组则按照以往的传统教学方法授课：以多媒体课件为主，挂图板书为辅，适当上机观察切片，课后书写实验报告。
4研究结果
以上数据经统计学分析p<0.01，问卷结果显示多数学生肯定了pBL教学法的优势。以上数据经统计学分析，p<0.01,分析结果显示采用不同教学模式对学生成绩有显著差异。
5讨论
电子显微镜是生物、医学、化学、农林和材料科学等领域的某些学科进行研究的重要工具，电子显微镜技术已成为上述各领域研究工作者应掌握的一项基本技能。近年来，在生命科学领域内，电子显微镜的应用已不再单纯局限于对组织、细胞超微结构的形态学观察与描述，而是深入到细胞分子水平的结构与功能的研究[3]。因此在高等中医院校开设“生物医学电子显微技术”课程意义非常重大。我校从2004年面向研究生开设了此课程，开设初期我们采用传统的讲授式教学模式，不断总结教学中遇到的问题，对教学内容、教学方法进行了一系列改革，并已取得了一定的成果。但是由于透射电子显微镜属于大型高精密仪器，不能让学生逐一操作，因此很多概念对于学生来说是非常抽象难以理解的，容易使学生对学习产生厌倦的心理，影响教学效果。pBL教学模式能够很好的弥补传统教学的弊端，极大地激发学生的学习兴趣，因此从2013年我室将pBL教学法引入到该课程的部分章节当中，旨在调动学生学习的积极性、拓展学生的知识面，为今后的科研工作打下良好的基础。实践证明将pBL教学模式应用于生物医学电子显微镜教学中，有助于激发学生的学习兴趣，提高学生分析问题和解决问题的能力；有助于增强团队合作意识；有助于提高教学质量。展望未来，pBL教学法作为一种全新的教学模式有其独特的优势，目前已逐步成为现代医学教育改革的发展趋势[4]。随着教学改革的不断深化，pBL教学模式将得到进一步的发展。
参考文献
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[3]付洪兰.实用电子显微镜技术[m].北京：高等教育出版社，2004，第一版.
微生物组学研究篇7
微波是指频率为300mHz～300GHz、波长为lmm～lm的电磁波。它的干燥原理是：微波发生器将微波辐射到待干燥的物料上，当微波射人物料内部时，使物料内的水等极性分子按微波频率作同步旋转和摆动；水等极性分子高速旋转的结果，使物料内部瞬时产生摩擦热，导致物料内部和表面同时升温，使大量的水分子从物料中蒸发逸出，从而达到干燥的目的。
微波真空干燥是随微波干燥技术发展起来的一项新的组合干燥技术。它不仅具有干燥速度快、时问短、物料温度低、色香味及营养成分保留好等优点，而且参数容易控制，能干燥多种不同类型的物料。目前我国虽有一些单位正在进行研究，但其技术性能还需要完善，在机理和工艺方面也还有很多问题需要深化和研究。
2.国内外研究现状
早在上世纪80年代，美国、加拿大、英国和德国就开始研究微波真空干燥技术，主要集中在美国的威斯康辛大学、加利福尼亚大学，加拿大的BritisC0lumbia大学，德国的Karlsruhe大学，英国的QueenUniversity，希腊的国立科技大学，法国的albi研究所等。研究的内容涉及微波真空干燥机理、传热传质微波真空干燥模拟、微波真空干燥能耗与工艺以及各种不同类型物料(香蕉，萝卜片，果胶，土豆，浆果等)的微波真空干燥操作等。
国内目前的研究单位有江南大学食品学院、东北大学、大连水产大学、中国农业大学、浙江大学、上海工程技术大学、华南理工大学、华南农业大学、天津轻工大学、上海辰灿轻工机械公司、四川大学食品学院食品科学与工程系、南京三乐微波技术有限公司等。
江南大学食品学院进行了甘蓝的微波真空和热风联合干燥试验。试验结果表明：微波真空联合干燥缩短干燥时问48％，提高了营养成分和叶绿素的保存率，改善了干燥品质。
大连水产大学张国琛进行了扇贝柱的微波-真空-联合干燥，试验研究了微波功率、真空度，微波炉启闭比、预处理盐水浓度和扇贝大小对干燥效果的影响，建立了扇贝微波真空干燥的动力学模型。
3.微波组合干燥技术
组合干燥是一种具有广阔发展前景的干燥技术，它可以发挥各种干燥工艺的长处，克服各自缺点，借长补短，达到高效率、低能耗、优品质的干燥目的。由于微波干燥是一种完全不同于其它干燥方式的干燥技术，所以它也是与其它干燥方式组合最多的一种干燥技术，同时也是当前国际上研究最多的一种干燥技术。以下是几种较常见的组合方式。
3.1微波热风组合干燥(也称微波对流干燥)
在与微波组合的干燥方法中，微波热风组合干燥是研究最多的一种。由于热风干燥时间长、质量差，故不适合干燥热敏性物料；采用热风微波组合干燥可以克服上述缺点。此外，微波干燥的成本与热风干燥相比还是很高，单纯微波干燥是不经济的。热风干燥对物料来说是从表面向内干燥，温度梯度与水分转移的方向相反，而微波干燥是从内部加热，温度梯度与水分转移的方向相同，二者结合，可以达到既缩短干燥时间又降低成本的目的。微波与热风干燥可以有三种结合方式。
3.1.1.在临界含水率处加入微波
当干燥从恒速段进入降速段(即物料含水率达到临界水分)时将微波能引入干燥器，使物料内部产生热量和蒸汽压，使水分扩散至物料的表面并被排除，这时利用微波会非常显著地提高干燥速度。
3.1.2.在干燥器的终端加入微波
单一的干燥系统在接近干燥终了时效率最低去除几个百分点的水分往往需要很长的时间，利用微波可以显著减少干燥时间。
3.1.3.在最初预热阶段加入微波
在干燥前物料含水率较高，可以先用微波将物料加热到蒸发温度，然后用普通热风干燥，去除表面水分，干燥时间可以缩短。
3.2.微波真空组合干燥
微波虽然具有加热速度快、干燥时间短、选择性好、能源利用率高和便于控制等优点，但单纯使用微波进行食品干燥，容易产生由于过热引起的烧伤现象和食品边缘焦化、结壳和硬化等现象；上述现象多半是由于温度过高和干燥过快引起的。采用真空可以降低水的蒸发温度，使物料在较低的温度下快速蒸发，同时还可避免氧化，因而改善了干燥品质。在医药、食品和化工领域有很多热敏性物料需要低温快速干燥，因此，将微波技术与真空技术相结合就成为一项极具发展前景和实用价值的新技术。从国内外有关微波干燥的研究现状来看，微波真空组合干燥也是目前发展较快的一种组合干燥技术。
3.2.1.脉冲间歇式微波真空干燥
微波干燥虽有许多优点，但经常会发生局部过热、表面硬化、颜色不正和加热不均匀等现象；此外，能量效率不高也是一个缺点。产生这些现象的原因之一就是热质传递控制不当，解决的方法之一是采用脉冲方式输入微波能，即短时间的微波加热和较长时间的间断。试验证明：当物料干燥到临界水分以后，连续施加微波能并不能加速水分的蒸发；采用间歇干燥的方法，不仅可以节省能量、提高干燥效率，还可以改善干后物料的品质。脉冲间歇式微波真空干燥技术是edh0lm于1933年提出的。采用这种技术的特点是使物料中的水分和温度在间歇阶段能够均衡再分配，减少水分梯度，这将有利于提高下阶段的干燥速率。
试验还表明，脉冲微波干燥时，微波接通时间越长、断开时间越短，物料温度越高。因此，通过调节脉冲比或真空度可以改变物料的温度。
3.2.2.变功率微波真空干燥
加拿大食品工程研究所ChristeneH．等进行了萝卜片的变功率微波真空干燥，微波的频率为2450mHz，微波功率4kw可调，真空度为13.3kpa，萝卜片的终水分为10％，微波谐振腔为圆筒形，直径350mm，长度500mm，采用的干燥工艺为：干燥开始后的最初19min微波功率为3kw，中间4min为1kw，最后10min为0.5kw。试验过程研究了颜色、复水性、密度和胡萝卜素、维生素含量等质量指标。结果表明：如果综合考虑，微波真空干燥的性能甚至优于真空冷冻干燥。美国加利福尼亚大学研制的微波真空干燥设备谐振腔是一个长12.2m的不锈钢圆筒，中间有输送带，沿长度方向分为三个干燥区，第一干燥区的微波功率较大，真空度为1.33～3.99kpa，第二、第三干燥区的微波功率递减。说明变功率微波真空干燥是一个研究方向。
3.2.3.微波热风和真空组合干燥技术
maskan利用微波和热风组合方式干燥猕猴桃，发现干后猕猴桃的收缩率(76％)小于单纯的微波干燥(85％)，而且颜色也有很大改善。Szab0利用热风+微波+热风的组合方式进行蘑菇的干燥试验，发现能改善干后蘑菇的品质。大连水产大学的研究表明，热风干燥扇贝具有较小的收缩率Durance利用微波真空与热风组合干燥西红柿，发现西红柿的复水率有所改善。由此可见，微波真空干燥与热风干燥具有一定的互补性。近些年，在高含水率和热敏性物料的干燥中，微波真空和热风的组合干燥也逐步得到了应用。
4.几个值得探讨的问题
4.1.关于物料的尺寸和形状
微波干燥的物料种类繁多，成分和状态也各不相同，按形状分有液状、糊状、浆状、粒状、片状、粉状；按类型分有蔬菜、水果、谷物、药品、水产品和农副产品；就尺寸而言可以小到菜籽，大到人参、蘑菇。微波干燥的研究表明，物料的大小、形状、数量、水分和在微波炉谐振腔中的位置对干燥效果均有一定影响。Dr0uzas用微波进行干燥果胶试验时，用五个料盘放在炉内五个不同的位置，发现干燥速率有明显区别。因此微波干燥应根据物料的特性(介电特性热物理特性、含水率和形状、大小)选择干燥工艺和参数，其原则如下：
①微波功率应与干燥的物料量相匹配。
②待干燥的物料其大小和含水率应尽可能均匀一致。
③考虑微波的穿透深度，大块物料最好先处理成小的粒状或片状。
④粉状物料如果堆积在一起时应看成是一个整体。
⑤小粒物料所用的微波功率(w/g)可以适当减小。
⑥对于热敏性物料可以适当加大真空度或减小微波功率。
4.2.关于真空度
从蒸汽特性表可知，真空度越高，水的沸点温度越低，水分越容易蒸发。但是在微波真空干燥时，并不是真空度越高越好，真空度增高，能耗加大，干燥成本加，而且会产生击穿放电现象。当微波频率为2450mHz时，真空度2～7kpa已经足够了，其相应的水分汽化温度是20℃和40℃。对于热敏性物料，要求物料的温度低，所以真空度就要高一些。法国pere教授进行了不同真空条件下的微波真空干燥试验，试验表明，在相同的条件下真空度从1kpa增加到7kpa时，各单位采用的真空度数值有很大的差别，说明对于微波真空干燥中真空度的合理选择尚需进一步研究探讨。
5.注意事项
采用微波真空干燥时，有一些问题需要注意：
①微波能被金属反射，干燥物料和测试传感器中不可混入金属。
②待干燥物料的大小和形状应基本接近。
③微波干燥设备不可空载运行。
④微波可以穿透玻璃和聚合物而不损失能量。
⑤微波炉内的物料应分散布置而不要堆积。
⑥干燥过程中物料最好能够运动。
参考文献：
[l]徐艳阳，张憨，等．热风和微波真空联合干燥甘蓝试验[J].无锡轻工大学学报，2003(6)．
[2]张国琛，毛志怀，等．微波真空干燥扇贝柱的物理特性研究[J]．农工学报，2004(6)．
[3]汤大卫，张天使，等微波真空干燥技术的运用与前景[J].医药工程设计，2000，(5)．
[4]崔正伟，孙大文，等．微波真空干燥技术的进展[J]．粮油加工与食品机械，2002(7)．
[5]pereC．Rodiero.2000，investigationonmicrowaveandvacuumdryingexperiments：dryingofamodelporousmediumatlaboratoryscale。iDS''''2000proceeding
微生物组学研究篇8
1资料与方法
1.1一般资料：选择2010年1月～2013年12月400例患者，分为研究组与对照组，每组200例。研究组男118例，女82例，年龄11～67岁，平均（382.73）岁。对照组男110例，女90例，年龄10～65岁；平均（392.96）岁。两组一般资料比较差异无统计学意义（p＞0.05）。
1.2方法：对照组患者仅仅是进行常规化治疗。研究组患者在此基础上定期进行微生物检验，对于微生物的分离鉴定可以对病原菌种进行鉴别，而细菌的具体分型方法也是多种多样的，主要包括：血清学分型、分子分型、细菌素分析、噬菌体分型、质粒图分析等。例如：在采用细菌学分析时，要对感染源和媒介进行监测，医院内的感染源有患者、医护人员等，而媒介则包括医疗器械、环境污染、空气污染等。
1.3观察指标：观察研究组和对照组患者在出院时发生医院感染的情况以及程度。
1.4统计学处理：使用SpSS13.0对各项资料进行统计、分析，以p＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
研究组200例患者中发生医院感染的有4例，占2%，对照组200例患者中发生医院感染的有15例，占7.5%，差异有统计学意义（p＜0.05），详见表1。研究组4例医院感染患者中轻度感染患者有1例，中度感染患者有1例，重度感染患者有2例，对照组15例医院感染患者中轻度感染患者有4例，中度感染患者有3例，重度感染患者有8例，差异有统计学意义（p＜0.05）。
3讨论
微生物组学研究篇9
关键词：宫颈糜烂;宫颈微波手术;药物
宫颈糜烂是妇科的常见疾病之一，妇科患者诊断患有宫颈糜烂应立即接受有效治疗，防止其发展成为恶性肿瘤。本研究对宫颈糜烂应用宫颈微波手术联合药物治疗的疗效进行分析，现将结果报告如下：
1.资料与方法
1.1一般资料
资料选取本院2013年2月-2014年2月收治的102例宫颈糜烂患者，按随机数字分为研究组与对照组；研究组51例，年龄23-56岁，平均（32.58±2.8）岁，病程6-18个月，平均病程（11.54±2.87）个月；对照组51例，24-55岁，平均（33.48±3.01）岁，病程5-17个月，平均病程（11.87±3.02）个月，两组年龄、病程等基线资料无明显差异（p>0.05），具有可比性。
1.2方法
对照组予宫颈微波手术治疗，术前准备包括：常规行宫颈刮片等病理学检查，确定病情未发展为恶性肿瘤；术前2d停止使用阴道用药，禁止。患者取截石位，医生对外阴及阴道行常规消毒，采用多功能的宫颈微波治疗仪器（输出功率调至50w），选距离宫颈内口0.5cm处钻入探头，在宫颈糜烂面自内向外活动10-15min，直至表面呈黄白色且无出血，治疗范围超过宫颈糜烂面1-2mm，以相同方式治疗宫颈上唇。
研究组在对照组的基础上予干扰素α胶囊联合治疗，选择月经结束后的2-3d为用药开始时间，将干扰素α胶囊置入阴道深处，1次/d，于睡前使用，8次1疗程，持续用药3个疗程。
1.3观察指标
观察术后两组患者的阴道排液量及排液持续时间，阴道排液量以月经量为参照标准，排液持续时间以10d为参照标准。观察宫颈糜烂面的恢复情况：糜烂面为鳞状上皮所覆盖，子宫颈光滑为完全恢复；糜烂面缩小幅度>1/3，但仍存在部分较小的糜烂面为恢复良好；糜烂面缩小幅度
1.4统计学分析
数据应用SpSS18.0软件包统计分析，一般资料应用标准差（x±s）完成表示，计量资料应用t完成检验，计数资料应用X2完成检验，当p
2.结果
2.1两组患者阴道排液量及排液持续时间对比
研究组患者阴道排液量
表1两组患者阴道排液量及排液持续时间对比[n(%)]
2.2两组患者宫颈糜烂恢复情况对比
研究组患者糜烂面完全恢复41例（80.39%），显著高于对照组的23（45.10%），比较差异明显（p
表2两组患者宫颈糜烂恢复情况对比[n(%)，n=51]
3.讨论
宫颈糜烂主要由宫颈炎病变致上皮脱落或溃疡引起，病因包括局部卫生不良或雌性激素分泌较少引起抗感染能力低下，流产或分娩导致宫颈损伤，病原体入侵，及疾病传播的病原体入侵等[2]。宫颈糜烂多发于已婚妇女，原因在于已婚妇女多有分娩或流产经历，性生活较为频繁，对宫颈损伤较大。本研究选取的102例宫颈糜烂患者平均年龄约为32岁，大部分患者为已婚且已生育妇女，符合宫颈糜烂患者的临床特点。临床中针对宫颈糜烂的传统疗法为单纯药物治疗，疗效欠佳，采用宫颈微波疗法则可能造成愈合期创面的分泌物增多，影响愈合效果，本研究对随机选取的51例患者予宫颈微波手术联合药物治疗，取得了一定疗效。
宫颈微波手术杀菌作用显著，微波的加热功能可以有效改善宫颈组织及其周围粘膜的血液循环，从而提升组织运动的速度，破坏组织的炎性反应，实现对糜烂面的治疗目的[3]。观察本研究中两组患者阴道排液量与阴道排液持续时间，可得研究组在愈合期创面排液情况显著优于对照组，该结果与微波手术的小血管封闭功能相关，在糜烂部分清除完成后微波能够有效封闭小血管，实现有效止血，从而帮助干燥宫颈创面，减少排液量与排液时间。观察本研究中两组患者宫颈糜烂面恢复情况，可得研究组患者完全恢复41例（80.39%），显著高于对照组，该结果的原因为宫颈微波手术在宫颈糜烂面较大、表面较不平整时与其进行直接接触，并予彻底的糜烂清除；干扰素α则可以结合靶细胞膜中的受体，刺激靶细胞上的病毒抑制基因，合成抗病毒蛋白，提升细胞的抗病毒功能，从而提高治疗效果，同时，干扰素α还具有抗微生物效果，降低引导内部炎症的发生率。另外，为进一步降低宫颈糜烂发展为宫颈癌的发生率，医护人员应嘱患者进行定期的病理组织学检查，以便及时发现宫颈糜烂面的病变情况，防止治疗延误。
综上所述，宫颈糜烂应用宫颈微波手术联合药物治疗创面愈合期分泌量少，效果显著，具有临床应用价值。
参考文献：
[1]李业霞.宫颈微波手术联合药物治疗宫颈糜烂50例疗效分析[J].当代医学,2013,19(07):56-57.
微生物组学研究篇10
湖南医药学院附属怀化市第三人民医院输血科，湖南怀化418000
[摘要]目的对回顾性分析比较不同临床标本微生物检验的阳性率进行探讨。方法选取我院收取的2011年6月—2012年6月收治的100例患者为研究对象，收集100份患者标本作为i组。选取我院收取2012年6月—2013年6月收治的100例患者为研究对象，收集100份患者标本作为ii组。采用ViteK-2全自动细菌鉴定药敏分析仪对两组患者实施检测，并观察和比较两组患者的检测结果。结果i组患者的呼吸道标本阳性率为38.2%，明显比ii组的29.0%高，i组的血液、胸腹水及脑脊液标本分别为9.1%，明显比ii组的16.7%低，i组的粪便标本为4.3%，以及非呼吸道标本的3.8%明显比ii组高，差异明显，有统计学意义（p<0.05）。结论临床医师需要针对不同时间段的不同类型标本阳性率进行分析，掌握微生物检验的相关知识和技术，提高检验准确率，从而为疾病诊治提供更多的依据。
[
关键词]临床标本；微生物检验；阳性率
[中图分类号]R446.5 [文献标识码]a [文章编号]1672-5654（2014）10（b）-0017-02
在临床上，微生物检验是疾病诊断的重要手段，其具有操作简便以及检验准确的优势，其在临床上的指导作用为医师的临床诊治提供了更多依据。在微生物检验的过程中，医师需要加强对技术操作的完善，从而使检验阳性率得到提高，提高诊断的精确度。本院收取2011年6月—2012年6月的100例患者标本以及2012年6月—2013年6月的100例患者标本作为此次研究的对象，分别设为i组和ii组，通过观察两组微生物检验标本的阳性率，从而总结不同时间段不同临床标本微生物检验的临床特点。详细临床报道如下所示。
1资料与方法
1.1一般资料
选取我院收取的2011年6月—2012年6月份收治的100例患者为研究对象，收集100例患者标本作为i组。其中有34例呼吸道标本、33例血液、胸腹水及脑脊液标本，23例粪便标本，其余非呼吸道标本有10例。选取我院收取2012年6月—2013年6月收治的100例患者为研究对象，收集100例患者标本作为ii组。其中有31例呼吸道标本，30例血液、胸腹水及脑脊液标本，26例粪便标本，其余非呼吸道标本13例。两组临床标本在一般资料的比较上，包括标本种类、检验方式等，均相仿，无统计学意义（p>0.05），具有可比性。
1.2方法
对两组标本进行分类，并采用ViteK一2全自动细菌鉴定药敏分析仪对标本进行检验，操作流程结合标准化规范进行实施，并对两组标本的检验结果进行观察和比较。标本袋检验需要遵循质量标准进行操作，从而保证检验工作的质量。
1.3观察指标
观察和比较两个时间段不同种类标本之间的阳性率，并对两组之间的差异性进行分析。
1.4统计学方法
采用spss14.0软件对研究数据进行处理，采用χ2检验对计数资料进行处理，统计学意义以p<0.05表示。
2结果
如表1所示。
可见，两组不同时间段的临床微生物标本阳性率明显存在差异性，其中i组的呼吸道标本、粪便标本以及其余非呼吸道标本的微生物标本阳性率明显比ii组高，i组的血液、胸腹水以及脑脊液标本明显比ii组低，差异明显，有统计学意义（p<0.05）。
3讨论
目前，医疗事业不断处于发展和创新的阶段，这也使得医疗技术日益成熟，越来越多的新型技术得到发展和应用。临床微生物检测技术在日益发展中逐渐成为现代医院检验科室的重要产物，为医师的临床诊治提供了指导性作用和更多依据。景晓敏[1]在研究中指出，随着人们生活方式的变化，感染性疾病的发生率日益增加，微生物检验技术的重要性也日益凸显。然而，因感染性疾病的种类不断增加，微生物检验技术在阳性率方面检出效果仍然不佳，这也使其临床应用品质并不完善。
杨安芳[2]在临床检验中对2010—2011年和2011—2012年共16425份标本依据不同时间段进行分组，同时对标本进行归类，检验结果显示，2010—2011年的呼吸道标本检验阳性率、非呼吸道标本检验阳性率明显比2011—2012年的阳性率高，2010—2011年的血培养标本以及大便标本阳性率则明显比2011—2012年低，差异明显，有统计学意义（p<0.05）。这与此次研究结果相仿。
此次研究中，两个时间段不同类型的标本阳性率在比较上存在差异性，结合相关研究[3]，认为其主要因素包括以下几点：
①标本采集不合理
标本在采集过程中，部分检验人员缺乏对采集过程注意事项的了解，导致所采集的标本所含微生物不准确，从而导致医师的临床诊断出现误诊，导致疾病病原体无法得到确诊，引起病情的延误[4]。另外，中段尿培养以及大便培养等标本需要患者自己采集，然而因医护人员与患者的沟通和交流不够清楚，加之患者意识缺乏，导致标本采集量不充分，微生物阳性检出率受到影响。
②标本保存和运送不当
微生物标本在运送以及保存的过程中，要求尽量维持微生物的活力，防止其余非致病微生物侵袭和过度繁殖，影响标本的检验。不同微生物标本的检验，在保存和运送上存在差异性，例如厌氧菌培养的标本需要避开与空气的接触，要求短时间内送检，防止兼性厌氧菌生长过度导致阳性检出率下降。因此要求标本的保存和运送遵循规范性操作，确保阳性率的准确性。这就要求实际检验工作中，检验人员需要加强对标本的保存以及运送的相关操作流程的了解，从而确保检验工作的准确性[5]。
③缺乏临床经验
在临床微生物检验上，主要依靠形态学以及生理学的生化反应进行检测，这就要求检验人员具备系统的判断能力、熟练操作能力以及试验能力[6]。然而实际检验工作中，部分检验人员因实际操作中缺乏经验，操作能力较差，对检验工作的重要性缺乏意识，导致无法准确掌握微生物检验的流程以及原则，从而引起检验结果产生误差。
此次研究显示，i组患者的呼吸道标本阳性率为38.2%，明显比ii组的29.0%高，i组的血液、胸腹水及脑脊液标本分别为9.1%，明显比ii组的16.7%低，i组的粪便标本为4.3%，以及非呼吸道标本的3.8%明显比ii组高，差异明显，有统计学意义（p<0.05）。可见，对于不同时间段不同的临床微生物标本的检验，需要加强自身的技术和实践，并与医师加强沟通和交流，加强对微生物检验的学习，从而丰富自身的知识体系，改善检验操作，从而提高临床标本微生物检验的阳性率，提高感染性疾病的临床诊治效果，改善患者的预后。
[
参考文献]
[1]景晓敏.回顾性分析比较不同临床标本微生物检验的阳性率[J].中国现代药物应用，2013,7（9）：123-124.
[2]杨安芳.不同临床标本微生物检验的阳性率流行病学分布分析[J].中国医药导刊，2013,15（11）：143-144.
[3]郭辉，苏民．临床检验标本的正确采集及错误分析[J]．中国伤残医学，2012，20（6）：28-30．
[4]梅雪飞，左改珍，范恒梅，等．临床医护人员微生物标本采集存在问题分析及对策[J]．护理学报，2010，17(16)：73-75.
[5]李俐佳，董开秀，许辛伯．临床粪尿常规检验标本不合格因素分析[J]．国际检验医学杂志，2010，10(7)：38-39．