动物免疫血清的双重性篇1
摘要:目的初步探讨igG/igmtCiC在HCV感染者体内的意义。方法采用捕捉法eLiSa，以抗人igG的羊igG为包被抗体，HRp抗人igm的羊igG为指示抗体，检测80例HCV感染者及30例健康人体内igG/igmtCiC的水平。结果HCV感染组igG/igmtCiC的水平显著高于健康对照组（p0.05）。结论igG/igmtCiC并不直接参与肝脏损伤的病理过程，而可能是丙肝患者体液免疫紊乱的重要指征。
关键词:HCV；igG/igmtCiC；eLiSa；免疫紊乱
abstract:objectivetopreliminarilyelucidatethesignificanceofigG/igmtCiCinHCVinfectedinpiduals.methodsCoatedwithgoatigGaimedtohumanigG，andthendetectedbyHRplabeledgoatigGaimedtohumanigm，acaptureeLiSamethodwasestablishedtoexaminethecirculatingimmunecomplexescomposedofigGandigm(i.e.igG/igmtCiC)inHCVinfectedinpiduals(80cases)andhealthyinpiduals(30cases).ResultsthelevelofigG/igmtCiCinHCVinfectedinpidualswasobviouslyhigherthanthatinthecontrolgroup(healthyinpiduals).inaddition，therewasnotanobviouscorrelationbetweenthelevelofigG/igmtCiCandaLtorBtintheserumofHCVinfectedinpiduals.ConclusionitwassuggestedthatigG/igmtCiCdidnotparticipateinthedamageofliver，whereasitmightbeanimportantindicationthatreflectedthedisorderedstatusofhumoralimmuneresponse.
Keywords:hepatitisCvirus(HCV)；igG/igmtCiC；eLiSa；immunologicderangement
自双特异性循环免疫复合物(twocomponentdeterminedcirculatingimmunecomplexes，tCiC)的概念提出以来［］，有关报道层出不穷。迄今为止，研究主要集中在抗原/抗体双特异性循环免疫复合物、抗原/补体双特异性循环免疫复合物及抗体/补体双特异性循环免疫复合物［2-6］，对ig/ig双特异性循环免疫复合物(ig/igtCiC)的研究则鲜见报道。本文拟建立一种捕捉法eLiSa以检测igG/igm双特异性循环免疫复合物(即igG/igmtCiC)，并通过该方法探讨HCV感染者体内这类免疫复合物的理论和临床意义。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1抗人igG的羊igG
羊抗人igG抗血清(卫生部上海生物制品研究所)，经硫酸铵盐析Deae32层析，提取igG组分。
1.1.2HRp
抗人igm的羊igG取羊抗人igm抗血清(卫生部上海生物制品研究所)，提取igG，采用简易过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRp，Sigma)。
1.2研究对象
HCVRna阳性血清标本80例（其中男性37例，女性43例），采自广州市传染病医院；另取30份健康体检者血清标本作为对照组。
1.3检测方法
1.3.1检测igG
igm双特异性免疫复合物捕捉法eLiSa的操作过程用0.1mol/L，pH9.6的碳酸缓冲液将抗人igG的羊igG稀释至7.5μg/mL，加入反应板，每孔0.1mL，4℃18-24h，用0.01mol/L，pH7.4pBSt洗涤3次，加入用生理盐水按1∶75稀释的血清标本，每孔0.1mL，4℃18-24h，同上洗涤；用含25%兔血清的pBSt将HRp抗人igm的羊igG作1∶3200稀释，每孔0.1mL，37℃1h，同上洗涤；加入tmBH2o2底物溶液，每孔0.1mL，37℃避光反应45min；2mol/L的H2So4终止反应，最后在BioRaD680全自动酶标仪(美国产品)上测oD值。每块反应板分别以混合人血清和羊血清作阳阴性对照。
1.3.2aLt测定方法按试剂盒说明进行。
1.3.3黄疸指数（Bt）测定方法
按卫生部颁发的临床操作规程进行。
2结果与分析
2.1本eLiSa法的特异性
2.1.1阻断实验
随机取血清标本20份，同时设阻断组和对照组。在加入HRp抗人igm的羊igG前，阻断组先加入用pBSt按100μg/mL稀释的抗人igm的羊igG，对照组加入pBSt，37℃1h，其余操作步骤同前，最后按同份血清阻断孔与对照孔的测定结果来计算其阻断率。结果20份标本的阻断率均大于50%。
2.1.2替代实验
取猪、兔、鸭和牛血清代替人血清标本进行实验。结果所有标本与作阴性质控的羊血清无异，其oD值均稳定在0.00～0.05之间。
2.2eLiSa的重复性
结果表明，本eLiSa法的变异系数均小于10%。
2.3HCV感染者igG/igmtCiC的检测
HCVRna阳性血清igG/igmtCiC的±s为092±0.11，而健康人血清为0.65±0.08，前者显著高于后者（p
2.4HCV感染者igG/igmtCiC与aLt的关系
在80例HCV感染者中，aLt正常者21例，升高者59例。经相关分析，aLt与igG/igmtCiC无相关（r=0.18，p＞0.05）。
2.5HCV感染者igG/igmtCiC与Bt的关系
80例标本中，有58例检测了Bt，其中Bt正常者40例，升高者18例。经相关分析，Bt与igG/igmtCiC无相关（r=016，p＞0.05）。
3讨论
本文采用抗人igG的羊igG为包被抗体，HRp抗人igm的羊igG为指示抗体，建立了检测igG/igmtCiC的捕捉法eLiSa。实验结果表明，本法特异性强，重复性好。采用本eLiSa法对HCV感染者及健康人的igG/igmtCiC进行检测的结果表明，HCV感染者这类CiC的水平要明显高于健康人对照组，两者差异极显著(p
由于igG/igmtCiC是机体igG和igm相结合的产物。从理论上来分析，它们的来源有两类，其一是变性抗体与其的抗抗体结合物，其二是免疫网络学说中ab1和ab2的结合物。这种免疫复合物中的igG和igm，既可能是抗体或ab1，也可能是抗抗体或ab2。但无论何种情况，这种由两种免疫球蛋白组成的循环免疫复合物其意义均主要在于对体液免疫的调节［7］。因此，HCV感染者体内igG/igmtCiC水平的升高可能是体液免疫调节紊乱的重要指征。
谷丙转氨酶（aLt）和黄疸指数（Bt）均为反映肝脏代谢功能的非特异性敏感指标。本文结果表明，在HCV感染者igG/igmtCiC的水平与aLt或Bt这两个指标均无明显相关（p>0.05）。提示igG/igmtCiC与其他免疫复合物如抗原/抗体免疫复合物、抗体/补体免疫复合物和抗原/补体免疫复合物临床病理意义有所不同，他并直接不参与HCV感染过程中对肝功能的损伤作用。有趣的是igG/igmtCiC水平在aLt正常组反而稍高于升高组，这可能系病毒对机体免疫应答的抑制所至。
HCV感染引起的丙型肝炎常易于慢性化，并有自身免疫的倾向。国外也有报道丙肝患者体内总的免疫复合物有升高的趋势［8，9］。本文仅从igG/igmtCiC的角度，初步探讨了该类免疫复合物在HCV感染者体内理论及临床意义。由于免疫网络非常复杂，参与体液免疫调节的ig/ig双特异性免疫复合物具有多种不同的组合，理论上至少还可以存在igG/igatCiC、iga/igmtCiC、igG/igGtCiC、igm/igmtCiC和iga/igatCiC。在HCV感染者体内，究竟这些不同类型的双特异性免疫复合物各有何变化，值得进一步深入研究。
参考文献:
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［3］彭宣宪.双特异性循环免疫复合物的研究进展［J］.上海免疫学杂志，1996，16(5):315.
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［6］彭宣宪，王三英.反应型双特异性免疫复合物的免疫生物学［J］.厦门大学学报，2001，40(2):620.
［7］王三英，杨天赐，彭宣宪.ig/ig双特异性免疫复合物定量及免疫调节作用［J］.中国公共卫生，2002，18(6):712.
动物免疫血清的双重性篇2
在本科免疫学实验教学中，凝集反应、沉淀反应、补体参与的免疫反应、免疫标记技术、细胞免疫功能测定等实验是经典实验，也是医学生必修实验。由于课时数的限制，以往实验教学模式是技术人员将一些耗时长的实验环节事先完成，学生按照课本指示完成其中一些操作。结果导致学生难以理解各个孤立的实验项目之间的有机联系以及实际意义，难以掌握实验的基本操作技能，也缺乏继续学习的兴趣和积极性。为了改变这些弊端，我们以医学免疫学基本理论和基本技能为主线，将传统的实验内容设计为一个系统的整体性研究项目，包括了从抗原制备动物免疫、免疫血清采集和分离、抗体效价测定和功能分析、免疫酶标记技术测定等一系列实验项目。根据实验教学的指导思想及目的，本项目设置了两大主体实验，“绵羊红细胞抗血清(溶血素)的制备及效价观察”和“牛血清白蛋白抗血清的制备及效价观察”。前者是颗粒性抗原，后者是可溶性抗原，制备的抗血清检测方法均不同。这两大实验从脱纤维绵羊红细胞的制备和牛血清白蛋白抗原浓度、免疫佐剂的配制，免疫程序、途径的设计，抗原剂量、动物注射次数的掌握、免疫时间间隔的确定，家兔心脏采血，抗体的提取，直至运用直接凝集法、电泳检测技术、双向扩散实验等检测相应抗体效价等一系列实验活动，将以往单个独立的实验贯穿起来，组成一个大实验，基本知识和基本技能训练融于项目之中，增强了学生动手能力，促进大学生科技创新活动展开。
2实验教学模式改革
为了改变由实验指导老师“抱着走”的传统教学方法，我们在本次实验改革别注重对学生自主学习能力的培养。实验开始前，将实验课件挂在教研室的网站供学生提前预习，学生们利用课余时间到图书馆查阅相关资料并设计实验方案。根据不同的抗原、免疫途径和剂量，有意识地将每班分成三个实验小组，从两种免疫抗原———颗粒型抗原和可溶性抗原入手，使学生在进入实验时就必须搞清楚这两种抗原的概念，促使学生不得不翻阅书本和查阅资料。在弄懂了实验原理和方法的基础上，学生自己设计方案，在带教老师的指导下，着手实施实验步骤，分析实验中出现的问题，以确保学生在实验时能够全面理解免疫概念、方法、效应机制等问题。本实验免疫的抗血清由于动物机体的差异，免疫的抗血清效价均不同，每一组的抗血清检测结果均未知，这就避免了同学之间抄袭实验报告的情况。“连贯性模块式”教学综合运用病原生物学、免疫学、生物化学、分子生物学、实验动物学等实验技术和方法;采用课堂内外相结合，学生为主体、以组为单位的项目制教学模式。具体实施过程中学生以小组为单位，利用课余时间来完成部分实验，学生对配制试剂、动物免疫、血清制备等过程都亲自操作，掌握了实验项目的整体性和连续性。开展本项目第2、3次实验上课要连续，不能隔周，因为凝集反应中的绵羊红血球要求新鲜配制，心脏抽取的溶血素要马上测定效价，补体参与的免疫反应试验要在第3次实验课完成，第2次和第3次实验课程安排时间要在同一天，分上下午完成，第4次实验安排免疫酶标、金标记技术测定和细胞免疫功能测定，在第5次实验开始前，学生继续利用这段业余时间进行可溶性抗原的免疫工作来提高抗体效价。对流免疫电泳和双向琼脂扩散试验则安排于最后阶段的功能检测实验中。本实验项目的每一个步骤都是学生自己安排，大大提高了学生继续学习的兴趣和积极性，培养了学生实践能力和协同能力，增强其在今后工作中的责任心和使命感。
3实验教学评价体系改革
本次改革的另一重点是对学生成绩评定系统的改革。每个学生在完成项目教学后要求撰写一份规范的研究小论文，成绩评定采用百分制。评分标准包括:方案设计、实验操作和习惯、团队合作能力、数据记录和分析、综合分析和科学思辨能力等内容。学生通过实验设计、实验记录、实验报告、实验讨论、结果报告这一系列的项目实施锻炼后，学习的主动性和积极性有明显的提高。
4实验教学改革的思考
动物免疫血清的双重性篇3
通讯作者：丁晓仙
【关键词】免疫吸附；狼疮性肾炎；临床疗效；护理
狼疮肾炎（Ln）是系统性红斑狼疮（SLe）最常见和最重要的内脏并发症，是我国最常见的继发性肾小球疾病，目前仍以激素和细胞毒药物治疗为主。而新型免疫抑制药物，如骁悉［1］、环孢素在治疗重症活动性狼疮性肾炎中已取得比较满意的效果。它们的作用机理是通过免疫抑制作用抑制新的抗体产生，但遗憾的是对已经产生的抗体无特异性清除效果。所以对血液中抗体和循环免疫复合物浓度较高的重症患者，采用药物联合免疫吸附治疗是近年来开展的一种新的治疗技术，它通过体外循环，以抗体-抗原或某些具有特定物理化学亲和力的物质作为配基与载体配合，制成吸附柱，利用其特异吸附性能选择性地清除血液中的致病物质，从而达到净化血液、缓解病情的目的［2］。本院自2008年起，使用药物联合免疫吸附方法治疗重症狼疮性肾炎，取得较满意的效果，现将这种新型的血液净化疗法的疗效和护理要点总结如下。
1资料与方法
1.1一般资料选择2008年7月～2010年6月在本院住院的Ln患者15例，其中男3例，女12例，年龄17～42岁，平均32岁，病程2个月～7年，平均（26.4±6.3）个月。诊断符合1982年美国风湿病学会制定的SLe诊断标准［3］及肾活检组织病理学确诊标准，病理类型为Ⅳ型及Ⅴ+Ⅳ型，均经肾穿刺活检确诊，并排除其他继发性肾病。所有患者抗核抗体和抗双链Dna抗体阳性，并排除合并严重细菌或活动性病毒感染者、伴有严重心脑血管疾病且病情危重者、肾活检显示慢性化病变严重者。
1.2方法在泼尼松配合环磷酰胺（CtX）的治疗基础上采用免疫吸附，给予珠海丽珠医用生物材料有限公司生产的Dna免疫吸附柱，颈内静脉或股静脉建立临时血管通路，在血液透析机上与血液透析器串联使用，吸附柱在前，透析器在后。血泵为金宝aK-95，血流量200ml/min，透析时间2.0～2.5h，吸附治疗3次，每周一次，检测吸附前指标，第3次吸附后第2天抽血查吸附后指标。
1.3统计学处理采用SpSS11.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差表示，治疗前、后比较采用配对t检验，p
2结果
与治疗前相比，患者治疗后抗核抗体、抗双链Dna抗体、血沉降低，补体C3升高，血肌酐降低，SLe-Dai降低，差异均有统计学意义（p
表1免疫吸附治疗后ana、抗ds-Dna抗体、C3、eSR、Scr的变化（x±s）
3护理
3.1治疗前的护理
3.1.1心理护理（1）狼疮性肾炎患者在治疗前多采用肾上腺糖皮激素及细胞毒药物，如环磷酸酰胺等抗炎、免疫抑制治疗，但临床效果欠佳，Dna-ia是一项治疗重症狼疮性肾炎的新技术，多数患者表现出既愿意接受又恐惧的心理。应向患者讲明Dna-ia是高选择性的免疫治疗新技术，避免了血浆置换的缺陷，如置换失衡综合征、血浆短缺等。了解患者的病情及心理状态，做好心理护理；（2）向患者讲解有效病例，使患者对治疗充满信心；（3）主动接近患者，耐心解答患者所提出的问题，与患者亲切交谈，及时了解患者的心理活动，以诚恳亲切的语言给予安慰，取得患者的信任，建立良好的护患关系；（4）对影响患者治疗的家庭因素，应取得家属的合作，根据不同的情况有针对性地给予解释说服，减轻患者心理负担；（5）鼓励患者消除顾虑，增强战胜疾病的信心，向患者说明体外循环治疗的并发症，如诱导期低血压、肝素化出血、滤器凝血、继发感染等。术前需签署“Dna-ia治疗知情同意书”。
3.1.2免疫吸附器的预冲（1）将血液透析血路管道与免疫吸附器动静脉连接好，灌流器先用5%葡萄糖液500ml充满吸附柱，静置30min，静置的过程中每隔10min轻敲1～2次。预冲3500ml生理盐水，每瓶加20mg肝素，预冲速度50～100ml/min；最后一瓶500ml生理盐水加肝素100mg，冲满300ml，然后闭式循环30min。将空气完全排出，尽量用盐水使吸附器吸湿膨胀。
3.2治疗中的监护与处理
3.2.1由于吸附器能吸附少量肝素，以及患者血色素及凝血机制正常，肝素用量要比血液透析稍多一些。首次剂量为0.8mg/kg，追加量为8.0mg/h，透析结束前半小时停止。4例有出血倾向的患者用低分子肝素抗凝，一次性给予4000U。连接动静脉，开动血泵，血液量调到50～100ml/min。若患者生命体征平稳，可逐渐调整血流量至200ml/min。灌流结束时用生理盐水回血法将灌流器、透析器及管道内的血液回输体内。每次吸附时间为2～2.5h。
3.2.2生命体征的监测Dna-ia治疗中，密切观察患者的生命体征变化，必要时予以心电监护，测血压2次/h，并随时询问患者感受。
3.2.3保证血管通路的畅通Dna-ia治疗中，注意观察静脉压、动脉压的变化，保证血流量冲足，维持在200ml/min，同时要注意观察透析器及吸附器内血液颜色的变化，及时发现凝血。
3.2.4不良反应的观察在治疗时，患者可能会出现发热、发冷、寒战、全身酸痛等流感样症状，或偶有皮疹、关节痛、恶心呕吐、头昏、心跳加快、血压下降或升高等表现，一般在8h内消失。1例在免疫吸附治疗时出现发热、寒战，经吸氧及静脉注射地塞米松10mg后好转。通过对15例次狼疮肾炎患者的ia治疗进行观察，患者在接受治疗后第2天，发热消失、心慌症状好转、面部红斑口腔溃疡明显好转、关节肌肉疼痛明显减轻、活动能力增强。
4讨论
Dna免疫吸附疗法是近年来临床用于治疗SLe的一种体外免疫调节方法。其原理是利用固定在载体上具有生物活性的配体吸附SLe患者血液中ana、抗ds-Dna抗体及其免疫复合物，从而清除血液中的致病物质，达到治疗疾病的目的。
2005年键帆伊美诺-Dna免疫吸附柱正式问世，系抗原抗体结合型，是以碳化树脂为载体材料，用火棉胶包膜固定化的小牛胸腺Dna，作为狼疮肾炎自身抗体的抗原，具有特异性结合ana、ds-Dna抗体及其复合物的功能。
免疫吸附在重症狼疮性肾炎治疗中的价值，是由于重症患者在狼疮活动高峰期，器官损伤主要表现为急性炎症反应，随着自身抗体以及炎症因子的有效清除，炎症反应消退较快，受损器官的修复和恢复更加明显。
尽管免疫治疗可快速有效地清除自身抗体和免疫复合物，但不能抑制患者体内自身抗体的再生和负反馈机制。单纯给予免疫吸附治疗，患者体内自身抗体可重新升高，病情也有反复的可能。故免疫吸附不能取代糖皮质激素和（或）其他免疫抑制剂的应用。
本临床报告认为，激素和CtX在治疗中主要是抑制淋巴细胞产生Dna抗体，而免疫吸附治疗能迅速清除已经产生的Dna抗体，两者起协同作用，可有利于迅速控制Ln的进展，尤其是重症狼疮性肾炎，同时可明显减轻激素及免疫抑制药物的副作用。Dna免疫吸附疗法，是一项新技术，本技术发展很快，操作比较简单，副作用少，不失为治疗重症狼疮性肾炎的又一个重要武器。在应用免疫抑制剂的基础上应用免疫吸附是临床治疗重症狼疮性肾炎的发展方向。
参考文献
［1］刘志红，黎磊石.霉酚酸脂在重症狼疮性肾炎中的应用.肾脏病与透析移植杂志，2002，11（6）：537-538.
［2］李小媚.Dna免疫吸附联合药物治疗系统性红斑狼疮的初步观察.中国现代医生,2009,47:113-114.
动物免疫血清的双重性篇4
【摘要】目的构建葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDna-LC2并鉴定其免疫原性。方法将ptripiex2-LC2质粒用ecoRⅠ和HindⅢ双酶切得到LC2葎草花粉变应原基因片段，将其插入pcDna3.1(-)真核表达载体，在鉴定重组质粒构建成功后，大量制备去内毒素核酸疫苗pcDna3.1-LC2，应用pcDna3.1-LC2核酸疫苗免疫小鼠，取免疫血清行双向免疫扩散实验，分析其免疫原性。结果通过测序确认构建pcDna3.1-LC2中的672bp的编码框碱基与原序列一致，没有突变及缺失。应用pcDna3.1-LC2免疫BaLB/c小鼠，经双向免疫扩散试验验证pcDna3.1-LC2在小鼠体内可以表达并产生特异性抗体。结论成功的构建了葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDna3.1-LC2，pcDna3.1-LC2可在小鼠体内表达，并能产生葎草花粉变应原特异性抗体，具有良好的免疫原性。
【关键词】支气管哮喘；葎草花粉变应原；核酸疫苗
ChinaaBStRaCt:objectivetoconstructhumulusscandenspollenmajorallergenDnavaccinepcDna-LC2andevaluateitsimmunogenicity.methodsHumulusscandenspollenallergengenewasdigestedfromrecombinantplasmidptripiex2-LC2byecoRⅠandHindⅢofrestrictionendonuclease，andtheninsertedintoexpressionvectorpcDna3.1(-).alargeamountofendotoxinpcDna3.1-LC2purifiedplasmidwasextractedaftersuccessfulconstruction，andanimalexperimentwascarriedouttostudyitsimmunocompetence.ResultsSequencingresultsshowedthat672bpinthecodingsequenceofframesofrecombinantpcDna3.1-LC2wasinlinewiththeoriginalbaseline，withoutdeletionormutation.pcDna3.1-LC2ofpollenallergenhumulusscandensallergenvaccinatedBaLB/cmice.DoubleimmunodiffusiontestshowedthatpcDna3.1-LC2couldbeexpressedandproduceantibodiesinmice.ConclusionHumulusscandensgrasspollenmajorallergenDnavaccinepcDna3.1-LC2hasbeensuccessfullyconstructed.itcanbeexpressedinmice，produceshumulusscandensgrasspollenallergenspecificantibodyandhasagoodimmunogenicity.
KeYwoRDS:asthma;humulusscandensgrasspollenallergen;Dnavaccine
支气管哮喘是全球最常见的慢性疾病之一，而过敏性哮喘则是临床上最常见的哮喘类型。过敏性哮喘通常由吸入变应原或食入变应原后诱发。诱发哮喘的物质很多，如花粉、尘螨、霉菌、动物皮毛等，其中葎草花粉是夏秋季最重要的吸入性变应原之一。变应原特异性免疫治疗是唯一针对病因治疗的方法。应用传统粗制变应原提取液进行免疫治疗，需要长疗程多次皮下注射，患者的依从性差，且粗制变应原的成分繁杂，除变应原成分外还含有非变应原成分，可能引起局部和全身过敏反应。变应原核酸疫苗具有持久免疫应答、易标准化、生产应用方便等优点，在过敏性疾病的预防、诊断、治疗上具有很大的潜力和优势。变应原核酸疫苗的构建及应用研究是目前的研究热点之一。本研究构建了葎草花粉主要变应原核酸疫苗并初步评价其免疫学活性，为葎草花粉过敏性哮喘的防治提供了新方法。
1材料与方法
1.1材料
DH5α工程细菌由西安交通大学医学院中心实验室惠赠，pcDna3.1(-)由第四军医大生物化学教研室惠赠，含目的基因的ptripiex2-LC2质粒由本课题组实验室保存。t4Dna连接酶，eL0014内切酶(HindⅢ，eR0507)，(ecoRⅠ，eR0277)购自Fermentas公司，Fastfilterendo-FreeplasmidmaxiKit(D6926-03)25preps购自e.Z.n.a公司。6周龄的雌性BaLB/c小鼠由西安交通大学医学院动物实验中心提供并饲养。葎草花粉变应原浸液1/20(g/mL)由西安交通大学医学院第二附属医院变态反应实验中心提供。
1.2ptripiex2-LC2和pcDna3.1(-)HindⅢ、ecoRⅠ双酶切
小量提取质粒分别测得ptripiex2-LC2质粒浓度为225.7mg/L，pcDna3.1(-)质粒浓度为483.6mg/L。用HindⅢ、ecoRⅠ内切酶双酶切后琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂回收LC2目的基因片段和pcDna3.1(-)质粒的大片段。
1.3将LC2目的基因定向插入pcDna3.1(-)质粒
测回收LC2基因片段的浓度为3.6mg/L，pcDna3.1(-)质粒大片段的浓度为18.3mg/L。用t4Dna连接酶连接，将连接产物命名为pcDna3.1-LC2，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。
1.4pcDna3.1-LC2转化DH5α大肠杆菌感受态细胞
应用预冷的无菌吸头从制好的感受态细胞悬液中吸取200μL，并转移到无菌的离心管中。每管中加入10μLDna，轻轻旋转以混匀，在冰上放置30min。然后，将离心管放入预加温至42℃的循环水中静置90s，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加800μLLB培养基，用水浴加温至37℃，将管转移至摇床上，温育45min，使细胞复苏至表达抗性基因。将已转化细胞转移到氨苄霉素LB固体平板培养基上，置于室温直至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养。
1.5双酶切鉴定pcDna3.1-LC2
将生长良好的单克隆菌落接种入含5mL氨苄霉素的LB培养基的50mL试管中培养，提取质粒测浓度为382.6mg/L，行HindⅢ和ecoRⅠ双酶切鉴定。
1.6核酸测序鉴定pcDna3.1-LC2
将1mL转化菌液送奥科生物技术有限公司测核苷酸序列。BLaSt比对pcDna3.1-LC2质粒与ptripiex2-LC2中目的基因有无突变、缺失及目的基因是否存在串连插入等。
1.7pcDna3.1-LC2免疫原性鉴定
6周龄的雌性BaLB/c小鼠，体重为(20±2)g，共12只，编号1～12号，用秒表行系统分组的方法随机分为对照组和保护组。每组6只分别标为a、B、C、D、e、F。第1天每只小鼠两后腿股四头肌各肌注7.5g/L布比卡因50μL，第2天对照组同部位多点注射pcDna3.1(-)质粒100μg(a260，1164mg/L)，保护组同部位多点注射pcDna3.1-LC2100μg(a260，909mg/L)。第8天重复第2天各组的操作。第29天将各组小鼠摘眼球处死取血清。
2结果
2.1pcDna3.1-LC2的双酶切
pcDna3.1-LC2进行HindⅢ和ecoRⅠ双酶切，将酶切产物琼脂糖凝胶电泳，可见5个克隆的条带基本一致，目的片段大小大致在900bp左右(图1)。
2.2pcDna3.1-LC2质粒的测序
构建好的含有葎草花粉主要变应原目的基因的pcDna3.1-LC2质粒，以t7通用测序引物，由奥科测序公司提供测序结果。BLaSt比对结果显示pcDna3.1-LC2质粒与ptripiex2-LC2质粒中目的片段无突变、缺失和倒置。
2.3pcDna3.1-LC2免疫原性的鉴定
本实验双向免疫扩散采用梅花斑方式，任何两周围孔与中心孔都组成呈中心对称的正三角形，两底角孔血清抗体浓度差别较大时，高浓度抗体会干扰低浓度抗体。本实验6只小鼠血清浓度的血清抗体没有明显差别，相互之间没有明显干扰。通过预试验检测葎草花粉变应原与小鼠血清反应时域的比例，得知葎草花粉变应原浸液1/20(g/mL)稀释4倍与小鼠血清反应可产生明显的沉淀线。30μL1/80(g/mL)葎草花粉变应原浸液与30μLpcDna3.1-LC2免疫血清双向免疫扩散试验结果见图2。
3讨论
一般认为支气管哮喘是由于外界因素诱发遗传性th1与th2细胞免疫失衡导致的Ⅰ型变态反应性疾病[1-2]。th1与th2细胞不同的免疫学功能导致不同的免疫反应，th1细胞主要分泌iL-2、iL-12、iFn-γ，主要活化巨噬细胞，参与细胞免疫。th2细胞主要分泌iL-4、iL-5、iL-9、iL-10、iL-13和Gm-CSF，主要刺激B细胞增殖并产生抗体，诱导肥大细胞和巨噬细胞生长分化和ige免疫球蛋白的生成，参与体液免疫。具有th2特异免疫的个体初次接触变应原后th细胞在iL-4的作用下分化为th2细胞，诱导B细胞增殖分化为浆细胞产生特异ige，ige的Fc段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面FcεRⅠ受体结合，导致机体处于致敏期，当再次接触过敏原时，致敏的肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的ige与变应原结合引发ige交联，导致脱颗粒释放组胺、白三烯等炎症介质，引起相应器官组织的病理生理学改变。
葎草(humulusscandens)俗称“拉拉秧”，主要分布于我国除新疆和青海外的各地区。另外，也见于日本和北美洲各国[3]。近年来葎草属花粉已成为我国及东亚地区夏秋季节花粉症的一个重要致敏原[4-5]。本研究成功构建了葎草花粉主要变应原pcDna3.1-LC2核酸疫苗，它以松弛型高拷贝质粒pUC为骨架，含有新霉素抗性、氨苄青霉素抗性筛选基因，pUC骨架含有CpG序列非甲基化的CpG六聚体，为5′-嘌呤嘌呤CG嘧啶嘧啶3′，有利于诱导th1为主的免疫反应[6-7]。带有细菌复制子ori，可以在大肠杆菌中高拷贝的扩增，适于大量制备核酸疫苗，并且含有SV40肉瘤病毒40复制子，GaBLeR等[8]研究梯牧草主要变应原phip5的核酸疫苗，提示含有病毒复制子的核酸疫苗可以诱发更强的保护性免疫反应。在人体应用这种优化后的核酸疫苗时，仅需毫克级的核酸疫苗即可诱导适当的保护性免疫反应。目的基因位于CmV巨细胞病毒启动子的下游HindⅢ和ecoRⅠ酶切位点之间。CmV真核启动子与其他启动子pSV、LiR等相比，CmV在各种组织中都能引发下游基因的高水平表达。经BLaSt序列分析LC2与拟南芥花粉外壳蛋白GSLtFB91Ze04号基因同源性达80%，用interproscan软件分析GSLtFB91Ze04号基因编码蛋白为过敏毒素，提示LC2基因编码的蛋白也可能为致敏蛋白。经oRF分析，目的基因片段有一个672bp大小的完整的开放阅读框，编码224个氨基酸。经小鼠动物实验证明葎草花粉主要变应原pcDna-LC2核酸疫苗能够在小鼠体内表达，能够产生葎草花粉变应原特异性中和抗体，具有良好的免疫原性，为进一步研究葎草变应性哮喘病的防治奠定了基础。
目前，国内外在尘螨、花粉、乳胶等变应原核酸疫苗的大量研究中，表明核酸疫苗可诱导th2为主的免疫反应向th1为主的免疫反应偏移，在动物哮喘模型中，花粉、蜂毒、卵清蛋白、豆类、花生、蟑螂、真菌、乳胶等核酸疫苗能够抑制哮喘动物模型呼吸道炎症反应的产生，而且对气道炎症有一定的治疗作用[9]。核酸疫苗的未来研究方向是要朝着理想疫苗的方向发展，即安全高效的疫苗方向发展。在抗原研究中，新近的研究主要集中在优势表位的筛选和组合，抑制性表位的剔除；在核酸疫苗载体的研究方面，除了现在常用的质粒载体，又出现了病毒载体，因其具有质粒载体所不具有的独特优势，被尝试使用，又因其具有潜在的危险性，处于慎重发展阶段。目前，受到关注比较多的病毒载体系统有痘病毒载体、腺病毒载体等[10-11]。在免疫佐剂的研究中，CpG基序和细胞因子作为核酸疫苗的佐剂的作用得到不断的证实；在免疫方案方面，联合疫苗、多途径联合免疫等显示了良好的应用前景。但是，对核酸疫苗的免疫机制和如何提高免疫水平仍然需要进一步的研究，核酸疫苗在构建以及生产方面还存在需要改进的地方。
参考文献
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[9]HCJ埃特尔.Dna疫苗[m].北京：化学工业出版社，2005:196-208.
动物免疫血清的双重性篇5
【摘要】目的探讨黄芪颗粒对小鼠免疫功能的调节作用。方法将30只8周龄Balb/c健康雄性小鼠随机分为3组，每组10只。正常组(a组)、模型组(B组)灌服蒸馏水，黄芪颗粒组(C组)灌服黄芪颗粒冲剂。给药第10日除a组外，其他2组均皮下注射环磷酰胺(Cy)，每日1次，共造模3d，观察黄芪颗粒对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能、2，4-二硝基氯苯(DnCB)所致迟发性超敏反应、鸡红细胞(CRBC)致敏小鼠溶血素抗体生成的影响。结果C组小鼠与B组小鼠相比，巨噬细胞吞噬能力提高(p
【关键词】黄芪颗粒；免疫功能；小鼠
abstract：objectivetoinvestigatetheeffectofHuangqikelionimmunefunctionofmice.methods30micewererandomlypidedinto3groups.themiceinaandBgroupwereadministratedwithdistilledwater，CgroupwereadministratedwithHuangqikeli.onthetenthday，allgroupsexceptagroupwereinjectedwithcyclophosphamidetoinducethemodel.theeffectsonthephagocyticfunctionofHuangqikelitomacrophageinabdominalcavityofmice，delayedhypersensitivityinducedbyDnCB，andproductionofhemolysinantibodyinmicethatCRBCsensitizedwereobserved.ResultComparedwithimmuno-suppressivemodelsgivendistilledwater(Bgroup)，phagocyticfunctionofmacrophageinabdominalcavityofmiceanddelayhypersensitivityleadedbyDnCBwereenhanced(p
Keywords：Huangqikeli；immunefunction；mice
反复呼吸道感染(Recurrentrespiratorytractinfection)是儿童时期的常见病、多发病，虽然目前对反复呼吸道感染的确切发病机制尚未完全清楚，但公认，免疫功能低下或紊乱是其发病的重要致病因素。中医学认为，本病的发病机理是小儿脏腑娇嫩，形气未充，五脏以肺脾肾偏于不足，又久病迁延，正气受损，正虚无力抵抗外邪。益气剂黄芪颗粒是儿科常用的治疗反复呼吸道感染的药物，为探讨该药的治疗机制，我们进行了黄芪颗粒对小鼠免疫调节功能的实验研究，现将实验结果报道如下。
1实验材料
1.1动物
30只8周龄Balb/c健康雄性小鼠，体重18～22g，中国医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK-2005-0013，层流架内饲养。
1.2药物
黄芪颗粒，4g/袋，国药准字Z20003380，四川百利药业有限责任公司生产，批号050606。
1.3试剂
环磷酰胺(Cy)200mg/支，山西普德药业有限公司生产，生产日期2006.1.2；肝素钠1250万U/支，天津生物化学制药厂生产，生产日期2006.3.9；甲醇，分析纯，北京化工厂生产，生产日期2002.12；丙酮，分析纯，北京化工厂生产，生产日期2002.12.1；生理盐水，北京双鹤药业有限公司生产，生产日期2006.1.2；姬姆萨染液，Sigma，自己配制；鸡红细胞(CRBC)悬液，鸡血取自北京华都肉鸡场，自行配制；补体(豚鼠血清)冻干，0.3g/支，购于中国药品生物制品检定所，生产日期2006.4.8；2，4-二硝基氯苯(DnCB)，aldrichChemicalCo.Ltd。
1.4仪器
olympus显微镜；离心机，tcl-16G台式高速离心机；分光光度计LG721，山东高密电子仪器厂；离心机，ieCCentraCL2；37℃恒温箱napCo5410；天平(1/10万)，Sartorius；打孔器，Kw-trio97ao。
2实验方法
2.1对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能影响的观察[1]
Balb/c小鼠30只，按体重随机分为正常组(a组)、模型组(B组)、黄芪颗粒组(C组)，每组10只。a组和B组经口灌胃蒸馏水0.5mL/次，C组经口灌胃黄芪颗粒冲剂20mg/(g·d)。C组每天给药2次，连续14d。给药第10天起除a组外，其他两组均每日皮下注射Cy40mg/kg，每日1次，共3d。各组经口灌胃给药后第14天，腹腔注射5%CRBC悬液0.4mL/只。8h后将小鼠颈椎脱臼处死，腹部消毒，剪开皮肤，以生理盐水2.5mL反复冲洗腹腔，吸出腹腔内液体，放入管中离心5min，将离心细胞悬液混匀，少许滴到载玻片，3min后将多余液体冲掉，以丙酮-甲醇液(1∶1)固定5min，用姬姆萨染液染色3min，晾干后油镜观察，每片计数200个巨噬细胞，按下式计算巨噬百分比与吞噬指数。
吞噬百分率＝吞噬CRBC的巨噬细胞数/200个巨噬细胞×100%
吞噬指数＝被吞噬的CRBC总数/200个巨噬细胞
2.2对DnCB所致迟发性超敏反应影响的观察[1]
供试动物的分组、处理方法和造模同上。各组小鼠首次给药后第4天，在小鼠颈部皮肤上涂抹5.0%DnCB丙酮溶液20μL/只致敏。灌胃给药后第14天，在小鼠右耳两侧均匀涂抹2.5%DnCB丙酮溶液20μL/只进行攻击。24h后，处死小鼠，用打孔器(直径7mm)在左右相同部位打下耳片，1/10万天平称重，以左右耳片重量差(肿胀度)表示迟发型过敏反应的强度。
2.3对CRBC致敏小鼠溶血素抗体生成影响的观察[1]
供试动物的分组、处理方法和造模同上。给药第4天，各组小鼠腹腔注射5%CRBC悬液0.4mL/只进行免疫。各组灌胃给药后第14天，摘眼球取血于管中，室温下放置1h，2000r/min离心，10min后取血清。用生理盐水稀释100倍，取稀释血清1mL，与5%CRBC悬液0.5mL、10%补体(豚鼠血清)0.5mL混合，在37℃恒温箱中保温30min后，0℃冰箱30min中止反应。离心，取上清液于分光光度计540nm处比色，另用生理盐水做空白对照，取其上清液作为比色时调零的基准。以光密度a值作为血清溶血素的指标。
2.4统计学方法
采用SpSS11.0统计软件包。计量资料以x±s表示，计数资料比较采用单因素方差分析，以p
3结果
(见表1～表3)表1黄芪颗粒对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(略)注：与B组比较，*p
4讨论
机体的免疫由特异性免疫和非特异性免疫所组成。非特异性免疫是特异性免疫的基础，特异性免疫所产生的免疫物质又能增强非特异性免疫的作用，因此，增强机体的非特异性免疫对提高机体的整个免疫功能意义重大。巨噬细胞具有吞噬异物、处理抗原等多种功能。CRBC对鼠类是一种较强的抗原性异物，当其被注入小鼠腹腔后，可引起腹腔巨噬细胞聚集并吞噬，这是一项机体非特异性免疫功能的主要指标，因此可用以检测药物对机体防御能力的影响[2]。血清溶血素测定是了解受试药物对动物特异性免疫功能影响的实验，溶血素水平反映了体液免疫能力，溶血素的含量与机体体液免疫能力呈正相关。DnCB诱导的小鼠迟发型超敏反应是由特异性致敏效应t细胞介导的细胞免疫反应，其中的t细胞在排斥移植物抗宿主病、自身免疫和肿瘤免疫等方面起着关键作用，是检测细胞免疫功能的常用方法之一[3]。
本研究结果显示，B组小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬率及吞噬指数、迟发性超敏反应强度、血清溶血素水平均低于a组(p
现代药理学研究表明，黄芪对免疫抑制剂造成的免疫低下有明显的保护作用，是具有双向作用的免疫调节剂[4-5]。本实验结果与其一致，表明黄芪颗粒能明显促进小鼠非特异性和特异性免疫(包括体液免疫、细胞免疫)功能，对Cy所致免疫功能低下模型小鼠的免疫功能具有一定调节改善作用。
参考文献
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动物免疫血清的双重性篇6
【关键词】狂犬病；预防；清洗；消毒；疫苗
据报道，目前全世界每年约有5万多人死于狂犬病。而大部分发生在非洲和亚洲等地区，其中亚洲因狂犬病死亡的人数已超过3万。调查显示，印度的狂犬病发病情况最为严重，平均每年因感染狂犬病而死亡的人数达20165，而我国的狂犬病也十分严重，感染的人数仅次于印度[1]。2008年Han等报道[2]1991至1996年我国狂犬病被控制在低水平，1996年我国确诊狂犬病例只有159例，2001年出现了一个发病高峰，发病率达0.2/10万人，到2006年发病总人数更是跃升到3279例，比1996年增加了20多倍。由于狂犬病一旦发病目前尚无有效疗法，所以人一旦罹患狂犬病，死亡率几乎是百分之百。本文简要总结了狂犬病预防和处理的方法，现将其报道如下：
1伤口的彻底清洗、消毒和后续的处理
对于狂犬病，越早处理伤口的越好。在就诊过程中，一旦发现伤口没有愈合，就必须采用下列方法对伤口进行及时的处理。
1.1彻底清洗以清水或者20%的肥皂水反复交替地对创口进行灌洗，每次灌洗的时间应不低于15分钟。其目的为：尽早、尽快、尽量彻底将动物的唾液及污染物去除。较深的伤口冲洗时，用20ml注射器抽取0.9%的无菌生理盐水伸入伤口深部进行灌注清洗，做到全面彻底。切不可用嘴去吸，以免狂犬病病毒在口腔黏膜有潜在破损的情况下被间接感染；更不要用手来挤压排血，这样可能通过被挤压污染的伤口，致使病毒被直接送入伤口深部，人为地建立了病毒侵入血液循环的途径[3]。洞穴式伤口比较特殊，不宜用肥皂水彻底清创的，也可用大量0.9%生理盐水彻底灌洗伤口后，后用双氧水清洗，（严重污染的伤口双氧水停留3分钟后），再用生理盐水彻底将双氧水冲洗干净。对于头、颈部被疑似疯犬抓、咬严重的伤口，即使延迟1～2天甚至3～4天也不可忽视局部处理，此类情况如果伤口已经结痂，也应将结痂去除后严格按先清洗后消毒的原则进行处理。
1.2消毒在彻底清洗伤口后方可进行的。用2%～3%碘酊擦拭伤口停留30秒以上，再后用75%酒精脱碘消毒。对于黏膜部位，如口腔、、会，敏感部位，如、等处的伤口，均用无刺激的2%碘伏消毒；眼部的伤口只用清水或0.9%生理盐水彻底清洗，禁止使用酒精、碘伏和碘酊等进行消毒。
1.3伤口的后续处理伤口经过冲洗与消毒之后，后续的处理必须按照“只要没有伤及大血管，尽量不采取缝合和包扎处理”的一般原则，以利于污染液及渗出液的充分排出。对于一些较大或位于面部的伤口，必须进行缝合时，则需在清创和消毒完成后，立即给予患者浸润注射人源性免疫球蛋白或动物源性抗血清，之后要等待数小时，才可以实施缝合及包扎等处理，缝合时每针之间要有较宽间隙，并根据情况放置橡皮引流条。
2动物源性抗狂犬病血清或人源性狂犬病免疫球蛋白的应用动物源性抗狂犬病血清或人源性狂犬病免疫球蛋白均为被动免疫制剂，其含高效价的狂犬病抗体，具有特异性中和狂犬病病毒的作用，与狂犬病疫苗联合应用，可相对延长狂犬病的潜伏期，使机体有足够的时间产生自身的抗体，较大限度的减少发病的机会。注射剂量按20iU/kg体重计算，一次性注射完毕。被动物咬伤后原则上注射愈早愈好，抓、咬后48小时内注射，可减少狂犬病的发病率。我们总结的经验是：伤口经彻底清创消毒后，应尽可能多地将免疫制剂注射于伤口部位，剩余的根据咬伤的部位及程度注射于颈背部或大腿外侧肌群；如果没有足够量的制剂，应进行稀释后注射。（应用动物源性血清须做过敏试验后按说明注射）。
3人用狂犬病疫苗的全程免疫
人用狂犬病疫苗为主动免疫制剂。人被动物抓、咬伤后应立即全程注射安全、有效的人用狂犬病疫苗，可刺激机体自身产生抗狂犬病病毒的免疫力，这也是目前仅有的一种预防狂犬病的方法。其中暴露后的免疫程序一般为：一般咬伤者于0天（第一天，咬伤当日）、3天（第4天，以下类推）、7天、14天、28天各注射疫苗一剂，全程共接种5针，成人、儿童用量相同。对于情形严重者，建议给予首剂加倍。注射狂犬病疫苗要及时、全程、足量，注射时间距咬伤时间越早，预防效果越好。最近研究报道[4]，皮下注射或肌肉注射狂犬疫苗1周后，发现血清嗜酸细胞活化趋化因子、白细胞介素5、白细胞介素β1等细胞因子明显升高并有显著性差异（p
世界权威狂犬病防治专家Briggs教授[5]认为尽管狂犬病发病后100%死亡，但注射狂犬病疫苗是有效预防狂犬病最关键的手段。因此，对于被温血类动物抓、咬伤的患者，应及时到国家卫生防疫部门指定的狂犬病暴露门诊进行规范的、系统的伤口清洗、消毒；及时的、安全的注射优质的狂犬病免疫制剂，才能有效的预防狂犬病的发生。
参考文献
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动物免疫血清的双重性篇7
关键词：重症肌无力；主动免疫；乙酰胆碱受体；Lewis大鼠
中图分类号：R-332
文献标识码：a
文章编号：1673-7717(2008)03-0518-03
theFoundofanimalmodelsofexperimentalautommunemyasthenisGravis
JinDi，ZHanGLi-de，LiUYu
(LiaoningUniversityoftraditionalChinesemedicine，Shenyang110032，Liaoning，China)
abstract：theexperimentalautommunemyasthenisgravisanimalmodelsandmyasthenisgravispatientsappearancehavebeenprovedtobeveryresembleinclinicalmanifestation，pharmacology，electrophysiology，immunologyandhistology.theyarethebesttoolsofresearchingmankindmyasthenisgravis.thistextmainlyintroducesthepreparativemethodofmakingtheexperimentalautommunemyasthenisgravisanimalmodelsandtheindicatrixandthefactorswhichaffectsucceed.
Keywords：myasthenisgravis；activeimmunity；acetylcholinereceptor；Lewisrats
重症肌无力(myastheniagravis，mG)是一种神经肌肉接头传递障碍的获得性自身免疫性疾病。病变主要是累及神经-接头突出后膜上乙酰胆碱受体(acetylcholinereceptor，achR)。临床主要表现为受累骨骼肌肉极易疲劳，经休息和服用抗胆碱酯酶药后可部分恢复为特征。乙酰胆碱受体抗体(aChRantibody，aChRab)的增加是mG发病机制中的主要因素，但是其致病机理和治疗方法尚有待于进一步完善，因此研究实验性动物模型的制备具有重要意义。
当人们意识到aChRab是mG发病关键所在之后，1973年patrick等首先从电鳗电器官提取纯化aChR，免疫接种新西兰大白兔后获得实验性自身免疫性重症肌无力(experimentalautoimmunemyastheniagravis，eamG)模型，后来在大鼠、小鼠、豚鼠、猴用同样方法也制备了eamG模型[1-5]。随着蛋白质组织化学的发展，现已掌握了人及一些实验动物aChR主要致病区的肽链结构，因此出现了用合成多肽作为免疫原制备eamG模型的方法。
1模型制备方法
1.1以achR蛋白为免疫原建立动物模型从丁(氏)双鳍电鳐的电器官分离乙酰胆碱受体(achR)免疫大鼠，建立实验性重症肌无力(eamG)动物模型。方法：参照徐浩鹏等[6]方法从丁(氏)双鳍电鳐的电器官提取achR蛋白，并采用Folin酚试剂法及酶联免疫吸附法(eLiSa)检测提取蛋白的含量及活性；以提取的蛋白主动免疫Lewis大鼠，健康、雌性8周龄Lewis大鼠24只随机分为3组，即正常对照组、福(氏)完全佐剂(CFa)对照组、achR+CFa实验组，每组8只。实验组大鼠分别于足垫、腹部及背部皮下多点注射乳剂1.5mL，第4周再次注射上述乳剂免疫大鼠。CFa对照组只接受等量CFa皮下注射[7]。
1.2用mG患者血清中的achR抗体建立动物模型重症肌无力被动转移小鼠模型(p-eamG)的制作，血清阴性(SnmG)和血清阳性(SpmG)组小鼠每日分别腹腔注射SnmG或SpmG患者血清0.6mL，连续7天。对照组小鼠注射方法同p-eamG组。所有小鼠定义词注射血清后24h腹腔注射环磷酰胺(300mg/kg)，以抑制小鼠对人血清蛋白的免疫反应[8]。还有用胸腺移植建立重症肌无力动物模型，Schonbeck等[9]将mG患者的胸腺组织移植到严重免疫缺陷小鼠肾被膜下1～2周后，在小鼠血清中可检测到抗人achRab，11周时抗人achRab滴度增至重度mG水平，且在骨骼肌运动终板处可见ig沉积。说明mG患者的胸腺组织能诱导和维持自身抗体产生。mG患者切除胸腺后细胞免疫、体液免疫均受抑制，achRab减少，纠正了mG免疫调节紊乱，故70%的患者症状缓解或改善。
1.3采用乙酰胆碱受体单克隆抗体体建立动物模型采用乙酰胆碱受体(nachR)单克隆抗体mab35建立C57BL/6幼年小鼠重症肌无力被动转移模型。健康清洁级，雌性C57BL/6小鼠48只，4～5周龄，体重12～14g参照文献[10]将实验动物分为实验组(e)和对照组(n)，实验组分为3组(e1、e2、e3)每组12只。分别经腹腔注射含0.5、1.0、1.5mg/kgmab35的Ringer’s液0.2mL给B6幼年小鼠，对照组(n)注射不含mab35的Ringer’s液0.2mL[11]。
1.4基因疫苗免疫小鼠建立重症肌无力动物模型郝志波等，用基因疫苗pcDna2achRα211免疫C57BL/6小鼠建立实验性自身免疫性重症肌无力模型(eamG)。方法：将人乙酰胆碱受体α亚基n端的主要免疫区(aChRα211)的基因片段插入到穿梭载体pcDna3.0中，构建基因疫苗pcDna2aChRα211。大量提纯质粒pcDna2aChRα211后肌肉注射C57BL/6小鼠。用eLiSa法检测小鼠血清中抗aChRα211的igG(aChRab)，并用pCR方法检测外源基因在小鼠各组织器官中的分布情况[12]。
此外，用鼠源乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段(R97-116)复制eamG模型[13]；吴怀国等乙酰胆碱受体α亚基125-147肽段制作实验性重症肌无力动物模型的研究[14]。
2观察指标
2.1临床观察按Lennon等[15]的分级法将症状严重程度分为4级。0级：没有肯定的无力表现；1级：撕咬无力，四肢力量较差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少且易疲劳；2级：明显无力，休息时身体呈隆起姿势，头尾下垂，大腿外展，前肢趾弯曲，动作笨拙，行走不稳；3级：严重无力表现，无撕咬动作，肌肉震颤，呼吸困难，濒死或死亡。
2.2aChR数目的计算将正常小鼠和eamG小鼠后肢肌肉溶于1%(体积分数)tritonX-100中，分别加入过量125i标记过的α-银环蛇毒(α2Butx)的磷酸盐缓冲液，孵育1～3h后加入过量兔抗鼠igG进行免疫沉淀反应，所得沉淀物用磷酸盐缓冲液冲洗2遍后用γ-计数仪计数，并用标准曲线求取已结合抗体的achR数。eamG模型的aChR数目应较正常鼠明显减少[16]。
2.3肌电图动物麻醉后固定于解剖板上，将成对刺激电极以2～3mm距离插至坐骨切迹附近肌肉内，记录电极置于腓肠肌内侧头(跟腱附着处)。重复用50～100Hz电刺激时eamG模型的腓肠肌电位及收缩波幅呈衰减反应[17]。
2.4光镜观察实验动物断颈处死，迅速取其腓肠肌，以40g/L多聚甲醛固定，常规制作石蜡切片。然后用011moL/Lα2Butx标记辣根过氧化酶(α2Butx2HRp)孵育切片1h，用pBS洗3次，最后用联苯二胺双氧水(DaB2H2o2)于室温下显色，在光学显微镜下观察运动终板上aChR数目的改变。光镜下可见eamG动物神经末梢和肌纤维处有巨噬细胞浸润，部分肌细胞呈节段性坏死，运动终板上achR数目减少。
2.5电镜观察实验小鼠断颈处死，迅速取其腓肠肌，用高碘酸盐2赖氨酸2多聚甲醛(pLp)液固定2h，沿肌纤维走行切成0.15cm×0.15cm×1.1cm大小块，用pBS冲洗，放至0.1moL/Lα2Butx2HRp中，于4℃孵育2h，用pBS洗净，以DaB2H2o2显色。用立体显微镜观察，选择nmJ多的部位行25g/L戊二醛及锇酸固定，脱水，环氧类树脂(epon812)包埋，制成6μm切片，经醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后，用em100/CR电镜观察。电镜下显示eamG动物突触后区域简单化，突触后膜皱褶退化，突触间隙加宽。通过tJtY-400tC图像分析仪测量神经末梢面积、突触前后膜长度及其比值、突触后膜面积。eamG动物显示平均突触后膜面积减小，突触后膜长度变短，突触后膜与前膜长度比值变小[18]。
3影响动物模型成功的因素
3.1动物的品系动物种系的选择现多采用大鼠和小鼠。其中大鼠对实验性自身免疫性重症肌无力的易感性强弱程度依次递减为wistar>munich>Fischer>Lewis>Buffalo>Brown>norway>aCi>watarKyoto>Kopen-hagen>wastarFurth；小鼠中单倍型H-2b系对实验性自身免疫性重症肌无力有高度易感性，H-2q系中度易感，单倍型H-2k和H-2p系相对抵抗。其中对实验性自身免疫性重症肌无力的易感性以小鼠C57BL/6、SJL和aKp较高，发病率在50%～70%，其他种系如SwR、BaLB/c和C3H/He易感性低，仅为0%～15%[19]。
3.2动物的年龄人类大约有60%mG患者是在40岁之后首次出现症状，而小鼠动物模型的成功率却与年龄大小呈相反趋势。年龄大的小鼠可抵抗mG发生，这是由于B淋巴细胞对achR有记忆作用所致。但是这种记忆反应可被诱导弱化，即在初次抗原致敏后进行再次免疫接种可提高大龄鼠的发病率。
因eamG临床表现、药理学、电生理、免疫学及组织学表现等方面已被证明与mG患者极为相似，是进一步研究人类mG的极佳工具。
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动物免疫血清的双重性篇8
【关键词】汉坦病毒
肾综合征出血热(HFRS)是一种严重危害人体健康的自然疫源性疾病。在各种预防HFRS的措施中，疫苗是一种最特异和最有效的预防手段。迄今为止，本实验室已经研究出HFRSⅠ型、Ⅱ型和双价及双价纯化沙鼠肾灭活疫苗并已投入规模生产。经现场流行病学调查，疫区人群的保护率在95%以上，为预防HFRS起到了重要的作用〔1，2〕。但疫苗的毒种Z10野鼠型(Htn)和Z37家鼠型(Seo)均为20世纪80年代分离，距今已将近20年，随着时间的推移，HFRS的流行及临床症状有较大的变化，这预示着引起该病的病毒有可能发生变异。因此，必须选择疫苗的后备毒株，一旦发生目前疫苗保护率不高或不能保护时，即可用后备毒株生产疫苗。2001～2002年，我们从浙江省的HFRS疫区鼠肺中分离到了9株汉坦病毒，筛选出病毒滴度较高、抗原性较好的4株毒株〔3〕，再将4株毒株在Vero细胞中的增殖特性、抗原性和免疫原性进行研究，从中筛选出ZJ4与ZJ5毒株为汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗理想的候选毒株。现将筛选的过程及结果报道如下。
1材料与方法
11Vero和Vero-e6细胞均由中国药品生物制品检定所惠赠，经本室传代保存，Vero细胞使用代次不超过150代，Vero-e6使用代次为30～60代之间。
12病毒ZJ2、ZJ4、ZJ7和ZJ5毒株由本室采用20d龄左右沙鼠分离自浙江省HFRS疫区捕获的野外鼠阳性鼠肺标本；76-118(Htn)和UR(Seo)株(中国药品生物制品检定所疫苗一室)。所有毒株使用前均经第四军医大学汉坦病毒单克隆抗体鉴定型特异性。其中对ZJ4、ZJ7毒株部分m片段核苷酸序列进行了测定，结果也证明属Htn型〔4〕。
13动物出生20d左右的沙鼠和2～5d龄的乳沙鼠(系本实验室饲养)；家兔(浙江省药品检定所)，白毛，体重2～3kg，雌雄不限。
14试剂HFRS荧光血清抗体和兔抗HFRSigG致敏血球为本室自制。
15汉坦病毒在乳沙鼠脑内传代及病毒含量的测定将分离到的毒株接种1～5d龄的乳沙鼠，每只脑内002ml，15d左右收获，无菌取脑，用含10%小牛血清基础建立培养液(mem)液制成鼠脑悬液，离心取上清，在Vero-e6细胞上测定病毒滴度以及利用反向被动血凝试验(RpHa)测定病毒抗原。需要传代的将脑悬液接种1～5d龄乳鼠，每只脑内002ml。
16病毒在Vero细胞上的适应性传代分别将汉滩病毒ZJ2、ZJ4、ZJ7株和汉城病毒ZJ5株鼠脑标本研磨制成10%的鼠脑悬液，离心后取上清液接种Vero细胞，进行适应性传代，培养7d左右，取细胞刮片进行直接免疫荧光法(Fa)〔5〕检查细胞感染情况，待感染量达+++～++++，将细胞瓶冻入-30℃冰箱，过夜后融化离心，取上清传代，连续传5代，每代取细胞冻融液少许，用来测定病毒和抗原滴度。
17病变(Cpe)观察将4株毒株感染长成单层的Vero细胞，37℃培养，每隔3d用含3%小牛血清的mem换液1次，并逐日在倒置显微镜下观察细胞病变发展情况，连续观察12d。
18敏感动物发病情况观察候选的4株毒株在Vero细胞上适应了5代后，将细胞冻融后离心的上清液(Cp5)腹腔注射2～5d龄的乳沙鼠，01ml/只，观察乳鼠的发病情况并记录发病或死亡时间。
19Fa法检测病毒滴度(LgCCiD50/ml)用025%胰酶消化生长良好的Vero-e6细胞，以适应细胞浓度接种96孔微量培养板，每孔150μl，置37℃、5%Co2条件下培养，待细胞长成单层，取待检毒种液，做10倍系列稀释，分别接种到e6单层细胞孔，接种量为10μl/孔，每个稀释度接种4种，置37℃、5%Co2条件下吸附2h，然后加3%小牛血清mem的细胞培养液150μl/孔，再置37℃孵箱培养6～7d，用Fa检查细胞感染病毒的情况，计算病毒滴度。
110RpHa检测病毒抗原量采用96孔120°“V”型微量反应板，每孔加25μlRpHa稀释液，取25μl待检毒种液于第一孔作1∶2，1∶4，1∶8……倍比稀释，然后每孔加25μl致敏血球悬液，于微量震荡器上混匀并置37℃水浴1～2h观察结果。
111Vero细胞灭活疫苗的研制选用ZJ2、ZJ4、ZJ7和ZJ5株作为疫苗株，将此毒株感染Vero单层细胞，培养后按生物制品规程中肾综合征出血热疫苗生产的方法研制疫苗〔6〕，最后以1∶4000β丙内脂灭活。
112免疫血清的制备和中和抗体效价的测定制成的疫苗经安全试验合格后(Vero-e6细胞盲传3代阴性)，用于免疫家兔，每批4只，后腿肌肉注射10ml，7d后以同法再免疫1次，第1次免疫后4周采血分离血清。每只家兔于免疫前4周采血，分离血清作为对照。应用间接免疫荧光法(iFa)〔5〕和本实验室建立的半微量直接免疫酶斑减少中和试验(DppRnt)〔7〕测定荧光抗体和中和抗体的效价。病毒用汉坦病毒国际标准株76-118和UR株。
2结果
21汉坦病毒在乳鼠脑内传代后病毒和抗原滴度的情况ZJ2、ZJ4、ZJ7和ZJ5毒株在乳沙鼠脑中连续传了8，8，5，7代，其鼠脑冰冻切片经直接免疫荧光检查均呈强阳性，鼠脑悬液经离心，上清液的病毒滴度和抗原滴度均较强。
22各汉坦病毒在Vero细胞上的适应性传代4株毒株对Vero细胞均很敏感，但适应能力存在一定差异。ZJ4、ZJ7株接种Vero细胞第2代的免疫荧光强度即达到+++，而ZJ2、ZJ5株荧光相对较弱，经5次传代，4株毒株的免疫荧光强度和病毒滴度均有明显的提高，免疫荧光强度均可以达到++++，ZJ2、ZJ4、ZJ7三株Htn型病毒呈片状荧光，ZJ5株Seo型病毒呈颗粒状荧光，结果传5代后4株毒株的病毒滴度均达到650LgCCiD50/ml，最高达750LgCCiD50/ml，病毒抗原量均达到1∶160，最高达1∶768，随着适应代数的增加，病毒滴度和病毒抗原量呈递增趋势，递增情况(表1)。
23毒株对Vero细胞致病变的观察连续观察12d，4株毒株的1～5代均不使Vero细胞产生病变。
24毒株致乳沙鼠发病情况的观察4株毒株的Cp5攻击乳鼠，7d后均发现乳鼠活动减少，精神萎靡，卷缩，后肢麻痹等症状发生，9d后出现死亡。
表14株毒株经Vero细胞传代后不同代次的病毒滴度和抗原滴度（略）
25家兔免疫疫苗后中和抗体的应答情况用ZJ4株和ZJ5株制备的2批单价原液灭活疫苗免疫家兔，2针后的免疫血清经DppRnt测定，对同型毒株的中和抗体效价，3/4只家兔不低于1∶10。
3讨论
本结果显示，经5代传代后，病毒在Vero细胞上已较好适应，病毒滴度和抗原量均有明显提高。病毒滴度均稳定在650LgCCiD50/ml以上，病毒抗原量稳定在1∶160。同时将筛选出的毒株制成Vero细胞灭活疫苗，疫苗免疫家兔后，ZJ4和ZJ5株疫苗的免疫血清4/4和3/4的家兔中和抗体滴度不低于1∶10，表明有很好的免疫原性，在家兔体内可以诱导出较高效价的中和抗体。因此，设想今后将ZJ4和ZJ5株毒株在Vero细胞上增加传代次数，研制HFRS双价纯化Vero细胞灭活疫苗，可能会更提高免疫血清的抗体效价。目前衡量汉坦病毒疫苗质量好坏非常重要的一个指标是免疫原性—中和抗体的效价。中国生物制品规程中评价HFRS疫苗质量的免疫原性标准是3/4的家兔中和抗体滴度应不低于1∶10。将ZJ4和ZJ5毒株经乳沙鼠脑内连续传8，7代后的鼠脑毒种经Vero细胞适应5代后再反传乳鼠，收获病鼠，其鼠脑经脱脂牛奶稀释后真空冷冻干燥后建立毒种库，根据2005版的《药典三部》〔8〕对疫苗毒种的要求，对其进行了外源因子、无菌试验、支原体等检测，均符合疫苗生产规程的要求。
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动物免疫血清的双重性篇9
【关键词】小鼠oCiLrp2;，原核表达;，抗oCiLrp2抗血清
[摘要]目的:在原核系统中表达破骨细胞抑制凝集素家族成员之一oCiLrp2基因，并制备大鼠抗oCiLrp2的抗血清。方法:应用RtpCR从小鼠脾细胞中克隆的部分oCiLrp2cDna，构建重组表达载体pet28aoCiLrp2，并转化大肠杆菌BL21(De3)，以iptG诱导表达HisoCiLrp2融合蛋白。以表达产物免疫SD大鼠，制备大鼠抗oCiLrp2的抗血清。采用westernblot测定其效价和特异性。结果:RtpCR法扩增出235bp的oCiLrp2基因，其cDna序列与GenBank中登录的序列一致。以构建的重组质粒pet28aoCiLrp2转化大肠杆菌获得目的蛋白的高表达。以表达的HisoCiLrp2融合蛋白免疫大鼠获得抗小鼠oCiLrp2的抗血清。westernblot分析表明，该抗血清均可与原核表达的HisoCiLrp2融合蛋白和真核表达的oCiLrp2ig融合蛋白特异性结合;抗血清的效价为1∶2000。结论:在原核细胞中表达了小鼠的oCiLrp2蛋白，制备了大鼠抗小鼠oCiLrp2的抗血清，为进一步研究oCiLrp2的生物学功能奠定了基础。
[关键词]小鼠oCiLrp2;原核表达;抗oCiLrp2抗血清
破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2（osteoclastinhibitorylectinrelatedprotein2，oCiLrp2）是破骨细胞抑制凝集素（oCiL）家族的成员之一，属于Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有1个较小的胞内区，胞外区含有1个C型凝集素结构域。小鼠oCiLrp2基因位于6号染色体的nK基因复合体内。此复合体存在很多C型凝集素相关基因，包括CD69、nKG2家族及Ly49家族及nKRp1家族等。oCiL家族包括oCiL(Clrb)、oCiLrp1(Clrd)和oCiLrp2(Clrg)3个基因，其胞外区具有很高的同源性(约80%)[1]。oCiLrp2主要在免疫系统中表达，其中在B细胞和树突状细胞（DC）中呈高表达;在未活化的CD4+和CD8+t细胞中有微量表达，但t细胞活化后，其表达上调。最近发现，oCiLrp2为nK细胞受体蛋白1（nKRp1）家族成员中nKRp1F的配体[2]。研究表明，oCiLrp2也可作为t细胞的共刺激分子，在t细胞的活化过程中起作用[3，4]。因此，需要进一步研究oCiLrp2在t细胞中的作用机制，在B细胞、DC中可能的功能，以及其与nKRp1F相结合后对nK细胞功能的影响。本研究中用RtpCR克隆并在原核细胞中表达oCiLrp2基因，以表达的蛋白为免疫原制备大鼠抗oCiLrp2的抗血清，为进一步研究oCiLrp2的功能提供了重要的试剂。
1材料和方法
1.1材料trizol试剂为invitrogen公司产品。RtpCR试剂盒、ecoRⅠ、XhoⅠ和t4Dna连接酶均为taKaRa公司产品。质粒提取试剂盒、Dna胶回收试剂盒为博大泰克公司产品。弗氏完全与不完全佐剂购自欣经科公司。HRp化学发光底物为pierce公司产品。HRp标记的羊抗大鼠igG为Sigma公司产品。蛋白marker购自华美公司。Dnamarker购自鼎国公司。C57/B6小鼠及SD大鼠购自维通利华公司。原核表达载体pet28a及e.coliBL21（De3）由本实验室保存。
1.2方法
1.2.1小鼠oCiLrp2基因的克隆及重组表达载体的构建以C57/B6小鼠脾细胞中提取的总Rna为模板，用oligo4进行逆转录反应合成cDna第1条链，再以上游引物（p1）5′aaaGaattCtGGaaGtGGaCaaaCaaCaC3′（含ecoRⅠ酶切位点）和下游引物（p2）5′aatCtCGaGGaCCataGGGGaaaaaGtaG3′（含XhoⅠ酶切位点）进行，pCR扩增ocilrp2的部分cDna。回收pCR产物（约为250bp），用ecoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到表达质粒pet28a中的ecoRⅠ和XhoⅠ位点之间，构建重组质粒pet28aocilrp2。以重组质粒经转化大肠杆菌BL21（De3）后，提取重组质粒，经ecoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后，送上海博亚公司测序。
1.2.2重组HisoCiLrp2融合蛋白的诱导表达在3mL含卡那霉素的LB培养基中，接种转化菌鉴定正确的单个菌落，于37℃振荡培养10h，再按1∶100的体积接种于10mL含卡那霉素的Yt培养基中，于37℃、摇菌培养至a600=0.6～0.8。加入iptG至终浓度为0.5mmol/L，于37℃诱导8h。收集菌体，用pBS混悬后，进行超声裂解，离心裂解液，收集上清和沉淀（沉淀用pBS混悬）。将上清和沉淀均加蛋白上样缓冲液煮沸5min，以未经iptG诱导的转化菌作为对照，进行SDSpaGe。
1.2.3大鼠抗小鼠oCiLrp2蛋白抗血清的制备SDSpaGe后，切取含有HisoCiLrp2融合蛋白的凝胶条。将此胶条于pBS中研碎后免疫SD大鼠，初次免疫用弗氏完全佐剂，抗原量约为200
μg/只，于腹线两侧皮下多点注射。3周后，加强免疫，抗原量同首次，加弗氏不完全佐剂，以后每隔2周加强免疫1次，共免疫4次。最后1次免疫后7d，由颈动脉取血，分离血清冻存于-20℃中。
1.2.4抗血清效价及特异性的westernblot检测将分离的抗血清按1∶200、1∶500、1∶1000、1∶2000系列稀释后，进行westernblot检测抗血清的效价。将菌体总蛋白和本实验室制备的真核表达的oCiLrp2ig融合蛋白同时进行SDSpaGe后，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。依次滴加系列稀释的大鼠抗血清（过夜孵育，洗涤）及1∶2500HRp标记的羊抗大鼠igG(孵育2h，洗涤)，最后滴加HRp化学发光底物，用Chemilmagertm4400凝胶成像仪检测发光信号。
2结果
2.1小鼠oCiLrp2基因的克隆以p1和p2为引物，以小鼠脾细胞中提取的总Rna为模板，经RtpCR扩增出约250bp的特异性基因片段，大小同预计结果相符（图1）。
图1oCiLrp2基因pCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析 略
2.2重组表达载体pet28aoCiLrp2的构建构建的pet28aoCiLrp2经ecoRi和Xhoi双酶切后，可得到1条约为250bp的片段（图2）。Dna测序结果与GenBank中登录的序列完全一致。
图2重组质粒pet28aoCiLrp2的酶切鉴定 略
2.3HisoCiLrp2融合蛋白的表达及鉴定将含重组质粒的菌株经诱导和未经诱导8h后，收获菌体，进行SDSpaGe分析。诱导菌出现相对分子质量（mr）约为10000的1条带，未诱导菌中没有此条带（图3）。采用抗His・tag的抗体进行westernblot检测，在相当于目的蛋白的mr处出现1条特异性的带（结果未显示）。
图3iptG诱导HisoCiLrp2融合蛋白表达的SDSpaGe分析 略
2.4大鼠抗oCiLrp2抗血清的制备与鉴定大鼠经4次免疫后，用westernblot检测抗血清的效价和特异性。结果显示，在相当于HisoCiLrp2融合蛋白的mr处出现1条特异性的带;而未免疫大鼠的血清则不与目的蛋白结合。抗血清的效价达1∶2000。进一步用本实验室制备的真核表达的oCiLrp2ig融合蛋白进行westernblot检测，抗血清也能与真核表达的oCiLrp2ig融合蛋白特异性结合，表明我们所制备的抗血清有较高的活性和特异性（图4）。
图4oCiLrp2抗血清的效价和westernblot的特异性分析 略
3讨论
oCiLrp2基因编码221个氨基酸，包括141个氨基酸的胞外区、21个氨基酸的跨膜区以及59个氨基酸的胞内区，其中胞外区含有由113个氨基酸残基构成的C型凝集素结构域。oCiLrp2可能在维持t细胞反应和记忆功能中起作用[3，4]。oCiLrp2与其配体nKRp1F的基因都在nKC区内，这种受体与其配体属于同一超家族，并且紧密连锁是极为罕见的，可能有利于受体和其相应配体的共遗传，并提示nKRp1和oCiL家族可能在免疫系统中具有重要的功能[2，5]。为了进一步研究oCiLrp2的功能，我们通过比较小鼠oCiL家族的3个成员（moCiL、moCiLrp1和moCiLrp2）的同源性，克隆了oCiLrp2基因胞外区同源性低的区域，构建了重组表达载体pet28aoCiLrp2，并在大肠杆菌中表达了融合蛋白Hisocilrp2。用表达的蛋白免疫SD大鼠获得了能与oCiLrp2特异性结合的抗血清，为进一步研究oCiLrp2的功能提供了工具。
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动物免疫血清的双重性篇10
关键词：高效免疫调节剂；人宫颈癌HeLa细胞；增殖
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，严重威胁广大妇女的生命和健康。宫颈癌的治疗是一个及其复杂的过程，如何纠正宫颈癌患者的整体免疫系统恢复到正常和协调上来，恢复机体的免疫监视，防止肿瘤的发生、发展和转移是宫颈癌治疗的关键之一。为此，我们采用多价疫苗组成的高效免疫调节剂（high-efficiencyimmunemodulators，HiS），制备成含药血清，对人宫颈癌HeLa细胞进行体外培养，观察HiS对宫颈癌细胞增殖的影响。
1材料
1.1动物及细胞株
雄性SD大鼠，体重250-280g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（动物中心许可证号：SCXK（湘）2011-0003，动物合格证号：43004700003244，级别：SpF级）。人宫颈癌HeLa细胞人肝癌细胞株Bel-7402，由中国医学科学院医药研究所购进，赣南医学院科研中心传代培养。
1.2药品和试剂
胎牛血清（Gibco，10099-141）、1640培养基（Gibco，12800-058）、0.25%胰酶（Gibco，25200-056）、mttFormazan（Sigma，m2003-1G）、piannexinⅤapoptosisdetectionkit（美国BD公司，3018688）
2.方法
2.1实验药物配置
HiS（中国发明专利申请号：200810107096.6）由江中肿瘤治疗研究组提供，将其配置成0.3g/mL，此为中剂量，再分别浓缩、稀释成0.9g/mL、0.1g/mL，此为高、低剂量。4℃冰箱保存，大鼠按0.1mL/100g腹股沟皮下注射给药，每日一次。
2.2含药血清制备
将20只清洁级SD大鼠随机分成4组：a、正常对照组；B、HiS低剂量组；C、HiS中剂量组；D、HiS高剂量组。a组每天腹股沟皮下注射生理盐水0.1mL/100g；B、C、D组分别给予低、中、高剂量HiS腹股沟皮下注射0.1mL/100g；连续治疗3天，于末次给药1h后，乙醚麻醉，腹主动脉取血，分离血清。将同组大鼠血清混匀，56℃，30min水浴灭活，0.22μm薄膜滤菌器过滤，密封冷藏备用。
2.3宫颈癌细胞HeLa的复苏与培养
HeLa细胞株复苏，Co2孵箱（5%Co2，37℃，95%湿度）传代培养，3代后用于以下实验。
2.4mtt法检测HiS含药血清对HeLa细胞增殖的影响
将细胞数量调整为5×10/mL接种至96孔培养板，每孔200uL，分4组（正常血清对照组，HiS含药血清低、中、高剂量组），每组8个复孔，培养24h后弃培养液，加含10%各组相应血清的1640培养液，继续培养24h、48h、72h后，每孔加入mtt20μL，37℃作用4h，弃培养液，加入二甲基亚砜100μL，37℃、l0min轻轻摇动培养板，上机检测，计算细胞增殖抑制率。
2.5annexinⅤ/pi双染色流式细胞术检测细胞凋亡
常规培养24h后弃培养液，加含10%相应血清的1640培养液继续培养48h，弃培养液，胰酶消化，收集细胞，离心，弃上清。取适量annexinⅤBindingBuffer重悬，计数，调细胞剂量为1×106个/mL，取40uL细胞（即4×104个）放入离心管中。每管加annexinⅤ、pi各2uL，混合后避光放置15min，上机检测。
3实验结果
3.1HiS含药血清对HeLa细胞增殖的影响
与对照组比较，各组HiS含药血清对HeLa细胞生长有一定的抑制作用（p
3.2annexinⅤ/pi双染色流式细胞术检测细胞凋亡
实验结果表明，随着HiS剂量的增加，细胞凋亡比例亦相应增加，分别为：（11.26±1.59）%、（17.67±1.72）%、（24.58±1.86）%，与正常血清对照组（6.92±1.07）%比较有显著性差异（p
4讨论
宫颈癌是指发生在宫颈阴道部或移行带的鳞状上皮细胞及颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤，其治疗是一个复杂的过程，目前临床常见的治疗手段是手术和放、化疗，其疗效值得肯定，但仍存在着一些弊端和毒副作用。
在动物实验中，我们观察了HiS对S180肉瘤小鼠肿瘤的影响，结果证实HiS可有效增强小鼠免疫功能[1]，同时促进肿瘤细胞凋亡[2]。本次实验我们制备HiS含药血清，对人宫颈癌HeLa细胞进行体外培养，观察HiS对宫颈癌细胞增殖的影响。结果表明HiS能够有效抑制HeLa细胞的增殖，促进细胞凋亡，这为进一步在临床应用HiS治疗宫颈癌提供了实验依据。
参考文献