凯氏定氮法的基本原理篇1
关键词：全自动定氮仪食品蛋白质检测分析
中图分类号：tS212.2文献标识码：a文章编号：1674-098X（2014）03（b）-0045-01
蛋白质是食品当中的主要营养成分之一，属于分子结构复杂的含氮有机化合物。主要的构成要素包括氨基酸以及肽键。在当前的技术条件支持下，食品当中蛋白质含量的测定方法有以下几种类型：其一为甲醛滴定法、其二为电流法、其三为紫外分光光度法、其四为双缩脲法。但以上检测方法在实际应用中均存在不同程度上的缺陷，或操作步骤过于繁琐，可行性不高，或相关设备仪器的投入资金过大，或操作反应时间较长，或数据缺乏精确性优势。故而需要对食品中的蛋白质分析方法进行合理的改进。文章即在对食品当中蛋白质成分进行检测的过程当中应用全自动凯氏定氮仪。现针对相关操作方法进行如下概括。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
在应用全自动凯氏定氮仪对食品中蛋白质含量进行测量与分析的过程当中，所涉及到的仪器设备包括以下几个方面：1）全自动凯氏定氮仪；2）样品消化器。同时，所涉及到的操作试剂包括以下几个方面：1）盐酸标准溶液。该试剂的制备方法为：0.10mmol/L剂量盐酸标准储备液，混合100.0ml剂量水分，定容形成1000.0ml剂量实验试剂；2）氢氧化钠溶液。该试剂的制备方法为：4000.0g剂量氢氧化钠，混合10.0L剂量水分，定容形成实验试剂；3）浓硫酸分析纯试剂；4）硼酸吸收溶液。该试剂的制备方法为：100.0g剂量硼酸，混合10.0L剂量水分，添加100.0ml剂量0.1%甲基红溶液以及70.0ml剂量0.1%溴甲酚绿溶液制备形成；5）铜催化剂。
1.2方法
在应用全自动凯氏定氮仪对食品中蛋白质成分进行分析的过程当中，具体的操作方法为：1）准备分析对象。本次使用全自动凯氏定氮仪对蛋白质进行分析中，所对应的分析对象包括：乳酸菌饮料、纯牛奶、鲜豆浆、全脂奶粉。2）具体分析。精密称取以上乳酸菌饮料、纯牛奶、鲜豆浆、全脂奶粉样品放入消化管当中。加入两片铜催化片。混合10.0ml剂量浓硫酸试剂，充分摇动均匀，确保样品处于完全湿润状态。消化管放置于消化器当中（消化器预先经过预热处理，预热温度达到420.0℃），反应时间持续0.5～1.0h，待观察反应仪器当中样品消化呈蓝绿色液体状态后取出冷却，冷却时间控制为15.0～20.0min。消化管放置入全自动凯氏定氮仪当中，关闭安全门，由仪器自动进行蒸馏、滴定工作，完成反应后对检测结果进行输出处理。
2结果
2.1仪器精密度测定结果
全自动凯氏定氮仪测定食品中蛋白质期间的仪器精密度测定结果如下表所示（见表1）。检测过程当中针对每一样品分别进行5次检验，平行检测结果平均值所对应相对标准片偏差均
2.2仪器准确度测定结果
全自动凯氏定氮仪测定食品中蛋白质期间的仪器准确度测定结果如下表所示（见表2）。检测过程当中，通过加标硫酸亚铁铵回收试验的方式证实硫酸亚铁铵所对应回收率取值均>99%标准，证实应用全自动凯氏定氮仪进行食品中蛋白质含量检测准确度高。
2.3对比测定结果
在应用全自动凯氏定氮仪对样品蛋白质进行测定期间，同时使用经典凯氏定氮法对样品进行检测，两种方法下的测定结果如下表所示（见表3）。证实应用全自动凯氏定氮仪检测与常规操作方法检测数据无明显差异，数据真实可靠。
3结语
研究显示，在对食品中蛋白质含量进行测定与分析的过程当中，全自动定凯氏氮仪是在化学分析基础之上的改进，测定原理与化学分析方法基本一致。相对于对玻璃仪器的整合，且兼顾对机电一体化控制技术的实现。通过对全自动凯氏定氮仪的应用，能够使整个测定流程更加的简单、快速、高效。同时，由于整个检测流程全自动，故而可以避免因人为误差而对数据精确性产生不良的影响。本次检测实验中证实：应用全自动凯氏定氮仪进行食品中蛋白质含量检测精确度高、准确度高、与常规操作方法检测数据无明显差异，数据真实可靠。
参考文献
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凯氏定氮法的基本原理篇2
关键词：凯氏定氮法；近红外透射光谱分析法；考马斯亮蓝染色；蛋白质；测定
中图分类号：S512．1；S331文献标志码：a文章编号：0439－8114（2011）12－2533-03
Comparisonof3Determiningmethodstowardsproteininwheat
JiYu－mei
（HebiVocational＆technicalCollege，Hebi458030，Henan，China）
abstract：thethreekindsofproteinmeasurements，includingmethodsofKjeldahl，nearinfraredtransmittancespectroscopy（nitS）andCoomassiebrilliantbluestaining，wereusedtodeterminethecontentofproteinin14kindsofwheatcomparatively．theresultsshowedthatallthemethodswerefeasible，andtherelationshipbetweentheaverageannualvaluesandtheresultsfromKjeldahlandnearinfraredspectroscopymethodinthe95％confidenceintervalwaslinear．nosignificantdifferenceamongtheresultsfromthethreemethodswasobserved．
Keywords：Kjeldahl；nitS；Coomassiebrilliantblue；protein；determination
小麦作为重要的农作物，其品质差异可显著影响其经济价值。蛋白质含量是衡量小麦加工品质的重要指标，通常采用具有较高准确度和精密度的用凯氏定氮法来测定［1－2］，但该法费时费工，其使用的试剂为强酸强碱，对环境污染较大［3－4］。近年来，近红外透射光谱技术已广泛应用于谷物子粒的品质分析和育种筛选［5－6］，例如：瑞典perten公司的Da7200近红外仪能在天然物理状态下，对谷物实现快速无损地定性定量分析［7］；考马斯亮蓝染色法是经典的蛋白质测定方法，通过测定595nm处光吸收的增加量来计算与染料结合的蛋白质量，具有反应快、灵敏度高的优点［8］。本试验通过分析比较凯氏定氮法、近红外透射光谱分析法和考马斯亮蓝染色法测定小麦中的蛋白质含量，确定各种方法的适用条件，为探索小麦育种早期材料的蛋白质测定提供有效分析方法。
1材料和方法
1．1材料
选择蛋白质含量差异分布较大的14个小麦品种，包括：轮选987、轮选326、轮选209、轮选979、新11试管株、新麦11、豫麦47、豫麦34、罗夫林、杨麦13、杨麦001－18、周麦16、百农3217和百农矮抗58。
本实验所用试剂均为分析纯试剂，实验用水为去离子水。
凯氏定氮法使用试剂包括：硫酸钾、硫酸铜、硫酸、20g／L硼酸溶液、400g／L氢氧化钠溶液，0．05mol／LHCl标准溶液，1g／L甲基红乙醇溶液，1g／L亚甲基蓝乙醇溶液和1g／L溴甲酚绿乙醇溶液。临用前配制2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液混合指示液。
考马斯亮蓝溶液：称取0．10g考马斯亮蓝G250，溶于50mL95％（V／V）乙醇后，加入100mL85％（V／V）磷酸，并用去离子水稀释至1000mL，滤纸过滤，待用。20g／L氯化钠溶液，5g／L氢氧化钠溶液，70％（V／V）乙醇溶液。
1．2方法
所有材料种植在本单位试验田，正常收获、测产、脱粒和保存，采用四分法选取各品种的实验材料。每个样品设平行样3个，结果取平均值计算。通过SpSSStatistics17．0软件进行相关性分析。
1．2．1凯氏定氮法测定蛋白质含量称取充分混匀的试样0．5g，精确至0．001g，移入干燥的250mL定氮瓶中，加入0．2g硫酸铜、6.0g硫酸钾及20mL硫酸，加热后，炭化全部内容物，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0．5～1h。取下放冷，小心加入20mL水。移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，定容至刻度，混匀备用，同时设置空白对照。再向水蒸气发生器内加水至2／3处，加入数粒玻璃珠、甲基红乙醇溶液数滴后，加热煮沸并保持沸腾。并在接收瓶内加入10．0mL硼酸溶液及1～2滴混合指示液，使冷凝管的下端插入液面下。分别吸取2．0mL试样处理液和10mL水注入反应室，随后塞紧棒状玻塞。缓慢滴加10．0mL氢氧化钠于反应室中，蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。冷却后，取下蒸馏液接收瓶。以盐酸标准溶液滴定至终点。同时作试剂空白。
按照下式计算蛋白质含量：
X＝×F×100
X――试样中蛋白质的含量（单位：g／100g）；
V1――试液消耗盐酸标准滴定液的体积（单位：mL）；
V2――试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积（单位：mL）；
V3――吸取消化液的体积（单位：mL）；
c――盐酸标准滴定溶液浓度（单位：mol／L）；
0．0140――1．0mL1．000mol／L盐酸标准溶液相当的氮的质量（单位：g）；
m――小麦粉的质量，（单位：g）；
F――小麦的蛋白质含量换算系数5．70
1．2．2Da7200近红外分析仪测定蛋白质含量利用瑞士perten公司生产的Da7200近红外仪测定，小麦近红外校准曲线由中国农业部谷物品质监督检验测试中心建模，结果由系统软件自动分析。
1．2．3考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量取0．3g小麦粉于研钵中，加少许二氧化硅研磨，取3mL水分两次洗研钵后转入10mL离心管中。超声振荡10min后，12000rpm离心10min，取上清液于另一试管中，沉淀重复用水超声提取，离心后，合并上清。取0．1mL提取液，加入0．9mL水和5mL考马斯亮蓝G250，染色3min后在595nm处测吸光值。另取取6支10mL干净的具塞试管，按表1制备梯度浓度的标准溶液，加考马斯亮蓝G250显色3min后，同条件测定其oD595nm，制备标准曲线。根据标准曲线计算小麦样品中的蛋白质含量。
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2结果与分析
表2为14个样品常年平均值（前5个为测试样品，没有常年平均值）和三种方法测定蛋白质含量结果，表3、表4为在95％置信区间时三种测定方法与常年平均值相关性的比较。
上述结果表明，三种蛋白质测定方法都能测定出小麦中的蛋白质含量。从表3可知，凯氏定氮法和近红外光谱分析法在95％置信区间显著性系数都小于0．05，表明两种方法与常年平均值之间存在线性关系。从表4可知，凯氏定氮法和近红外光谱分析法在t检验结果中，显著性概率大于0．05，这说明两种方法测定的蛋白质含量与常年平均值之间不存在显著性差异，可以真实的体现出被测样品的蛋白质水平。但另一方面，考马斯亮蓝染色法的测定值与常年平均值之间相关性不强，这可能是操作误差引起的，也可能是与该参考值的测定方法不同所导致，还可能是考马斯亮蓝染色法仅对微量蛋白测定罗为准确有关［9］。
3讨论
凯氏定氮法测试结果虽然准确可靠，但该法所需仪器多为特制玻璃仪器，蒸馏与吸收装置复杂，易破损，难操作和维护［10］，而且整个过程耗时约7～8h，操作繁琐，试剂消耗量大且排放物污染环境。特别是该方法测定后，样品无法回收，因此，该方法并不适合于分析较为珍贵的样品。采用近红外光谱分析法分析样品的耗时为10～20min，分析效率高，适用的样品范围广，样品勿需处理、30～40g种子即可用于分析，分析成本低，测试重现性好，属于无损检测，非常适合于育种过程中的早代种子鉴定和筛选大量中间材料［11－12］。考马斯亮蓝染色法快速、灵敏，但只对微量蛋白有较好的测定线性范围，因此在实验前应将样品的蛋白浓度稀释为0．1～1．0mg／mL，而且实验必须在1h内完成，否则测试结果不准确［13］。
总之，通过分析上述3种蛋白质的测定方法的原理和特点，并结合本实验的分析结果，对实际样品分析方法的选择和应用分析具有重要的指导意义。
参考文献：
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凯氏定氮法的基本原理篇3
1 材料与方法
1．1 材料
试验用球等鞭金藻、米氏凯伦藻、三角褐指藻、海水小球藻、绿色巴夫藻、衣藻藻种均由淮海工学院海洋学院藻类实验室保存。海水培养液采用f／2营养液，衣藻采用BG－11培养液；微藻培养所用海水采自连云港高公岛海域（盐度约31．00～32．00）涨潮时，醋酸纤维薄膜过滤，121℃、20min灭菌待用；淡水采用蒸馏水，灭菌要求同海水，试验所用的试剂均为分析纯。
1．2 方法
1．2．1 微藻培养方法
藻种在f／2培养液中进行培养，达到指数生长期便可作为藻种进行接种。微藻静止培养，海水藻采用f／2培养液，在无菌条件下将50mL处于对数期的藻种接种于装有200mL f／2培养液的500mL的锥形瓶中，光照度为3000lx，光照周期12h∶12h，不通气培养，每日定时摇动3次，23℃下培养［8］。衣藻采用BG－11培养液，其他条件同海水藻培养。
1．2．2 微藻生长测定
以正常培养液nano3的含量为100％，在其他成分含量不变的条件下改变nano3含量设置浓度。f／2培养液中的氮含量（m／V）设置为100％、80％、60％、40％及20％5个梯度组，BG－11培养液设置方法同f／2培养液。分别培养6种微藻，采用吸光度法定时对其生长进行测定。吸光度的测定：以接种时刻为初始时间，第4d开始测定，每日取出5mL藻液。以蒸馏水为空白对照，分别在不同波长下测定每种藻（球等鞭金藻450nm，米氏凯伦藻500nm，三角褐指藻260nm，海水小球藻680nm，绿色巴夫藻450nm，衣藻645nm）oD值。
1．2．3 微藻总脂含量测定
f／2培养液与BG－11培养液中的氮含量设置梯度同上，分别培养6种微藻。对数期末收集藻体，5000r／min，离心5min，冷冻干燥后－20℃保存，以索氏抽提法测定微藻总脂含量。
2 结果与分析
2．1 微藻生长对氮含量变化的响应
2．1．1 球等鞭金藻
氮含量为80％、60％及40％组，球等鞭金藻的生长量均超过100％组，其中80％试验组，微藻长势良好，到第10d，生长量超过100％组67％；60％组在第8～9d出现一个生长高峰，后急剧下降；40％试组第4～7d变化无几，第7d开始，生长量增加很快，培养至第9d达到最高；20％试验组生长情况低于100％组（图1）。图1 氮含量变化对球等鞭金藻生长的影响
2．1．2 米氏凯伦藻
米氏凯伦藻氮含量为80％组，生长量在第10d达到最高，超出其他试验组约60％。其中第5～6d出现第一个生长高峰，后急剧下降，原因有待探讨。之后在第9d出现第二个高峰，第10d达最高。生长过程波动性大，稳定性差；其他各试验组变化不大，生长量均未超过100％组（图2）。
2．1．3 三角褐指藻
三角褐指藻随培养时间的延长，各试验组生长平稳，波动性小；各组在第4～5d、第6～7d出现2个生长高峰；60％、80％组生长量自第7d始均超出100％试验组，但超出量不大（图3）。
2．1．4 海水小球藻
海水小球藻在不同氮含量条件下生长曲线见图4。各试验组生长平稳，波动性小，在第5～7d出现生长高峰。100％组生长最好，其次是60％组，100％组生长量从开始至第10d始终高于其他试验组（图4）。
2．1．5 绿色巴夫藻
绿色巴夫藻对不同氮含量响应明显，各试验组在第4～5d均出现生长高峰，100％组自第8d，进入又一个生长高峰期。40％组自第5d后开始下降，至第10d，只有100％组的16％，生长情况较差。其次为20％组，至第10d，为100％组的61％（图5）。2．1．6 衣藻在不同氮含量条件下，衣藻生长波动较大，尤其40％组变化很大，自第4～7d维持高速生长，到第8d生长量开始急剧下降，第9d生长量是最大值的65％，后趋于平稳。60％和80％组生长量均超过100％组，80％组生长最好（图6）。
2．2 微藻总脂含量对氮含量变化的响应
试验证实，供试的6种微藻总脂含量对氮含量的变化均有不同程度的响应，球等鞭金藻氮含量60％组总脂含量最高，达细胞干质量的67．78％；三角褐指藻氮含量80％组总脂含量最高，达细胞干质量的80．77％；米氏凯伦藻氮含量80％组总脂含量最高，达细胞干质量的51．85％；海水小球藻氮含量80％组总脂含量最高，达细胞干质量的65．38％；绿色巴夫藻氮含量60％组总脂含量最高，达细胞干质量的73．68％；衣藻氮含量80％组总脂含量最高，达细胞干质量的39．13％（图7）。
3 讨论
氮是植物必须营养元素之一，水中氮浓度状况直接影响着微藻的生长繁殖和胞内总脂的积累。微藻在一定的胁迫条件下可以促进脂类的合成和积累，但是这样的环境条往往也会抑制藻细胞的生长，导致生物量降低。在微藻脂类生产中，藻类生长和含脂高的最适条件经常是相冲突的。为缓解这一矛盾，本试验参考陈贞奋等［9］方法，改变氮含量，适当降低氮源，相对增加碳源，形成培养微藻提高总脂产量的模式。
凯氏定氮法的基本原理篇4
关键词环境监测；氨氮；分析方法
中图分类号X7文献标识码a文章编号1674-6708（2014）112-0126-02
通过调查研究我们可以得知，在地下水以及地表水中普遍存在氨氮，存在形式是离子铵和游离氨，并且在降雨过程中，地下水以及地表水中还会进入一些大气中的气态氨；如果水中氨氮在相关限定值以上，就会威胁到鱼类的生存和人们的身体健康，因此，在判断水体污染程度时，需要综合考虑氨氮的多少。目前在环境监测中，已经将氨氮作为了重要的一项指标。
1分光光度法
在氨氮测定中，经常用到的一种方法就是分光光度法，通常情况下，可以将分光光度法分为两类，这种划分依据是结合试剂的不同；首先是纳氏试剂分光光度法，主要是分析和测定那些清洁饮用水、天然水以及高纯净化废水出水等水体中的氨氮；在具体的实践过程中，我们可以得知，这种分光光度法比较的简单，操作起来比较的灵敏，但是在测定过程中，容易受到其他因素的干扰作用，如水中的金属离子、酮类和醛类以及浑浊程度、水体颜色等等，因此，在测定之前，需要预先处理水体。其次是苯酚――次氯酸盐比色法，相较于纳氏试剂分光光度法，这种测试方法有着完全一致的适用范围、干扰状况和消除方法，并且可以灵敏的进行操作，有着较高的稳定性。经过近些年来，分光光度法得到了大力发展，被普遍应用到氨氮测定中，有专家学者提出，首先利用H2S04来消煮土壤，然后利用naoH来中和ph值，促使其在相关标准范围以内，将溶液中的相关粒子给沉淀分离出来，因为溶液中的nH4会和二氯异尿氰酸钠发生反应，促使稳定绿色化合物生成。通过这样的操作，可以提高操作的准确性，并且有着较高的灵敏度，有较大优势。
2离子色谱法
有专家学者在测定大气中的氨时利用了离子色谱法，主要步骤是这样的，首先采用离子色谱仪来对硼溶液采集到的样品进行分析，然后对比国际的靛酚蓝比色法，结果发现，本方法有着较大的优势，不仅更加的准确，还比较的简洁，节省了大量的时间，有着较高的灵敏度和较大的线性范围。
3离子选择性电极法
通过大量的实践研究我们可以得知，这种方法具有一系列的优点，有着较宽的测定范围，并且在测定之前，也不需要预先处理水样等，有学者通过研究得知，在强碱性环境下，将掩蔽剂二钠盐加入到废水中，可以将很多种干扰离子给有效消除掉，完全能够满足环境分析的相关要求，并且有着较好的准确度和精密度，在测定效果方面可以与纳氏试剂分光光度法所媲美。另外，还有研究者采用离子选择性电极法对大气中氨的含量进行了科学测定，都取得了不错的效果。
4流动注射分析法
某外国专家利用流动注射分析法测定了电厂水nH3态氮，测定结果显示有线性相关存在于0.05-0.06mmol/L的nH4中。我国王伟利用流动分析技术来测定水中氨氮含量，并且对各种实验条件对结果的影响进行了研究，结果发现，基本上没有因素会干扰到这种方法的应用，可以有效的分析饮用水和污染水。徐华华等专家将气体扩散膜装置的方法加入到了流动注射体系中，在maoH溶液中加入水样中的nH4，促使其发生反应，转化为nH3，扩散之后，透过气体分离膜，以此来对水样中微量nH4进行分离，之后测定氨氮含量，经过实践得知，有着十分良好的效果。
5仪器分析法
随着科学技术的不断革新，如今出现了诸多的仪器来分析氨氮，首先是凯式定氮仪，这种仪器将蛋白质中氮含量恒定的原理给充分利用了起来，通过对样品中氮含量进行测定，对蛋白质丹炉进行计算，因为凯式定氮法就是计算和测量蛋白质含量，因此，这种仪器就被称之为凯式定氮仪。主要工作原理是这样的，不需要消解水样，将适量的氢氧化钠加入进去，对其碱性进行调节，转化水样中的铵盐，促使其形成氨，然后对其进行蒸馏，将氨析出来，吸收用硼酸溶液来完成，然后将电位滴定仪来进行。将氨用硼酸溶液吸收之后，会升高溶液的酸碱值，然后滴入一些硫酸溶液，促使其达到初始ph值，对滴定终点进行控制，当接近终点时，降低滴定速度，然后结合消耗盐酸的量，来对水样中氨氮的含量进行计算。我国某专家深入研究了凯式定氮仪测定氨氮的分析方法，并且对比了国际纳氏试剂法的差异，发现有着大致相同的效果。其次是色谱仪，这种方法也被人们称之为层析法，属于物理分离技术，具有较高的效能，结合其他的检测手段，共同形成了色谱分析法。通常在那些有着比较复杂成分样品的分离分析中应用这种方法。周伟峰利用外国某公司生产的离子色谱分析仪来对水样中的氨氮进行了分析，这种方法没有较多的干扰离子，并且经过微孔滤膜过滤过样品之后，就可以开始分析，如果较高浓度的有机物存在于其中，需要合理应用蒸馏方法，这样可以避免分离柱中的固定相遭到损害，或者分离柱的寿命得到降低。通过具体的实践，发现采用色谱仪进行检测，有着较高的精密度和准确度，并且操作起来难度不大，有着较高的灵敏度，可以对环境二次污染问题进行有效的减少，值得推广和应用。通过上文的叙述分析我们可以得知，随着时代的发展，人们生活水平越来越高，对环境质量提出了很高的要求。针对这种情况，就需要大力开展环境监测工作，其中氨氮分析法是非常重要的一个方面，需要引起人们足够的重视。目前的氨氮分析方法具有各自的适用范围和优缺点，在实际的应用中，需要合理选择。
参考文献
[1]杨玉珍，王婷，马文鹏.水环境中氨氮危害和分析方法及常用处理工艺[J].山西建筑，2010，2(20)：123-125.
凯氏定氮法的基本原理篇5
【关键词】BCa；蛋白质；神奇灵颗粒剂
【abstract】objectivetodeterminetotalproteininShenqilinggranules,andestablishthemethodologytoassayproteinlevelindrugs.methodsafterfilteringthesamples,takebovineserumalbuminascontrolarticle,useBCatodeterminetheabsorbance,andthendothetestsforprecision,reproducibility,averagerecovery.Resultstheaveragecontentofthesampleswas48.09%intheprecisionexperiment,RSD=0.11%(n=6).theaveragerecoverywas98.81%,RSD=0.51%.Conclusionthemethodinthispapercanbeusedfordeterminingproteinindrugs.
【Keywords】BCa;protein;Shenqilinggranules
二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCa）法是近年来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowry法相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+。BCa与Cu+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562nm处有高的光吸收值并且与蛋白浓度成正比，据此可测算蛋白质浓度。与Lowry法相比，BCa蛋白测定方法灵敏度高、操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCa法的显著优点是受杂质的影响较小[1]。
神奇灵颗粒是由几种中药的水提取物，辅以乳清蛋白、蜂蜜等按一定比例加工成型的一种保健食品，具有改善机体免疫功能、调节人体的适应状态功能，适用于机体免疫功能低下，运动状态下降以及体力虚弱等的人群，其中蛋白质是主要的功效成分。《中国药典》以及食品标准中传统的方法是用凯氏定氮法，虽然测定准确，但操作繁琐费时，需经过冗长的消化、蒸馏等处理过程，而且容易产生有毒的气体，不适宜快速、简便地测定一般食品药品中的蛋白含量。本文采用BCa法测定神奇灵颗粒剂中蛋白的含量，从而为药品检测建立一种快速、准确测定蛋白含量的方法。
1材料
1.1仪器eLX-800型酶标仪(美国宝特公司)；梅特勒aG285电子天平。
1.2试剂BCa蛋白测量试剂盒（北京天来生物医药科技有限公司）；神奇灵颗粒剂（广东省体育科学研究所提供，批号20061107）；其余试剂均为国产分析纯，文中所用水均为二蒸水。
2方法与结果
2.1标准曲线的绘制根据BCa蛋白测量试剂盒说明书操作配制“工作液”。按50体积BCa试剂a溶液加1体积BCa试剂B溶液配制，充分混匀备用。
取试剂盒中蛋白标准品-牛血清蛋白10μl，用0.9％生理盐水90μl稀释，使终浓度为0.5mg/ml，此即为标准品稀释液。精密吸取标准品稀释液按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔平板的标准品孔中，加0.9％naCl补足到20μl。向标准品孔中加入200μlBCa工作液，轻微振荡，混匀于37℃恒温水浴中温育30min。取出平板于酶标仪上测定吸光度，测定波长为570nm和595nm。见图1和图2。
以吸光度为纵坐标（y）、标准品质量为横坐标（x）,进行回归运算，求得曲线方程分别为y=1.71×10-2x+8.00×10-3，r=0.9838；y=4.82×10-2x+5.60×10-3，r=0.9996。可见当波长为595nm时，吸光度与标准品质量相关系数好，r为0.9996。故选用波长为595nm的方程。
2.2样品溶液的制备与测定取一定量的本品，在研钵中研磨粉碎，精密称取0.3998g，加水后超声20min使之溶解，过滤，定容至25ml，取1ml，按照标准曲线项下的方法，把样品加入到96孔平板中的样品孔中，测定吸光度，按照标准曲线计算蛋白质的含量。
2.3重现性实验分别精密称取6份样品，加入到96孔平板的样品孔中，依照样品的测定方法，得到吸光度，计算蛋白质的含量，计算平均值及RSD。见表1。
样品平均含量为48.09%，RSD为0.11%，n=6。说明该方法测定该样品误差范围较小，方法准确性高，方法切实可行。
2.4加样回收实验精密称取6份已知含量的样品，加入一定量的标准品试液，同供试品的方法定容于25ml水制备，测定吸光度，计算平均回收率，及RSD。见表2。
平均回收率为98.81%，RSD=0.51%，说明该法以及在样品处理过程中损失较少，操作可行性很大。
3讨论
蛋白含量测定方法有很多种，常见的有微量凯氏定氮法，利用被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨气，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸气蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量（mol）相当于被测样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。蛋白含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘以系数6.25，即可得到该样品的蛋白质含量；Lowry法，因为蛋白质含有两个以上的肽键（-Co-nH-），因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂（磷钼酸-磷钨酸试剂），蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比；紫外分光光度法，是由于蛋白质分子中芳香氨基酸的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有紫外吸收的性质，吸收高峰在280nm处。在此波长范围内，蛋白质溶液的吸光度与其含量成正比关系，因此可以定量测定；考马斯亮蓝染色法在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm波长处的光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。
参考文献
凯氏定氮法的基本原理篇6
【关键词】氨氮；测定方法；生活饮用水
【中图分类号】R991【文献标识码】a【文章编号】1004-7484（2014）06-3520-02
Determinationmethodsimprovementofammonianitrogeninwater
JiangnanLiuSijie*
JilinprovincialCenterforSanitationinspectionandtest，Changchun130062，China；
【abstract】objectivetoimprovethemethodforammonianitrogenindrinkingwater.methodsthesampleaddingphenate-citratesolutionisaddedtochlorinebuffersolutionimmediately.thesolutionisquantifiedin630nmwavelengthafterstaticlymixingin90min.Resultstherecoveryofammonianitrogenwas92.1%.therelativestandarddeviation（RSD）was4.3%.Conclusiontheimprovedmethodissimple，rapid，sensitiveandaccurate.therefore，itissuitableforanalysisofammonianitrogenindrinkingwater.
【Keywords】ammonianitrogen；determinationmethod；drinkingwater
氨氮是指水中以游离氨（nH3）和铵离子（nH4+）形式存在的氮。动物性有机物的含氮量一般较植物性有机物更高。同时，人畜粪便中含氮有机物很不稳定，容易分解成氨。因此，水中氨氮含量增高时指以氨或铵离子形式存在的化合氨。氨氮是水质监测中的重要指标，可以有效地体现水体受污染程度及其自净情况，所以开展水体中氨氮的含量测定对于水体生态环境质量和水体功能评价具有非常重要的现实意义〔1〕。测定生活饮用水中氨氮的方法有氨气敏电极法、纳氏试剂比色法、吹托-电导法、凯氏定氮法等等。生活饮用水标准检验方法（GB/t5750.5-2006）中氨氮检测采取纳氏试剂分光光度法、酚盐分光光度法和水杨酸盐分光光度法〔2〕。纳氏试剂分光光度法稳定性一般，并且含有碘化汞，易对环境和人体造成污染和危害；水杨酸盐分光光度法中水杨酸气味较重，对实验人员易造成危害；而酚盐分光光度法所用试剂相对简单安全，基体干扰少，常被用于水中氨氮的测定。本文拟对酚盐分光光度法进行一定的改进，使其分析过程和效果达到更优。
1材料与方法
1.1仪器2结果与讨论
徐陆妹〔3〕、陈惠琴〔4〕、杜晓旭〔5〕等已经对于氨氮进行过一定的分析，在此基础上本人结合大量实验对生活饮用水中的氨氮方法做出以下改进：
2.1含氯缓冲溶液配制的优化：原方法中为称取12g无水硫酸钠及0.8g碳酸氢钠，溶于100mL纯水中。加入34mL次氯酸钠溶液（30g/L），并加纯水至200mL，放置1h后即可使用。本试剂1mL用纯水稀释到50mL，加入1g碘化钾及3滴硫酸，以淀粉溶液作指示剂，用硫代硫酸钠标准溶液滴定生成的碘，应消耗5.6mL左右。如低于4.5mL应补加次氯酸钠溶液。实验发现由于次氯酸钠溶液本身极其不稳定，所以市售次氯酸钠溶液浓度往往低于其所标示浓度，致使其滴定生成的碘消耗硫代硫酸钠的量远远低于4.5mL。经过反复试验，补加次氯酸钠的量可高达31mL（见图1），所以再重新配置含氯缓冲溶液时，可以先一次性加入60mL次氯酸钠溶液，如果消耗硫代硫酸钠溶液量仍小于5.6mL，再逐步小剂量一点点补加次氯酸铵溶液。这样可以节省大量试验时间。
硫代硫酸钠消耗量（mL）
2.3实验地点选择的优化生活饮用水中氨氮含量的测定结果跟实验地点选择有很大的关系，比如实验地点应远离卫生间，不能跟测定总硬度的人员同时间同地点测定等，否则测定值将会高于实际值。
2.4方法精密度和准确度以某样品为代表，平行测定6次，测量结果的相对标准偏差为4.3%。测定相同样品基底的加标回收率为92.1%。精密度和准确度均符合方法性能指标的要求。
3结论
综上所述，采用优化后的酚盐分光光度法检测生活饮用水中氨氮可以简化操作过程，减少操作时间，增加实验准确度。并且该方法能够满足方法学的要求，具有良好的效果。
参考文献：
[1]王文萍，郭周芳，尚伟伟.水中氨氮的测定方法[J].水科学与工程技术，2012年第3期：26-28.
[2]中华人民共和国卫生部/中国国家标准化管理委员会.GB/t5750-2006，生活饮用水标准检验方法[S].北京：中国标准出版社，2007.
[3]徐陆妹，陈荣乐.生活饮用水中氨氮检测方法的研究[J].中国卫生检验杂志，2010，20（3）：673-674.
凯氏定氮法的基本原理篇7
关键词：三聚氰胺；理化性质；合成方法；生物学毒性；检测
文章编号：1005－6629(2009)01－0052－03中图分类号：o626文献标识码：e
2007年3月，美国食品药物管理局（FDa）在对连续死亡猫狗的调查中发现，导致宠物死亡的罪魁祸首，是作为宠物饲料的小麦蛋白粉和大米蛋白浓缩物里含有的一种名为三聚氰胺的化学物质。这种物质对人体和动物的危害尚未被完全认知，但已知的是，“如长期和反复接触作用，该物质可能对肾发生作用”[1]。
2008年中国婴幼儿奶粉污染事件再次将三聚氰胺的毒性引入公众视野。由于不法分子为增加原料奶或奶粉的蛋白含量而人为加入部分批次的三鹿牌婴幼儿奶粉中，结果导致甘肃等地发生多起婴幼儿泌尿系统结石病例。
本文就三聚氰胺的理化性质、合成工艺、生物学毒性及检测方法作一综述。
1三聚氰胺（melamine）的理化性质
三聚氰胺，又名蜜胺，氰脲酰胺，三聚氰酰胺，化学名称为2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪，分子式为C3H6n6或C3n3(nH2)3，相对分子质量为126.13，是一种白色单斜晶体，密度（20℃）1.573g/cm3，熔点354℃，沸点升华；低毒，不可燃[2]，微溶于水，无味，溶解度随温度升高而逐渐上升，溶液呈弱碱性。三聚氰胺在二乙醇胺、三乙醇胺、甘油、热乙二醇中具有一定溶解度，但不溶于醚、苯和四氯化碳，可与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等形成盐。在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而生成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性中
（pH值5.5~6.5）与羟甲基的衍生物
进行缩聚反应而生成树脂产物。其
化学结构式如右图所示。
三聚氰胺一般用作阻燃剂。由于三聚氰胺不可燃，在250~450℃时吸热发生分解反应，放出氨气，形成缩聚物，影响基体材料的熔化行为，并加速其炭化成焦，从而使三聚氰胺成为优良阻燃剂。它也可用作改性剂，改善酚醛树脂和脲醛树脂的性能。在应用于酚醛树脂改性时，三聚氰胺与甲醛、苯酚之间均可发生缩聚反应，因而能降低酚醛树脂的固化温度、缩短热压周期，减少酚醛树脂中游离酚、游离醛的含量，改善酚醛树脂的环境应用特性。在用于脲醛树脂改性时，三聚氰胺呈六元环状结构，其侧基活性基团可与脲醛树脂中羟甲基反应形成支链结构，促使脲醛树脂交联，形成三维网状结构，可提高脲醛树脂的热稳定性、耐水性和使用寿命。同时，三聚氰胺与甲醛的反应可降低脲醛树脂中游离甲醛的含量，制成的合成树脂是生产食品包装材料的原料，可用来生产盘子和碗等食品用餐具[3]。此外，三聚氰胺还可制成一系列衍生物，从而在塑料、涂料、粘合剂、消毒剂、化肥和杀虫剂等领域获得广泛应用。但三聚氰胺不是食品原料，也不是食品添加剂，包括我国在内的全球多数国家都禁止将其用于食品及饲料生产中。
2三聚氰胺的合成路线
根据原料路线不同，三聚氰胺生产方法有双氰胺法和尿素法。
2.1双氰胺法
德国化学家李比希最早于1834年使用双氰胺法合成了三聚氰胺。其合成路线为：由电石（CaC2）制备氰胺化钙（CaCn2），氰胺化钙水解后二聚生成双氰胺（dicyandiamide）[4]，再以双氰胺和氨为原料在甲醇溶剂中，200℃温度下进行反应生成三聚氰胺，经精制得到成品三聚氰胺。有关化学反应方程式为：
CaC2+n2CaCn2+C
2CaCn2+2H2oCa(HCn2)2+Ca(oH)2
Ca(HCn2)2+2H2o2nH2Cn+Ca(oH)2
2nH2Cn(nH2Cn)2
3(nH2Cn)22C3H6n6
1960年前，世界各国生产三聚氰胺均以双氰胺为原料。目前因为电石的高成本，双氰胺法已被淘汰。
2.2尿素法
尿素法按工艺可分为干法、湿法和半干法；根据熔融尿素热解的压力不同，尿素法生产三聚氰胺的工艺路线又可分为高压法（7~10mpa）、中压法（0.5~1mpa）和常压法（0.3mpa以下）3种。其中采用高压法工艺技术代表有美国aCC工艺、意大利etCe工艺和日本niSSan工艺；低压法工艺技术代表有荷兰的DSm工艺和奥地利oSw工艺；常压法有德国的BaSF工艺和我国自行开发的改良型低压法工艺[5]。这些工艺路线的化学反应原理为：
6Co(nH2)2C3n3(nH2)3+6nH3+3Co2
1962年美国建立了世界第一套以尿素为原料生产三聚氰胺的装置。由于以尿素为原料的生产路线的各项技术经济指标远远好于双氰胺为原料的工艺路线，从1971年起，所有三聚氰胺生产装置均采用了以尿素为原料的生产工艺。
3三聚氰胺的生物学毒性
林祥梅等[6]选用健康小鼠作了三聚氰胺急性毒性试验，结果表明，三聚氰胺的不致死的最大剂量为5000mg・kg-1，参考国家药物急性毒性分级标准，LD50>5000mg・kg-1，可以初步认定为微毒。该科研小组还以猫为试验动物进行三聚氰胺的亚慢性毒性试验，结果显示，实验组和对照组血常规检测正常，实验组的血清BUn和CRe升高，且在第23天，两项指标超过正常范围，而BUn和CRe两项指标的升高在临床上提示实验动物存在肾衰竭的可能，并且动物饲喂三聚氰胺后肾脏肾小管中出现了晶体，由此推断长期饲喂三聚氰胺可能引起肾衰竭。
虽然受试动物在肾脏发现了结晶，但现在仍不清楚在三聚氰胺摄入之后肾衰竭的发生和肾脏的结晶作用之间是否有直接的联系。Cornell大学的Smith拍摄了结晶的电子显微镜照片，并在实验室进行三聚氰胺和三聚氰酸的混合实验，重现这种结晶的形成。这是一个瞬间反应，当两种物质的澄清溶液混合后，呈烟雾状，静置片刻，晶体下沉。然而，Smith强调，三聚氰胺已知的毒性反应还不能解释所有病例的临床及病理症状，比如中毒后在肾脏中出现的肾小管急性损伤和特征性的细胞炎症等。中毒机理方面，ogasawaraH等（1995年）的研究报告认为，三聚氰胺诱发膀胱癌和泌尿道增生性疾病归因于结石的形成，而结石的成分主要为1∶1的三聚氰胺和尿酸。已证实三聚氰胺和三聚氰酸联合饲喂猫时发生急性肾衰，并发现晶体的存在，但是肾衰的发生与晶体形成之间是否有必然联系，中毒后形成结石和晶体的机制以及三聚氰胺及其同系物相互之间的毒性影响等问题尚待进一步研究[7]。
4三聚氰胺的检测与假蛋白原理
4.1凯氏定氮法测定蛋白质含量
通常采用“半微量凯氏定氮法”对婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质含量进行测定，其基本原理为：利用硫酸及催化剂与样品加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成Co2和H2o逸出，而蛋白质中的氮则转化成(nH4)2So4，在强碱条件下加热蒸馏，其中nH3被硼酸吸收为(nH4)2B4o7，然后用标准的硫酸溶液滴定，根据硫酸的消耗量和浓度计算出氮的含量，乘以蛋白质系数，即为蛋白质含量，其计算公式为[8]：
样品中蛋白质含量（g/100g）=
式中：V――滴定时消耗硫酸标准溶液的体积，mL；
V0――空白试验消耗硫酸标准溶液的体积,mL;
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c(H+)――硫酸标准溶液中H+的浓度，mol・L-1;
m――样品的质量，g；
0.014――氮原子的摩尔质量，kg・mol-1；
F――氮换算为蛋白质的系数。乳粉为6.38，纯谷物类（配方）食品为5.90，含乳婴幼儿谷物（配方）食品为6.25。
有关化学反应方程式为：
[-nHCH(R)Co-nHCH(R')Co-]+H2So4
(nH4)2So4+H2o+Co2+So2
(nH4)2So4+2naoH2nH3+na2So4+2H2o
2nH3+4H3Bo3(nH4)2B4o7+5H2o
(nH4)2B4o7+H2So4+5H2o(nH4)2So4+4H3Bo3
根据凯氏定氮法测定原理，在消化过程中除蛋白质中的氮转化成(nH4)2So4外，只要在奶粉或饲料中添加一些含氮量高的化学物质（如三聚氰胺），样品中非蛋白质中的氮也能转化成(nH4)2So4，计算氮的含量时，认为所有的氮都来源于蛋白质，从而在检测中造成蛋白质含量达标的假象。
一般奶粉中蛋白质含量为15~20%，蛋白质中含氮量平均为16%。以某合格牛奶蛋白质含量为2.8%计算，含氮量为0.45%，某合格奶粉蛋白质含量为18%计算，含氮量为2.88%。而三聚氰胺含氮量约66%，是牛奶的151.6倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，就可使得奶中蛋白质含量虚高约0.4%。
4.2三聚氰胺的检测方法
鉴于不法分子在食品或饲料中添加三聚氰胺对人或动物造成的危害，国家质检总局采取紧急措施，开展全国质量监督专项抽查，并将三聚氰胺列入出口法检范围。三聚氰胺检测方法通常有酶联免疫吸附法(eLiSa)、高效液相色谱法和气质联用(GC-mS)法等三种。
（1）酶联免疫吸附法原理：利用萃取液通过均质及震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定[9]。
（2）高效液相色谱法原理：试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定[10]。
（3）气质联用法原理：通过甲醇/水/三乙胺混合液提取动物食品中的三聚氰胺，氮气吹干、硅烷化衍生，再由气相色谱-质谱联用仪检测，苯代三聚氰胺内标法定量。该方法在饲料和动物食品中三聚氰胺的加标回收率在82.0%～105.6%之间，相对标准偏差(RSD)不大于5.8%，在0.1mg・L-1～50.0mg・L-1范围内呈现良好的线性关系，灵敏度高，最低检测限达到0.1μg・g-1；选择性好，能有效消除复杂基体干扰。可作为常见样品中三聚氰胺类有机物含量检测的确证方法[11]。
5结语
三聚氰胺虽是一种用途广泛的有机化工原料，但添加在食品及饲料中，会对人类健康造成严重威胁，也给养殖业带来严重的影响。我们应该大力推进食品及饲料科技进步，制定和完善食品及饲料行业政策法规，打击搀杂作假、违规添加禁物行为，作为化学工作者要大力普及相关知识，使我国食品及饲料工业得到健康发展。
参考文献：
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凯氏定氮法的基本原理篇8
摘要
采用亚临界丁烷对大豆粉脱油制得豆粕(DSF－B)，并与正己烷制备豆粕(DSF－H)比较，对分离蛋白得率及热变性、豆粕残余极性脂和在贮藏过程中蛋白的氧化进行分析。DSF－B的蛋白得率(32．1%)比DSF－H高(约6%)，蛋白热变性二者一致，且11S变性温度低于工业白豆片。残余极性脂分析，DSF－B比DSF－H总量低、磷脂含量高，脂肪酸组成有差异。模拟贮藏试验表明，DSF－B在贮藏中蛋白更易被氧化，这可能与极性脂的组成有关。亚临界萃取技术无高温处理、可选溶剂多样，可开发应用于大豆等植物蛋白制品。
关键词
亚临界丁烷；正己烷；豆粕；蛋白氧化
豆粕是大豆提取豆油后的副产品。它含有45%左右的蛋白质，氨基酸种类齐全，除蛋氨酸含量较低外，其余必需氨基酸含量均比较丰富，且含有大豆磷脂、大豆异黄酮等生物活性物质，营养价值高。作为优质植物蛋白原料，豆粕被广泛应用于畜禽饲料和商用脱脂大豆蛋白产品。但豆粕在生产及贮藏过程中，受加工方式、外部环境及水分、脂质、酶等因素影响，质量发生劣变，蛋白随之受到诱导变性，蛋白氧化是主要形式之一，严重降低其营养价值。亚临界萃取技术是近20年发展起来的一项新的萃取分离技术［1］。在萃取过程中，萃取剂温度高于其沸点、始终为液态，利用相似相溶原理，萃取生物原料中的脂类物质。它的主要优点是低温工艺，不会对热敏性成分造成损害，目前已在精油、色素、植物油、药材等几十种植物原料脂溶性和水溶性成分的分离提取中得到应用［2］。同时，有研究报道植物油料应用亚临界丙烷和丁烷萃取工艺，保证了粕中植物蛋白等成分不变性［3］。以大豆为代表的食用油生产中，国内外大多采用正己烷作为浸出溶剂，工艺中的热处理会破坏油料中的有用成分，并且正己烷对神经系统有一定的毒性，人们已提出质疑并期望找到可替代溶剂。对亚临界萃取技术的研究，目前主要集中在油脂、天然活性物质等有关成分的分离提取方面，对粕和蛋白的研究鲜见报道。本试验采用亚临界丁烷萃取技术制备豆粕，并与传统的正己烷制备豆粕进行比较，分析分离蛋白得率及热变性、豆粕残余极性脂和在贮藏过程中蛋白的氧化变性，以期为亚临界萃取技术中副产品的综合利用提供理论参考。
1材料与方法
1．1材料与设备大豆和白豆片，市售;亚临界丁烷:广州深岩燃气有限公司;其他试剂为分析纯或色谱纯。亚临界流体萃取装置:珠海共同机械有限公司;DYF－500摇摆式高压万能粉碎机:温岭市林大机械有限公司;KDn－102C定氮仪:上海纤检仪器有限公司;CR22G高速冷冻离心机:日本Hitachi公司;alpha－4冷冻干燥机:德国Christ公司;Sevene-asypH计:梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;UV2300紫外－可见分光光度计:上海天美科学仪器有限公司;nano示差扫描量热仪:美国ta公司;GC5890－mS5975气相色谱质谱联用仪:美国安捷伦公司。
1．2试验方法
1．2．1脱脂豆粕的制备亚临界丁烷萃取:大豆经清理除杂、粉碎，过30目筛，萃取压力0．4mpa、温度40℃、时间30min，重复3次。然后铺成薄层置于通风厨，并定期翻动，干燥24h粉粹过60目筛。正己烷浸提:大豆经清理除杂、粉碎，过60目筛，加入4倍体积正己烷浸提脱脂，温度40℃、时间30min，重复3次。然后铺成薄层置于通风厨，并定期翻动，干燥24h过60目筛。
1．2．2分离蛋白的制备脱脂豆粕经碱溶酸沉提取蛋白，采用Zheng等［4］的方法。蛋白得率=(提取的蛋白干重/脱脂豆粕干重)×100%。蛋白回收率=(提取的蛋白干重×蛋白含量)/(脱脂豆粕干重×豆粕蛋白含量)×100%。
1．2．3豆粕主要指标测定蛋白含量:参考GB/t5009．5—2003，微量凯氏定氮法［5］。蛋白含量=含氮量×6．25。极性脂含量:参考GB/t2677．6—1994［6］，用索氏抽提法测定极性脂含量，抽提溶剂为氯仿－甲醇(2∶1，V/V)。极性脂含量(干基)=(极性脂质量/试样干重)×100%。
1．2．4分离蛋白热变性测定采用meng等［7］的差示扫描热量法(DSC)。将约2mg样品和10μL、50mmol/L、pH7．0的磷酸缓冲液密封于铝盘中，以空白铝盘作对照，将样品以10℃/min加热速率由20℃加热至120℃。
1．2．5豆粕残余极性脂分析残余极性脂提取:称取豆粕3g，加入15mL氯仿－甲醇(2∶1，V/V)，室温搅拌萃取30min，10400r/min离心10min取上清液备用，测脂肪酸和磷脂组成。气相色谱－质谱联用(GC－mS):取适量上清液，氮吹除去溶剂，采用GB/t17376—2008［8］酯交换法进行甲酯化。气相色谱条件:色谱柱Hp－5mS(30m×0．25mm×0．5μm)，进样口温度250℃，载气流速(He)1．0mL/min，进样量2．0μL，分流比50∶1。采用程序升温，柱初温100℃，以10℃/min升温至280℃，保持10min。离子源ei70ev，扫描范围50～450amu。用面积归一化法确定各成分的相对含量。薄层层析(tLC):取上清液20μL点到硅胶H薄层板上，用氯仿/甲醇/冰醋酸/水(85∶15∶10∶3，V/V)混合液展开，取出，晾干，碘蒸气显色。
1．2．6模拟贮藏豆粕2种豆粕各取适量，均分为2份。各取1份100℃干热处理20min。将4份豆粕(干热处理与未处理各2份)铺成薄层置于35℃密闭水浴锅吸收水分2h，提高含水量。将上述豆粕放入密封瓶中，置于60℃烘箱存放，分别于第1、2、4、6天取样，4℃保存备用。进行一次重复试验。
1．2．7豆粕蛋白的氧化指标测定溶解度:精确称取0．02g样品于消化管，参考GB/t5009．5—2003微量凯氏定氮法［5］测定总氮含量;再精确称取0．35g样品于20mL去离子水中，室温下搅拌溶解1．5h，以10000r/min离心20min，取上清蛋白液5mL于消化管，沸水浴浓缩至稠状物，按微量凯氏定氮法［5］测定可溶性氮含量。蛋白含量=含氮量×6．25。溶解度=(上清液中的蛋白含量/样品蛋白含量)×100%羰基含量:取上述测溶解度的上清蛋白液，根据Huang等［9］的方法测定羰基含量。以上清液中每g蛋白所含μmol计。自由巯基含量:精确称取0．35g样品，加入20mL、0．1mol/L、pH8．0磷酸缓冲液，该磷酸缓冲液含有lmmol/LeDta(乙二胺四乙酸)和1%SDS(十二烷基硫酸钠)，室温下搅拌溶解1h。以10000r/min离心20min，取上清蛋白液。根据Huang等［9］的方法测定自由巯基。以每g豆粕蛋白所含μmol计。
1．3数据分析利用SpSS11．7和originpro8软件进行数据统计分析及作图，数据以均值±标准差(means±SD)表示，显著水平为p＜0．05。
2结果与讨论
2．1豆粕主要成分如表1所示，以市售wF作参照，DSF－B与DSF－H的蛋白含量和极性脂含量与之相近。DSF－B的极性脂含量比DSF－H略低，残余极性脂是影响豆粕品质和引起蛋白氧化变性的主要因素。
2．2蛋白质得率和回收率蛋白得率的高低与生产大豆蛋白企业的经济效益直接相关，其变化范围一般为20%～30%［10］，DSF－B蛋白得率为32．1%，比DSF－H高(约6%)。二者蛋白含量接近，故DSF－B的蛋白回收率相应比DSF－H高(图1)。
2．3分离蛋白的热变性图2显示3种蛋白的7S和11S组分都有明显的特征吸收峰，说明蛋白变性程度低。表2列出了11S组分变性的起始温度(tm)、峰值温度(td)及焓变(ΔH)，可知Spi－B与Spi－H的11S组分变性温度比wFSpi低。由于DSF－B与DSF－H采用自然干燥脱溶，全部处理温度最高仅为40℃，而市售wF目前常采用闪蒸脱溶和卧式脱溶，有不同时间的高温处理(闪蒸脱溶约2s，卧式脱溶10～15min)［11］，蛋白结构更加稳定，使其热变性需要更高温度，所以可能导致Spi－B与Spi－H的11S组分变性温度比wFSpi低，具有较差的热稳定性。
2．4豆粕残余极性脂分析棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸是大豆中含量最多的5种脂肪酸，占出峰物质的99%以上［12］。从表3可见，脂肪酸含量高低顺序均依次为亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸、亚麻酸，但其相对含量有一定的差异。DSF－B的亚油酸和亚麻酸相对含量比DSF－H略高，而油酸含量明显低于DSF－H。大豆中丰富的脂肪氧合酶能催化含1，4－顺，顺－戊二烯结构的多不饱和脂肪酸(亚油酸、亚麻酸)，发生脂质过氧化反应，产生的自由基、脂质氢过氧化物及活性醛类会使蛋白发生共价修饰，造成蛋白氧化［13］。残余极性脂含量DSF－B为3．90%，DSF－H为4．38%(见表1)。tLC分析表明(见图4)，2种豆粕含有磷脂酰乙醇胺(pe)、卵磷脂(pC)，磷酯酰肌醇(pi)等磷脂，磷脂的含量和组成不同。图4可知，L是商业卵磷脂，从上至下3个主要组分依次为pe、pC、pi［14］，可以看出DSF－B中磷脂含量较高，主要表现在pC较多。这是因为，丁烷比正己烷对磷脂的浸出量少，DSF－B残余的磷脂相应多。
2．5贮藏过程中蛋白的氧化评价豆粕在贮藏过程中，水分、残余脂质、脂肪氧合酶等将导致其质量劣变，蛋白氧化随之发生。脂肪氧合酶在60℃左右有一个激活态，酶被激发出更高的活力［15］。试验中为了较快分析豆粕在贮藏中蛋白的变化，贮藏前使豆粕吸收水分成为高水分豆粕，温度采用60℃，以构建一个高温高湿环境模拟加速氧化。同时对经过100℃干热处理20min的豆粕进行试验。贮藏1、2、4、6d后，分别对蛋白溶解度、羰基和自由巯基进行测定。
2．5．1溶解度变化溶解度在一定程度上反映了蛋白的变性程度。从图5可知:豆粕经100℃、20min干热处理，溶解度保持不变;随着贮藏时间的延长，溶解度均显著下降;经干热处理后，溶解度下降明显比未干热的缓和，但贮藏到第6天时，同样降至很低。pro－B与DHpro－B分别比pro－H与DHpro－H，溶解度下降相对较快。说明经适度干热灭酶处理不影响蛋白的溶解度，且能减缓溶解度降低，干热与否pro－B均比pro－H更易氧化变性。
2．5．2羰基含量蛋白质氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累，蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的敏感指标［16］。图6显示，在贮藏过程中，羰基含量逐渐增加，这是大豆脂肪氧合酶酶促氧化积累的结果。羰基含量:DHpro－B低于pro－B，DHpro－H低于pro－H;DHpro－B高于DHpro－H，pro－B高于pro－H。另外，在第6天时，由于pro－B和pro－H的溶解度过低，无法测出羰基含量。说明经适度干热灭酶处理可以减少贮藏中蛋白的氧化损伤，干热与否pro－B均比pro－H更易氧化。
2．5．3自由巯基含量半胱氨酸残基可能是最敏感的氨基酸残基，将巯基转化为其他含硫氧化物是蛋白氧化的早期现象之一［17］。如图7所示，在贮藏前2天，pro－B与DHpro－B自由巯基含量逐渐减少，而pro－H与DHpro－H是先增加后减少。第2天之后，pro－B与pro－H的自由巯基含量持续下降，而DHpro－B与DHpro－H则基本保持不变。自由巯基含量降低，意味着蛋白质发生了变性，可能通过形成分子间二硫键聚集发生了氧化。自由巯基含量升高，是蛋白分子展开、内部基团暴露的结果。说明干热灭酶处理能减弱自由巯基的氧化，干热与否pro－B在贮藏初期表现出比pro－H较易氧化。残余极性脂作为诱导豆粕蛋白氧化变性的主要因素，尽管DSF－B含量低于DSF－H，其油酸相对含量明显低于豆粕－H，但贮藏过程中pro－B更易被氧化。亚油酸和亚麻酸可以发生脂质过氧化反应，而油酸不能，DSF－B的亚油酸和亚麻酸相对含量比DSF－H略高，pro－B更易被氧化可能与此有关。
3结论
凯氏定氮法的基本原理篇9
【关键词】超声辅助碱法；超声辅助酶碱法；燕麦麸；蛋白及其产物
【中图分类号】R197【文献标识码】a
本文旨在比较分析超声辅助碱法与超声辅助酶碱法提取燕麦麸蛋白及其产物，以期为提取燕麦麸蛋白及其产物提高参考，具体报告如下：
1材料与方法
1.1材料和试剂燕麦麸皮，糖化酶，葡聚糖凝胶（G-100），考马斯亮蓝（G-250），牛血清白蛋白，分析纯。
1.2设备水浴恒温振荡器，离心机，超声浸取装置，冷冻干燥机，层析柱，恒流泵，氨基酸分析仪。
1.3方法
1.3.1基本化学成分的分析测定蛋白质的含量：以考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白的含量：以凯氏定氮法测定原料中粗蛋白的含量；以索氏抽提法测定粗脂肪的含量：以酸水解法测定淀粉的含量；以105℃恒重法测定水分的含量：以550℃灼烧法测定灰分的含量[1]。
1.3.2超声辅助碱法提取的试验设计和工艺流程试验设计：以燕麦蛋白的提取率作为指标，确定超声辅助碱法提取燕麦麸蛋白及其产物的最佳工艺参数。工艺流程：脱脂、加水、pH值调整、恒温水浴、超声处理、离心处理、取上清液、测定蛋白含量、计算提取率。
1.3.3超声辅助酶碱法提取的试验设计和工艺流程试验设计：以燕麦蛋白的提取率作为指标，确定超声辅助碱法提取燕麦麸蛋白及其产物的最佳工艺参数。工艺流程：脱脂、加水、pH值调整、加糖化酶、恒温水浴、超声处理、再次浸提、离心处理、取上清液、测定蛋白含量、计算提取率。
1.3.4燕麦蛋白的提取率计算蛋白的提取率=提取液内蛋白质量（g）/燕麦麸内蛋白质量（g）×100。
1.3.5组成氨基酸和营养价值评定组成氨基酸：取2种方法所提取的燕麦麸蛋白放入水解管内，加入HCl溶液（6mol/L），真空封口，于110℃下进行24小时水解，将封管切开，在冷却后进行定容和过滤及蒸干操作，再加入HCl溶液（0.02mol/L），于空气中进行30分钟的放置，使用氨基酸分析仪对氨基酸进行分析。营养价值评定：根据1973年Fao/wHo制定的氮氨基酸的评分标准模式评定，氨基酸含量、eaai按照公式进行计算[2]。
凯氏定氮法的基本原理篇10
关键词 三鹿 三聚氰胺 假蛋白 食品安全
中图分类号：R155文献标识码：a
2008年9月8日，甘肃《兰州晨报》等媒体首先爆料毒奶粉事件，但没有公开奶粉品牌，三鹿集团以事不关己的态度稳坐如山。11日，三鹿集团被新华网曝光，是毒奶粉的始作俑者，社会哗然。12日14时，三鹿集团将毒奶粉的责任推到奶农身上，称不法奶农向鲜牛奶中掺入三聚氰胺以获取更多的利润。16日，国家质检总局公布：三鹿、伊利、蒙牛、雅士利等22家奶粉中检出三聚氰胺超标，其中三鹿奶粉含量最高。
三聚氰胺含氮量大约为66%，被非法添加在饲料、牛奶、奶粉中以提高蛋白质的表观测定值。美国在2007年有4000只宠物发生中毒事件，我国有5万名婴幼儿患尿路结石，研究发现，三聚氰胺是这些事件的罪魁祸首，对社会公共安全造成了极大的危害。
1三聚氰胺简介
三聚氰胺俗称蜜胺、蛋白精，也可以叫作三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，这一有机化合物具有三嗪类含氮杂环。常温下性质稳定，为单斜晶体，呈白色，无异味。易溶于热水，微溶于冷水，显弱碱性，遇酸形成三聚氰胺盐，对身体有害。
生产三聚氰胺树脂是三聚氰胺主要用途，所生产出的树脂耐水性、耐热性、耐电弧性、阻燃性很好，在装饰板、涂料、粘合剂、造纸、纺织、皮革、氨基塑料、电器、医药等行业有广泛的应用。三聚氰胺不能作为食品原料和食品添加剂添加到食品中去，若人为向食品中添加三聚氰胺的话，要负法律责任。查资料可知，正常情况下，食品中三聚氰胺含量很低，主要是通过环境、食品包装材料等媒介进入。为保护人体健康，保证食品安全，我国制定了三聚氰胺在食品中的限量值，婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，如果高于此数值不得销售。
2假蛋白原理
不法商人为了将食品检测中的蛋白质含量指标增高，常利用测定食品和饲料中蛋白质含量方法上的缺陷，将三聚氰胺作为食品添加剂使用，这也是三聚氰胺常被人称为“蛋白精”的主要原因。
蛋白质主要组成成分是氨基酸，氨基酸的分子式含氮量最多才达30%，而三聚氰胺分子式里的氮含量大约为66%。在蛋白质的测定中，一般会选用“凯氏定氮法”测定氮含量，利用氮与蛋白质的关系将蛋白质的含量间接推算出来，由于三聚氰胺的高含氮量，可以使得食品中蛋白质测定含量值偏高，以通过食品质量检测。花费真实蛋白原料的1/5，即可将食品和饲料中“蛋白质”含量增加1%，且三聚氰胺溶于水后无色无味，掺杂后也不易被发现。
3三聚氰胺的危害
早有研究表明，三聚氰胺对动物和人体的生殖、泌尿系统有危害。1945年，《药理学与实验治疗学》期刊上发表了美国纽约里德勒实验室两位毒理学专家的论文，他们以大鼠、兔和狗为实验材料，长期喂养大剂量三聚氰胺，三种动物的生殖、泌尿系统均受到不同程度的损坏，膀胱、肾部出现结石，发展成膀胱癌的几率很大。
日本学者在1992年也做了类似的科学试验，以大鼠为实验材料，连续36周饲喂1%、3%两种不同浓度的三聚氰胺，膀胱癌的发生率差距较大，分别为5%和79%，结石发生率较高，且差距不大，分别为70%和100%。1994年《国际化学品安全手册》表明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。
三聚氰胺毒性较低，但呈弱碱性，易与酸性物质发生反应，如果该酸性物质是三聚氰酸，将产生不溶于水的氰尿酸三聚氰胺，形成肾结石。三聚氰胺被人体食用后，经过消化系统，尤其是在胃酸的作用下，会有一部分转化为三聚氰酸，与没有转化的三聚氰胺形成结晶，成为肾结石。
三聚氰胺摄入时间过长，在人体内积累，转化和发生反应，损害生殖、泌尿系统，在膀胱、肾部易形成结石，诱发膀胱癌。摄入三聚氰胺量越大，患结石和膀胱癌的可能性就越大。大人很少吃奶粉，且代谢能力强，承受能力也强，受到三聚氰胺的影响较小，患病的几率也较小。婴幼儿很多以奶粉为食，且代谢能力弱，承受力差，长期食用会严重危害身体健康，甚至对生命造成威胁。
婴幼儿很多以乳与乳制品为食，检测乳与乳制品的品质，蛋白质含量是重要的评价指标之一，由于三聚氰胺的成本低，含氮量高，溶于水后无色无味，在乳与乳制品中掺杂三聚氰胺，不仅对蛋白质含量检测结果的提高有作用，且不易被发现，因此不法商人非法添加三聚氰胺提高蛋白质的检测值，以致接连出现多起奶粉质量安全事件。2009年有学者研究分析了掺假三鹿乳粉中三聚氰胺及其类似物，发现三聚氰胺含量低于检测限0．05mk/kg的样品只占21%，剩余样品中三聚氰胺检测值远远超过了wHo规定的限量值，比其他品牌婴幼儿乳粉中的三聚氰胺含量高出许多，而其他部分品牌的婴幼儿乳粉也受到不同程度污染。针对婴幼儿在三聚氰胺吸收率方面的研究发现对三聚氰胺吸收最好的是3个月的婴儿，年龄越大，其吸收率越低。
4违禁添加三聚氰胺的原因
蛋白质含量是食品工业中检测食品安全的重要测量指标，直接测量成本高，技术复杂，且大范围推广较难。一般会选用“凯氏定氮法”测定氮含量，利用氮与蛋白质的正比关系间接推算蛋白质的含量。即食品中所测得的全氮含量越高，则认定蛋白质含量就越高。
这套检测方法并不能真实的反应蛋白质含量水平，给食品检测达标情况制造假象。三聚氰胺分子式中含氮量高达66.7%，而牛乳氮含量是15.7%，大豆蛋白含16%的氮。这样，三聚氰胺就就成了最佳的选择。食品中添加三聚氰胺，蛋白质含量的测出值就增加了，而三聚氰胺没有任何营养价值，有低毒，更无法替代蛋白质。
三聚氰胺被添加到奶制品中的途径有以下两种。一种是先将原奶兑水，再掺入三聚氰胺，使奶制品的氮含量提高，达到国家要求标准，轻松骗过检测；另一种是在生产过程中添加三聚氰胺，提高产品的氮含量，使其达标。除此之外，许多厂商还加入低价的淀粉等，平衡氮的含量。
5奶粉中鉴别三聚氰胺的方法
家庭实验条件较简陋，三聚氰胺易溶于热水，微溶于冷水，溶解度随温度升高而增大，在家中，可以利用降温结晶化学原理，快速检测可能含三聚氰胺的奶粉。具体方法如下：取干净玻璃杯，将待测奶粉放入其中，向杯中加入少量沸水（比平常冲奶粉的水略少），搅拌均匀。奶粉完全溶解后放入冰箱，静置降温。一小时后，将奶粉从冰箱取出，仔细观察，若杯底有少量沉淀，则证明奶粉中含三聚氰胺。然后拿一个空杯，将黑布固定在有奶粉的杯子杯口上，将奶粉过滤到空杯里，若黑布上有少量白色块状固体，将白色固体导入冷水中，沉入水体，则说明该固体很可能就是三聚氰胺。在家中可以用这种方法检测奶粉中是否含有三聚氰胺。
这个实验比较容易，不需要专业仪器，且对理论知识和实验操作技能的熟练度要求不高，只需要仔细观察，具有很强的实用性。这种方法的不足之处在于还不能排除其他物质造成沉淀的可能性，不能有量的证明沉淀就是三聚氰胺。但它的应用仍可以尽力地减少饮用添加三聚氰胺的奶制品，给人们的生活多一份安全保障。
6从三聚氰胺事件看我国食品安全问题现状
经历了“三鹿奶粉事件”，食品安全成为了消费者心中的一大疑虑，谈“食”色变。虽然三鹿集团宣告破产，三聚氰胺事件依然历历在目，陕西金桥乳业有限公司三聚氰胺超标，上海熊猫乳品有限公司的四批次奶粉和炼乳中三聚氰胺含量超标，青海省一乳制品厂三聚氰胺超标五百倍等。我国的食品安全状况的改善需要通过对与民众生活息息相关的乳制品产业进行重新审视，加强企业诚实诚信理念，加强国家法律监管力度，对食品安全的检测更要认认真真，不得马虎，更不得投机取巧。
参考文献
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