细胞生物学定义篇1
【摘要】目的：采用Survivin反义寡核苷酸(aSoDn)复合物抑制survivin的表达，研究其对槲皮素诱导肝癌SSmC7721细胞凋亡的影响.方法：体外培养人肝癌SSmC7721细胞，取对数生长期细胞进行实验.实验分Ⅰ,Ⅱ两部分：Ⅰ分为空白对照组(设平行组)、等量脂质体Lipofectaminetm2000对照组、400μmol/LSoDn复合物组、400μmol/LaSoDn复合物组(设平行组)，转染48h;Ⅱ弃掉Ⅰ部分各组培养液，换新指定培养液，分为空白对照组、40μmol/L槲皮素组、脂质体Lipofectaminetm2000组、SoDn复合物组、aSoDn复合物组、aSoDn复合物+40μmol/L槲皮素组(联合组)，孵育细胞24h后检测.Ⅰ结束时采用RtpCR、细胞免疫组化染色检测各组SSmC7721细胞survivin表达变化；Ⅱ结束时用吖啶橙染色法观察细胞凋亡时形态变化，mtt法检测SSmC7721细胞生长抑制率，annexiV/pi双染流式细胞仪检测SSmC7721细胞凋亡率.结果：aSoDn复合物作用肝癌SSmC7721细胞48h后能下调survivinmRna及Survivin蛋白的表达(p<0.01)；与其他组比较，联合组ao染色图片可观察到凋亡小体等典型的细胞凋亡形态特征变化且凋亡细胞数量明显增多，并用mtt法、annexinV/pi双染流式细胞仪检测显示联合组细胞的生长抑制率增高(p<0.01)、细胞凋亡率提高(p<0.01).结论:aSoDn复合物可有效抑制肝癌SSmC7721细胞survivin基因的表达；aSoDn复合物能增强槲皮素对SSmC7721细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用即二者具有协同作用，该作用可能与抑制survivin基因的表达有关.
【关键词】反义寡核苷酸；槲皮素；肝肿瘤；细胞凋亡；细胞周期；Survivin
0引言
肝癌(hepaticcarcinoma,HCC)是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤之一，对于大多数肝癌患者，经肝动脉化学药物栓塞治疗和全身化疗仍是最常用的治疗方法.近年来抗凋亡机制在肿瘤细胞耐药性发生中的作用倍受关注［1］.survivin是1997年由ambrosini等［2］发现，ito等［3］报道Survivin蛋白对破坏肝癌细胞增生凋亡平衡、促进肝癌细胞快速增生具有重要作用.槲皮素(quercetin,Quc)是广泛分布于蔬菜、水果、中草药等的一种天然的黄酮类化合物，化学名为3,3′,4′,5,7五羟基黄酮.LopezLazaro等［4］研究表明，Quc没有毒副作用.近年来的研究表明Quc在体外、动物实验模型中均显示出抗癌活性［4-6］.本实验旨在研究反义抑制survivin的表达，检测其对Quc抑制肝癌SSmC7721生长和诱导细胞凋亡的影响，探讨反义抑制survivin的表达是否在体外可增强Quc抗癌作用及可能的机制，为其进一步动物实验和临床应用提供新的实验依据.
1材料和方法
1.1材料人肝癌细胞株SSmC7721兰州大学医学实验中心提供.Rpmi1640(Sigma公司)，小牛血清(杭州四季清公司)，槲皮素(Sigma公司,用前以少量DmSo溶解，用时加Rpmi1640稀释至使用浓度)，mtt(Sigma公司),trizol(BBi公司)，Survivin蛋白一抗兔抗人抗体、二抗羊抗兔抗体(北京中山公司)，taKaRa试剂盒(宝生物工程公司)，annexiV/pi试剂盒(宝灵试剂公司),阳离子脂质体Lipofectaminetm2000(invitrogen公司).寡核苷酸(oDns)脂质体(Lip)转染复合物survivin正、反义寡核苷酸的设计、合成：根据survivin的基因序列(GenBankaccessionnumberU75285),应用primer5.0软件设计互补于survivinmRna的232-251序列的20个碱基组成的aSoDn链：5′CCCaGCCttCCaGCtCCttG3′,同时合成正义链：5′CGCaGtaGCtGCGCtGattG3′,两条链均采用硫代磷酸化修饰.在GenBank中证实反义寡核苷酸(aSoDn)及正义寡核苷酸(SoDn)与任何已知哺乳动物基因无匹配，上海生工公司合成.用Lipofectaminetm2000输送oDns，依文献［7］oDns/Lipotm2000=4g/L配置oDnsLipotm2000转染复合物，按质脂体转染试剂盒说明书进行操作.
1.2方法取对数生长期的SSmC7721细胞，消化、收集、计数并接种于96孔或6孔培养板或100mL细胞培养瓶.
1.2.1分组实验分Ⅰ,Ⅱ两部分：Ⅰ分为空白对照组(设平行组)、等量脂质体Lipofectaminetm2000对照组、400μmol/LSoDn复合物组、400μmol/LaSoDn复合物组(设平行组)，转染48h;Ⅱ弃掉Ⅰ部分培养液，换新指定培养液，分为空白对照组、40μmol/L槲皮素组、脂质体Lipofectaminetm2000组、SoDn复合物组、aSoDn复合物组、aSoDn复合物+40μmol/L槲皮素组，孵育细胞24h后检测.
1.2.2RtpCR检测SSmC7721细胞survivinmRna表达变化在实验Ⅰ部分结束时，按takara试剂盒操作说明书进行，收集各组细胞，trizol提取总Rna,用紫外分光光度计检验纯度并定量.设βactin为内参照，对样品模板用量标准化,survivin和βactin分管扩增,引物由上海生工公司合成.其序列如下：survivin引物序列5′aaaGaGCCaaGaaCaaaattGC3′(F)和5′GaGaGaGaaGCaGCCaCtGttaC3′(R),338bp;βactin引物序列5′CttCtaCaatGaGCtGCGtG
3′(F)和5′tCatGaGGtaGtCaGtCaGG3′(R),243bp.10μL逆转录体系用于逆转录合成cDna,30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min完成逆转录.10μLcDna用于pCR反应,分别单独加入相应上下游引物等在50μLpCR反应体系进行pCR反应.94℃预变性2min后进入pCR循环，条件：survivin和βactin，94℃变性30s,54℃复性30s,72℃延伸30s,共35个循环；RtpCR产物8μL在18g/L琼脂糖凝胶上电泳，经凝胶图像分析仪分析结果，以survivin与βactin的比值作为survivinmRna表达的相对含量.
1.2.3细胞免疫组化染色检测SSmC7721细胞Survivin蛋白表达变化取对数生长期细胞于预先置入盖玻片6孔板进行细胞爬片，在实验Ⅰ部分处理结束时，取出各组爬片细胞，pBS液轻轻漂洗，750mL/L乙醇固定，按试剂盒操作步骤进行细胞免疫染色.以正常鼠血清和磷酸盐缓冲液分别代替一抗行替代对照和空白对照.于普通光学显微镜下观察，以细胞核或细胞质出现棕褐色或棕黄色颗粒为阳性，随机选取5个高倍视野进行计数，每个高倍视野计数100个细胞，共500个细胞，计算细胞Survivin蛋白阳性表达率.
1.2.4吖啶橙(ao)染色法观察细胞凋亡时形态变化消化、收集实验Ⅰ,Ⅱ两部分处理的各组细胞，用磷酸盐缓冲液(pBS)洗2遍，制成单细胞悬液，浓度1010个/L,750mL/L乙醇固定4h,离心弃乙醇，加入8.5mg/L的ao2mL工作液，室温染10min后，滴几滴在载玻片，加缓冲甘油封片.在荧光显微镜下用吸收波长405nm,发射波长550~630nm观察，并随机拍照.
1.2.5mtt法检测细胞增殖变化取对数生长期的SSmC7721细胞，消化、收集、计数并接种于96孔板，每孔2×103个，并设3个复孔.实验设数个平行板，分Ⅰ,Ⅱ两部分；到实验预定点前4h加5g/L的mtt10μL，37℃反应4h，弃掉mtt，加200μLDmSo,轻轻振荡10min,使结晶溶解，酶标仪检测570nm波长a值.计算细胞生长抑制率(inhibitoryrate，iR).重复2次，取平均值.iR(%)=(a对照组-a实验组)/a对照组×100%.
1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡率消化、收集经实验Ⅰ,Ⅱ两部分各处理组细胞，按annexinV细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，磷酸盐缓冲液(pBS)漂洗，加入Bindingbuffer缓冲液200μL、annexinV/FitC(20mg/L)10μL和pi液(50mg/L)5μL，室温避光孵育30min后加入Bindingbuffer缓冲液300μL，立即用流式细胞仪FaCScan(BeclonDickison公司)测定，经计算机软件处理，计算凋亡细胞百分率,实验重复2遍.
统计学处理:实验数据以x±s表示；应用SpSS13.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析，并进行两两比较(q检验).以p<0.05认为差异有统计学意义.
2结果
2.1aSoDn反义复合物对肝癌SSmC772细胞survivinmRna表达的影响RtpCR检测survivinmRna水平显示400nmol/LaSoDn反义复合物组(0.21±0.03)较空白对照组(0.99±0.02)、等量脂质体Lipofectaminetm2000对照组(0.94±0.03),400nmol/LSoDn复合物组(0.94±0.03)RtpCR扩增的条带减弱(p<0.01).通过计算机图像分析结果表明，400nmol/LaSoDn反义复合物组与空白对照组、等量脂质体Lipofectaminetm2000对照组、400nmol/LSoDn复合物组相比较差异有统计学意义(p<0.01)，其他各组间相比较差异无统计学意义.
2.2aSoDn反义复合物对肝癌SSmC772细胞Survivin蛋白表达的影响细胞免疫组化染色结果显示，400nmol/LaSoDn反义复合物组(19.7±3.7)%较空白对照组(76.5±8.7)%、等量脂质体Lipofectaminetm2000对照组(74.5±8.2)%,400nmol/LSoDn复合物组(73.9±7.9)%Survivin蛋白表达明显下调，差异有统计学意义(p<0.01).
2.3细胞凋亡形态学变化aSoDn反义复合物联合槲皮素组凋亡细胞数量明显较空白对照组、等量脂质体Lipofectaminetm2000对照组、SoDn复合物组、aSoDn复合物组及槲皮素组增加，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质成红色荧光.凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体等典型改变(图1).
2.4mtt法检测SSmC7721细胞增殖变化aSoDn复合物组（28.4%）或槲皮素组（43.1%）可抑SSmC7721细胞增殖(p<0.01)，而脂质体组（1.7%）则无此效，aSoDn反义复合物联合槲皮素时表现出协同抑制细胞增殖作用（69.8%），两药联合对细胞的增殖抑制效果高于单用aSoDn复合物组（28.4%，p<0.01)和槲皮素组(43.1%，p<0.01).
2.5细胞凋亡率的变化与空白对照组、脂质体对照组相比，aSoDn复合物组、槲皮素组、aSoDn复合物+槲皮素组均能诱导细胞凋亡，且其诱导细胞凋亡率(annevix(+)pi(-))分别是脂质体组的3.1倍、4.3倍、18.2倍，差异有统计学意义(p<0.01)，aSoDn复合物联合槲皮素组与aSoDn复合物组、槲皮素组比较，其诱导细胞凋亡率分别是他们的5.9倍、4.2倍，差异有统计学意义(p<0.01)，并且各组间流式细胞仪检测时损伤率(annexin(+)pi(+))无统计学意义（表1）.表1各组细胞凋亡率变化
3讨论
Survivin的组织分布特征具有明显的选择性，其表达于胚胎和发育
的胎儿组织，但不见于终末分化的成人组织(胸腺、生殖腺除外)，而表达于大多数肿瘤组织中［8-9］，使它成为一个癌的分子标志和治疗靶点.研究发现，Survivin能够通过杆状病毒iap重复序列(BiR)作用于Caspase3,Caspase7来抑制凋亡蛋白酶活性，阻止多种凋亡信号诱导的细胞凋亡，而且能在细胞有丝分裂前期通过与纺锤体微管发生特异性结合反应，使肿瘤细胞逃避细胞周期G2/m期检测点的监控，抵抗因Dna损伤或突变自身诱导的细胞凋亡，从而导致肿瘤细胞异常分裂增殖［10］，另外Survivin蛋白亦可通过p21蛋白间接抑制caspase酶而起作用,阻断细胞的凋亡过程,其抑制细胞凋亡的作用远远大于bcl2家族成员,是迄今发现的最强的凋亡抑制因子.Survivin的高表达可以使肿瘤细胞免受各种凋亡信号的刺激而帮助细胞存活［11-12］.槲皮素(Quercetin)是具有多种生物活性的黄酮类化合物，其维生素p样的作用已应用于临床.国内外已有研究显示，槲皮素是目前已知的最强的抗癌剂之一，能够诱导多种肿瘤细胞凋亡［13］，同时槲皮素还有抗炎、抗过敏、抗氧化、降血脂、降压等生理活性.本实验应用反义核酸技术，用脂质体Lipofectaminetm2000介导人工合成的特定Dn段aSoDn分子转染SSmC7721细胞，人工合成的特定Dn段aSoDn分子与进入细胞质的survivinmRna上的特定位点相结合，形成DnaRna复合物，抑制survivinmRna与核糖体结合，同时激活Rna降解酶H，降解survivinmRna，从而抑制或封闭基因的表达，干扰survivin致病蛋白的产生［14］.实验结果显示，aSoDn复合物作用于肝癌SSmC7721细胞48h后，采用RtpCR和细胞免疫组化检测示与空白对照组比较，aSoDn复合物组survivinmRna、Survivin蛋白表达明显下调，而等量脂质体组、SoDn复合物组survivinmRna、Survivin蛋白表达变化差异则无统计学意义，实验证明了aSoDn复合物可有效抑制survivin基因的表达.实验进一步用等剂量的槲皮素(亚致死浓度)处理实验Ⅰ部分各实验组肝癌SSmC7721细胞24h后，实验结果显示，与其它组比较，aSoDn复合物+40μmol/L槲皮素组(联合组)ao染色法观察在相同条件联合组满视野见典型细胞凋亡形态学变化且凋亡细胞数量明显增加，mtt法、annexinV/pi双染流式细胞仪检测示在同等条件联合组细胞生长抑制率和细胞凋亡率明显高于其它组，差异有统计学意义.也就是有效封闭肝癌SSmC7721细胞survivin基因的表达能增强槲皮素对该细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用即aSoDn反义复合物联合槲皮素对肝癌SSmC7721细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用具有协同效应.实验结果还表明，SSmC7721细胞survivin基因表达降低后，其抗凋亡能力被有效抑制了，推测联合组对肝癌细胞的协同细胞毒性导致的凋亡可能是通过两个凋亡途径的共同通路［15］即激活Caspase效应子而实现的.至于是通过死亡受体途径还是通过线立体途径介导的凋亡有待进一步研究.
【参考文献】
［1］HuangY,ibradoam,ReedJC,etal.CoexpressionofseveralmolecularmechanismsofmultidrugresistanceandtheirsignificanceforpaclitaxelcytotoxicityinhumanamLHL60cells［J］.Leukemia,1997,11(2):253-257.
［2］ambrosiniG,adidaC,altieriDC,etal.anovelantiapoptosisgenesurviving,expressedincancerandlymphoma［J］.natmed,1997,3(8):927-921.
［3］itot,ShirakiK,Yamanakat,etal.Survivinpromotescellproliferationinhumanhepatocellularcarcinoma［J］.Hepatology,2000,31(5):1080-1085.
［4］LopezLazarom.Flavonoidsasanticanceragents:Structureactivityrelationshipstudy［J］.CurrmedChemanticanceragents,2002,2(6):691-714.
［5］RanellettiFo,maggianon,SerraFG,etal.Quercetininhibitsp21RaSexpressioninhumancoloncancercelllinesandinprimarycolorectaltumors［J］.intJCancer,2000,85(3):438-445.
［6］Shim,wangFS,wuZZ.Synergeticanticancereffectofcombinedquercetinandrecombinantadenoviralvectorexpressinghumanwildtypep53,GmCSFandB71geneonhepatocellularcellsinvitro［J］.worldGastroenterol,2003,9(1):73-78.
［7］DaiDJ,LuCD,LaiRY,etal.Survivinantisensecompoundinhibitsproliferationandpromotesapoptosisinlivercancercells［J］.worldGastroenterol,2005,11(2):193-199.
［8］tongQS,ZhengLD,ChenFm,etal.Selectionofoptimalantisenseaccessiblesitesofsurvivinanditsapplicationintreatmentofgastriccancer［J］.worldJGastroenterol,2005,11(5):634-640.
［9］altieriDC.Survivin,versatilemodulationofcelldivisionandapoptosisinc
ancer［J］.oncogene,2003,22(53):8581-8589.
［10］JohnsonaL,LangerJS,BridghamJt.Survivinasacellcyclerelatedandantiapoptosisproteiningranulosecells［J］.endocrinology,2002,43(9):405-413.
［11］tammi,wangY,Sausvillee,etal.iapfamilyproteinSurvivininhibitsCaspaseactivityandapoptosisinducedbyFas(CD95),Bax,Capase,andanticancerdrugs［J］.CancerRes,1998,58(23):5315-5320.
［12］Conwayem,pollefeytS,Steinermosonyim,etal.DeficiencyofsurvivinintransgenicmiceexacerbatesFasinducedapoptosisviamitochondrialpathways［J］.Gastroenterology,2002,123(2):619-631.
［13］KimwK,BangmH,KimeS,etal.QuercetindecreasestheexpressionoferbB2anderbB3proteinsinHt29humancoloncancercells［J］.JnutrBiochem,2005,16(3):155-162.
细胞生物学定义篇2
一、“细胞分化”概念内涵及层级
1.在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上会发生稳定性差异。细胞的这种特化不仅是正常发育所必需的,而且还能提高细胞各种生理功能的效率。
2.一般说来,体内各种细胞均含有物种的全部基因,但基因的表达具有时空性。细胞之所以在形态、结构和功能上发生稳定性差异,是因为组织特异性基因选择表达成了组织特异性蛋白的缘故。从理论上讲,已分化的细胞仍然具有发育成一个完整个体的潜能。
3.细胞分化是渐进性的,其方向的限定早于形态差异的出现,且分化细胞的表型保持相对稳定,一般不可逆转。
之所以采用完整的陈述句的形式来表述概念,是因为这种表述方式更易于确认需要学生理解和掌握概念的内容及意义,也更易于建立概念之间的联系。
二、“细胞分化”概念教学的组织
在分析“细胞分化”的概念内涵及层级之后,教学设计应该紧紧围绕着相应的概念条款展开,通过列举事实、分析讨论,或者基于资料的探究等活动,帮助学生深层理解这些概念内涵,并基于概念理解而构建合理的知识结构(见图1)。
1.列举事实,尝试定义。呈现人的受精卵发育至胎儿的图片:列举学生熟知的根尖分生区细胞分化成伸长区、成熟区的事实,然后,引导学生抽象概括出:“细胞分化是指在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上会发生稳定性差异的过程。”这是广大教师一贯坚持的做法,值得肯定。因为事实是用来帮助学生建立和理解概念的,事实当然要围绕着概念的结构来排布。但是,定义常常不等同于概念。“定义”通常用“是……”来表述,说得十分肯定。“概念”描述一类事物的本质,有时并不用“是”来描述。在引导学生下定义之后,教师还应该设置下列问题,吸引学生深入思考细胞分化的结果和生物学意义。①在人的个体发育过程中,假若没有细胞分化,受精卵能发育成胎儿吗?为什么?②细胞在形态、结构上出现特化,对于细胞完成其生理功能有何意义?③从遗传的角度分析,受精卵为什么能够发育成一个完整个体?问题3的设置实际上是指向“细胞全能性”这一核心概念的丰富内涵,之所以在此设置问题3,一方面是因为不仅已分化的细胞具有发育成完整个体的潜能,未分化的受精卵在自然条件下更容易发育成一个完整的个体。也就是说,“细胞全能性”这一概念是随着教学进程不断建构起来的;另一方面,其用意还在于探讨细胞分化的原因,起到承上启下的教学功效。
2.探究发现,明晰原因。美国地平线研究组(HorizonResearchteam)主席维斯(weiss)及高级研究助理帕斯利(pasley)经过了18个月的观察,对364节课详细分析,发现优质课堂主要有几个特征,其中包括:①在课堂教学过程中,教师善用多种策略,为某个科学概念提供清晰的阐释;②吸引学生从事动脑筋的活动;③帮助学生理解学科的核心概念等。因此,可以引入相关科学史对细胞分化原因进行探讨。
资料1:最早试图对细胞分化机制作出解释的学者是weismann(1883),他根据当时对马蛔虫的研究结果,提出了“体细胞分化是由于遗传物质丢失造成的,每一种组织只保留了其特有的遗传物质”的见解。在马蛔虫这一特例中,在卵裂过程中体细胞的染色体确实发生丢失现象。因此,weismann这一观点在当时看来既符合逻辑,又有实际例证,因而被学术界所普遍接受。你同意上述观点吗?根据是什么?
资料2:1958年Steward等利用胡萝卜根的韧皮部组织培养出了完整的新植株;1970年Steward用悬浮培养的胡萝卜单个细胞培养成了可育的植株。
资料3:1969年nitch将烟草的单个单倍体孢子培养成了完整的单倍体植株。
分析资料2和资料3,你得出的结论是什么?基于对上述3则资料的分析探究,学生就容易得出以下结论:①高度分化的植物体细胞,遗传物质并没有丢失,仍含有发育成一个完整个体所需的全套基因,具有发育的全能性;②在二倍体染色体组中,只要有一套单倍体的基因组,就含有该物种的全部遗传信息,因此,植物的生殖细胞也具有发育的全能性。至此,细胞全能性的概念内涵已昭然若揭,师生共同归纳(见图2)。学生仍然会有2个疑问:①既然已分化细胞中含有相同的遗传信息,为什么细胞的形态、结构和生理功能会出现稳定性差异?②已分化的动物细胞是否也像植物细胞那样具有发育的全能性?针对疑问1,教师可以列举事实,循循善诱,问题指向要明确,最终让学生领悟“细胞分化是组织特异性基因表达的结果”。例如:通过分子杂交实验表明,在任何时间一种细胞的基因组只有一少部分基因在活动。在幼红细胞中,糖酵解酶系的编码基因、核糖体蛋白基因是否均能表达?血红蛋白基因、胰岛素基因是否都能表达?细胞的形态、结构与生理功能主要由哪种化学物质直接体现?幼红细胞最终分化成红细胞的主要原因是什么?针对疑问2,教师要向学生说明:到目前为止,人们还没有成功地将单个已分化的动物体细胞培养成新个体,这是因为动物细胞的发育潜能随着分化程度的提高而逐渐变窄。但这种分化潜能的变化是对细胞整体而言的,对细胞核来说是否还保持着全能性呢?进而引导学生分析细胞核移植实验。
3.因果分析,把握特征。学生一旦理解了细胞分化的因果关系,就容易从中把握细胞分化的特征:①渐变性——细胞在发生形态差异之前的一定时间,细胞分化命运即已确定,基因活动模式已发生改变,从基因到蛋白质再到细胞形态、结构、功能特化是一个渐变过程。②不可逆性——分化细胞的表型保持相对稳定,以执行特
定的功能。然而,在某些条件下,分化细胞的基因活动模式可发生可逆的变化,又回到未分化状态。
细胞生物学定义篇3
[摘 要] 目的：通过探讨机械刺激对大鼠“足三里”穴筋膜组织成纤维细胞的压力信号生物转换作用，为腧穴“感受刺激，防治痰病”的现代医学生物学机制提供理论与实验依据。方法：体外培养大鼠“足三里”穴及穴旁区域的筋膜组织细胞，对细胞进行形态学鉴定后，实施压力刺激并检测细胞外培养液中前列腺素e2(pGe2)和白细胞介素－6(iL-6)含量的变化。结果：“足三里”穴及穴旁区域的筋膜组织细胞主要都是成纤维细胞，压力刺激均能够促进细胞pGe2和iL-6合成释放的增加，差异有统计学意义。结论：腧穴与非穴的筋膜组织成纤维细胞皆能直接感受刺激，从而将机械信号转换为生物信号。
[主题词] 穴，足三里；成纤维细胞／针灸效应，信号传递；物理刺激
文章编号：0255-2930(2007)02-0135-06
中图分类号：R245．2 文献标识码：a
腧穴是人体脏腑经络气血输注并散发于体表的部位，它不仅能够反映病候以协助诊断，更重要的是，腧穴在感受毫针针刺与推拿按摩的机械性刺激后，还能激发出本身所固有的调节功能，从而发挥其防治疾病的作用。那么，腧穴究竟是如何感受机械性刺激，并将无机的机械信号转换为有机的生物信号的呢?目前，对此大多是从神经生物学机制的角度进行解释的，但实际上，在实施机械刺激的腧穴局部，除了各种神经装置外，其他组织和细胞也是直接暴露于治疗操作的力学环境之下的，理论上就更有可能主动地参与腧穴“感受刺激”的信号转换过程。由于在腧穴特性的研究中，“足三里”穴有着典型的代表意义，因此，对其附着组织的主要细胞群体――筋膜结缔组织成纤维细胞机械力学信号生物转换作用的研究，将有助于补充神经生物学机制对腧穴研究的不足，从而更全面地阐述腧穴“感受刺激，防治疾病”的一般生物学原理。
1 材料与方法
1．1 材料
(1)实验动物、主要培养试剂及检测试剂
健康3月龄雄性SD大鼠32只(由四川抗菌工业研究所动物中心提供，合格证：川实动管质第041307号)，Dmem培养基(GiBCo，USa)，小牛血清(GiBCo，USa)，胰蛋白酶(DiFCo，USa)，eDta(SiGma，israel)，pGe试剂盒(上海森雄公司)，iL-6试剂盒(深圳晶美公司)。
(2)主要实验器材
C02培养箱(Heraeus，Germany)，倒置相差显微镜及组像系统、体视显微镜(olympus，Japan)，离心机(北京医用分析仪器厂)，气压传导压力加载装置(自制)，HtS7000plus多孔板(紫外／荧光／可见光)高效分析仪(pe，USa)，6孔培养板，100mL细胞培养瓶，微量加样枪，滤菌器等。
1．2 腧穴与非穴筋膜组织细胞的原代培养及传代
(1)腧穴筋膜组织细胞的原代培养及传代
对32只SD大鼠分别进行“足三里”穴区皮下组织块取样，体视显微镜下分离其中的筋膜结缔组织，按酶消化法，无菌条件下剪碎组织块，移入无菌小瓶中，加入o．25％胰酶1mL，混匀，37℃，5％C02孵箱内培养10～15min，每5min振摇1次；加入含10％小牛血清的Dmem培养基终止消化；离心，1000r／min，8min，收集筋膜组织细胞；然后加入含20％小牛血清的Dmem培养基，混匀；转移至100mL培养瓶中，Co孵箱内继续培养。细胞贴壁后，每隔2天换液，每日观察生长状况，细胞生长达80％融合时，传代培养，镜下连续记录细胞形态并进行细胞形态学鉴定。
(2)非穴筋膜组织细胞的原代培养及传代
对上述大鼠进行“足三里”穴区皮下组织块取样的同时，于穴旁5分以上距离区域同步切取皮下组织块，体视显微镜下分离其中的筋膜结缔组织，按相同方法获取筋膜组织细胞并进行原代培养、传代培养、生长记录及细胞形态学鉴定。
1．3 细胞力学加载实验
(1)气压传导压力加载装置
气压传导压力加载装置――自制带压力表及压力气囊的压力锅；装置设计原理采用气体传导静压力的静压加压法；装置制作方法参考相关文献方法进行。
(2)细胞在6孔板上的接种培养及加力前处理
分别取第7～8代腧穴筋膜组织细胞和非穴筋膜组织细胞，弃培养液，加入o．25％胰酶和o．1％eDta混合消化液消化细胞，约3～5min；当瓶底出现针孔样透明时，用含10％小牛血清的Dmem终止消化细胞，调整细胞密度，按2×10。／mL接种于6孔培养板；显微镜下见细胞完全贴壁生长后，继续培养72h；弃含10％小牛血清的Dmem培养液，准确更换含5％小牛血清的Dmem培养液3mL，再培养24h，使细胞同步化，备用。
(3)实验设计及操作
①实验设计
实验采用3因素(细胞因素、力学因素和时间因素)析因方差实验设计进行。将实验大鼠腧穴筋膜组织细胞样本(n=32)随机分为压力刺激组(n=16)和空白对照组(n：16)，每个组下根据不同处理时间又各设4h和8h共两个检测点，每个检测点均包含8个样本；同时将非穴筋膜组织细胞进行相同分组处理，从而动态比较压力刺激对腧穴与非穴筋膜组织细胞生物学状况的影响。
②空白对照组处理
将空白对照组细胞置于37℃含5％Co孵箱中，不施加压力刺激，于压力组实验开始的同时，分别继续培养4h和8h，于每个时间点上取出细胞培养板，提取细胞培养液以备检测。
③压力刺激组处理
将压力刺激组细胞置于压力装置中，然后移入37。C含59／6Co孵箱中，以孵箱内59／Co加95％空气组成的混合气体加压，维持压力装置内的压力达50kpa，分别继续培养4h和8h，于每个时间点上取出细胞培养板，提取细胞培养液以备检测。
1．4 指标检测
(1)细胞鉴定采用形态学鉴定方法进行。
(2)pGe2测定采用上海森雄公司酶联免疫吸附竞争试剂盒法。
(3)iL-6测定采用深圳晶美公司酶联免疫吸附试剂盒法。
1．5 统计学处理
形态学资料采用直接对比法；数据资料采用SpSS12．0统计软件中广义线性模型(GeneralLin―earmodel，GLm)的单变量(Univariate)过程析因方差分析(Factorialanalysis)进行检验，比较细胞因素、力学因素和时间因素在实验组与对照组之间的差异有无统计学意义。
2 结果
2．1 细胞鉴定
在倒置相差显微镜下，腧穴与非穴的筋膜组织细胞在传代接种时，由于细胞密度低、数量少且分散，细胞开始贴壁生长时呈小圆形或短梭形(见图1、图2箭头所示)；当细胞生长达到一定密度后生长融合，细胞梭形变长，胞体丰满，胞浆均匀，核圆形或
卵圆形，核仁清晰，细胞群体单层生长，呈漩涡状、栅栏状、放射状外观(见图3、图4箭头所示)。
两种细胞的形态学特点都符合正常成纤维细胞在形态学上的共同特征。因此，从形态学上可以鉴定本次实验的实验对象――腧穴与非穴的筋膜组织细胞均主要为成纤维细胞，且腧穴与非穴成纤维细胞在形态学上无明显差异。
2．2 压力刺激对腧穴与非穴成纤维细胞pGe合成释放的影响
不同实验因素对成纤维细胞合成释放pGe2的影响不同，见表1。统计分析显示：力学因素、细胞因素与时间因素之间，力学因素是促进腧穴与非穴成纤维细胞合成释放pGe的主要因素，其差异有统计学意义(p＜0．05)；而细胞因素和时间因素对pGe合成释放的影响均无统计学意义(p＞0．05)。
2．3 压力刺激对腧穴与非穴成纤维细胞iL-6合成释放的影响
不同实验因素对成纤维细胞合成释放iL－6的影响见表2。经统计分析，力学因素、细胞因素与时间因素之间，力学因素是促进腧穴与非穴成纤维细胞合成释放iL－6的主要因素，其差异有统计学意义(p＜0．01)，细胞因素和时间因素对iL－6合成释放的影响均无统计学意义(p＞0．05)。
3 讨论
3．1 筋膜结缔组织成纤维细胞是经脉腧穴主要组织的主要细胞群体
通过多年的反复研究，近年来，越来越多的经络腧穴研究者开始逐步把目光更多地注视于过去没有引起充分重视的筋膜结缔组织上来，认为经络穴位的物质基础是在以结缔组织为基础，连带其中的血管、神经丛和淋巴管等交织而成的复杂体系之中。这个由结缔组织结构联系起来的体系，不仅是各种器官、组织和细胞的载体，而且与细胞进行着物质、信息和能量的传输和调节，构成一个对生物机体内外环境能作出反应的动态平衡体系。
结缔组织起源于胚胎时期的间充质，在体内广泛分布，一般认为具有连接、支持、营养和保护等多种功能。但目前发现结缔组织的许多重要功能尚未充分认识，其细胞组成以未分化的潜能细胞为主，其中，细胞数量最多的是成纤维细胞。
3．2 压力是毫针针刺和推拿按摩的基本力学作用形式之一
从历史发展的角度看，对经脉和穴位最原始的刺激方式应是以手指(或手掌)对阿是穴的按压(或按揉)。生产力的发展促使人类发明了针具，针具的使用使得人手的功能得到进一步延伸。原始的针具大而粗糙，针刺时，穴位除了明显的组织损伤外，针体也会对其周围组织产生明显的侧向挤压作用，因此压力刺激是腧穴应力刺激最原始的一种作用方式。
随着推拿按摩治疗技术的发展，手法逐渐多样化，而与此同时，生产力的发展也使得针具的生产工艺日益精细，毫针的各种操作手法日渐丰富起来，这时，压力刺激已不再是针推治疗的主要力学刺激形式，其他力学形式(如提插力、捻转力、牵张力、摩擦力和剪切力)的刺激作用显得越来越重要，但仔细分析，这些变化都不能否定压力刺激仍然是针推治疗过程中腧穴应力刺激最基本的力学作用方式之一。
3．3 腧穴感受刺激现代研究的困境与思考
现代研究认为，腧穴通过各种穴位感受器感受刺激，穴位感受器的物质基础就是能将刺激转换为神经冲动的各种感觉感受器。这些穴位感受器将机械信号转换为生物电信号(神经冲动)后，一方面传递到大脑皮质形成针感，另一方面通过各级中枢的反射或调制，对内脏和躯体活动进行调控(神经调节或神经一体液调节)。临床针推治疗的适应证广泛，目前对其作用机理的现代研究，究其根本几乎都是在该神经生物机制的基础上进行解释的，因为一旦脱离该机制，已有的经络腧穴研究将无法解决机械信号输入、整合，以及对其他系统的输出、调控问题，因此，神经生物学机制似乎是腧穴“感受刺激，防治疾病”惟一的生物学机制。然而，当神经系统发生疾患时，在信号的感受、传递、整合或者传出等诸多环节大多存在功能障碍，而为什么针推临床的很多有效病种恰恰又是神经系统方面的疾病呢?
重新审视一个常见的针灸临床现象时笔者发现，一部分患者在开始接受针刺治疗时，即便是取穴准确，针刺操作得当，还是会遇到患者不得气的情况。这时，医生通常会采取“留针候气”或“循弹催气”的方法以促使患者得气。事实上，借助于留针的静态机械刺激，或通过循弹手法的动态机械刺激，大多数患者是能够产生酸胀得气感的；即便是始终没有得气感出现的患者中，在治疗结束时，也仍然还是有部分患者能够体现出一定的治疗效应的。根据已有的科学基础，可以肯定的是：穴位感受器的物质基础虽然属于神经组织，但神经组织不仅能够感受机械刺激，而且同机体的其他组织器官一样，同样能够感受周围生化环境的变化，从而调整自身的功能，适应正常生理活动的需要。因此，在理论上，对“留针候气”或“循弹催气”等上述临床现象的解释就可能是，不依赖于神经生物学机制，穴区的其他组织细胞同时也直接参与了机械信号向生物信号的转换过程；这种生物信号可能包含某些生化信号分子，这些分子在细胞间隙的弥散，一方面作用于穴位感受器，促进了对机械刺激失敏的、功能低下的穴位感受器重新恢复正常的机械信号感受功能；另一方面，作用于其他组织和器官(包括神经组织的其他部分)，介导了腧穴其他不同治疗功能的发挥。但是，如果要证实腧穴存在非神经途径的作用机制，其关键的第一步就是要证明腧穴的非神经组织和细胞，特别是基本组织的主要细胞――筋膜结缔组织成纤维细胞究竟能不能感受机械力的刺激，能不能将机械信号转换为生物化学信号。
研究中，最理想的实验方法是直接探讨腧穴筋膜成纤维细胞在机体内的生理状态下对机械刺激诱导的各种反应。可是神经系统的敏感性、复杂性以及体内众多的环境因素(如血液循环、组织液流动等)将使体内研究难以区别单一效应或特定的联合效应，直接控制或检测以上诸多理化因素的影响是很困难的。所以，为了屏蔽这些因素的干扰，尝试体外培养腧穴筋膜组织成纤维细胞，进行离体的细胞力学刺激就成为本次研究的实验手段。
3．4 腧穴筋膜结缔组织成纤维细胞机械信号生物转换作用的针灸推拿学意义
(1)腧穴与非穴筋膜结缔组织成纤维细胞机械信号生物转换作用的差别研究
此次研究选取“足三里”穴筋膜组织成纤维细胞为研究对象，“足三里”属胃经合穴，是人体重要穴位之一，在腧穴特性的研究中有广泛的代表意义；选取“足三里”穴旁开5分以上距离的筋膜组织成纤维细胞为非穴对照组的研究对象。研究发现，腧穴成纤维细胞可以感受力学刺激，促进细胞合成释放pGe和iL－6，从而将无机的机械刺激信号转换为有机的生物化学信号；研究同时也发现，腧穴与非穴成纤维细胞对力学刺激的机械信号生物转换作用在实验中并无显著性差异。
回顾腧穴感受力学刺激的生物学机制时，笔者发现，首先从神经生物学机制上看：腧穴与非穴的神
经感受装置在结构上本身并无本质的不同，只是穴区的神经感受装置分布比非穴区多，但就相同的神经感受装置而言，其相同机械刺激信号的生物转换机制目前也并未见有不同报道；其次从非神经生物学机制上看：现代医学生物学多个领域的研究其实已经证实，机体其他广泛分布的组织细胞同样能够感受各种应力刺激，静态、动态生理力学刺激和外界应力刺激对细胞的形态、生化特性有重要影响，细胞的一个自伺放大机制可使一个短暂的刺激如应力刺激转换为一个持续的细胞反应，机械力对组织细胞的作用类似激素和其他生物活性物质，这些生化介质在将机械负荷转换为生物反应过程中起到了重要的作用。但针灸推拿学在该领域的基础研究，目前尚未见报道。
因此，虽然笔者此次研究并未发现腧穴与非穴筋膜组织成纤维细胞的机械信号生物转换作用有何明显差异，但是，如果考虑到整体状况下腧穴可以通过经脉进行生物信号级联传递的特性，那么重点研究腧穴筋膜组织细胞对力学刺激信号的生物转换作用，也是可以为全面认识腧穴的一般生物学特性、突破单一神经机制的限制提供新的实验依据的。
(2)压力刺激促进腧穴成纤维细胞pGe合成释放的意义
pGe2是众多前列腺素(pGs)中的一种。pGs广泛分布于人和哺乳动物的组织与体液中，对机体神经、心血管、泌尿、生殖、呼吸、消化、造血和免疫等多种生理病理功能起着重要的调节作用。人和哺乳动物组织的各种细胞(除红细胞外)均可合成pGs。pGs的合成与释放，首先都要动员不饱和脂肪酸，这种不饱和脂肪酸存在于细胞膜结构中呈结合状态的磷脂内。当刺激因素作用于细胞时，细胞膜磷脂上的磷酸酯酶，主要是磷酸酯酶a(pLa)被激活，作用于磷脂，释放出不饱和脂肪酸――花生四烯酸(aa)，aa先在细胞微粒体经脂肪酸环加氧酶催化，将氧加到不饱和脂肪酸上，形成15羟前列腺内过氧化物――pGG2，然后经前列腺内过氧化酶的催化生成pGH2。pGG2和pGH2在水中不稳定，它们在37℃时半衰期为5min，可自动地或在酶的作用下转化为pGe2、pGD2a、pGF2、pGl2和血栓素a2(tXa2)等各种pGs。不同类型的pGs可因结构上的细小差异而显示不同的生理活性，有的甚至相反，因而各种pGs在体内含量的增减和相互比例的失调均可导致有关生理功能的变化，对许多疾病的病理学和治疗学都有重要意义，至于具体合成哪一种则取决于当时的生理需要。
压力作为针推机械刺激的一种基本力学作用形式，其促进腧穴筋膜结缔组织成纤维细胞pGe2合成释放的关键意义在于：①离体培养的腧穴筋膜组织成纤维细胞在压力作用下能够启动pGe的合成释放，这意味着整体状况下腧穴成纤维细胞的胞膜磷脂结构在针推压力的刺激作用下也可能发生改变，启动pGs的合成，从而将机械刺激信号转换为生物化学信号；②由于pGe2可以抑制血小板凝集，扩张局部小血管，促进局部血液循环，因此笔者认为，该机制可能是针推疗法(物理性治疗手段)本身具有“活血化瘀”功效的基本生物学原理之一；③pGs合成一旦启动，其具体合成哪一种则取决于当时的生理需要，笔者推测，这和针推治疗效应与机体当时生理状态有关的作用规律可能存在某种内在的必然联系。
(3)压力刺激促进腧穴成纤维细胞iL-6合成释放的意义
iL-6的生物学作用广泛，在免疫方面：iL-6能诱导B细胞增殖、分化和产生抗体，能促进t细胞在胸腺的生长与细胞毒性t细胞分化成熟，并诱导其活性发挥，刺激肝细胞产生急性期反应蛋白，引起发热；在血液方面：iL-6具有刺激机体血液生成系统，发挥造血作用；在神经系统方面：iL-6能对抗神经损伤，促进神经元的存活，促进和保护受损神经元及轴突的再生，诱导神经元分化，加强神经内Ca2+反应，调节神经递质合成，刺激星形细胞增殖，刺激丘脑下部一垂体一肾上腺皮质轴和诱导发热，并对疼痛进行调节。
由于pGe2在体内不稳定，远距离传递的过程中容易失去生物活性，故只能起到局部不同组织之间信息传递的作用和局部治疗的效应，因此它的治疗学意义可能小于它作为信号分子的意义，更多的是为腧穴其他特定组织诸多功能的启动营造一个适宜的局部生化环境。而iL-6不同，iL-6作为一种可以由力学刺激而诱导产生的生物活性蛋白，在体内，其生物活性相对稳定，既能作用于穴区局部，起到局部不同组织间的信号传递作用(自分泌和旁分泌作用方式)，又能通过某种途径作用于远端组织器官甚至全身(内分泌作用方式胡)，发挥远治效应，所以iL-6的治疗学意义同样巨大。如果iL-6作用于局部与远端的神经组织，发挥神经营养作用，对抗神经损伤，调节神经感受功能等，笔者认为这些生理作用的发挥，也许就是为什么针推治疗能够治疗多种神经系统方面疾病的潜在机制之一；另外，iL-6的免疫增强作用和刺激造血作用似乎也正体现了腧穴筋膜组织在机械力刺激下发挥“蠲邪扶正”治疗效应的现代医学生物学原理。
细胞生物学定义篇4
目的：观察高糖条件下VeGFmRna,epomRna和epoRmRna在体外培养的müller细胞中的表达情况。方法:胰蛋白酶将新生小鼠视网膜组织吹打消化后，制成单细胞悬液，体外培养müller细胞，Rt?pCR测定高糖条件下视网膜müller细胞VeGF,epo和epoR基因的表达。结果：成功获得视网膜müller细胞,传代后90%以上的细胞呈兔抗鼠谷氨酰胺合酶（GS）染色阳性。müller细胞VeGFmRna，epomRna和epoRmRna在高糖条件下表达升高，且呈浓度依赖性(p<0.05)，但糖浓度50mmol/L组较40mmol/L组差异无统计学意义，无明显时间依赖性。结论：müller细胞在高糖条件下VeGF，epo，epoR的表达增加。教师职称
【关键词】 视网膜müller细胞；血管内皮生长因子；促红细胞生成素；促红细胞生成素受体；新生血管
abstract aim:toobservetheexpressionsofvascularendothelialgrowthfactor(VeGF),erythropoietin(epo),erythropoietinreceptor(epoR)mRnaindifferentlevelsofglucoseintheretinalmüllercellsofmiceinvitro.metHoDS:müllercellsofnew?bornmicewereculturedwithenzymedigestion.müllercellswereseparatedandpurifiedbyblowingandstrikingmethod.theexpressionsofVeGFmRna,epomRna,andepoRmRnaweredetectedbyRt?pCR.ReSULtS:Retinalmüllercellswereculturedsuccessfully,90%ofwhichwerepositivelystainedbyglutaminesynthetase(GS).theexpressionsofVeGFmRna,epomRnaandepoRmRnainretinalmüllercellsweresignificantlyenhancedinthehighglucosegroupwhichincreasedobviously(p<0.05),butthedifferencebetween50mmol/Lgroupandthe40mmol/Lgroupdidnothavestatisticalsignificanceortimedependence.ConCLUSion: withglucoseconcentrationelevating,VeGF,epo,epoRexpressionofculturedretinalmüllercellsincreased.
?
KeYwoRDS:retinalmüllercells;vascularendothelialgrowthfactor;erythropoietin;erythropoietinreceptor;neovascularization
0 引言
糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一,是患者视力丧失的主要原因。视网膜müller细胞为一种特殊的神经胶质细胞，在病理因素下，参与DR的发生。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VeGF)和促红细胞生成素(erythropoietin,epo)具有血管生成素的活性[1]。已经发现，VeGF主要由视网膜müller细胞分泌，近来Fu等[2]发现，正常视网膜组织中的epo主要是由müller细胞产生的。而增生性视网膜病变(proliferativediabeticretinopathy,pDR)患者的眼玻璃体中的epo浓度增高，与血清中epo浓度无关[3]。那么，视网膜müller细胞中VeGF，epo和促红细胞生成素受体(erythropoietinreceptor，epoR)的表达受哪些因素调控呢？是否与细胞周围环境中糖浓度有关呢？同时，还是否与葡萄糖作用时间有关呢？为了证实以上假设，我们采用不同葡萄糖浓度干预鼠视网膜müller细胞，并且同一糖浓度组干预不同的时间，然后观察müller细胞VeGF，epo和epoR基因表达的变化，从而探讨高糖对视网膜müller细胞VeGF，epo和epoR基因表达的调控作用。
1 材料和方法教师职称
1.1 材料
出生7d的清洁级健康昆明小鼠，由中南大学湘雅医学院动物学部提供。逆转录试剂盒（promeg公司），Simplyp总Rna提取试剂盒（Solarbio公司），兔抗鼠谷氨酰胺合酶（GS）（美国adi公司），高糖型和低糖型Dmem培养液（美国Hyclone公司），胎牛血清（FBS）（灏洋生物技术公司），pCR试剂盒（大连宝生物有限公司），pCR引物及Dna分子量标准(上海生物工程有限公司)，DaB显色盒、生物素标记的山羊抗兔igG、辣根酶标记的链霉卵蛋白素工作液（北京中衫金桥生物技术有限公司）等。出生7d的昆明小鼠脱颈处死后，无菌条件下迅速摘除眼球，移入超净台，D?Hanks液重复冲洗2次后，将离体眼球置于含Dmem培养液(含200mL/L胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L庆大霉素)沿角膜缘后约1mm剪开，轻轻挤压剥取视网膜。将视网膜剪碎，2.5g/L胰蛋白酶消化10min，含血清培养液终止消化。反复吹打细胞制成细胞悬液，经200目筛网过滤后，800r/min离心5min后弃上清。Dmem培养液调整细胞浓度为3×108/L，接种于事先包被有明胶的50mL塑料培养瓶内,置入恒温湿热培养箱(37℃，含50mL/LCo2，50mL/L空气)中培养。3～4d后，首次半定量换液，以后换液2～3次/wk。约10～12d，达80%以上融合，以1∶2方式进行传代。小鼠视网膜细胞悬液接种于细胞培养瓶24h后，可见有细胞贴壁呈不规则圆形，有角。3～5d后贴壁细胞增多，并从边缘长出数个细胞伪足。而后细胞分裂生长，10～12d左右融合达80%以上时，细胞形态典型：胞体呈长梭形，胞质丰富，胞核位于胞体中央、椭圆形、有2个或2个以上核仁，细胞呈轴向平行而紧密排列，可进行消化传代培养。p1～p4代细胞5～7d左右融合达80%以上，与原代细胞具有相似的细胞形态，胞体较原代细胞变大，变长，呈梭形、星形等多种形态。细胞间可有嵌合、粘连。取第2～3代细胞消化接种于预置有盖玻片的六孔培养板内，待盖玻片上细胞增殖到80%融合时，以谷氨酰胺合酶(GS)为一抗，进行免疫细胞化学染色,阴性对照用pBS代替一抗，DaB显色剂显色，苏木素复染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并照相。免疫细胞化学染色示细胞质中和细胞膜上出现棕黄色、棕褐色颗粒状或者网状物质的为阳性细胞。阳性细胞率>90%，可以认为实验所用为müller细胞。而加pBS代替一抗的细胞，免疫细胞化学染色呈阴性。
1.2 方法教师职称
以p3代对数生长期的小鼠视网膜müller细胞用于实验：将p2代müller细胞种植于六孔板中，种植前用含200mL/L胎牛血清的Dmem培养液制成细胞悬液并计数调整细胞浓度约为3×108个/L，接种至六孔培养板中，每个孔1mL，置于恒温湿热培养箱中培养。当孔中细胞达到80%融合时，换无血清培养液培育24h。分为对照组(糖浓度为25mmol/L)和高糖组(糖浓度分别为30，40和50mmol/L)，培养1，3和5d。干预过程中每天换液，维持恒定干预浓度。每孔做3个。用Simplyp总Rna提取试剂盒（Solarbio公司），提取细胞的总Rna，取Rna5μL以15g/L琼脂糖凝胶电泳分析总Rna的完整性，在紫外灯下见到明显的5S，18S，28S的条带认为合格；Rna2μL用紫外分光光度计测a260nm和a280nm计算a值和浓度，两者比值在1.8～2.0之间者视为合格，剩余于?70℃保存。小鼠引物序列采用primer5.0引物设计软件设计，所有碱基对均经BLaSt程序检验。所有引物系列均由上海生工生物工程公司合成。epo引物序列：上游5?CtCtGGGCCtCCCaGtC3?、下游：5?tGttCGGaGtGGaGCaG3?，pCR产物大小410bp。epoR引物序列：上游5?attGGataaGtGGttGCtGCC3?、下游：5?CCCCCGaaCtGtaatCtGttG3?，pCR产物大小305bp。VeGF引物序列：上游：5?GGatCCatGaaCtttCtGCt3?、下游：5?GaatCCaCCGCCtCGGCttGtC3?，pCR产物大小450bp。β?actin引物序列：上游：5?GtGGGCCGCtCtaGGCaCCa3?、下游：5?CGGttGGCCttaGGGttCaGGGGG3?,pCR产物大小245bp。按照RevertaidFirstStrandcDnaSynthesisKit说明进行，总反应体系为20μL，反应前将Rna终浓度调整为0.1g/L，进行逆转录反应。各取cDna2μL，分别加入VeGF，epo和epoR特异性引物，引物终浓度调整为20μmol/L；内参照β?actin特异性引物终浓度调整10μmol/L。按taq酶说明书加入试剂，pCR扩增条件：94℃，30s，变性；VeGF60℃，1min，退火，epo59℃，1min，退火，epoR58℃，1min，退火；68℃，2min，延伸。以上3步循环35次，最后72℃，终末延伸10min。扩增反应结束后取pCR产物5μL与LoadingBuffer1μL混合，进行15g/L的琼脂糖凝胶电泳，100V，30min后，自动凝胶成像仪成像分析，计算目的基因mRna的相对含量。mRna的相对含量=目的基因mRnaa值/β?actinmRnaa值。应用mBi公司100bp梯度maker为分子大小对照确定电泳条带。
统计学分析：实验数据用SpSS17.0软件处理，结果用均数±标准差(±s)表示VeGF，epo和epoR的表达组间均数比较采用独立样本t检验，p<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1VeGFmRna的表达教师职称
müller细胞VeGFmRna的表达基本上随着葡萄糖浓度的增加逐渐增强(p<0.05)，但葡萄糖浓度50mmol/L组相较40mmol/L组差异无统计学意义。随着干预时间的延长müller细胞表达VeGFmRna的表达差异无统计学意义(图1，表1)。表1müller细胞VeGF,epo,epoRmRna的表达(略)
2.2epomRna的表达
视网膜müller细胞epomRna的表达基本上呈浓度依赖性(p<0.05)，但至最高浓度时(即培养液葡萄糖浓度50mmol/L)差异无统计学意义。在相同糖浓度作用条件下epomRna表达的差异无统计学意义(图1和表1)。
2.3epoRmRna的表达
müller细胞epoRmRna的表达基本上随着葡萄糖浓度的增加逐渐增强(p<0.05)，50mmol/L浓度组相较40mmol/L浓度组差异无统计学意义；相同糖浓度条件下epoRmRna的表达随时间的变化，差异无统计学意义(图1和表1)。
3 讨论
视网膜müller细胞是一种特化的视网膜神经胶质细胞，具有维持视网膜正常结构与功能、营养视网膜等多种生理功能。DR血管闭塞区域müller细胞胶质反应性增强，细胞轴突长入闭塞的毛细血管内腔，可能参与pVR和pDR相关的牵拉性视网膜脱离[4]。müller细胞对胶质细胞酸性蛋白、波纹蛋白、谷氨酸胺合酶（GS）、S抗原、碳酸酐酶等染色阳性，因只有GS在视网膜中仅存在于müller细胞，所以GS为müller细胞的特异性标志物[5]。体外培养时25～30mmol/L的高糖浓度，可近似地等同于糖尿病时体内高糖状态，故以此为对照组。我们实验选用30，40和50mmol/L的葡萄糖浓度模拟体内的绝对高糖环境。实验中采用了高糖Dmem培养液，取25mmol/L葡萄糖浓度作为对照组。VeGF是由2条相同多肽链组成的高度糖基化碱性蛋白。免疫组化研究表明，糖尿病患者视网膜血管内皮细胞VeGF反应明显增高，而非糖尿病患者视网膜毛细管内皮细胞及周细胞染色较弱[6]。高糖作为DR的始动因素，其可能机制之一为诱导视网膜müller细胞VeGF的表达，并且已经出现了针对VeGF血管生成素活性的治疗手段。avastin是重组的人类单克隆igG1抗体，与VeGF异构体结合，达到中和配体的作用，从而抑制其生物活性。在pDR手术前1～2wk玻璃体腔注射1～1.25mg的avastin可以有效地减少术中出血，并且使新生血管消退[7]。我们发现，不同浓度葡萄糖组的müller细胞VeGF表达较前一浓度升高，差异具有统计学意义(p<0.05)，这与以往的报道是一致的。而50mmol/L组相较40mmol/L组差异无统计学意义。这种现象可能是müller细胞的一种自分泌反馈调节机制。而随着干预时间的延长，müller细胞VeGF的表达差异无统计学意义。教师职称
epo是含有165个氨基酸，分子质量为34.4kDa的激素糖蛋白，epoR属于Ⅰ型细胞因子受体家族成员之一，由507个氨基酸组成。研究表明在增生性糖尿病视网膜病(pDR)患者的眼玻璃体中的epo浓度较普通人有显著的提高[8]。高氧诱导的血管增生性视网膜病变的动物模型实验，玻璃体内注射促红细胞生成素受体抗体（epoRa），发现突破视网膜内界膜进入玻璃体腔内的新生血管内皮细胞核明显少于未经注射眼，且新生血管的密度明显轻于未注射眼[9]。epo/epoR系统与糖尿病视网膜病变的联系可以具体到DR的不同阶段。早期糖尿病大鼠的视网膜中epoR呈大量强阳性表达，到了Dm的晚期epo便作为一个血管源性因子发挥作用[10]，由此推测在早期DR中epo/epoR是自我保护系统，到了晚期epo的自我保护转化成了致病因素。我们的实验中发现：不同浓度葡萄糖组的müller细胞epomRna，epoRmRna表达较前一浓度组明显升高(p<0.05)。而50mmol/L组相较40mmol/L组差异无统计学意义。同样可能为müller细胞的自分泌反馈调节。随着干预时间的延长，müller细胞epo/epoR的表达差异无统计学意义。故高糖条件下视网膜müller细胞的epo/epoR表达增多可能为DR发生的机制之一。因此，我们推测Dm可能通过刺激视网膜müller细胞VeFG,epo,epoR的分泌增多，从而导致DR的发生。
【参考文献】
1 俞梅，郎景和，朱兰，等.子宫颈病变中促红细胞生成素受体的表达及其与微血管密度的相关性研究.中国现代实用医学杂志2005；14（6）：1?4
2 FuQL,wuwt,wangH,etal.Upregulatedendogenouserythropoietin/erythropoietinreceptorsystemandexogenouserythropoietinrescueretinalganglioncellsafterchronicocularhypertension.Cellmolneurobiol2008；28(2):317?329
3 KatsuraY,okanot,matsunoK,etal.erythropoietinishighlyelevatedinvitreousfluidofpatientswithproliferativediabeticretinopathy.DiabeteCare2005；28（9）：2252?2254
4 凌志红,徐格致.糖尿病视网膜müller细胞病理改变的体内外研究.眼科研究2005；23(3):262?265
5 苟琳,张作明,徐汉鹏.视网膜müller细胞在视网膜病变中的作用和研究现状.眼科研究2003；21（2）：217?220
教师职称
6 Yokoim,YamagishiSi,takeuchim,etal.elevationofaGeandvasularendothelialgrowthfactorwithdecreasedtotalantioxidantstatusinthevitreousfluidofdiabeticpatientswithretinopathy.BrJophthalmol2005；89(6):673?675
7 李灵,席新华.avastin在眼科中的应用.国际眼科杂志2008；8(3):582?583
8 LynchSS,ChengCm.Bevacizumabforneovascularoculardiseases.annpharmac2007；41(4):614?625
细胞生物学定义篇5
【关键词】胃肿瘤
关键词:胃肿瘤;血管内皮生长因子;反义核酸中图号:R730.23文献标识码:a
摘要:目的利用本室构建的反义VeGF165（血管内皮生长因子，vascularendothelialgrowthfactor）真核表达载体，研究VeGF反义Rna表达对人胃癌细胞生物学表型的影响.方法用阳性脂质体介导的基因转染技术，将VeGF反义Rna重组体转入人胃癌细胞系，观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学表现.结果VeGF反义Rna重组体转染胃癌细胞后，斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示，反义Rna基因转染技术可使VeGF的表达明显减弱;与未转染的细胞相比，G2/m期细胞增加（0.39），而S期细胞减少（0.54）;克隆形成率（2.2%）低于未转染细胞（4.0%）;肿瘤细胞接种裸鼠后33d时，VeGF反义Rna表达人胃癌细胞所致的移植瘤体积（345±136）mm3明显小于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363）mm结论VeGF反义Rna可以通过抑制肿瘤组织血管生成而防治肿瘤的生长，另外VeGF的表达可能与细胞增殖能力有关.
Keywords:stomachneoplasms;vascularendothelialgrowthfactor;antisensenucleotide
abstract:aimtoinvestigatetheeffectofvascularen-dothelialgrowthfactor（VeGF）antisensegeneonthebiolog-icalcharacteristicsofhumangastriccancercellsbyantisensenucleotidetechnique.metHoDStheVeGF165antisensegenerecombinantwasintroducedintogastriccancercelllinebylipofecttransfectiontechnique.thenthecellcycle，prolif-erativeabiliytinvitroandgrowthinnudemiceoftransfectedcellswereexamined.ReSULtSintroductionoftheVeGF165antisenseconstructintoSGC-7901cellsresultedinamarkedreductionintheexpressionofVeGF-specificmRnaandproteinbydotblotandimmunofluorescencestaininganalysisintransfectedtumorcells.Cellcycleanalysisshowedthatcomparedwiththeparentalcells，thenumberoftrans-fectedcellshadanincrease（0.39）inG2/mphase，adecrease（0.54）inSphase，anditscolonyformingrate（2.2%）waslowerthanthat（4.0%）ofthecontrolcells.thevolumeoftumor（345±136）mm3inthenudemiceinoculatedwiththecellstransfectedbyantisenseVeGF165geneconstructwasgreatlyreducedincomparisonwiththat（1534±363）mm3inthenudemiceinoculatedwithSGC-7901cells.ConCLUSionasrepressingangiogesis，antisenseVeGFgenetransfectionmightinhibitthegrowthofsolidtumor;inaddi-tion，itmightcorrelatewiththeproliferationoftumorcells.
0引言
血管形成与肿瘤的发生、生长、转移及预后有密切的关系.目前治疗肿瘤的各种药物主要是针对肿瘤细胞本身进行的，但恶性肿瘤生长和转移的血管依赖性提示，通过抑制肿瘤新生血管形成可以防治肿瘤的生长与转移，开辟治疗肿瘤的第二战场［1，2］.我们拟采用VeGF/VeGFR为靶点进行反义核酸抗肿瘤治疗，主要基于以下考虑:①VeGF是一个强有力的血管内皮细胞促分裂因子，并能增加毛细血管的通透性.许多实体肿瘤组织细胞均高水平表达VeGF［3-5］，且表达量与肿瘤的恶性程度正相关.正常组织中仅肾、卵巢等少数脏器有较高水平的表达［6，7］.胃肠道肿瘤以外的正常上皮、增生性息肉、腺瘤则未见VeGF及其受体的表达［8］;②虽然发现至少有十四种生长因子具有刺激新生血管形成的作用，但只有VeGF专一作用于血管内皮细胞，而且现已发现有许多生长因子，如tGF-β刺激新生血管形成的作用是全部或部分通过诱导VeGF表达而实现的;③已有研究用VeGF单克隆或多克隆抗体有效抑制新生血管形成和肿瘤生长的报道.
1材料和方法
1.1材料
限制性核酸内切酶、无Dna酶的Rnase购自promega公司，Lipofectamine由Gibco公司提供.G418由Sigma公司提供.Rna地高辛标记试剂盒（Sp6/t7）购自Boehringermannheim公司.FitC标记的羊抗兔igG由Vector公司提供.人胃癌细胞系SGC-7901、宿主菌e.coliDH5α等均为本校全军消化性疾病研究所保存.含有605bp的VeGF165cDna基因被克隆在pGem-3Zf（+）的BamHi位点质粒pGem-hVeGF由美国加利福尼亚大学医学院癌症研究所abraham教授惠赠;pcDna3真核表达载体由本校生物化学教研室柴玉波博士惠赠.根据质粒图谱，作者将ecoRi+Hindiii消化pGem-hVeGF后得到的VeGF165cDna反向克隆至由此两种酶消化后的pcDna3中，成功构建了反义Rna表达质粒-pcDna-as-hVeGF.BaLB/c裸小鼠由本校实验动物中心提供并饲养.
1.2方法
1.2.1VeGF反义基因转染及转染细胞的鉴定
SGC-7901细胞在含100mL・L-1小牛血清的完全Rpmi1640培养基中贴壁生长，37℃，50mL・L-1Co2条件下培养，以2.5g・L-1胰酶消化传代.在6孔板中接种指数期生长的细胞，过夜培养，直至细胞50%汇片.用无血清Rpmi1640液洗涤后，将Dna/Liposome复合物及无血清Rpmi1640液加入待转染细胞孔中，5h后加入含200mL・L-1小牛血清的完全Rpmi1640培养液.培养48h后传代于含350mg・L-1的G418选择培养液，挑选G418抗性克隆并扩增培养作进一步鉴定.①pCR分析，取VeGFcDna5’端引物为a:3’GaGGaGGaa-GaCGGtaCCCaCG5’，取3’端引物为b:3’CtaCaCtGttCGGCtCCGCCaCt5’，Sp6序列为:3’GatatCaCaGtGGatttaG5’.分别用Sp6+a，Sp6+b两对引物对克隆细胞的Dna提取物进行pCR扩增;②VeGFRna地高辛标记探针的制备，pcDna-as-hVeGF质粒经Hindiii酶切后，加入Dig标记用的ntp混合底物，即可以以Sp6Rna聚合酶转录出正义VeGFRna，用于检测反义Rna表达;③Rna斑点杂交，提取克隆细胞的总Rna，变性后，点样于nC膜上，干燥烘烤后，65℃水浴预杂交3h.然后加入地高辛标记的VeGFRna探针，60℃水浴杂交18h，最后加碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体进行检测，nBt/BCip呈色.
1.2.2细胞生长试验
①生长曲线:将处于对数生长期的SGC-7901细胞、携带有pcDna-as-hVeGF和pcDna3空载体细胞分别接种于24孔培养板，37℃，50mL・L-1Co2孵育，以2.5g・L-1胰酶消化计数，连续6d绘制生长曲线.②集落形成试验:将细胞作梯度倍数稀释，以50，100，200个细胞/皿的密度接种于含10mL预温37℃培养液的培养皿中，然后以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀.当出现肉眼可见的克隆时，终止培养，克隆计数并计算克隆形成率.③细胞周期测定:取对数期生长的细胞5×105，700mL・L-1乙醇固定后加pi染料，进行FCm分析.④流式细胞仪免疫荧光检测:将5×105细胞悬浮于10mL・L-1副醛pBS液（pH7.0）中，室温固定30min，离心后重新悬浮于染色液（pBS+1g・L-1triton-X-100+100mL・L-1羊血清）中.封闭1h后离心，分别加入第一抗体及正常兔igG，60min后加入FitC标记的羊抗兔igG，最后进行流式细胞仪免疫荧光检测.⑤裸鼠移植瘤试验:以1.4×106肿瘤细胞接种于BaLB/c裸小鼠右侧大腿背部皮下.用精密卡尺测量肿瘤最大直径和横径.肿瘤体积为V=1/2（d×b2）［9］.对不同数据分别采用卡方检验或t检验.
2结果
2.1靶基因导入人胃癌细胞的证据
①G418抗性筛选:与未转染的细胞相比，10d后可见转染pcD-na3空载体对照组、pcDna-as-hVeGF实验组的细胞继续生长，而SGC-7901细胞大部分死亡，14d后，全部死亡.G418筛选2mo后，转染细胞仍继续生长.②pCR分析:用Sp6+a和Sp6+b两对引物分别对细胞染色体Dna进行pCR扩增，pcDna-as-hVeGF转染的细胞可用Sp6+b扩增大小约670个bp的片段，而用Sp6+a未扩增出产物（Fig1）.③核酸分子杂交:应用VeGF正义Rna单链探针进行杂交时，从转染pcDna-as-hVeGF细胞（SGC-as-hVeGF）中提取的Rna出现较强的杂交信号，其他细胞无杂交信号.
2.2细胞生长试验
①曲线测定结果:SGC-7901及SGC-as-hVeGF细胞在完全培养基中的生长曲线如Fig2所示.这一结果表明，在正常培养条件下，VeGF的表达强弱对人胃癌细胞生长曲线无明显影响.②集落形成试验:平板培养14dSGC-as-hVeGF的克隆形成率为2.2%;SGC-7901为4.0%;SGC-pcDna为4.8%.③细胞周期分布:用流式细胞仪检测细胞周期结果表明，SGC-as-hVeGF与SGC-7901细胞相比，G2/m期细胞增加了0.39，而S期细胞减少了0.54（tab1）.④VeGF免疫荧光检测:用FCm测定经FitC染色后的细胞荧光强度和阳性细胞数，间接反映细胞内VeGF含量变化.当阴性对照细胞（一抗为正常兔igG）的荧光强度为1.8%时，SGC-7901细胞为31.6%，SGC-as-hVeGF为8.9%.表1转染细胞周期分布（略）
2.3VeGF反义Rna表达对人胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响
实验分两组，SGC-as-hVeGF细胞接种的转染实验组和SGC-7901细胞接种的对照组，每组5只裸鼠.裸鼠在细胞接种6d可见肿瘤长出，8d始测量肿瘤大小，结果可以看出，接种后8d时，各组间的肿瘤大小无差别，从13d开始，VeGF反义转染细胞所致的实体肿瘤生长速度明显变慢，肿瘤倍增时间增大.33d时处死动物，取肿瘤组织进行组织学检查，与SGC-7901细胞组相比，反义转染细胞组的肿瘤组织切片中，血管稀疏，肿瘤细胞缺血性变性坏死多见（tab2）.表2裸鼠移植瘤体积（略）
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3讨论
关于肿瘤的治疗，Denekamp［10］提出了这样的理论:联合肿瘤血管生成抑制剂和直接细胞毒药物最终将是合适的治疗恶性肿瘤的选择方案，但两者的机制应该作为两个领域分开进行研究.最早提出把抑制血管生成作为阻止肿瘤生长的治疗方法是在20世纪70年代，为进入临床应用已积累了许多动物实验资料.治疗机制可以归纳为以下3个方面:①抑制肿瘤细胞释放血管生成活性分子;②中和已释放的血管生成分子活性;③抑制血管内皮细胞对血管生成活性分子的反应.利用本实验室已构建的VeGF反义Rna表达载体，我们通过基因转染技术，在Rna水平阻抑肿瘤细胞VeGF的表达，从而以反证法研究了VeGF对肿瘤发生、生长的作用，在动物实验水平为肿瘤的拮抗血管生成治疗提供了一条可行的措施.
melnyk等［11］将氯霉素乙酰转移酶（chloram-phenicolacetyltransferase，Cat）基因导入a431细胞（一种人表皮样癌细胞系）.转染子被注入免疫缺乏小鼠皮下，6wk后处死动物，a431转移灶的存在通过检测器官溶解物中的Cat活性而确定.实验发现，VeGF中和抗体不仅能抑制原发灶肿瘤的生长，也能抑制远处转移.结果提示，单独VeGF的抑制则可阻止体内肿瘤的生长和播散.Ramakrishnan等［12］将重组的VeGF与白喉毒素分子毒性部分（Dt385）共价结合成对血管内皮细胞特异的细胞毒性化合物（VeGF165-Dt385），发现其对体外培养的人脐静脉内皮细胞和人微血管内皮细胞的生长呈特异性剂量依赖性抑制.在体内血管模型中，VeGF165-Dt385也能阻断bFGF诱导的血管生成.以上都是人们针对血管生成关键活性分子VeGF在抗肿瘤血管生成领域的探索，这些均显示，针对VeFG/VeGFR的抑制肿瘤血管生成研究在抗癌领域前景广阔.
反义技术即是根据碱基互补原理，利用与目标靶Dna或Rna特定互补的短链核苷酸片段封闭基因表达的方法，它包括反义Dna、反义Rna和Ri-bozyme（核酶）三大技术.反义Rna分为反义寡聚核苷酸（antisenseoligonucleotide，aSon）和载体表达的反义Rna（antisenseRna）［13-15］.利用反义技术抑制癌基因的表达，抑制细胞生长因子的表达及与免疫调节治疗和化疗的协同抗肿瘤研究，近年来发展较快.某些反义制剂目前已经进入了ii期临床［16］，但反义技术真正进入肿瘤临床治疗还需要进行许多工作.本实验通过Lipofectamine介导VeGF反义Rna进入人胃癌细胞，并通过G418筛选、pCR分析及Rna斑点杂交试验，均证明质粒Dna稳定地整合进细胞基因组中.
集落形成试验及细胞周期测定均提示，VeGF的表达与瘤细胞增殖能力可能有关.SGC-as-hVeGF的集落形成率能力比SGC-7901低，与亲本细胞相比，转染细胞的G2/m期细胞增加了38.8%而S期细胞减少了53.6%.对转移细胞的生长曲线进行了测定，发现其无明显改变，细胞倍增时间一致.这点与集落形成试验并无矛盾，因为，肿瘤细胞系由不同比例的增殖及分化能力不同的瘤细胞群构成，共中仅小部分具有自我更新能力，即所谓的干细胞，干细胞为放射治疗及抗癌药物治疗的靶细胞，它与肿瘤的治愈、复发或转移关系密切.一般认为，只有干细胞才具有分化、形成集落的能力.我们发现高表达VeGF者，肿瘤生长速度快;而不表达或低表达者，肿瘤生长速度慢，但在致瘤率、出瘤时间及初时成瘤阶段肿瘤大小等方面并无明显差别，说明在肿瘤的血管期，VeGF对实体胃癌的生长有明显的促进作用;通过对VeGF的表达实行反义封阻技术，能明显阻抑胃癌的生长，加强了人们将VeGF/VeGFR作为靶点治疗实体肿瘤的信心，指出通过反义核酸技术阻断人胃癌的生长是可行的.
参考文献
［1］LiuCL，DuKF，LiB.expressionandsignificanceofvascularendothelialgrowthfactoranditsreceptorsinhepatocellularcar-cinomacelllines［J］.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthmilmedUniv），2000;21（6）:770-772.
［2］DengZH，HuangwG，JinY，QiuJH，wangJL，wangJB，JipoeGL.Relationshipofapoptosisandangiogenesisandthecarcinogenesisoflaryngealmucoma［J］.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthmilmedUniv），1999;20（1）:17-20.
［3］LiuDH，ZhangXY，HuangYX.theexpressionofvascularen-dothelialgrowthfactoranditsreceptoringastriccarcinoma［J］.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthmilmedUniv），1999;20（4）:316-318.
［4］DengZH，HuangwG，JinY，QiuJH，wangJL.Distributionandfunctionoffibroblastgrowthfactorfamilyandvascularen-dothelialgrowthfactorinlaryngealmucosa［J］.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthmilmedUniv），1998;19（1）:70-72.
［5］YanRL，HuiHX，XinXY，wangJB，wangJ.expressionofvascularendothelialgrowthfactorinepithelialovariancancer［J］.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthmilmedUniv），1999;20（4）:291-293.
［6］KimKJ，LiB，winerJ，armaninim，Gillettn，phillipsHS，Ferraran.inhibitionofvascularendothelialgrowthfactor-in-ducedangiogenesissuppressedtumorgrowthinvivo［J］.na-ture，1993;362:841-844.
［7］warrenRS，YuanH，matlimR，Gillettna，Ferraran.Regu-lationbyvascularendothelialgrowthfactorofhumancoloncan-certumorgenesisinamousemodelofexperimentallivemetasta-sis［J］.JClininvest，1995;95:1789-1797.
［8］BrownLF，BerseB，JackmanRw，tognazziK，manseaueJ，SengerDR，Dvorak.expressionofvascularpermeabilityfactor（vascularendothelialgrowthfactor）anditsreceptorinadeno-carcinomasofthegastrorintestinaltract［J］.CancerRes，1993;53:4727-4735.
［9］Lnabam.Chemotherapyofhumangastrictumorsinnudemouse［J］.JpnJCancerRes，1996;77（2）:190-196.
［10］DenekampJ.Reviewarticle:angiogenesis，neovascularprolif-erationandvascularpathophysiologyastargetsforcancerthera-py［J］.BrJRadiol，1993;66（783）:181-196.
［11］melnyko，Shumanma，KimKJ.Vascularendothelialgrowthfactorpromotestumordisseminationbyamechanismdistinctfromitseffectonprimarytumorgrowth［J］.CancerRes，1996;56（4）:921-924.
［12］RamakrishnanS，olsonta，BautchVL，mohanrajD.Vascu-larendothelialgrowthfactortoxinconjugatespecificallyin-hibitsKDR/flt-1-positiveendothelialproliferationinvitroandangiogenesisinvivo［J］.CancerRes，1996;56（6）:1324-1330.
［13］weintraubHm.antisenseRnaandDna［J］.Scientificamer-ican，1990;262（1）:34-40.
［14］ChenBL，muRH，maXD，wangDt，XinXY，ZhengwG，YanRL.effectsontype-specificantisenseoligonucleotidesoncervicalcarcinomacelllinesiHacontainingpapillomavirustype16［J］.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthmilmedUniv），2000;21（3）:340-342.
细胞生物学定义篇6
关键词：重症急性胰腺炎，谷氨酰胺，肠道免疫
基金项目：2014福建省科技项目计划，编号：2014D030
谷氨酰胺（Gln）是人体最多的游离氨基酸之一，在生理情况下是非必需氨基酸。在某些危重疾病，如急性胰腺炎时，由于消耗明显增多等原因导致Gln明显缺乏。补充谷氨酰胺可以治疗重症急性胰腺炎，但具体机制尚未完全明了，本文拟通过动物试验研究丙氨酰-谷氨酰胺对重症急性胰腺炎大鼠肠道免疫功能的影响，探讨其可能的作用机制。
1.资料与方法
1.1实验动物采用福建医科大学实验动物中心的清洁级SD大鼠，体重180-240g，经适应性喂养24h后用于实验。
1.2实验动物分组购买来的SD大鼠，适应性喂养24h，随机分为Sap组（60只）和对照组（20只）。Sap组又随机en组、en+Gln组和pn组、pn+Gln4组。
1.3动物模型的制备通过逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠溶液建立大鼠重症急性胰腺炎模型，采用传统的aho【1】逆行胰胆管注射法建立大鼠Sap模型。Sap大鼠术中将3.5%牛磺胆酸钠溶液用微量注射泵恒速注入胰胆管内，用量1ml/kg体重，以0.2ml/min的速度注射完毕;对照组大鼠术中使用生理盐水进行胰胆管灌注，剂量及方法同Sap组。en组采取胃十二指肠置管方法进行肠内营养，pn组采取尾静脉留置插管方法进行肠外营养。对照组进行假手术后给予自由普通饮食。
1.4营养制剂en营养制剂组分为：水、麦芽糊精、酪蛋白、植物油、膳食纤维（大豆多糖等）、矿物质、维生素和微量元素等。每100ml提供总能量10okal，碳水化合物、蛋白质、脂肪供能比为61：20：19。pn营养制剂：采用50%葡萄糖、20%复方氨基酸和20%脂肪乳剂作为基本营养成分，每100ml提供总能量100kal，碳水化合物、蛋白质、脂肪供能比为56：19：25。Gln制剂：en+Gln组及pn+Gln组动物每天肠内及肠外营养液中添加0.4g/Kgd纯度为98%的丙氨酞-谷胺酞胺双肽（力肽注射剂，华瑞公司产品）。所有实验动物可自由饮水。营养制剂的剂量为每天250mL/kg，麻醉苏醒后2小时开始输注营养液，第1天输半量，第2天开始输全量。各组营养液当天配制，用微量注射器泵在24小时内均匀输注。
1.5实验方法
1.5.1肠内容物Siga含量：取盲肠内容物，加入4ml生理盐水，4oC冰箱震荡过夜，4000rpm离心10分钟，取上清液按eLiSa试剂盒（购自上海蓝基生物科技有限公司）操作方法检测。
1.5.2肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+t淋巴细胞和CD68+巨噬细胞检测：在大鼠小肠的近端空肠5cm以下处取2cm长的空肠（回盲部肠管）匀浆后，4℃条件下，准确称量0.3g肠组织，剪碎，移入玻璃匀浆器，然后加入预冷的生理盐水至总体积3mL，在冰浴中用玻璃匀浆器仔细研磨，制备10%肠组织匀浆。将匀浆液低温离心（4℃，3500rpm）10min，取上清液，使用流式细胞仪（美国贝克曼公司的CoULteR？DnapRep？ReagentsKit）测定CD3+、CD4+、CD8+t淋巴细胞亚群的百分比及CD68+巨噬细胞的百分比。
1.6统计学方法数据采用SpSS17.0统计软件进行处理分析，以数据用x±s表示，组间参数及两组参数之间的比较采用相关样本的非参数检验，以p≤0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1Sap组和对照组大鼠肠内容物S-iga的含量及肠上皮淋巴细胞分布
与对照组相比，Sap组大鼠肠内容物S-iga的含量明显降低，差别具有统计学意义;与对照组相比，Sap组大鼠肠上皮细胞中CD3+、CD4+、CD8+t淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显降低，差别具有统计学意义。详见下表1。
表1Sap组和对照组大鼠肠内容物S-iga的含量及肠上皮淋巴细胞分布
2.2en组及pn组Sap大鼠肠内容物S-iga的含量及肠上皮淋巴细胞分布
与en组相比，en+Gln组大鼠肠内容物S-iga含量明显升高，肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+t淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显升高，差别具有统计学意义（F值依次为98.305、111.37、23.158、89.848、86.895，p值均<0.001）;与pn组相比，pn+Gln组大鼠S-iga含量、肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+t淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平升高，但差别无统计学意义（F值依次为0.039、3.052、2.346、2.461、0.625，p值依次为0.846、0.098、0.143、0.134、0.44）。详见下表2。
表2en组及pn组Sap大鼠肠内容物S-iga的含量及肠上皮淋巴细胞分布
3.讨论
重症急性胰腺炎是临床常见重症疾病，因其易破坏肠道功能屏障导致胰腺组织细菌感染、全身炎症反应综合征甚至多器官功能衰竭，故病情凶险，病程进展快，死亡率高达20%-30%[2]。如何保护肠道功能屏障是治疗重症急性胰腺炎的首要任务，而肠道免疫功能屏障是肠道功能屏障的重要组成部分，其在保护Sap肠道功能屏障中的作用日益突出。大量实验结果[3-4]表明，Sap时谷氨酰胺明显缺乏，补充谷氨酰胺具有治疗Sap的作用，而谷氨酰胺对Sap是否具有保护肠道免疫功能屏障的作用目前研究较少。
肠道免疫屏障由肠上皮细胞（intestinalepithelialcell，ieC）、肠上皮内淋巴细胞（intestinalintraepitheliallymphocyte，iieL）、固有层淋巴细胞（laminapropriallymphocyte，LpL）、派伊氏结（peyer'patch，pp）和肠系膜淋巴结等肠道组织及肠道浆细胞分泌型免疫球蛋白a（siga）构成[5]。其主要功能是由相关淋巴样组织通过分泌siga发挥抗感染的体液免疫以及细胞毒性的细胞免疫。
本研究结果表明，与对照组相比，Sap组大鼠肠内容物细菌S-iga的含量、肠上皮细胞中CD3+、CD4+、CD8+t淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显降低，说明Sap时肠道免疫功能屏障明显受损。由于谷氨酰胺不稳定，常与丙氨酸结合制成稳定的Gln双肽。本实验中，分别应用肠内营养及肠外营养两种不同途径添加Gln。结果显示，与en组相比，en+Gln组大鼠肠内容物S-iga含量明显升高，肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+t淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显升高，差别具有统计学意义;与pn组相比，pn+Gln组大鼠肠内容物S-iga含量、肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+t淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平升高，但差别无统计学意义。说明肠内营养添加Gln具有明显提高肠道局部体液免疫及细胞免疫，保护肠道免疫功能屏障，从而达到治疗Sap的作用。
参考文献：
[1]GerlachH.Riskmanagementinpatientswithsevereacutepancreatitis[J].CritCare，2004;8（6）：430
[2]ahoHJ，KoskensaloSm，nevalainentJ.experimentalpancreatitisintherat.Sodiumtaurocholateinducedacutehaemorrhagicpancreatitis[J].ScandJGastroenterol，1980，15（4）：411-416.
[3]GamrinL，essenp，Forsbergam，Hultmane，wernermanJ：adescriptivestudyofskeletalmusclemetabolismincriticallyillpatients：freeaminoacids，energy-richphosphates，protein，nucleicacids，fat，water，andelectrolytes.CritCaremed1996，24：575-583.
细胞生物学定义篇7
细胞的全能性是本节课教学的难点，由高度分化的细胞能否继续进行分化引出细胞的全能性，在细胞全能性教学中，尽量以图片实物等感官教学为主，以使学生易于理解。
二、教学目标
（1）说明细胞的分化；
（2）举例说明细胞的全能性。
三、教学设计
1.创设情境，设疑导入
幻灯片展示“胎儿发育的过程图”，设计问题：你是由什么细胞发育而来的？成年后你身体内大约有多少个细胞？你知道你身体内的细胞有多少种吗？让学生通过观察图片，学生思考得出“人是从受精卵发育而来，成年后大致有40万亿～60万亿个细胞，这是通过细胞的分裂形成的，这些细胞分为200多种。”从而引出课题“细胞的分化”。
2.通过资料分析，引导学生展开讨论，总结细胞分化的定义等
指导学生观察ppt上展示的几种人体细胞，提出问题：①已经分化的人体细胞最初来源于哪个细胞？②它们存在哪些方面的不同？③它们还能再变回受精卵吗？通过课题引入的问题分析以及图片，学生能够明确这些已经分化的体细胞都是受精卵的后代，它们在形态和生理功能方面存在差异，从而引导学生总结出“细胞分化”的定义。
3.分析细胞分裂与分化的关系，认清两者之间的联系与区别
引导学生分析ppt展示的图片，思考：（1）①过程表示什么过程？引起了怎样的变化？各细胞中的遗传物质改变了吗？（2）②过程表示什么过程？引起了怎样的变化？各细胞中的遗传物质改变了吗？
4.利用自制教具，引导学生探究细胞分化的机理
引导学生思考“细胞分化是由细胞中的什么物质决定的？”，引发学生提出假说：假说①：细胞的分化是由遗传物质（Dna）决定的；假说②：细胞的分化是由蛋白质决定的。教师将学生的争论搁置，展示资料，思考：通过资料你获得了哪些信息？得出了哪些结论？为什么各细胞中的基因相同，而蛋白质种类不同呢？
5.看图说话，亲眼观察组培样品，体会细胞全能性的应用
细胞生物学定义篇8
细胞衰老是细胞不可逆的失去增殖能力的过程，被认为是机体抑制肿瘤发生的重要屏障[2]。但是也有研究表明衰老细胞可以通过分泌表型促进肿瘤发生。因此，细胞衰老与肿瘤之间的关系还需要进一步的研究。而对细胞衰老发生的分子机理的理解，有助于我们开发新的肿瘤治疗策略。目前已经发现多种基因毒性刺激都能诱发细胞发生早熟性细胞衰老，如端粒缩短、原癌基因激活、辐射损伤、活性氧损伤等，这些刺激都能引发Dna损伤[3]。
细胞衰老存在于多学科中，属于交叉学科，它自产生就与抽象、深奥的哲学紧密联系、相互促进。
一、细胞衰老学说的研究，离不开哲学思维的发展
哲学的发展来源于人类在探索世界时候的不断反省，通过对生命的意义的思索，促进着自然科学的发展。20世纪60年代，Hayflick和moorhead等人[4]在体外培养人正常成纤维细胞时发现：多株体外培养的正常人成纤维细胞，在经历多次细胞分裂之后，并没有无限制的增殖，而是发生了增殖失败现象。当排除了因细胞体外培养和营养需求改变等因素的影响后，他们确定这是细胞固有的一种生理状态。而与此现象相佐证的是：胚胎来源的成纤维细胞的增殖能力要比成体来源的成纤维细胞的增殖能力更强。这种现象使得他们提出了细胞衰老（Cellsenescence）的概念，并认为这种细胞增殖失败的现象与器官的老化是相关联的[5]。西方医学的很多发展都源于哲学的进步，他们观察自然和人类生活的变化，产生哲学思辩，从而研究物质存在的机制。西方的哲学发展较快，较为进步，正式哲学的发展促进了其他学科的发展，哲学思维给予了医学正确看待生命与健康的理论指导。医学家在哲学世界观与方法论的指导下，从事基础医学研究，推动着医学进步发，促进了基础医学的进步。
二、细胞衰老学说研究要靠实践的唯物主义哲学思想
细胞衰老机制研究是一门医学基础的研究，归从于细胞生物学研究，必须通过反复的实验进行验证。而细胞衰老对于机体器官的衰老，机体本身的衰老都是其研究的基础，是其理论基础，哲学思想充斥在科学实践与理论思维之中。细胞衰老机制研究是一个基础认识过程，由感性认识到理性认识，从机体自然界的生老病死的现象，使人类产生研究其基本结构单位细胞的想法，对细胞衰老的机制研究，进一步解开人类机体衰老的奥秘，从认识到实践，实践再进一步指导认识，实现科研造福于人类的意义。
三、细胞衰老学说研究依靠哲学思维发挥出社会效应，实现价值
哲学对医学的发展具有世界观的理论指导意义，细胞衰老学说的发展也不例外。列文虎克发明第一台显微镜,初步认识了微生物，人类就开始了细胞学说的研究。从细胞的大体结构，细胞壁、细胞器、细胞核的研究，到微细的细胞结构中细胞各组织结构的功能，细胞内信号的传导、物质的代谢，再到细胞生长、增殖、衰老、凋亡机制的研究，所有这些都离不开哲学的指导需要哲学思维价值观来指导任一学科的发展，同时细胞衰老学说的研究，必然伴随社会价值的体现，人类向往永生，向往肌肤的永生，甚至生命的永生，所以哲学承担起揭示医学科学社会效应的责任，指导细胞衰老的研究来充分发挥出其社会效应，这涉及人的出现，生存、发展等一系列哲学问题。离开了哲学，科学的理论基础就将崩塌。物理学家玻恩曾经说“每个现代科学家，都深刻地意识到自己的工作是同哲学思维错综地交织在一起，要是没有对哲学文献的充分认识，他们的工作会是无效的”[6]。细胞衰老学说的研究不是独立的个体，它是普遍联系的，将之与环境问题，经济问题，社会人文问题、法律问题等等综合研究才能真正实现社会价值，为社会的发展，社会的前进起到应有的作用。
四、细胞衰老学说离不开哲学思维的唯物辩证法
科学研究中的哲学思维是与一般科研思维融入一体，真正的唯物主义哲学并不认为假说是唯心的，需要通过不断地提岀新的假说或假设，然后通过构建科学技术，进不去证明。假说或假设是科学无法存在的基础，是科学向前发展的动力。这就是科学的理性主义态度或方法论。用胡适先生说科学的态度或方法就是“大胆地假设，小心地求证”[7]。假设-验证是医学科学家常常使用的思维方式。细胞衰老学说就是首先通过假设，然后通过实验的不断证实进行的，只有不断的假设，不断的通过基础实验去验证，才能使衰老学说的机制得到很好的验证，才能不断的进步，不断的探究，更好的使用在机体衰老机制的研究。
五、正确认识事物的逻辑方法
细胞生物学定义篇9
（一）教学内容的地位
《细胞增殖》是高中生物必修教材第二章《生命活动的基本单位――细胞》中第二节内容，它是建立在已经学习第一节《细胞结构和功能》，掌握了细胞的基本结构及功能的基础之上来学习该节内容，同时，为学习第五章《生物的生殖、发育》中减数分裂和第六章《遗传和变异》中遗传的基本规律知识奠定基础，起到了承前启后的作用，并且是历年来高考的重要考点，在近五年的各地高考试卷中，总分达47分，具有十分重要的作用。
（二）教学目标
1、知识目标
知道细胞增殖的方式、意义以及无丝分裂的过程和特点。
识记有丝分裂细胞周期的概念；动植物细胞有丝分裂过程的异同点；有丝分裂的特征和意义。
应用有丝分裂过程各时期的特点。
2、能力目标
1）凭借有丝分裂过程图、图文结合，培养学生的识图能力，形象思维能力。
2）运用坐标曲线归纳出有丝分裂过程中染色体数目Dna含量变化，培养学生的分析能力。
3）情感目标
细胞分裂――运动是物质的根本属性，建立生命活动的唯物主义观点。
（三）教学重点、难点
1、教学重点
真核细胞有丝分裂的细胞周期的概念和特点以及真核细胞有丝分裂的过程。
2、教学难点
真核细胞有丝分裂过程中，各个时期染色体的变化特点。
二、教学对象分析
首先，作为高二的学生，已经具备了一定的阅读能力、自学能力，对于一些基础知识可由其自学；其次，生物这门学科是高二初开的一门学科，学生对其学习的方法和技巧欠缺，有关生物的基础知识积累少；第三，激发学生对于生物这门学科的学习兴趣也很重要。
三、教学时间安排
由于学生实际情况，加之本节内容知识点多，学生理解较为困难，因而教学时间安排为3课时（讲授2课时，实验1课时），本次说课内容仅限于第1课时（内容：细胞增殖方式、意义；有丝分裂细胞周期的概念，植物细胞有丝分裂过程）。
四、教法和学法
学生是教学的主体，让学生积极参与到探求知识的过程中，主动去获取知识，这是现代教学理念的基本观点，因而，在本课教学中，采用自学法、讨论法和讲授法相结合，以问题贯穿本堂课，激发学生的求知欲，充分利用插图、挂图、坐标图，把抽象、微观的有丝分裂过程，形象、生动的展现在学生眼前，通过学生自己的阅读、比较、归纳获取知识，培养学生的识图能力、分析能力。
五、教学过程
（一）新课引入
回忆第一节学习了细胞的结构和功能，细胞是生命活动的基本单位，但大多数生物是由很多细胞构成，细胞的数目是如何增殖的呢？引入细胞增殖、板书课题（通过简洁地提问，引入新课，激发起学生的求知欲）。
（二）新课学习
1、细胞增殖的方式、意义
提问：细胞以什么方式增殖，真核细胞的分裂方式有几种？哪几种？增殖有何意义？
阅读教材第一、二自然段，并思考提出的问题，在教材中勾划出相关内容。给2分钟时间，抽同学回答并点评。（培养学生的自学能力，语言表达能力）
2、有丝分裂
有丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式，用以增加体细胞数量，体细胞进行有丝分裂具有周期性，也就是具有细胞周期引出。
1）细胞周期
细胞周期的概念是什么？请同学阅读教材，并引导学生分析概念，是不是所有在分裂的细胞都有细胞周期？一个细胞周期的起点在哪儿？止点在哪儿？（以问题促进学生思考，培养学生的问题意识，进行探究学习，突破重点）
然后阅读插图2-19有丝分裂细胞周期图，引导学生得出一个细胞周期包括两个阶段：分裂间期和分裂期，结合起止点，知道分裂间期在前，分裂期在后，从弧线的长短上得出时间的长短，并用表2-1不同细胞的细胞周期持续时间来反证。追问：各阶段有何特点？对于植物细胞和动物细胞而言，它们是否一样？我们先分析植物细胞有丝分裂的特点引出：
2）植物细胞有丝分裂各时期的特点。
①分裂间期
利用挂图指出间期图例，观察结构，提问是不是间期就是“间歇期”？讲述完成Dna复制和有关蛋白质合成，回忆染色质的主要成分，说明实质是进行染色体复制，但并未分开仍由一个着丝点连在一起，画图：由一个着丝点连着的两结构称为姐妹染色单体，染色体数目不变。
②分裂期
人为地分为了四个时期：前、中、后、末。
前期：比较挂图上间期与前期的区别，学生自由交流。
老师归纳两出现两消失，中期：与前期比较，后期：与中期比较，末期：与后期比较。
依次进行，指导学生重点在于分析染色体的变化，老师用一、二句精炼的话归纳，并在黑板上画出特点（让学生把不易看见的变化与看得见的图结合起来，抓住特点，便于记忆，理解、突破重点、难点）。
然后，老师与学生一起对照挂图来描述变化过程，学生复述（通过重复强化学生记忆过程）。
分裂中染色体和Dna数量变化有何规律？用坐标图来反映，老师建立一个坐标图，引导学生据过程一起分析，得出染色体变化曲线。练习，由学生自己按照上述思路绘Dna变化曲线，抽一位同学到黑板前绘制，其他同学在草稿纸上绘，最后点评。（用坐标图更能直观反映出变化过程，引导学生分析，并知道变化规律的由来，加深对过程的理解，让学生积极参与到获取知识的过程中体验快乐）
（三）小结
指出重难点：细胞周期的概念，各时期的特点。（让学生明确需要掌握的内容）
（四）作业布置
预习动物细胞有丝分裂的过程，思考动物细胞有丝分裂与植物细胞有丝分裂有何异同。
（五）板书设计
第二节细胞增殖
一、细胞增殖方式、意义
二、有丝分裂
1、细胞周期
2、植物细胞有丝分裂过程
①分裂间期：Dna复制，有关蛋白质合成，形成姐妹染色单体
②分裂期有：
前：两出现，两消失
中：着丝点排在赤道极上
细胞生物学定义篇10
【关键词】腺苷;细胞生长;细胞周期;存活
[abstract]objective:tostudytheinfluenceofincreasedconcentrationofadenosineoncellsunderenvironmentalcrisis.methods:Highconcentrationofadenosinewasaddedtocellculturestosimulateenvironmentalcrisis，andthecellproliferation，cellcycleandsurvivalofcellswereexamined.Results:adenosineinhibitedcellproliferationbutdidnotinducecellapoptosis.adenosineinhibitedcellcycleandpromotedcellsurvivalundernoglucosecondition.Conclusion:Highconcentrationofadenosinepromotescellsurvivalbyinhibitingcellproliferation.
[Keywords]adenosine;cellproliferaton;cellcycle;survival
腺苷是细胞内的天然代谢产物之一。当细胞遭遇低氧低糖等环境生存压力时，细胞内外的腺苷浓度将急剧升高[1-3]。然而这种高浓度的腺苷对细胞产生的影响及其生物学意义鲜有报道。本研究通过向细胞培养物中添加高浓度的腺苷，模拟了低氧低糖环境下细胞内外腺苷浓度升高这一事件，同时检测这种高浓度下细胞的生长增殖、细胞周期、凋亡等事件，阐明危机情况下腺苷对细胞的影响，为进一步理解腺苷在机体细胞应对暂时性缺血等病理情况时发挥的作用提供理论基础。
1材料和方法
1.1细胞培养及相关试剂
HeK293t细胞、meF细胞均购自atCC公司，置于含10%新生牛血清的Dmem培养基中，在37℃、体积分数为0.05的Co2孵育箱中培养。Rnasea、DmSo、mtt和pi购自Sigmaaldrich公司。
1.2显微镜观察细胞密度
将对数生长期HeK293t细胞以(1～2)×104每孔接种于24孔板。置37℃、体积分数为0.05的Co2细胞培养箱中培养过夜后进行腺苷处理。腺苷处理前及处理24h后分别在显微镜下拍照。
1.3mtt法测细胞活力
在24孔板里按每孔(1～2)×104个细胞接种400μl细胞悬液，置37℃、体积分数为0.05的Co2细胞培养箱中孵育过夜，进行药物处理24h或48h后;每孔加入40μlmtt溶液(5mg·ml-1)，37℃反应4h;小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入100μl二甲亚砜(DmSo)，室温孵育10min;振荡后通过酶标仪测定各孔在570nm的光吸收值，参比波长为690nm，对每孔的光吸收值进行定量测定，每组设定3复孔。
1.4pi法测定细胞周期
胰酶消化细胞后，用含血清的培养基终止消化，离心收集细胞;然后用预冷的pBS洗涤细胞，弃上清，用100μlpBS悬浮细胞;冷的体积分数为0.75的酒精1ml滴加固定细胞(边振荡，边滴加);4℃固定过夜;2000r·min-1离心3min;弃上清，pBS洗涤;2000r·min-1离心3min;1×Rnase(10～15μg·ml-1)，消化15min;pi染色10min，利用流式细胞仪检测分析细胞周期。
1.5细胞凋亡检测
收集细胞，pBS洗涤细胞，离心弃上清;用结合缓冲液洗涤细胞，离心弃上清，400μl结合缓冲液悬浮细胞;加annexinVeGFp，冰上避光20min;每管加1μlpi(500μg·ml-1)，10min后利用流式细胞仪检测细胞凋亡。
2结果
2.1高浓度腺苷抑制细胞增殖但不诱导细胞凋亡
通过观察细胞密度可以看到，加入高浓度腺苷后，HeK293t细胞密度明显降低(图1a);mtt实验结果显示腺苷处理HeK293t细胞24或48h后，HeK293t细胞活力随着腺苷浓度的上升逐渐降低(图1B);说明高浓度腺苷可以抑制细胞的增殖(图1B);流式细胞仪检测细胞凋亡显示高浓度腺苷处理细胞24h并没有显著诱导细胞凋亡(图1C)。
2.2高浓度腺苷通过抑制细胞周期从而抑制细胞增殖
细胞通过细胞周期而不断地自我增殖，我们利用流式细胞术检测腺苷是否通过抑制细胞周期的进行从而抑制细胞增殖。结果显示，高浓度腺苷明显改变HeK293t细胞周期的进程，导致G0/G1期和G2/m期细胞明显增多，呈阻滞现象(图2)。说明腺苷通过抑制细胞周期的进行从而抑制了细胞的增殖。腺苷可以通过细胞膜上的转运载体蛋白运输进入细胞质内发挥作用[4-5]，也可以通过与细胞膜受体结合发挥生物学功能[6-7]。我们通过向细胞培养物加入腺苷转运蛋白抑制剂发现，加入转运载体蛋白抑制剂缓解了腺苷对细胞的抑制作用，说明腺苷需要通过转运载体蛋白进入细胞内发挥其抑制细胞周期的作用(数据未公开)。
a.腺苷抑制细胞增殖的细胞形态图;B.mtt法测定细胞活力(纵坐标为加药后的细胞活力占对照组细胞活力的比值);C.用1mmol·L-1腺苷处理HeK293t细胞24h，无凋亡细胞图1腺苷抑制细胞增殖
a.CellmorphologyofHeK293tafteradenosinetreatmentfor24h;B.mttassayofHeK293tafteradenosinetreatment(Yaxisrepresentstheratioofproliferatingactivityofcellstreatedwithadenosinetocontrolgroup);C.apoptosisofHeK293taftertreatmentwith1mmol·L-1concentrationofadenosine
2.3高浓度腺苷提高细胞在无糖环境中的存活率
在无糖条件下，细胞会大量分泌腺苷[2-3]，而腺苷可以抑制细胞周期的进行。因此，检验腺苷是否通过抑制细胞周期的进行从而提高细胞的存活率是十分有意义的。我们利用无糖培养基对meF细胞进行连续培养32h，结果显示(图3a)，3mmol·L-1腺苷可以明显促进meF细胞的存活;类似的在无糖条件下连续培养HeK293t细胞24h，3mmol·L-1腺苷可以明显减少细胞凋亡的发生(图3B、C)。
a.meF细胞在无糖条件下连续培养32h，对照组加DmSo，另一组加3mmol·L-1adenosine处理;B.HeK293t细胞先用DmSo或adenosine预处理4h，然后换无糖培养基培养24h;C.图B中HeK293t细胞的凋亡分析结果
3讨论
低糖或无糖环境是细胞经常遭遇的危机环境，细胞怎样度过这种环境危机一直是研究的热点之一。在无糖条件下，细胞会大量分泌腺苷，关于这种分泌的高浓度腺苷对细胞的影响及其生物学意义鲜有报道，原因是腺苷在胞内外浓度的测定存在一定的困难，而且腺苷分子并不稳定，可以被细胞内的腺苷脱氨酶的脱氨作用代谢分解[1]。我们的研究发现，随着作用时间的延长，腺苷对细胞周期的抑制效果会有所下降。这种情况可能与腺苷分子的不稳定等因素有关。
我们的研究表明，细胞在无糖环境下分泌大量腺苷是细胞的一种自我保护机制。这种高浓度的腺苷通过抑制细胞周期的进行从而抑制细胞生长增殖，这种抑制作用降低细胞内的能量消耗从而提高了细胞的存活率。
总之，本研究揭示了腺苷通过抑制细胞周期的进行，有效地协助细胞度过遭遇的低糖生存危机，为临床上组织细胞在缺血环境下分泌大量腺苷的意义提供了一种生物学解释。
参考文献
[1]BLaCKBURnmR，VoLmeRJB，tHRaSHeRJL，etal.metabolicconsequencesofadenosinedeaminasedeficiencyinmiceareassociatedwithdefectsinalveogenesis，pulmonaryinflammation，andairwayobstruction[J].Jexpmed，2000，192(2):159170.
[2]LinDenJ.adenosineintissueprotectionandtissueregeneration[J].molpharmacol，2005，67(5):13851387.
[3]VanBeLLeH，GooSSenSF，wYnantSJ.Formationandreleaseofpurinecatabolitesduringhypoperfusion，anoxia，andischemia[J].amJphysiol，1987，252(5):H886H893.
[4]HUanGS，apaSoVS，KoSHiBam，etal.Roleofa2aextracellularadenosinereceptormediatedsignalinginadenosinemediatedinhibitionoftcellactivationandexpansion[J].Blood1997，90(4):16001610.
[5]tHampYKG，BaRneSem.adenosinetransportbyprimaryculturesofneuronsfromchickembryobrain[J].Jneurochem，1983，40(3):874879.