微生物的多样性篇1
[关键词]马铃薯连作栽培土壤微生物生物多样性影响
[中图分类号]S435.32[文献标识码]a[文章编号]1003-1650（2017）05-0040-01
近年来，甘肃省临夏州临夏县把推广脱毒马铃薯新品种作为培育和发展壮大洋芋产业，促进农民增收的一项主要措施，加强领导，加大投入，狠抓培训和技术指导，种植规模不断扩大，发展进程不断加快，临夏县农技中心针对全县洋芋品种出现的种性退化、块茎畸形现象以及马铃薯连续种植几年后常出现植株矮化、丛生、长势弱，叶片皱缩、变小、变脆或出现环斑条斑，叶子易脱落和全株枯死等实际问题，认真开展了调查。通过调查分析，找出了马铃薯种性退化的主要原因是受多种传染性病菌、病毒侵害所致。尽管更新品种对临夏县马铃薯产生积极促进作用，但是马铃薯连作问题如果得不到解决，将会严重影响到地区马铃薯种植产业的健康发展。
1实验材料和方法
本次实验选择在麻尼寺乡进行，年降水为400mm左右，年平均气温在7度左右，供试土壤为黑垆土，其中连作0年、2年、5年和10年的土壤理化指标如表1所示。
1.2试验设计
本次实验从2014年开始，在不同连作时间的地块中种植马铃薯，连作0年为对照组，连作2年、5年和10年为试验组，马铃薯品种为陇薯3号，小区面积为9*25m，重复三次，马铃薯株行距为35*40cm。从实验开始，除了种植地连作年限不同之外，其他栽培条件均保持一致。在2016年马铃薯盛花期，取每个处理区域是马铃薯根部底层5cm以下的土壤，样品分成两份，一份进行土壤微生物分析，一份进行土壤am真菌鉴定。其中土壤微生物分析采用平板计数法进行分析，细菌、放线菌和真菌培养分别采用牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和pDa培养基培养[1]。土壤微生物多样性采用Biologeco板测定，严格按照操作要求进行处理[2]。土壤am真菌鉴定采用某种属孢子数和该地区土壤am真菌孢子总数的比值进行计算。使用eXCel2007软件进行数据收集并制作表格，使用DpS7.05进行方差分析，用Canoco4.5进行多元化分析。
2Y果
2.1马铃薯连作栽培对土壤微生物群落结构的影响
通过对表2数据进行分析发现，连作0年种植马铃薯土壤明显具有较高的总菌落数，而连作10之后，土壤中的微生物呈现下降趋势，各个处理区域的细菌数量表现为随着连作年限的增加，微生物数量总体呈现下降趋势。连作5年和10年之后，相对于连作0年的，土壤中微生物数量呈现明显下降趋势，但是之间的差异性不明显。由此可以看出去，随着连作时间的增长，连作会显著改变马铃薯根部土壤微生物的多样性，其中真菌、放线菌的群落结构数量变化最大。马铃薯长期连作容易形成单一的土壤环境，这种土壤环境有利于真菌和放线菌的生长，生长过程中产生大量化学物质，抑制细菌的繁殖，从而导致细菌数量下降。详细情况见表2所示。
2.2马铃薯连作栽培条件下am真菌多样性变化
通过对表3数据分析发现，am真菌相对多度和出现频率随着连作年限的增加而呈现先上升后下降的趋势，连作5年后达到最高值，其中球囊霉属相对多度表现为连作5年>连作2年>连作10年>连作0年。其他菌属也表现为相同的规律。各种优势菌种也随着连作年限的增加而出现变化。由此可以看出，连作会显著影响am真菌多样性变化，随着年限的增加真菌多样行减弱。真菌优势种群的变化直接影响到土壤微生物群落结构的变化。详细情况如表3所示。
3结论
微生物在很大程度上会影响到土壤和植物的作用过程，对土壤结构的形成发育、有机物质的循环利用和土壤肥力会产生深远的影响。本次研究发现，随着连作时间的增长，马铃薯根部土壤的环境会发生变化，微生物的结构群路组成失调，土壤中细菌受到抑制，真菌数量增加，在这样环境下土壤肥力会持续下降。微生物群落是土壤生态系统的重要组成部分，结构复杂。土壤环境条件改变，导致土壤养分、微生物结构和功能多样性变化在很大程度上影响了am真菌的多样性。
总之，持续连作影响到土壤根部真菌、细菌和放线菌数量，真菌群落中am真菌种群的多样性受连作影响持续下降，优势种群发生改变，造成土壤微生物群落结构和功能出现变化，结构失调。
参考文献
微生物的多样性篇2
关键词：发酵食品；微生物多样性；分子生物科学技术
食品若要发酵就必须要有一个特定的微生物环境，发酵过程中微生物的种类会对发酵食品的口感产生非常大的影响，而加强对发酵食品中微生物多样性的研究可以十分有效的为相关的研究提供更多的理论依据，在研究的过程中，最为基本的两个要素就是物种的丰度和物种的均匀程度。而微生物在生长的过程中也有其自身独到的特点。因为微生物自身的体积小，结构也并不是十分的复杂，所以我国在微生物多样性的研究方面还处于比较缓慢的状态，在很长一段时间里都采用非常陈旧的方法去研究微生物的多样性，而我国有关的技术在不断的发展，所以在微生物研究方面也有了一些新的迹象。
1微生物的培养分离方法
在微生物多样性研究的过程中，培养技术起到了非常关键的作用，直到现在，这种技术都广泛的使用在研究当中，微生物培养主要是按照目标的要求给微生物选择比较适宜的培养基，然后再按照不同的微生物特性来对其进行更加全面和准确的鉴别，但是这种方法在使用的范围上还是有着一定的限制，一般情况下它比较适合使用在小范围的微生物多样性鉴别中。
微生物培养法在实际的应用中需要首先通过人工的方式对培养基进行适当的处理，虽然不同的微生物在生长环境和自身的特性上都存在着较为明显的差异，所以研究的结果会和实验室当中不受任何外界因素影响条件下得出的结果存在着一定的差异，此外，自然界当中，很多种微生物都是没有办法通过人工培养的方式得到的，所以在研究的过程中也会造成生物多样性的流失，这样就使得实验室中所得出的结论不是非常的准确，存在着一定的片面性。
2化学方法
磷脂脂肪酸是生物细胞膜中一个非常重要的成分，而不同的微生物能够通过生活反应形成不同种类的磷脂脂肪酸，这样就可以对不同的微生物进行鉴别和检验，但是在这一过程中尤其需要注意的一点就是不同类型的磷脂脂肪酸或者是不同生物体上的磷脂脂肪酸有可能会出现完全相同的研究和实验结果，所以还需要采用其他的辅助方式对其进行进一步的检验。
3生理方法的鉴定系统
BioLoG微孔平板阀是国外的研究机构在1991年建立起来的一套专门研究土壤微生物多样性的一种方法，这种方法通常就是按照生物对单一碳源不同的反应而实现对不同种类的微生物进行区分的目的，该鉴定系统当中主要有95反应孔的微孔平板和鉴定的软件组成的，反应孔当中还设置了碳源底物和对应的指示剂，而当接种样品溶液的时候，其中的一些营养物质就会被吸收和利用，从而使得孔中的反应物呈现出不同的颜色和状态，因为不同的微生物对95糖的反应和接受程度具备一定的差异按照反应孔当中颜色的转变和吸光度的变化就形成了不同的形式，这样也就使得不同微生物逐渐被判断出来。经过该系统软件的处理和判断，和标准菌种的数据进行详细的对比之后，这种菌的种类也就被准确的判断了出来，这种方法实际上已经进入到了微生物食品微生物多样性的研究当中，但是这种方法在应用的过程中也存在着一定的局限，所以也无法很好的独立使用，其主要的不足有：由于真菌、放线菌的代谢反应不能分解氯化物.此方法只能检测微生物群落细菌中快速生长的那部分微生物信息主要为革兰氏阴性菌：另外由于培养环境的改变可能引起微生物对碳源底物实际利用能力的改变而造成一定的误差目前所具有的标准菌种的数据库还不完善。有些种类还不能被准确进行鉴定即使存在以上不足。但由于其不需经过培养分离繁琐的步骤.仍被用于微生物多样性的研究。
4分子生物学方法
分子生物学技术在微生物多样性研究上的应用主要可以归纳总结为2个方面：一方面是在pCR技术应用前提下所衍生出的一些研究方法.这些方法可以把少部分的Dna进行大量的增加.通过对基因排列顺序的对比和分析来对微生物的多样性进行研究另一方面是在应用分子杂交技术的前提下使用分子标记的方法。
4.1建立在pCR技术的方法
pCR是1985年由mULUS发明的一种聚合酶链式反应技术.主要特点是短时间内在实验室条件下人为控制并特异扩增目的基因或Dn段，以便于对已知Dn断进行分析。pCR技术的发明和不断完善.不仅为分子生物学的发展作出了巨大的贡献.而且在微生物生态学的发展和分析技术的建立提供了有利工具。
4.2基于分子杂交技术的分子标记法
分子杂交技术是基于核酸分子碱基互补配对的原理.用特异性探针与待测样品的Dna或etna形成杂交分子的过程用于微生物多样性研究常用的探针主要有Rna基因探针、抗性探针和编码代谢酶基因探针等。特别是近年来发展起来的荧光原位杂交技术是研究环境中不可培养微生物群落多样性最为常用和有效的手段荧光原位杂交技术是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的Dna序列，以荧光标记的特异寡聚核酸片段作为探针与环境基因组中Dna分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度。操作步骤是将微生物样品固定在载玻片上，用荧光染料标记的基因探针杂交，将未杂交的荧光探针洗去后用普通荧光显微镜进行观察和摄像采用这一技术可以同时对不同类群的细菌在细胞水平上进行原位的定性定量分析和空间位置标示。该方法的特点是可以进行样品的原位杂交，且特意性和灵敏度高，克服了pCR扩增的偏好性，对生态系统样品中的种群结构的测度准确性高发酵食品中微生物多样性研究方法在传统技术的基础上有了很大的发展.主要发展出了4种研究方法四种方法在不同的方面有不同的优缺点，只有根据不同的特点选择不同的研究方法，才能更好地保证研究的准确性，从而促进发酵食品中微生物多样性研究。
结束语
发酵食品越来越多的走入到人们的生活当中，发酵食品中的生物多样性是影响其口感的一个非常重要的因素，而在实际的研究工作中，有很多的研究方法，不同的研究方法尤其自身的优势和使用范围，所以一定要根据实际的需要选择适当的方式，只有这样，才能更加充分的保证发酵食品微生物多样性研究更加的成熟。
参考文献
微生物的多样性篇3
关键词：变性梯度凝胶电泳；微生物实验；实验教学改革
中图分类号：G462文献标志码：a文章编号：1674-9324（2013）39-0247-02
微生物学是高等院校生物类专业的一门重要专业基础课，是一门实验性和应用性很强的学科。微生物学实验是微生物学的重要组成部分，是现代生物学技术的重要基础，对于学生加深理论知识的理解，培养创新与实践能力具有非常重要的作用[1]。传统的微生物实验教学内容一般以验证性和演示性为主，注重培养学生的基本实验技能，但对学生综合实验技能和创新能力的培养有待提高。随着国家对创新人才的需求，适当增加综合性和研究性实验内容的比重是微生物实验教学改革的发展方向，对于提高学生的思维能力、动手能力有着积极的作用[1-3]。
本校非常重视实验教学改革工作，鼓励学生在掌握基本实验技能后，积极参加设计性、研究性实验，包括院校两级的大学生科研立项或教师的研究课题，并给予相应的创新学分。通过该项措施进一步激发了学生的学习兴趣，并有效提高了学生的实验技能及分析问题和解决问题的能力。目前微生物实验教学主要包括传统的微生物实验技术，随着分子生物技术的发展，微生物研究技术突破了以往主要依赖纯培养物的局限性，特别是在生态环境样品中的微生物群落结构分析中，基于pCR扩增的分子生物学方法逐渐取代了传统的培养方法，大大拓展了微生物研究的范围[4]。因此，我们在后续的研究性实验中引入了变性梯度凝胶电泳在微生物群落结构分析中的应用等创新型实验项目，使实验教学从基础性向综合性和研究性推进。
一、变性梯度凝胶电泳（DGGe）技术概述
由于自然环境中微生物生存条件的复杂性，大多数微生物以未可培养的形式存在。DGGe是一种不依赖微生物培养技术的研究方法，能快速、准确鉴定环境中微生物种群，在揭示复杂微生物群落演替规律和功能基因多样性方面具有独特的优越性，已被广泛应用于微生物分子生态学研究各领域[5]。DGGe技术的基本原理是在聚丙烯酰胺凝胶的基础上，加入呈梯度分布的变性剂（甲酰胺及尿素），双链Dna分子部分解链导致电泳迁移率降低，而序列不同的Dna分子解链行为不同，在凝胶中的移动速度也就不同，从而使得长度相同而序列不同的Dn段分离。因此，通过测序分析凝胶上不同的谱带，可以检测微生物种群的遗传多样性和动态变化[6]。DGGe技术的工作流程主要包括以下几个步骤：（1）环境样品的采集；（2）样品中微生物基因组Dna的提取；（3）Dn段的pCR扩增；（4）pCR产物的DGGe分析；（5）Dna条带的序列分析。
二、变性梯度凝胶电泳技术在微生物实验教学中的应用
变性梯度凝胶电泳技术是一项综合性较强的实验技术，涉及的知识面较广，要求学生既要有全面扎实的理论知识，又要求较强的实际动手能力。我校的微生物学实验安排在大学二年级的上学期，通过学习使学生掌握微生物学实验的基本原理和操作技术。此外通过后续的生化分析技术和分子生物学实验等课程，学生掌握了聚丙烯酰胺凝胶电泳、基因组提取和pCR扩增等实验技术。因此该项研究性实验项目主要面向大学二年级和三年级的学生，我们为学生提供开放的实验室环境，学生自己组成实验小组，可根据自己的实际情况安排时间。整个实验由学生实验小组开展并完成，同时在实施过程中配备指导教师进行随时指导。根据学生的学习兴趣并结合实验室的科研课题，我们近几年开设了多项DGGe技术在微生物研究中应用的实验，包括《氯嘧磺隆对土壤微生物类群的影响》、《SBR反应器中聚磷菌群的结构分析》、《不同森林土壤中产漆酶细菌群落结构的研究》和《厌氧污泥对偶氮废水的脱色及污泥菌群结构分析》等研究性实验项目。环境样品中Dna的提取是影响微生物多样性的DGGe检测结果的重要因素[7]，学生通过比较不同提取方法对Dna产量和纯度的影响，确定了针对不同的实验样品（土壤或污泥）的最佳提取方法，在这一过程中加深了对Dna提取原理和方法的认识。通过DGGe图谱的分析，学生可以直观地了解到污染胁迫等环境条件下微生物群落结构的改变及优势菌群形成的动态过程，更加深刻地理解富集培养技术在分离特定功能微生物上的应用。学生通过后续的序列比对分析，可以学习到相关环境中常见的微生物优势菌属，特别是一些非培养微生物序列的出现丰富了学生对微生物多样性的认识。通常面向本科生开设的微生物实验主要以好氧微生物为对象，因此学生接受的微生物学知识侧重于好氧微生物，对厌氧微生物的接触和认识较少。我们通过引入厌氧环境中微生物结构分析等实验项目，使学生有机会接触厌氧箱的使用，掌握厌氧微生物的培养方法等实验内容，进一步丰富实验教学内容，深化实验教学改革。
三、小结
分子生物学技术的发展，展示了一个更为丰富的微生物世界。与目前基于高通量测序的微生物多样性分析方法相比，DGGe技术具有快捷、方便、成本低等优点，适合应用于微生物创新实验教学。通过这些研究性实验的开展，使学生完成无法在正常教学时间进行的实验内容，拓展了与其他学科实验技术的综合应用，在激发学生学习兴趣的同时，不仅提升了学生的实验操作技能和团队协作能力，而且增强了综合思考及分析解决问题的能力，为独立完成毕业论文实验及今后从事科研工作打下了坚实的基础[8]。
参考文献：
[1]张萍华，蒋冬花.微生物学创新实验教学体系的构建与实践[J].微生物学杂志，2013，32（3）：107-109.
[2]袁生，徐旭士，戴传超，何伟，张茵，尚广东，戴亦军.微生物学实验课程的改革与实践[J].高等理科教育，2012，（2）：138-140.
[3]贾艳萍，张兰河，马姣.立足学科发展的微生物学实验教学改革研究[J].实验技术与管理，2012，29（12）：26-32.
[4]李晓然，吕毅，宫路路，柳陈坚.微生物分子生态学发展历史及研究现状[J].中国微生态学杂志，2012，24（4）：366-369.
[5]李琬，李景鹏.分子生物学技术在堆肥微生态研究中的应用研究进展[J].中国农学通报，2012，28（18）：20-25.
[6]王洋清，杨红军，李勇.DGGe技术在森林土壤微生物多样性研究中的应用[J].生物技术通报，2011，（5）：75-79.
[7]高慧琴，刘凌.pCR-DGGe技术中不同Dna提取方法综述[J].安徽农业科学，2011，39（1）：52，102.
[8]高健，周建良，蒋本桂，张洁.普通微生物实验教学全面开放理论的建构[J].当代教育理论与实践，2012，4（3）：113-114.
微生物的多样性篇4
关键词：松嫩草地；土壤细菌群落；16SrDna；DGGe
中图分类号：Q938.13文献标识码：a
土壤微生物是土壤的重要组成部分，微生物的多样性代表着微生物群落的稳定性。土壤微生物不仅能够改善土壤的结构；促进土壤养分转化与循环；更能为地上植被储备养分，促进植物的吸收，增加植物的抗性，为植物的多样性提供有利的条件[1]。所以土壤微生物群落多样性与覆盖在土壤上的植物群落多样性呈正相关。通过研究植物群落结构对土壤微生物多样性的影响，可以得到该地区土壤微生物遗传信息在微生物聚集地或群落中的量和分布，反映微生物群落中总的遗传潜力，为今后探讨研究土壤微生物与植被的关系；植物、动物以及微生物的之间互作关系与生态环境保护提供科学依据。
不经过传统的微生物分离培养步骤，直接从土壤中抽提总Dna，利用变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGe）分析16SrDna的序列多态性[2]，以此反映微生物的种群结构。该方法重现性较强、可靠性高，可以有效克服传统方法的缺点，能够更深入的揭示的土壤微生物种群结构。
本实验利用DGGe技术，在分子水平上研究松嫩草原不同地表植被对土壤中微生物种群结构的影响，探讨处于不同地表植物覆盖的松嫩草地土壤微生物群落结构上的变化，为从土壤微生物的角度探讨松嫩草地退化的机理提供科学依据，并为草原生态系统的恢复提供更直接的信息。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1土壤样品
土壤样品采自吉林省长岭县腰井子前金山试验地，土样地表的植物群落为单一优势物种，分别是虎尾草（Chlorisvirgata），羊草（Leymuschinensis），牛鞭草（Hemathriasibirica），拂子茅（Calamagrostisepigeios），全叶马兰（Kalimerisintegrifolia），全叶马兰（Kalimerisintegrifolia），罗布麻（apocymumvenetumL.），碱地肤（Kochiasieversiana），芦苇（phragmitesaustralis）和星星草（puccinelliatenuiflora）。土壤取样时，以不同植物群落为参照，在群落内随机抛投25x25cm2样方，采样深度为5～20cm，采用五点取样法采集土壤样品。
1.1.2主要试剂和引物
试剂盒wizardpCRprepsDnapurificationSystem购自美国promega公司，引物选择细菌的16SrDna的V3高变区通用引物[3]，引物序列338F-GC：5'-CGCGCCGCCCGCGCGCCGGGCGCGGCGGGGGCaCGGGGGGCCtaGGGGaGGCaGCaG-3'，518R：5'-attaCCGCGGCtGCtGG-3'，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2方法
1.2.1土壤样品预处理
将土壤样品混匀，过20目的筛网，称取2g土壤样品，置于离心管中；加入5mLtenp抽提缓冲液，旋祸震荡10min；12000转/min，室温离心5min，弃上清；在沉淀中加入5mltenp，震荡10min，重复（2）（3）2次；加5mLpBa缓冲液，震荡10min；12000转/min，室温离心5min，弃上清，收集沉淀。
1.2.2土壤中细菌总Dna的提取
加入2mLDna提取液，旋祸震荡5min；加入100μL溶菌酶与100μL蛋白酶K，37℃恒温水浴震荡30min；加入500μLSDS，旋祸震荡10min；4℃离心10min，收集上清；加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提1次，12000转/min，离心5min，收集上清；加入等体积异丙醇，颠倒混匀，12000转/min，4℃离心10min，弃上清；Dna沉淀用70%乙醇洗，12000转/min，室温离心5min，干燥后将Dna沉淀溶于100uL无菌水中。
1.2.316SrDnaV3片段pCR扩增
pCR反应体系：10×pCR缓冲液5μL（含mg2+），dntp（10mmol/L）1μL，引物各2μL，taqDna聚合酶2U，Dna模板50ng，BSa（2%）2μL，无菌双蒸水补至50μL。
pCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火温度由65℃～55℃，每2个循环递减1℃，72℃延伸1min，共10个循环；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，20个循环，72℃后延伸10min；4℃保温。
反应完毕后，将pCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，切出的200～250bp片段用试剂盒wizardpCRprepsDnapurificationSystem进行回收。
1.2.4DGGe变性凝胶电泳
使用6.5%丙烯酞胺凝胶（37.5：1），电泳缓冲液为l×tae，变性梯度40%～60%，上样量为pCR产物10μL和6×缓冲液2μL，电压110V，温度为60℃，运行时间为10h。电泳完成后，eB染色1h，在凝胶成像系统中观察结果，并用Bio-RadQuantityone软件分析图谱。
2结果
2.1不同种植物群落下上壤细菌16SrDna扩增结果
图1不同植物群落下的土壤细菌16SrDna凝胶电泳
（m：marker；1：虎尾草；2：羊草；3：牛鞭草；4：拂子茅；5：全叶马兰；
6：罗布麻；7：碱地肤；8：芦苇；9：星星草）
琼脂糖凝胶电泳结果（图2-1）表明所有9种不同植物群落下的土壤细菌的16SrDnaV3片段的电泳条带均较清晰，长度在200～250bp，扩增效果良好，可用于DGGe进一步分析。
2.2不同植物群落下土壤细菌16SrDnaV3片段pCR产物的DGGe图谱分析
DGGe分析结果（图2）表明，不同植物群落下土壤细菌16SrDnaV3片段pCR产物被分离为若干条带，条带数目以及深浅都有所不同，表明9种不同植物群落下，细菌的图谱在条带的数目和位置上有较为明显的差异。
图2不同植物群落下的土壤细菌16SrDna的DGGe图谱
（1：虎尾草；2：羊草；3：牛鞭草；4：拂子茅；5：全叶马兰；
6：罗布麻；7：碱地肤；8：芦苇；9：星星草）
表1不同植物群落地下细菌DGGe条带数
泳道（编号）植物群落土壤pCR-DGGe条带数
1虎尾草21
2羊草27
3牛鞭草25
4拂子茅28
5全叶马兰26
6罗布麻30
7碱地肤30
8芦苇28
9星星草27
不同种植物群落下土壤细菌的DGGe指纹图谱的条带数（表1）表明，每泳道中的条带数量、位点以及明暗度都有一定的差异，这说明不同种类植物群落地下土壤细菌的种类以及生物量都有所不同。其中，碱地肤和罗布麻下的条带最多，表明其土壤中细菌种群多样性最高；全叶马兰和牛鞭草、芦苇和罗布麻的条带最为接近，土壤中细菌种群组成上具有很高的相似性；虎尾草群落下土壤微生物的多样性明显低于其他植物群落，在本实验的取样区域中，多数植被盖度相对较高，其土壤的pCR-DGGe条带数相对较多；而虎尾草群落的盖度偏低，导致阳光对虎尾草群落下的土壤照射过强，这也说明了地上植被的盖度，影响了地下土壤微生物的种类和多样性[4]。
3讨论
不同植物群落下土壤细菌的16SrDnapCR产物DGGe指纹图谱都有所差异，利用DGGe梯度凝胶Dna条带的数量、分布位点及条带中Dna浓度来分析土壤细菌的群落特征，是一种快速研究土壤中微生物群落的方法。如果不经DGGe，采用其它测量微生物多样性的分子生物学的手段，就必须依靠大量的Dna测序来获得土壤总Dna的信息，需要投入大量人力与财力。
但DGGe获得的通常是众多数量相似、位点不同的条带，这些不同的条带表明了不同的Dn段，代表着不同的细菌种类。若要确定土壤细菌的群落具体种类，就必须再对部分目标条带进行克隆、测序及绘制进化树，这可能是比较可行的途径。
参考文献
[1]王长庭，龙瑞军，刘伟，等.高寒草甸不同群落类型土壤碳分布与物种多样性，生物量关系[J].资源科学，2010，32（1）：2022-2029.
[2]muyzerG.DGGe/tGGeamethodforidentifyinggenesfromnaturalecosystems[J].Curropinmicrobiol，1999，2：317-322.
[3]muyzerG.wailL，C.CitterlindenaG.13ofilingofcomplexmicrobialpopulationsbydenaturinggradientgeleletrophoresisanalysisofpolymerisechainreaction-amplifiedgenescodingfor16SrRna[J].applGrwiroramicroliol.1993.59C3）：695-700.
微生物的多样性篇5
【关键词】环境工程微生物学实验教学探索
环境工程微生物学是环境工程专业的专业基础必修课。它是生命科学和环境科学与工程的交叉学科,具有极强的实践性和应用性。环境工程微生物学实验是加深学生对理论知识的理解,培养学生实验技能、实验思维和动手能力的一个重要途径。同时,该实验又是一门操作性很强的课程,需要大量的实验仪器,以及老师手把手传授实验技能,如果没有先进的教学方法做支持,掌握其中的操作技术是很困难的。下面提出几点心得体会,将有利于提高实验教学的质量,深化学生对微生物的认识。
1让学生参与实验准备的全过程
实验室的前期准备工作是很重要,工作量要比实验课程多许多。老师除了要认真备课外,还需要对培养皿、试管、镊子等消毒灭菌,配制各种试剂,最好还要进行预实验,不但更加熟悉实验步骤,而且能保证实验课程的顺利进行。
通过让学生参与实验准备过程,可以让学生学习到完整微生物实验操作技术,这样一个完整流程学生完全参与下来,不但让学生体会到实验过程的艰辛,进而更加珍惜来之不易的实验课程,还可以培养学生科研思维,提高科研能力,使他们在课堂上学到的知识在实验操作中体会得更形象、更具体、更全面,从而激发他们学习兴趣。在巩固专业知识的同时,还培养了其发现问题、综合分析和解决问题的能力。这些对于提高学生的实际动手能力都有很大的帮助。
2更新实验教学内容,加大新知识和新技术的传授
微生物学和环境科学知识的更新推动着环境工程微生物学这门新兴的边缘学科不断向前发展。特别是日新月异的分子生物学技术已渗透到环境工程应用的各个领域。为了紧跟时代和学科发展的步伐,培养高质量人才,让学生熟悉和掌握学科前沿新的理论知识和操作技术,为他们将来工作研究或是硕士博士阶段的深造打下良好的基础。
例如,过去研究环境中微生物的方法是建立在平板分离基础上的,但迄今为止利用这种方法培养出的微生物只占总微生物种类的0.1％～10％。固体培养基其实是人类为微生物创造的人工培养环境,与微生物的实际生存环境有很大差异,用它来培养环境中的微生物相当于是对自然微生物群落进行了一次强制的人工筛选。所以,用平板分离的方法来研究自然环境的微生物生态时,往往不能准确反映微生物群落的实际组成和存在状态。分子生物学、基因组学和生物信息学等学科的发展及其向微生物学领域的渗透,形成一个新的交叉学科分支——微生物分子生态学(molecularmicrobialecology),它为我们全面客观地研究微生物生态系统提供了新的技术手段。微生物分子生态学是以微生物基因组dna的序列信息为依据,通过分析环境样品中dna分子的种类、数量和分布特征来反映微生物区系组成和群落结构[2,3]。所以,这项技术就需要研究者掌握dna提取及纯化技术、dna琼脂糖凝胶电泳技术和pcr基因扩增技术。针对这一点,我们就可以给学生设计一个微生物大实验,以活性污泥为样品,从dna的提取、纯化,凝胶电泳检测,到细菌16srdna基因扩增,都让学生自己操作一遍。通过这一实验的学习,使学生对当今环境工程微生物学的前沿技术都有一定的了解和掌握。
3增强不同实验间的连贯性,以及实验和理论知识的连贯性
3.1增强各实验间的连贯性
过去实验内容多为孤立、连贯性不强的项目,各实验之间的内容重复较多,学生难以系统地把握微生物学实验,既浪费了有限的实验学时,又不利于培养学生的科学素养。对此,我们调整了实验内容,将原来独立设置的实验内容整合到一起,形成一个综合实验,通过一个综合实验就能使学生学到以前3-4个实验项目的实验技能。
3.2增强实验和理论知识的连贯性
环境工程微生物学是一门实践性很强的学科,涉及到的内容覆盖面广,要学好这门课,仅仅依靠理论教学是远远不够的,实验教学可以弥补理论教学的不足,将微生物学的基础理论在实验教学中延伸、深化,并通过实验,加强基本技能的训练。
4实现多媒体实验教学,更直观展现实验内容
环境工程微生物学实验中的各种微生物需要在光学显微镜甚至电子显微镜下放大才能看到。由于环境样品中微生物的复杂性和多样性,应用传统的实验教学方法不便于更好的展示微生物的形态结构、动态变化过程,多媒体教学与传统教学相比,能更加生动形象、栩栩如生的展现微生物的特点,提高学生的学习兴趣和参与度,从而使学生更好的掌握实验知识。
首先,可以在多媒体课件中放入大量彩色的宏观及微观图片、flas,从而更直观的反应微生物的形态特征,利于学生对新知识的吸收掌握,有了这些认识,才能在自己动手实验中达到很好的实验结果。
其次,也可以使用录像教学。教学录像具有较强的直观性,它可以通过屏幕清晰形象准确地展现每一个步骤,使学生掌握实验操作技能的关键所在。同时节约时间,提高实验教学的效率。如配置培养基实验,称量-溶化-调ph-过滤-分装-加塞-包扎-灭菌-搁置斜面-无菌检查等步骤,如果没有录像,需要老师反复强调实验顺序及注意要点,才能保证大部分学生配好正确的培养基。但是,如果有录像,老师只需要先播放一遍录像,从旁作简单介绍,播放完后再讲一下原理及注意要点,然后再播放一遍录像,学生就可以开始实验了。
最后,还可以利用电视显微镜进行教学。老师将样品放在显微镜下,找到微生物个体,让学生先有感性认识,然后再观察自己的样品。该方法既明确了实验目标,又能让全班学生同时看到老师显微镜里样品的特点,避免了以往同学们一个个排队去老师显微镜目镜里观察样品,提高了教学效率。
环境工程微生物学是一门来自实践的科学,学生掌握了它之后也最终要应用于实践。所以,实验教学是培养学生具备从事科学实验能力和严谨求实的科学素质的重要途径,许多问题还需要我们不断探索、实施和进一步完善。
参考文献
[1]周群英,高廷耀.环境工程微生物学(第三版).北京高等教育出版社,2008.
[2]watanabek,kodamay.molecularcharacterizationofbacterialpopulationsinpetroleum-contaminatedgroundwaterdischargedfromundergroundcrudeoilstoragecavities[j].appliedandenvironmentalmicrobiology,2000,66:4803-4809.
微生物的多样性篇6
关键词：土壤微生物；多样性；Dna；提取技术
中图分类号：S154.3文献标识码：a文章编号：0439-8114（2012）23-5253-06
advancesoftotalDnaextractiontechnologyforSoilmicrobialDiversityResearch
XiaoBin，JianGDai-hua，LiULi-long，LiUQuan-dong
（Collegeofagronomy，GuangxiUniversity，nanning530005，China）
abstract：theinfluencingfactorsandapplicationaspects，aswellasthepotentialsandlimitationsofDnaextractiontechniquesformicrobialdiversityanalysiswerereviewed.applyingappropriatemethodstoextractmicroorganismDnafragmentthathaverightpurityandappropriatesizefromsoilwerethepreconditioninsoilmicrobialstudyonthemolecularlevel，andthesubsequentmolecularbiotechnologyoperationswereallrelyonthesemethods.
Keywords：soilmicroorganism；diversity；Dna；extractionmethod
土壤微生物多样性是生物多样性研究的一个重要领域，是指其在遗传、种类、结构与生态功能方面的变化，对指示土壤微生物群落的稳定性，在保持土壤质量和生态系统稳定性等方面具有重要意义[1]，是当今国内外关注和研究的热点问题之一。
长期以来，由于研究方法的限制，传统的分离纯化培养技术仅能获得土壤中微生物总种群数的1%左右，而绝大部分微生物目前还不能获得纯培养[2]，未能获得纯培养的微生物才是土壤微生物的主体，因此，有关微生物多样性研究进展不大。
近年来，随着分子生物学技术的发展和研究手段的更新，基于土壤微生物群落总Dna的现代微生物分子生态学研究方法避免了传统分离培养方法的缺点，被广泛应用于土壤微生物群落结构、功能以及动态监测研究[3]。因此作为微生物群落分子分析方法的基础，最重要的一步就是从土壤样品中尽量毫无偏差地提取出高质量的、具有代表性的微生物总基因组Dna。关于土壤微生物Dna提取方法的报道很多[4，5]，然而这些方法主要侧重于土壤中的细菌群落，很少关注土壤中真菌群落总基因组Dna的提取方法及其提取效果。另外，细胞裂解不完全、Dna分子吸附在样品基质颗粒的表面、从样品中同时提取了某些重要酶的活性抑制剂、Dna分子的损耗、降解和破坏等因素也影响着土壤微生物Dna提取的质量，因而提取土壤微生物总Dna在研究中尤为重要[6]。本文主要对Dna提取过程中的主要影响因素、现行各方法的优缺点以及存在的问题作一综述。
1基于Dna方法的土壤微生物多样性研究现状
传统微生物学研究方法主要依赖于纯培养技术和显微镜技术，对土壤微生物多样性的描述与研究存在一定的局限性。20世纪中后期，随着土壤微生物多样性研究向多方面发展，人们尝试着利用分析微生物细胞中某种指示成分，如磷脂脂肪酸（pLFa）来研究土壤微生物的种群组成，但是这些方法的缺陷是无法保证细胞中某种指示成分在土壤中的稳定性，并且如果某种微生物的pLFa是未知的，则该不可培养微生物仍难以鉴别[7，8]。
1980年，torsvik等[9]首次建立了从土壤样品中直接提取细菌Dna的方法，并于1990年将其成功应用于Dna杂交技术，研究发现1g土壤中有4000个以上不同的细菌种类，说明土壤中微生物多样性是极其丰富的。后来研究者发现16SrDna在原核微生物中普遍存在，并且含有相对保守和可变区域，在不同的个体间16SrDna基因序列也不会进行基因交换，因此，每一种生物都有自己的独特序列。1986年，pace[3]第一次以16SrDna为基础确定环境样品中的微生物，使人们对大量不可培养微生物群体有了全新的认识。此后，基于16SrDna基因的指纹图谱分析的现代分子生物学技术得到迅速发展，包括限制性片段长度多态性分析（RFLp）、随机扩增Dna多态性分析（RapD）、单链构象多态性分析（SSCp）、基因芯片（microarray）、pCR-DGGe/tGGe等，为全面揭示土壤微生物种群结构和遗传多样性提供了重要手段。其总的技术路线：分离微生物基因组Dna，用特异性引物扩增16SrRna基因片段，再将该pCR扩增产物进行更深一步分析，从而可在种、属的水平上研究不同生境中的微生物种群结构及其动态变化[10]。
2土壤微生物总Dna的提取
从土壤样品中提取Dna的方法大致可分为2类，即间接提取法和直接提取法。间接提取法首先是对土壤样品进行反复悬浮和离心，去除土壤等杂质，提取土壤微生物细胞，再采用酶裂解细胞提取微生物总Dna。直接裂解法是不去除土壤等杂质，而是通过物理的、化学的、酶解等手段相结合，直接裂解土壤中的微生物细胞，使其释放Dna，再进行提取和纯化。但不论采用何种方法，都存在一定的缺陷，要想提取较完整的Dna需要具备以下几个条件：①土壤微生物能从土壤中充分释放，尤其是那些紧紧吸附在土壤颗粒，甚至深藏于土壤微穴中的细菌等相对比较难分离的微生物。②对一些比较顽固的微生物，如革兰氏阳性菌、孢子和小细菌的裂解，需要更剧烈的处理，而这又会造成对裂解敏感的细菌Dna折断。③采集土壤样品后应尽快提取Dna，因为土壤在4℃储藏几周就会造成大分子Dna的降解。
2.1间接提取土壤微生物总Dna
torsvik等[11]最先报道了从土壤中提取微生物Dna的间接法，包括以下4个步骤：①分散土壤；②土壤微生物的提取（分离细胞与土壤）；③土壤微生物的纯化；④细胞裂解及Dna纯化。
2.1.1土壤分散土壤微生物一般与土壤颗粒结合，包藏在土壤团聚体内，因此，最大限度地分散土壤是从土壤中分离提取微生物的关键。通常采用物理或化学法，或是二者相结合以达到微生物与土粒分离的目的。常用的物理分散技术是使用玻璃珠与土壤悬液一起振荡，或是使用韦林氏搅拌器（匀浆器、转子混合器）搅拌分散，或是使用超声波分散土壤团聚体等。而化学分散法是通过加入化学分散剂以达到促进微生物与土粒分离的目的。最常用的分散剂为0.2%焦磷酸钠，其他还有winogradsky盐溶液、tris缓冲液、生理盐水、六偏磷酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、纯水等[26]。值得注意的是，为有效地分散土壤，分散剂的种类、浓度、加入量、机械作用（振荡、搅拌和超声波等）的方式、时间以及容器的大小等均应加以考虑。还可以将化学试剂与机械方法结合来悬浮土壤颗粒。研究发现Chelex100就是一种有效的土壤颗粒悬浮剂。各种分散方法分散效果不同，采用何种分散方法效果最佳目前尚无一致结论，而且防止细胞因物理、化学作用导致破裂提前释放Dna很重要，处理不当会使Dna降解。常用分离提取土壤微生物的土壤分散方法列入表1。
2.1.2土壤微生物的提取土壤微生物的提取通常采用离心分离法，既要使微生物与土壤颗粒分离，又要保证基本不破坏微生物细胞。由于土壤中细菌的平均密度（1.1μg/cm3）远小于土壤矿物质的平均密度（2.6μg/cm3），因此采用离心或淘选法可使细菌与土壤颗粒得到较好的分离。Hopkins等[17]采用密度逐级离心法分离出60%以上的土壤细菌。此外，也有学者提出用过滤法，即将土壤样品分散处理后，经20μm或30μm微孔筛真空抽滤，其滤液中即可能含有绝大多数土壤细菌，此过程操作简便，提取液中土壤残留物少，易于纯化。
由于土壤中的真菌、放线菌主要以菌丝的形态与土壤颗粒缠绕在一起以及细胞壁结构的特殊性，从土壤样品中分离提取真菌放线菌要比提取单细胞的细菌相对困难。迄今为止，国内外有关分离提取真菌的研究文献极少，且这些报道方法所提取的真菌菌丝只占真菌总生物量的极少部分。Vilarino等[21]在前人研究的基础上提出了分离土壤真菌的原理：新鲜土壤经分散后，土壤悬浮液中的菌丝可附着在慢速转动的铜丝（直径150μm）框上，洗脱后即得提取的土壤真菌。潘力等[22]以曲霉菌为例，采用微波处理菌丝并置于10×teBuffer中即可得到Dna，建立了一种快速提取丝状真菌Dna的实验方法，为高通量快速筛选丝状真菌转化子奠定了基础。吴敏娜等[23]以传统土壤总Dna提取方法及纯菌Dna提取方法为基础，分别与蜗牛酶、纤维素酶进行组合、优化，得到7种不同的土壤真菌基因组Dna提取方法。分离提取土壤细菌和真菌的流程如图1所示。
2.1.3土壤微生物的纯化目前常用两相分离技术对上述土壤微生物提取液进行纯化。两相分离技术最早为德国化学家albertsson于20世纪50年代所建立，当时主要用于生物大分子的分离。近些年该技术广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物工程等领域，是一种分离、纯化生物大分子、细胞、病毒的方法，该技术也逐步发展成为一种温和的生物分离方法，相对于原始的纯化手段具有过程简单、纯化时间较短等特点，应用领域广泛[24]。关于其分离机制目前尚不完全清楚，有人认为其分离的原理主要取决于不同组分的亲水性差异，也有人认为还与不同组分的电荷性质差异有关。当两种互不相溶的聚合物以一定浓度溶于水中时，便可形成体积不同的两相，被分离组分由于其与两相的亲和力不同，分别进入不同相从而达到分离的目的。目前应用最为广泛的是peG（聚乙二醇）/Dextran（葡聚糖）系统和peG/无机盐（磷酸盐或硫酸盐）系统。对于不同的两相组分，分离时间不尽相同[25]。Smith等[19]研究了应用两相分离技术从土壤中分离纯化非菌丝体微生物的效果，发现经充分混合静置一定时间后，即可形成上下两层体积比约为4∶1的两相分离系统，其中细菌主要富集在上层peG相，土壤残存颗粒将进入下层Dextran相，经4次提取纯化，富集在上层peG相的细菌总量约达加入两相分离系统细菌总量的60%，而上层peG相中的土壤矿质颗粒总量仅占总加入量的4%以下。李妍等[26]用2%peG+6%Dextran两相分离技术（a2pp）纯化细菌，测定细菌生物量，研究两相分离技术在土壤微生物研究领域的可应用性，结果表明采用0.1%胆酸钠、钠型离子交换树脂、玻璃珠与土壤一起在4℃下振荡2h，能较好地分散、纯化土壤细菌。研究表明，两相分离技术同样有可能用于分离纯化土壤真菌。
2.2直接提取土壤微生物总Dna
现今的土壤细菌Dna直接提取法是在ogram等[27]建立的方法基础上发展起来的，主要包括两个步骤：①原位细胞裂解；②Dna提取和纯化。
2.2.1原位细胞裂解直接裂解土壤微生物细胞的方法包括：机械破碎法、化学法、酶解法及3种手段相结合。机械破碎法常用的有冻融法、微波、超声波法和玻璃微珠震荡法；化学法常用表面活性剂SDS和Sarkosyi、热酚、高盐、异硫氰酸胍等；酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶等。其中溶菌酶不仅可处理革兰氏阳性菌细胞壁，还可水解糖苷键和腐殖酸。2种或多种方法相结合对Dna的提取效果较好。王啸波等[28]采用pBS缓冲液洗涤土壤样品，结合SDS裂解微生物细胞的方法，同时提取2种土壤样品的微生物Dna和Rna，结果表明该法提取的核酸不需要进一步处理，其纯度就可以满足后续的分子生物学试验，从而避免了由于纯化导致的核酸量的降低。熊开容等[29]采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法提取了活性污泥中微生物Dna，结果表明获得的Dna适合于酶解和pCR扩增要求。
值得关注的是，土壤中微生物种类繁多，生理状态不同，革兰氏阳性和阴性细菌以及细菌与真菌的细胞壁结构和组成亦不相同。为了使提取的Dna具有代表性，就必须保证土壤样品中所有微生物细胞裂解释放出核酸，因此必须根据试验的性质、要求选择适当裂解方法。研究表明，基于SDS的高盐提取法会对一些革兰氏阳性细菌效果不好。张瑞福等[30]采用冻融+溶菌酶+SDS方法提取3种芽孢杆菌（G+）Dna，结果表明经冻融处理的霉状芽孢杆菌均提取到了Dna，未经冻融处理的霉状芽孢杆菌未提取到Dna，且冻融处理未对Dna造成大的剪切，提取的Dn段还大于23.1kb。张颖慧等[31]使用优化的CtaB法提取真菌基因组Dna。使用液氮冻融以及玻璃珠振荡的方法代替了传统的液氮研磨，实验结果表明该方法所需菌体量少，且得到的基因组Dna比用传统的CtaB法得到的基因组Dna产率高、纯度好且步骤简单，适用于一次微量提取多个样品的基因组Dna，可用于大部分分子生物学基本实验如pCR和Dna的酶切等。
2.2.2Dna提取和纯化在已报道的Dna提取和纯化方法中，通常采用饱和酚或氯仿和蛋白酶处理，去除Dna样品中的蛋白质和部分Rna，然后对Dna进行抽提，再用乙醇、异丙醇或聚乙二醇（peG）沉淀后，经羟基磷灰石柱或氯化铯密度梯度超速离心等进一步纯化。其他纯化方法有聚乙烯吡咯烷酮（pVpp）法、色谱法、电泳法、透析和过滤法、试剂盒法等。
Lamontagne等[32]研究结果表明pVp能够与腐殖酸结合，起到有效去除提取的Dna中腐殖酸杂质、提高Dna纯度的作用。李靖宇等[33]采用氯化钙-SDS-酶法对湿地土壤微生物Dna进行提取，结果表明该方法能高效去除湿地土壤腐殖酸，纯度较高，能直接满足pCR扩增。李钧敏等[34]用含pVpp的缓冲液预洗Dna样品，然后添加CaCl2和牛血清白蛋白可去除其中的腐殖酸，用peG8000沉淀Dna，可提高Dna质量，并证实这是一种简便有效可直接应用于pCR分析的土壤微生物总Dna的提取方法。蔡刘体等[35]采用SDS-CtaB法提取烟草病圃土壤微生物总Dna，该方法既可达到裂解效果，还有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取Dna的质量。吴红萍等[36]采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂对粗提取的土壤微生物Dna进行纯化后，可用于pCR扩增，并以细菌16SrDna基因引物可扩增到相应的片段。朱立成等[37]采用直接法提取土壤微生物总Dna，然后用SephadexG-200凝胶离心层析法纯化，可得到纯度较高的Dna。段学军等[38]采用稀释模板及巢式pCR法很好地解决了在Dna提取纯化过程中不能完全去除腐殖质的问题。滕应等[39]将Bio101Systems公司研制的Fastprep多试管核酸提取系统与相应的FastDnaSpinKitforSoil试剂盒联用，有效地提取了重金属复合污染的农田土壤微生物总Dna。
没有哪种单一的纯化步骤可以除去所有污染物，故许多研究者已经将几种纯化步骤结合起来以期获得最好的纯化效果。Smalla等[40]将粗提的Dna进行3步纯化：①氯化铯密度梯度超速离心纯化；②醋酸钾沉淀；③Geneclean纯化。发现经前2步纯化的Dna通过稀释即可部分被限制性酶切和扩增，但如不经稀释而进行限制酶切和扩增，则必需进行最后一步纯化。
2.2.3直接法和间接法的比较研究表明，直接法获得的Dna较多，但不易去除抑制剂，间接法提取的Dna只占直接法的1/10，但分离的Dna纯度较高，而且间接法得到的细菌量只占总菌群的25%～50%，直接法提得的Dna却可以超过细菌总Dna的60%。因此，要想获得大量Dna，选择直接法较好，当所需Dna量不大，而且要排除真核或胞外Dna污染时，可用间接提取法。
直接提取对某些特定样品用特定的操作方法能获得较高的提取效率，但是对有些生物量不高的样品则很难得到足够的环境总Dna用于后续操作，适合在样品生物量较大但采样量不大的情况下采用。间接提取在提取效率上远小于直接提取，但用间接提取法所得到的环境总Dna纯度较高，所有样品能直接用于pCR扩增，并且能更好地体现样品中微生物的多样性，适用于有大量样品的情况。
2.3Dna的纯度和浓度测定
Dna在260nm处有吸收峰，腐殖酸在230nm处有吸收峰，计算oD230/oD260（腐殖酸/Dna）的比值可以确定所提Dna中腐殖酸的污染程度。一般情况下oD230/oD260比值应在0.4～0.5之间为好，oD230/oD260比值越高，腐殖酸污染越严重。蛋白质在280nm处有吸收峰，因此oD260/oD280比值经常被用来指示Dna中蛋白质的污染程度，当oD260/oD280比值为1.8～2.2时，Dna较纯，当受蛋白质或其他杂质污染时，oD260/oD280值则较低[41]。此外，还可采用pCR扩增检测Dna的纯化质量，所用扩增引物见文献[42]。
提取的Dna浓度也可根据测定的oD260值计算，根据公式[dsDna]=50×oD260×稀释倍数，计算Dna的浓度（μg/mL），换算出每克干土提取Dna的量[43]；还可采用DynaQuant200荧光仪对纯化后Dna的浓度进行测定[28]。
3影响土壤微生物总Dna提取的因子
土壤成分复杂，含有大量的有机及无机等多种生物活性抑制物，如腐殖酸、多酚类化合物、重金属等，它们的存在可能影响土壤Dna的提取质量，抑制Dna聚合酶的活性从而影响土壤微生物多样性的分析。研究发现，腐殖酸是土壤Dna提取过程中极难去除的污染物，由于它的分子大小和理化性质与Dna相似，过分注重腐殖酸的去除，势必会造成Dna的大量损失，因此腐殖酸的有效去除是土壤Dna提取的难点所在。
各种土壤类型、质地和成分的差异，都会影响土壤微生物Dna的提取效果。Zhou等[44]用SDS-CtaB法从8种土壤（包括沃土、沙沃土和沙黏土，其中黏土含量为5%～31%不等）中提取Dna，平均获得Dna的量为0.5～26.9μg/g，并发现获得的Dna量与土壤的有机磷含量有明显的正相关关系。另外，研究也发现，土壤中细菌的裂解效率与其中黏粒的含量呈明显的负相关。土壤中各粒级颗粒对细菌的吸附量从大到小的顺序为：黏粒、粉粒、细沙粒、粗沙粒，其中黏粒是粉粒的3.7～4.9倍、细沙粒的44.3～89.2倍、粗沙粒的262.0～799.0倍，细菌在粒径不同的土壤颗粒表面的最大与最小吸附量分别相差389.0和857.0倍，去有机质土壤颗粒对细菌吸附亲和力较含有机质土壤颗粒的大[45]。因此，不同的土壤适合于不同的Dna提取方法，在土壤Dna提取过程中，应针对土壤类别选取合适的提取方法，以便进行后续研究。
4小结
从土壤微生物群体基因组的角度研究其多样性及功能是可行的方法，并受到广泛的关注[46]。因而越过分离培养的步骤，直接从土壤中获得总Dna以分析土壤微生态群落结构，关键是如何尽可能全面地提取土壤中微生物的总Dna。土壤本身成分复杂，有许多物质难以预料，对提取较好质量的Dna提出了很高的要求。因此建立一种简单有效的提取方法显得非常重要。
间接法提取的微生物Dna纯度较高，提取的种类和数量较少；直接提取法直接在土壤中裂解细胞，使其中内含物尽可能地释放，能够代表大部分的土壤微生物，但土壤中所含物质种类较复杂，所以提取的Dna质量受到很大的影响，需要进一步纯化，而这些处理往往造成部分Dna的丧失，可能使在土壤中本身存在量较少的种类丧失或检测不到，影响到土壤微生物多样性的分析。最近，milko等[47]发现一种taqDna聚合酶基因突变型可增加对腐殖酸等pCR抑制物的抗性，不需要对基因组Dna进行纯化就可以进行后续的分子生物学分析，因此具有广泛的应用前景。
绝大多数直接提取法提取的Dn段长度不会超过23kb，而Dna的某些用途如宏基因组文库构建，需要大片段的Dna，直接提取法对此几乎无能为力。
在Dna提取产率高即表示其所代表的微生物多样性高的前提下，Dna直接提取法被认为是较好的方法并被广泛应用[48]。但近年来有研究表明Dna提取的产率高不等同于微生物的多样性高，间接提取法又再次被提出并用于相关研究[49]。这就要求在选择提取方法时不仅要试用直接提取和间接提取这两类方法，而且在每类方法中也要试用不同的处理组合方式，以使后续操作能顺利进行，并得到准确可信的研究结果。
评价一种土壤微生物Dna提取方法是否有效，除了通常要求的提取片段无降解且比较完整外，还需要能够有效去除土壤中大量存在的影响后续实验的物质，如腐殖酸、腐殖酸似物、酚类化合物、重金属离子等；能在单位样本量中比较彻底地提取出微生物Dna；提取方法应具有普适性，对土壤中大多数微生物能够有效等[50]，且提取的Dna能更好地代表土壤微生物的真实性和异质性。
5展望
目前，国内外对土壤微生物总Dna提取方法的报道很多，但每一种方法都存在一定的缺陷。因此，从土壤样品中提取Dna还没有通用的最佳方案，需要根据具体的土壤特点、实验室条件和实验目的而定。在提取过程中还要兼顾实验操作是否简便，方法是否经济以及样品量是否充足。另外，将现代分子生物学技术与传统微生物研究方法结合起来，才能更全面地认识和理解土壤微生物群落多样性及其相应的生态功能。
参考文献：
[1]肖艾和，张洪霞，谭周进，等.土壤微生物多样性研究的DGGe/tGGe技术进展[J].核农学报，2009（4）：721-727.
[2]amannRi，LCDwiGw，SCHLeiFeRKH.phylogeneticidentificationandinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithoutcultivation[J].microbiologicalReviews，1995，59（1）：143-169.
[3]paCenR.amolecularviewofmicrobialdiversityandthebiosphere[J].Science，1997，276：734-740.
[4]陈邦，范代娣，王琰.土壤微生物Dna提取方法的研究[J].西北大学学报（自然科学版），2009，39（5）：785-788.
[5]DeLmontto，RoBep，CLaRKi，etal.metagenomiccomparisonofdirectandindirectsoilDnaextractionapproaches[J].Journalofmicrobiologicalmethods，2011，86（3）：397-400.
[6]孙海明，朱梅，郭宇南，等.不同土壤微生物Dna提取方法比较[J].北华大学学报（自然科学版），2011（5）：550-552.
[7]SHinpeiYoSHitaKe，maSaKiUCHiDa，taKaYUKinaKatSUBo.Characterizationofsoilmicrofloraonasuccessionalglacierforelandinthehigharcticonellesmereisland，nunavut，Canadausingphospholipidsfattyacidanalysis[J].polarBioscience，2006，19：73-84.
[8]pHiLipwR，mattHiaSCR，KeVinpF，etal.Choiceofmethodsforsoilmicrobialcommunityanalysis：pLFamaximizespowercomparedtoCLppandpCR-basedapproaches[J].pedobiologia，2006，50：275-280.
[9]toRSViKV，GoKSoYRJ，DaaeFL.HighdiversityinDnaofbacteria[J].app1iedandenvironmentalmicrobio1ogy，1990，56：782-787.
[10]JenniFeRLK，LeeaB，miRanDaH，etal.methodsofstudyingsoilmicrobialdiversity[J].Journalofmicrobiologicalmethods，2004，58：169-188.
[11]toRSViKVL，GoKSoYRJ.DeterminationofbacterialDnainsoil[J].SoilBiologicalandBiochemistry，1978，10（1）：7-12.
[12]芦晓飞，赵志祥，谢丙炎，等.米拉山高寒草甸土壤微生物Dna提取及宏基因组Fosmid文库构建[J].应用与环境生物学报，2009，15（6）：824-829.
[13]刘宏伟，彭谦，李沁元，等.高温环境样品总Dna直接和间接提取方法的比较[J].微生物学报，2006，46（6）：1018-1002.
[14]GaBoRem，deVRieSeJ，JanSSenDB.efficientrecoveryofenvironmentalDnaforexpressioncloningbyindirectextractionmethods[J].FemSmicrobiolecology，2003，44：153-163.
[15]maCDonaLDRm.Samplingsoilmicrofloras：optimizationofdensitygradientcentrifugationinpercolltoseparatemicroorganismsfromsoilsuspensions[J].SoilBiologicalandBiochemistry，1986，18：407-410.
[16]HeRRonpR，weLLinGtonemH.newmethodforextractionofstreptomycetesporesfromsoilandapplicationtothestudyoflysogenyinsterileamendedandnonsterilesoil[J].app1iedandenvironmentalmicrobio1ogy，1990，56：1406-1412.
[17]HopKinSDw，maCnaUGHtonSJ，o’DonneLLaG.adispersionanddifferentialcentrifugationtechniqueforrepresentativelysamplingmicroorganismsfromsoil[J].SoilBiologicalandBiochemistry，1990，23：117-225.
[18]tUpinpe，maYCRoFtKa，RoLanDSCL，etal.anion-exchangebasedextractionmethodforthedetectionofsalmonellasinsoil[J].appliedBacteriology，1993，53：860-863.
[19]SmitHnC，StRiBLeYDp.anewapproachtodirectextractionofmicroorganismfromsoil[a]//RitZK，DiGHtonJ，GiLLeRKe.BeyondtheBiomass[m].London：BritishSocietyofSoilScience，1994.
[20]LinDaHLV.improvedsoildispersionproceduresfortotalbacterialcounts，extractionofindigenousbacteriaandcellsurvival[J].microbiolmethods，1996，25：279-286.
[21]ViLaRinoa，aRineLJ，SCHUeppH.extractionofvesiculararbuscularmycorrhizalmyceliumfromsandsamples[J].SoilBiologyandBiochemistry，1993，25：99-110.
[22]潘力，崔翠，王斌.一种用于pCR扩增的丝状真菌Dna快速提取方法[J].微生物学报，2010，37（3）：450-453.
[23]吴敏娜，张惠文，李新宇，等.提取北方土壤真菌Dna的一种方法[J].生态学杂志，2007，26（4）：611-616.
[24]RaGHaVaRaoKSmS，RanGanatHantV，SRiniVaSnD.aqueoustwophaseextraction——anenvironmentallybenigntechnique[J].Cleantechnicalenvironmentalpolicy，2003，5：136-141.
[25]向万胜，吴金水，肖和艾，等.土壤微生物的分离、提取与纯化研究进展[J].应用生态学报，2003，14（3）：453-456.
[26]李妍，倪德军，胡红青，等.应用两相分离技术研究红壤微生物组成的探讨[J].土壤学报，2007，44（1）：152-158.
[27]oGRama，SaYLeRGS，BaRKaYt.theextractionandpurificationofmicrobialDnafromsediments[J].microbiolmethods，1987，7（2-3）：57-66.
[28]王啸波，唐玉秋，王金华.环境样品中Dna的分离纯化和文库构建[J].微生物学报，2001，41（2）：133-140.
[29]熊开容，张智明，张敏.活性污泥Dna提取方法的研究[J].生物技术，2005，15（4）：43-45.
[30]张瑞福，崔中利，曹慧，等.土壤微生物总Dna的提取和纯化[J].微生物学报，2003，43（2）：276.
[31]张颖慧，李明春，魏东盛，等.一种改进的丝状真菌Dna提取方法[J].微生物学通报，2008，35（3）：466-469.
[32]LamontaGnemG，miCHeLFC，HoLDenpa，etal.evaluationofextractionandpurificationmethodsforobtainingpCR-amplifiableDnafromcompostformicrobialcommunityanalysis[J].Journalofmicrobiologicalmethods，2002，49（3）：255-264.
[33]李靖宇，赵吉，边玉，等.湿地土壤微生物Dna提取及其脱腐技术[J].微生物学通报，2010，37（8）：1130-1137.
[34]李钧敏，金则新.一种高效可直接用于pCR分析的土壤总微生物Dna抽提方法[J].应用生态学报，2006，17（11）：2107-2111.
[35]蔡刘体，胡重怡，罗正友，等.SDS-CtaB法提取烟草病圃土壤微生物总Dna[J].江西农业学报，2011，23（2）：119-121.
[36]吴红萍，郑服丛.不同环境中土壤微生物总Dna的提取与纯化[J].广西农业科学，2008，39（1）：21-61.
[37]朱立成，邹小明，蔡瑞玉.红壤中微生物总Dna的分离与纯化[J].井冈山学院学报（自然科学版），2007，28（12）：5-7.
[38]段学军，闵航.镉胁迫下稻田土壤微生物基因多样性的DGGe分子指纹分析[J].环境科学，2004，25（6）：122-126.
[39]滕应，骆永明，赵祥伟.重金属复合污染农田土壤Dna的快速提取及其pCR-DGGe分析[J].土壤学报，2004，41（3）：343-347.
[40]SmaLLaK，CReSSweLLn，menDoCa-HaGLeRLC，etal.RapidDnaextractionprotocolfromsoilforpolymerasechainreaction-mediatedamplification[J].JappliedBacteriology，1993，74：78-85.
[41]YeateSC，GiLLinGSmR，DaViSonaD，etal.methodsformicrobialDnaextractionfromsoilforpCRamplification[J].Biologicalproceduresonline，1998，1（1）：40-47.
[42]张于光，李迪强，王慧敏.用于分子生态学研究的土壤微生物Dna提取方法[J].应用生态学报，2005，16（5）：956-960.
[43]吴冠芸，潘华珍.生物化学与分子生物学实验常用数据手册[m].北京：科学出版社，1999.249-250.
[44]ZHoUJZ，BRUnSma，tieDJeJm.Dnarecoveryfromsoilsofdiversecomposition[J].appliedandenvironmentalmicrobiology，1996，62（2）：316-322.
[45]蒋代华.细菌在粘土矿物及土壤颗粒表面的吸附研究[D].武汉：华中农业大学，2009.
[46]toRSViKV，oVReaSL.microbialdiversityandfuctioninsoil：fromgenestoecosystems[J].ecologyandindustrialmicrobiology，2002，5：240-245.
[47]miLKoBK，LYUBKaiK，eRiKaeV，etal.mutantsoftaqDnapolymeraseresistanttopCRinhibitorsallowDnaamplificationfromwholebloodandcrudesoilsamples[J].nucleicacidsResearch，2009，37（5）：2-14.
[48]HUBeRJa，BUtteRFieLDDa，BaRoSSJa.Bacterialdiversityinasubseafloorhabitatfollowingadeep-seavolcaniceruption[J].FemSmicrobiologyecology，2003，43：393-409.
微生物的多样性篇7
（贵阳职业技术学院，贵阳550081）
摘要：采用t-RFLp法实验研究贵州省特有药用植物根际丛枝菌根真菌（arbuscularmycorrhizalfungi，amF）的多样性。结果表明：4种贵州省特有药用植物根际amF种类丰富，数量较大。植物种类不同，对应的amF群落多样性有较大差异，证明了宿主植物对根际微生物群落结构多样性的影响；同时，有机质、pH和速效磷对根际amF群落多样性影响较大。
关键词：丛枝菌根真菌；贵州特有药用植物；群落多样性
中图分类号：S567文献标识码：a文章编号：1006-4311（2015）17-0219-02
作者简介：封晔（1981-），女，陕西绥德人，贵阳职业技术学院讲师，研究方向为微生物应用。
0引言
贵州特有药用植物是指目前在贵州省境内发现有分布并具有药用价值，但是在贵州以外的其它地区都没有分布的物种，其代表种类有：银背叶党参、梵净山小檗、梵净山蒲儿根、梵净山冠唇花、梵净山火绒草、梵净山紫苑、短茎淫羊藿等[1]。
菌根真菌（mycorrhizalfungi）在自然界中有着重要的生态作用，它可以与世界上大多数的维管植物根系形成互惠共生体。丛枝菌根真菌（arbuscularmycorrhizalfungi，amF）是菌根中分布最广泛的一类。研究表明，amF因其能扩大植物根系吸收面积、加快养分运输速率、分泌活化物质、提高光合速率等直接和间接作用，改善宿主植物的矿质营养，增加植物中的碳积累，进而促进植物生长[2]。
目前对药用植物amF的研究主要集中在菌根多样性或接种菌根真菌对植物的影响。李品明等对重庆市13种中药材植物的amF物种多样性进行了研究，结果表明，从中药材植物根际土壤中分离出了10种菌根真菌，隶属三个科[3]。王森等以山西历山自然保护区暴马丁香、连香树、南方红豆杉和领春木4种珍稀药用植物为材料，从4种植物根际共鉴定amF27种[4]。在国内因药用植物种质资源丰富，宿主范围十分广泛，目前已经对上百种药用植物进行了研究。
长久以来，中药材大多来自野生药用植物，但随着对药用植物需求的不断增加，野生药用植物已经无法满足人们对药用植物的需求，甚至濒临灭绝，加之人工栽培技术落后、栽培措施不配套等原因，导致药用植物种质退化、质量下降、入药性质不稳定等。本课题主要是通过对贵州特有药用植物根际土壤采集和分析，研究药用植物根际amF种质资源及多样性，以期为充分发掘和利用amF资源，筛选amF优势菌，利用菌根生物技术提高药用植物产量、品质和扩大人工栽培区提供材料和依据。
1材料与方法
1.1研究地概况
采样地位于贵州东南部茂兰保护区及织金县牛场镇。本区处于温暖湿润的中亚热带气候区，区域内有雷公山和月亮山，分布着适宜常绿栎林及热带常绿阔叶林生长的红壤和红黄壤，海拔最高处为2178．8m，最低处137m。区域内有中草药资源十分丰富。
1.2样品采集
2014年10月在贵州省茂兰保护区及织金县牛场镇采集铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetmigo）、黄连（CoptischinensisFranch.）、太子参（pseudostellariaheterophylla(miq.)pax）、丹参（SalviamiltiorrhizaBge.）根系及根际土。每株按东西南北4个方位，除去5cm厚的表层土后，挖10～20cm深的土壤剖面，剪取带有细根的根系，用塑胶袋存放根系和根际土样品。经检测，土样基本性质如表1所示。
1.3amF的形态观察及其侵染能力的检测
采用philips和Haymay染色方法进行观察和计算。
1.4分子生物学方法分析样品多样性
1.4.1总Dna的提取和纯化
采用Zhou等[5]的酶裂解法提取土壤总Dna。
1.4.2pCR扩增
采用由大连宝生物公司合成的引物am1和nS31扩增18SrDna施测。反应体系为20ml.pCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检验。
1.4.3群落多样性分析
采用t-RFLp方法分析样品，以图谱中每一个限制性片段（t-RF）为一个otU，测定otU数目即为物种丰富度指数（S），峰高值低于100荧光单位的峰不计入分析范畴。根据丰富度指数（S）和相对峰高值（pi）测定均匀度指数（e）和Shannon多样性指数（H）。
相对峰高值（pi）：pi=ni/n
均匀度指数（e）：e＝H/lnS
Shannon指数（H）：H＝－∑pilnpi
式中，n为该样品所有累计峰高，ni为第i个t-RF峰值。
1.5数据分析
用表3中的实验数据代入eXCeL（2003）、spss（V17.0）软件系统进行汇总和分析。
2结果与分析
2.1根际amF的形态及其侵染率
从表2中可见，不同宿主植物根系菌根真菌侵染率不同，四种植物中铁皮石斛的菌根侵染率最高，丹参最低。对比采样环境可以看出，侵染率与土壤性质有一定相关性。其中pH越高侵染率越高；侵染率与速效磷和速效钾呈反比。
2.2群落多样性
2.2.1样品总Dna提取和基因的扩增结果
从土壤中提取出的总Dna粗提样品中有大量黑褐色杂质，基因组片段大小为20kb，用1%琼脂糖电泳检测，条带明亮齐整，这说明所得到的微生物总Dna比较完整。扩增的18SrDna基因片段长度为550bp。
2.2.2群落多样性指数
表3可见，4个样品的根际amF多样性存在明显的差异。其中，丰富度指数和Shannon指数最高的是黄连，最低的是太子参，表明植物种类的差异对根际amF群落多样性有影响。
3结论和讨论
根际微生物活性及群落结构的变化是评价土壤生态系统的重要指示因子，通过观察其变化能够发现植物和土壤质量[6]。本研究表明，4种贵州省特有药用植物根际amF种类丰富，数量较大。由于植物种类的不同，amF群落多样性也存在很大的差异。由此可见，宿主植物也会影响根际微生物群落结构多样性。但oehl具有不同意见，他认为土壤类型和土地利用模式决定了amF的群落结构[8]。
对于根际微生物来说，很多的环境因子都对其群落多样性影响很大，如有机质、pH和速效磷等，这是因为土壤微生物中的养分越高，营养物质就越多，这有利于其活性的增加。卜洪震等发现使用肥料后可以促进土壤微生物的活性，并且不同施肥处理对土壤微生物量碳和微生物多样性有着重要影响[7]。本研究中速效磷是影响amF群落多样性的一个主要因素。而从o’Donnell等[8]学者的研究成果来看，土壤pH值也是一个重要的土壤微生物群落多样性影响因子。徐辉[9]在现有研究成果的基础上展开进一步研究，发现速效磷也直接影响刺槐和沙棘根际amF侵染率。在自然环境中随着环境因子的变化，土壤微生物群落的形成和变化也会随之调整，这说明土壤微生物的生长和环境因子有着直接关系。通过研究土壤微生物群落动态变化，也就为了解生态系统的土壤健康状况和植被发育阶段提供了可能。
参考文献：
[1]孙济平，何顺志.贵州特有药用植物的种类与分布[J].中国中药杂志，2005，30（10）：735-738.
[2]刘润进，陈应龙.菌根学[m].北京：科技出版社，2007.
[3]李品明，韩如刚，刘杰，等.中药材植物根际土壤Va菌根多样性研究[J].湖南农业科学，2011，3：141-142.
[4]王森，唐明，牛振川，等.山西历山珍稀药用植物am真菌资源与土壤因子的关系[J].西北植物学报，2008，28（2）：355-361.
[5]ZhouJZ，Brunsma，tiedjeJm.Dnarecoveryfromsoilsofdiversecomposition.appliedandenvironmentalmicrobiology，1996，62（2）：316-322.
[6]滕应，黄昌勇，骆永明，龙健，姚槐应.铅锌银尾矿区土壤微生物活性及其群落功能多样性研究.土壤学报，2004，41（1）：113-119.
[7]卜洪震，王丽宏，尤金成，肖小平，杨光立，胡跃高，曾昭海.长期施肥管理对红壤稻田土壤微生物量碳和微生物多样性的影响.中国农业科学，2010，43（16）：3340-3347.
微生物的多样性篇8
问题串;化学概念;思维;建构
“问题串”是指在一定学习范围和主题内，围绕一定的目标，按照一定的逻辑结构，精心设计的一组问题。教师根据预设的三维目标，将教学内容设置成一个个看似独立，却彼此联系的问题，每个小的知识点下的多个问题成一组，整节课的几个知识点之间的问题就形成了“问题串”。在“问题串”的引导下，学生的思维能够由表及里、由浅入深，也能够清晰地把握住整节课的主线与思路，再通过自身的主动探索，可以实现对化学知识的理层理解，从而提高化学教学的有效性。近年来，国内的学者和一线教师们对“问题串”教学进行了广泛的探讨，本文以苏教版必修2《从物质结构看物质的多样性》为例，从实践层面对基于“问题串”设计的化学概念教学进行研究，以期对中学化学概念教学实践有所帮助。
一、背景分析
《从微观结构看物质多样性》第一课时主要围绕“同素异形”现象与“同分异构”现象来解释物质多样性的原因。引起这两种现象的主要原因是微观粒子在微粒种类、原子间连接方式等方面的多样性。渗透微粒观比简单的让学生懂得何为“同素异形”现象与“同分异构”现象更为重要。而微观粒子是学生看不到摸不着的东西，因此渗透微粒观需要的就是教师的引导。通过“问题串”的设计，让学生实现从宏观到微观、微观到宏观的思维转换，体会微观粒子成键方式的不同，从而有效落实教学目标。
二、教学目标及重难点
1.教学目标
知识与技能：从金刚石、石墨、足球烯等碳的同素异形体以及C4H10、C2H6o等同分异构体为例认识同素异形现象和同分异构现象以及定义。认识微观结构不同引起的物质多样性。
过程与方法：通过多媒体图片展示、问题串的设计以及学生的讨论和动手实践等方法认识同素异形现象和同分异构现象。
情感、态度与价值观：从微观角度探究物质世界的本质，认识物质的多样性，形成正确的世界观。
2.教学重点
以金刚石、石墨、足球烯等碳的同素异形体以及C4H10、C2H6o等同分异构体为例认识由于微观结构不同而导致的同素异形现象和同分异构现象。
3.教学难点
同位素、同素异形体、同分异构体三个概念的辨析。
三、教学过程设计
1.第一个问题串的设计：新课引入
【问题1】构成物质的微粒有哪些？
【学生】原子、离子、分子。
【问题2】化学变化的最小微粒是什么？
【学生】原子。
【问题3】为什么构成物质的微粒有原子、离子、分子，而化学变化的最小微粒却只有原子呢？
【学生】因为原子可以通过得失电子形成离子，也可以相互结合或直接形成分子。
【问题4】原子转化成离子或者分子，又可以形成什么样的物质呢？
【学生】原子若变化成离子可以形成离子化合物，原子也可以形成共价化合物和单质。
【问题5】通过分析我们知道了：宏观物质都是由微观粒子结合而成的。物质又分为单质和化合物。那你们知道目前存在的化合物大概有多少种？
【学生活动】讨论可能的答案。
【补充资料】美国《化学文摘》统计数据
【学生活动】猜测与推断：微观粒子与物质多样性有着怎样的联系？
设计意图：通过第一组问题串的设计，引导学生从宏观物质出发，进入微观世界，挖掘潜在意识中的微粒观，为后续课程做好铺垫。
2.第二个问题串的设计：同位素
【问题1】元素周期表中现有的元素种类是多少呢？
【学生】113种。
【问题2】元素的种类会无限多吗？
【学生活动】讨论可能的答案。
【补充资料】现在已经发现了113种元素了，其中天然元素94种，人造元素19种，在人类现有的条件下应该还能发现几种，然后就差不多达到极限了。因为当核子数增大时，原子核会越来越不稳定，当核子数达到一定数目时，它们无法形成一个稳定的“集团”，就不能构成一个原子，也就不能有无限种元素。
【问题3】目前发现的原子种类有多少种呢？
【补充资料】目前发现的原子种类大约有3500多种，但是有一大部分仅仅短暂存在于实验室。
【问题4】元素种类只有113种，即使再发现几种也与原子的种类数差距很大，为什么二者的数目不相等呢？
【学生活动】讨论相关问题，给出可能适合的答案
【问题5】原子是如何构成的？
【学生】由原子核与核外电子构成。
【问题6】原子核内又有什么微粒？一定有？还是可能有？
【学生】原子核内一定有质子，可能有中子。
【问题7】决定元素种类的微粒是什么？决定原子种类的微粒又是什么？
【学生】决定元素种类的微粒是质子，决定原子种类的微粒是质子和中子。
【问题8】如果原子中出现质子数相同但中子数不同，这些原子是什么关系呢？
【学生】是同种元素的不同的原子。
【小结】我们把质子数相同，但中子数（或质量数）不同的这些原子互称为同位素。这一现象导致了原子的多样性。也是物质出现多样性的原因之一。
设计意图：通过第二个问题串的设计，从元素种类与原子种类数量的巨大差异，引发学生的思维碰撞。再从原子与元素的决定因素分析，得出元素存在同位素现象，理解物质世界多样性原因之一――原子的多样性。3.第三个问题串的设计：同素异形现象和同素异形体
【问题1】单质分子是如何形成的呢？
【学生】可由单个原子直接形成单原子分子，也可以多个原子形成多原子分子。
【问题2】同种元素的一种原子可否形成原子个数不同的单质呢？举出身边的例子予以说明。
【学生】可以，比如氧元素可以形成双原子分子o2，也可形成三原子分子o3。
【问题3】除了氧元素之外，还有其他生活中的例子吗？
【学生】还有金刚石和石墨，红磷和白磷等。
【问题4】这些物质相互之间是什么关系呢？
【学生活动】讨论相关问题，给出可能适合的答案。
【小结】同素异形现象：同种元素形成几种不同单质的现象。
同素异形体：同一种元素形成的不同单质的互称。
【问题5】同素异形体间的化学性质和物理性质是否存在差异呢？
【补充资料】分别给出碳、氧、硫、磷几种元素存在的同素异形体的结构与性质对比。
【小结】可以看出，同素异形体之间的结构是不同的，物理性质也存在较大差异。同素异形体和同素异形现象的存在造成了单质分子的多样性，也是物质世界多样性的原因之一。
设计意图：通过第三个问题串的设计，从单质与原子个数的关系出发，引导学生理解同素异形现象与同素异形体。分析对比同素异形体之间性质的差异，使学生理解物质世界多样性原因之一――单质分子的多样性。
4.第四个问题串的设计：同分异构现象和同分异构体
【问题1】通过前面的资料我们知道，已发现的化合物中绝大多数都是有机物，请问构成有机物的核心元素是什么？
【学生】碳元素。
【问题2】碳原子能形成几个共价键呢？
【学生】四个。
【问题3】如果将两个碳原子链接在一起形成化合物，可以有几种连接方式？
【学生】可以是碳碳单键、碳碳双键和碳碳三键。
【问题4】它们的区别在哪里？
【学生】碳原子的成键方式不同。
【问题5】如果将四个碳原子用单键连接，又有几种方式呢？
【学生活动】画出不同的连接方式，比较差异性。
【小结】因为没有限定氢原子的个数，仅仅是四个碳原子以单键连接的话，可以是链状连接，分子式为C4H10，也可以是环状连接，分子式为C4H8。每种连接方式下又有两种不同的结构。它们分子式相同，但是结构不同。
【问题6】若给我们确定的分子式还会出现上述情况吗？请以C2H6o为例说明。
【学生活动】利用桌面所给的实物搭建球棍模型得出结论。
【问题7】对比几种情况，造成这些现象的原因有哪些？
【学生】碳原子的成键方式不同，可以以单键、双键和三键连接，也可以以链状连接，还可以以环状连接。
【小结】我们利用小球和短棍可以得到CH3oCH3和CH3CH2oH两种结构，分别称为二甲醚和乙醇。同样，分子式为C4H10的两种结构分别称为正丁烷和异丁烷。它们分子式相同，但是碳原子的连接方式是不同的。
同分异构现象：有机化合物具有相同的分子式，但具有不同结构式的现象。
同分异构体：具有相同的分子式，但具有不同结构的有机化合物。
【问题8】同分异构体之间的化学性质相同吗？
【补充资料】同分异构的两种类型：立体异构与顺反异构的图片及性质对比。
【小结】比较同素异形体和同分异构体的性质，我们不难得出结论：物质的结构决定其性质。结构不同的物质，性质必定存在差异。有机物中原子的连接方式和成键方式的不同，造成了同分异构现象的出现。而同分异构现象的出现又导致了物质世界的多样性。
设计意图：通过第四个问题串的设计，从碳原子的共价键数与成键方式的关系出发，分析C4H10与C2H6o的同分异构体，在学生亲手实践的过程中理解同分异构现象与同分异构体，分析同分异构体的性质差异，结合同素异形体的性质差异，渗透结构决定性质的化学观。让学生理解物质世界多样性原因之一――有机化合物的多样性。
5.第五个问题串的设计：课堂小结
【问题1】除了上述原因之外，我们不妨思考：一种原子可以形成多种离子吗？
【学生】可以，比如Fe2+、Fe3+。
【问题2】相同的原子能形成不同的离子团吗？
【学生】So42-，So32-。
【问题3】大家给出的氧原子和硫原子能形成不同的化合物吗？
【学生】So2，So3。
【问题4】大家说的这些都是导致物质世界的多样性的原因。回顾这节课，我们发现导致物质世界多样性主要有三个方面的原因：同位素、同素异形体和同分异构体，它们之间又有什么不同呢？
【学生活动】自我小结。
设计意图：通过第五个问题串的设计，使学生能够认识到物质多样性还有其他原因。适当的将三个概念进行小结和对比能够加深学生对知识的理解和掌握。
6.收获与感悟
物质世界丰富多彩的原因：
（1）原子的多样性――同位素;
（2）单质分子的多样性――同素异形现象;
（3）有机化合物的多样性――同分异构现象;
（4）离子的多样性――同种元素形成多种离子;
（5）………
………――物质世界的多样性
还有更多的原因期待着我们共同努力去发现！
设计意图：最后的“收获与感悟”对整节课进行升华。
四、反思与收获
微生物的多样性篇9
1.微波消解技术生物医学及药物分析的应用
生物样品的消解是微波应用最早的领域，处理样品包括动物、植物、食品和医学样品等，微波消解克服了传统干法或湿法的高温、使易挥发元素损失、费时等缺点，结合众多分析手段(如：原子吸收光谱法、icp-aes、icp-ms、faas等)，可以对微量元素及痕量元素进行分析。微量元素与人体健康的研究成为当代医学中引人注目的新领域，采用微波消解人发样本测定元素包括：al、bi、ca、cd、cr、cu、fe、ge、hg、mg、mn、mo、ni、pb、se、sr、zn及稀土元素。我国是稀土大国，稀土的储量及产量均占世界首位。过去认为稀土很少，不可能进入环境及动植物体。稀土元素参与了自然界的生物链，随着环境中稀土浓度增加，人体内稀土浓度也相应发生变化。因此，人发中稀土元素的分量测定，可以了解不同环境人群头发中稀土分量的实际水平和变化，是研究环境与人体生命科学的一种良好的指示性生物样品。用微波消解样品，采用土壤标准样品(gbw07403)进行质控，icp-ms法测定人发标准样品(gbw07601)中15种超痕量稀土元素，测得值与标准值及参考值有很好的一致性，证明本法准确可靠，填补了原标准样品中仅la、ce和y有标准值，其余12种稀土元素无分量值的空白。[1]
测定生物样品中的痕量元素时，样品的制备是一个重要的课题。近年来，迅速发展起来的微波密封消解技术，利用微波辐射引起的内加热和吸收极化作用及所达到的较高温度和压力使消解速度大大加快，不仅可以减少样品的污染和易挥发元素的损失，而且样品分解彻底，操作过程简便容易，使样品前处理效率大大提高。[2]中国原子能科学研究院放射化学所采用wrt-3ch微波样品处理系统研究微波技术在生物样品预处理中的应用，对标准物质潞党参(gbw09501)、海产品消解后分析并进行国际比对，其结果准确可靠。
通过测定中药中微量元素的含量的研究其对人类正常生理功能的影响，考察中药微量元素的药理活性及建立中药微量元素质量控制标准有着重大的意义。微波制样技术则为中药中微量元素的提取提供了一种很好的方法，配合icp-aes、icp-ms、冷原子吸收、fi-hg-afs等对微量元素进行分析。新疆大学分析中心采用wr-1c微波样品处理系统结合icp法对新疆贯叶连翘中无机元素的含量进行了测定，该法在30min内即可完成试样的消解，测定结果令人满意。[3]由于微波消解技术加速了样品的分解，改进了传统的消化模式，改善了工作环境以及减轻了分析人员的劳动强度。
2.微波消解技术食品及化妆品分析中的应用
采用微波消解植物、动物、水产品、粮油谷物等样品，利用国家标准物质验证方法的可靠性，测得微量元素的回收率为92～103，rsd为1.2～8。
微波对食品样品的消解主要包括有传统的敞口式、半封闭式、高压密封罐式，以及近几年发展起来大的聚焦式，配合之后的分析检测手段afs、aes、原子荧光法、毛细管电泳、icp-ms、icp-ms等。在各类食品中有些含有对人体有害的重金属元素，如pb、as、hg、cd等，在传统的干法或湿法消解很容易损失，而al及营养元素ca、zn、fe等在环境、试剂、器皿中含量很高，易造成污染，这样使得微波消解在食品及卫生检验领域的应用越加广泛。[4]天津市卫生防疫站理化检验科利用微波消解－氢化物原子吸收光谱法测定食品中的铅，取得良好效果。[5]天津市食品卫生监督所采用wr-1e型微波密闭溶样系统结合冷原子吸收测定微量的汞，仅用10min左右即可将有机物消化完全，并可同时消化多个样品。实验重现性好，添加回收率达90以上。
对海(水)产品的研究，有利于人们综合利用海洋(淡水)资源，保护水域生态环境。海洋生物及淡水生物对水体各种元素有一定的富集作用，其中的有害元素(如：pt、cd、as、se、hg等)对人类的作用逐渐为人们所重视。采用icp-ms、icp-aes、afs对海产品中微量元素的分析微波消解前处理是关键。中国原子能科学研究院放射化学所采用王水、hf体系在wrt-3ch微波样品处理系统消解海产品[1]同样在国外样品分析比对结果中取得很好结果。
化妆品是与人们生活密切相关的轻化工产品，其配方中含有很多有机和无机成份。[6]其中某些金属元素的存在将损害皮肤，有的元素甚至可以沿毛孔和呼吸道进入体内，对人体健康产生严重危害，化妆品中有害金属元素含量是评价化妆品质量的重要卫生指标，对化妆品的金属元素必须严格限制，其中as、pb、cd、cr、bi五种微量元素危害最大，对这五种元素的分析方法有比色法、原子吸收法和icp-aes法，由于乳状化妆品基体复杂，这五种元素的含量又极低，一般比色法和火焰aas法很准确测定，水平管炬的icp-aes由于其灵敏度可达ng/ml级，基体干扰小，一次进样可以同时测定五个元素，是一种较好的分析方法。微波消解技术可以在较短的时间内对有机成分进行快速消解，由于容器密闭，对金属挥发组分不损失，是一种很好的化妆品前处理方法。
3.微波消解技术环境式样分析中的应用
在环境式样分析中，采用和样品预处理所耗时间及费用约占实验室分析过程投资的60，因此，改进传统消解方法的弊端，从整体上提高环境分析的速度和质量尤为重要。
微波消解在环境试样分析方面的应用很广，涉及到的环境试样包括土壤、固体垃圾、核废料、煤飞灰、大气颗粒物、水系沉积物、淤泥、废水、污水悬浮物和油等。微波消解环境试样可以用来测定其中的as、al、ba、be、ca、cd、co、cr、cu、fe、hg、k、li、mn、mg、na、ni、pb、sb、si、sr、se、ti、tl、v、zn、zr和稀土等金属元素，总磷、总氮、无机硫等非金属及废水的cod值等。
浙江省疾病预防控制中心采用微波消解原子吸收法测定土壤中的铬。[8]铬是重要的污染物，铬的氧化状态毒性较大，被公认为致癌物，另一方面，铬盐引人土壤中明显增加糖的含量与产量，增加一些生物化学的活性，因此，必须了解环境中的铬浓度，才能有效地了解和控制环境。微波消解作为样品分析的新技术，由于消化样品能力强、速度快、消耗化学试剂少、金属元素不易挥发损失、污染小、空白值低等优势，已被广泛应用于各种实验室的化学分析。微波消解和应用原子吸收法对对土壤中的铬测定具有简便快速、灵敏准确的特点，是土壤分析的较好方法。
需氧量是评价水体污染程度的重要指标之一。[7]污染水样的微生物有机体分解消耗水中的氧，使水中需氧量增大，含氧量减少，当溶解氧低于(4mg/l)供给水生动植物生存的必需水平时，水质恶化，严重影响生态系统的平衡。化学需氧量cod、生物化学需氧量bod和总有机碳toc是评价水体有机物污染的三项指标。因bod测定周期长，toc测定结果的相关性较差，因此，cod成为评价水污染的首选方法。利用微波较强的穿透能力和有效的瞬间深层加热作用，样品和试剂分子通过对微波能的吸收，可以使药品中的极性分子在微波电磁场中快速转向和定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦而发出的深层热量足以使水样中的还原性物质被氧化剂充分氧化，这样，微波消解作为测定水体cod前处理部分发挥其举足轻重的地位。 4.微波消解技术地质冶金分析中的应用
地质试样主要指岩石、矿物、土壤、水系沉积物等样品。一些微量元素共存时的存在形态和行为与他们单独存在时不尽一致，使地质试样的分解显得比其它样品要困难得多。
采用teflontef密封容器，氢氟酸与王水分解花岗岩和海洋沉积物样品，溶样60s，火焰和石墨炉原子吸收光谱法测定其中的cr、al、zn，回收率大于97。用王水、氢氟酸微波分解硅酸盐，用icp-aes测定多种元素也得到较好的效果。
由于煤灰化学成分复杂而且含有大量的sio2和al2o3，试样处理及分析测试均比较困难。传统的熔融法和湿法消化操作中引入的沾污经常干扰分析测定过程，而且样品需要分别处理，如：测si的国标方法是将煤灰和naoh混合在700℃熔融，再分别用热水和hcl溶解；测al、ca、fe、mg、ti、mn、k的国标方法是将煤灰分别用hclo4、hf和hcl加热消解；测pb、cr的国标方法是将煤灰分别用hclo4、hf和hno3加热消解。若采用微波消解方法可以用于煤灰中多元素的同时消解和测定。[9]
钢铁工业分析一个长期存在的问题是钢中铝的溶解，传统方法是采用nahso4熔融，但会引入大量易电离元素，不适合随后的光谱测定。采用hno3/hcl/hf消解的高压弹法，虽可避免挥发损失并得到无盐基体，但需要80℃加热1h。采用微波加热只需要80s。微波消解还特别适合用于低温焊接、非铁基耐热合金、硅酸盐材料等。
5.微波消解行业概况和对未来的展望
微波样品处理设备兴起于上世纪最后几十年，对解决长期困扰aas、afs、icp、icp-ms、lc、hplc等仪器分析的样品制备，起了革命性的推动作用。采用微波样品处理设备，样品放在双层密封罐里，在压强或温度控制下，在微波炉里自动加热，难消解的样品几十分钟即可，时间大大缩短，酸雾量也减少，同时也减少了对人和对环境的危害。用酸少，空白低、检出限低，易挥发元素几乎没有损失，结果准确、能耗低。
微波样品处理设备，国外主要生产厂家有美国cem、意大利milestone、美国oi、p.e、加拿大questron等。国内除盈安美诚公司同时在北京和上海有数家企业在生产。与国外同类设备相比，国产仪器差距较明显：
首先：国外采用专门制造的炉体，容积大（40l，35cm）操作方便，采用双磁控管，输出功率达1400～1600w。国产微波炉容积小，一般只有24～28l，22～25cm高，操作不方便，功率仅800w，罐多时升温慢。
其次：样品罐耐压低，国外已达110大气压，我们才14～40个大气压。
最后：控制软、硬件水平低，国外温度压力双坐标同时用图形显示和控制，国内甚至还在采用原始的数控模式。
盈安美诚公司从1993年初开始研制wr系列微波样品处理系统，积累了研发该类产品的实际经验，所以在本课题攻关中，目标是赶超国际水平。盈安美诚公司在攻关过程中不断突破关键技术，使仪器的整体水平达到了国外同类产品的中档水平，并正在建设一套完整的实验方法来配合wr系列微波样品处理系统的使用。虽然该项目技术难度大、指标高，但意义普遍、推广价值大，对国内该行业水平的提高必定会起一定的推动作用。
[1]微波溶样icp-ms法测定人发标样中15种稀土元素的研究刘虎生质谱学报vol.17no.41~5
[2]微波技术在生物样品预处理中的应用张丽华现代科学仪器2004.no.537~40
[3]微波消解icp-aes法测定新疆贯叶连翘中的微量元素易新萍光谱学与光谱分析vol.24no.7890~892
[4]微波消解－氢化物原子吸收光谱法测定食品中铅李凤萍中华预防医学vol.34no.6360~362
[5]微波密闭消解－冷原子吸收法测定生物样品中微量汞郝林中国卫生检验vol.8no.4215~217
[6]微波消解法测定化妆品中铅砷汞朱永芳理化检验－化学分册vol.38no.6305~307
[7]微波消解原子吸收法测定土壤中的铬韩见龙中国卫生检脸杂志第11卷第2期22~24
微生物的多样性篇10
（1.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东青岛266100；
2.青岛理工大学环境与市政工程学院，山东青岛266033）
【摘 要】微生物群落是生态系统中最活跃的结构单位和功能单位，因此了解各种环境中微生物的群落结构有着重要的意义，其研究的技术也一直在进步。高通量测序可以一次获得多条基因序列，使得其在环境微生物学中的研究中倍受青睐。探讨了454高通量测序早在环境微生物学中的应用。
关键词高通量测序；环境微生物；微生物群落结构
微生物群落是广泛存在于生态系统中的一种结构单位和功能单位，它们是生态系统内较为活泼的一部分。群落中各种不同的种群能以有规律的方式共处，进行相互作用，同时它们具有各自明显的营养和代谢类型。了解微生物群落结构的方法主要有分子生物学的方法、Biolog法以及近年来发展起来的高通量测序技术。
1 高通量测序技术
随着科技的迅猛发展，测序技术也在进步，这些测序技术可以在种的水平上对环境微生物进行分析和研究。出现在上世界70年代的Sanger测序法[1]，成本高测序通量低，成为了其广泛使用的限制因素，但它却是20世纪90年代到本世纪初期一直在使用的测序技术。
人类基因组这样庞大的序列分析工作需要，使得新一代的测序技术也发展了起来。它的特点是价格低通量高，高通量则指的是每次分析都能得到几十万或几百万条Dna的序列。454高通量测序是由454生命科学公司在了2005年开发的，2007年，该公司了GSFLX系统，2008年了它的升级GSFLXtitanium。
现在新测序技术的主要平台主要有[2]：罗氏454公司推出的GSFLX+system测序平台，illumina公司推出的miSeq测序平台，和aBi公司的Solid测序平台等。本研究使用的是454高通量测序技术。
454高通量测序原理[3]：它采用的是焦磷酸测序法，是4种酶催化统一体系的酶级联化学发光反应。首先将pCR扩增的单链Dna与引物杂交，并与Dna聚合酶、atp硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5´-磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一轮测序反应中只加入一种dntp，若该dntp与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。焦磷酸盐被硫酸化酶转化为atp，atp就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光。CCD检测后通过软件转化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
扩增和测序可以高度保留细菌的遗传特性，是一种很常见的来确定其分类和组成的方法。通过比较现有的数据库，可确定其来自哪个生物的序列，从而确定细菌门类和各自占据的比例。
2 高通量测序技术在环境微生物中的应用
454高通量测序可以得出某个土壤区域或者生物膜中各种菌类组成，从而研究该区域微生物物种多样性；通过测序可以得到微生物的群落结构、组成，再与微生物活性、营养元素的转化等理化性质结合一起分析，来研究微生物的功能多样性。
张彩霞[4]等运用454高通量测序来研究甘肃不同地区的土壤由荒漠变成百年老农田、约30年的农田、约20年的农田、樟子松林等过程中土壤微生物群落结构变化规律及其影响因素，对比对照组的土壤发现，在由天然荒漠土壤转变成为不同利用类型的土地土壤过程中，具有从多变少再变多的趋势。在天然荒漠土壤中，微生物总量的96%以上，在土壤转变的过程中其生长受到了抑制，有4%的微生物在次过程中生长受到了促进。这个结果表明了土壤的微生物群落结构会受到土地利用类型变化的显著影响。
michaela等[5]人利用高通量测序技术研究了森林凋谢物和土壤中微生物的细菌和真菌群落结构，对28个站点的样品进行分析，发现凋落物和土壤中存在着不同的微生物群落结构。其中，细菌的多样性要比真菌丰富，尤其是在凋谢物中，细菌群落表现出了更高的均匀度。无论是凋谢物还是土壤中的微生物群落结构，都显著受到了树种的影响。
李鑫等[6]运用高通量测序技术分析了盐碱地中，桑树与大豆单作和间作不同种植模式的土壤细菌微生物群落结构差异性。结果显示，间作时土壤的微生物多样性要比单作丰富，即间作使得土壤的微生物群落结构多样性有所提高。同时间作也改变了大豆和桑树的根基微生物群落结构。在盐碱地的种植中，间作不仅可以降低土壤碱性，还使得土壤的群落结构多样性有所提高，植物产量增加。
夏围围等[7]将新一代高通量测序技术与DGGe两种技术结合使用到了研究是新西兰典型草地和森林土壤微生物群落结构上，以16SrRna基因为标靶,通过两种技术来分析土壤微生物群落的结构组成和多样性，同时以此来比较两种技术的优缺点。测序分析结果显示，新西兰草地土壤检测到22门，54纲，60目，131科和350属；而DGGe却只检测到6门，9纲，8目，10科，10属，这表明了高通量测序比DGGe能更完整的表达出微生物的群落结构组成。同样的，在森林土壤也显示出了类似的规律。
3 结论
目前，高通量测序技术仍处于发展的初期，但我们可以预见，在未来几年将是第三代测序技术快速发展和三种测序技术的共存的黄金时代。测序成本将继续迅速下降。科学家们在不同的领域将可以花更少的钱测序基因组物种或转录来达到更好的实验结果和获得更多的新的发现。此外，如何分析通过高通量测序产生的大量数据和从这些数据中提取有价值的生物信息将成为未来研究的热点和重点。
参考文献
［1］SangerF,nicklenS，CoulsonaR.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheUnitedStatesofamerica[J].1977,74:5463-5467.
［2］Quailma,Kozarewai,SmithF,Scallya,StephenspJ,DurbinR,SwerdlowH,turnerDJ.naturemethods[J].2008,5:1005-1010.
［3］meyerm,StenzelU,Hofreiterm.natureprotocols[J].2008,3:267-278.
［4］张彩霞.新一代高通量测序技术研究土壤微生物群落结构对环境条件的影响[D].南京:南京农业大学,2012.
［5］李鑫.苏打盐碱地桑树/大豆间作的土壤微生物多样性研究[D].哈尔滨:东北林业大学,2012.
［6］夏围围,贾仲军.高通量测序和DGGe分析土壤微生物群落的技术评价[J].2014,12:1489-1499.