医学遗传学系谱分析篇1
关键词：医学遗传学；遗传咨询；情景模拟
中图分类号：G642.4文献标志码：a文章编号：1674-9324（2014）46-0225-03
医学遗传学是医学与遗传学相结合、并互相渗透的一门综合性学科。医学遗传学理论学习中主要针对人类遗传性疾病的发生机制、传递规律、诊断方法以及治疗和预后进行系统学习。在此基础上开设实验课，将理论应用于实践，通过遗传咨询估算再发风险和制定应对对策和措施，有效预防遗传病的发生，从而达到降低遗传病发病率的目的[1]。根据现代医学的发展，我国将面临极具缺乏医学遗传学医师这一职业。目前，大多数医院无专门的遗传咨询门诊，使医学生没有机会接触到遗传病病例，学生对遗传性疾病的掌握只限于书本而无临床实践机会，这将会导致临床医生缺乏对遗传病的认知能力。因此，我校从2007年开始对五年制临床医学、检验等本科专业开展医学遗传学实验教学，其中开设了遗传咨询教学内容。通过多年教学实践探索和改进，发现利用情景模拟教学法进行遗传咨询知识点的传授可以更好地调动学生学习的积极性，更好地理解遗传咨询的理论基础及临床意义，培养学生综合运用知识的能力。
一、教学设计
1.明确教学目的。遗传咨询情景模拟教学法是模拟临床遗传咨询的情景进行教学的方法。它是针对临床医学、检验等专业本科医学生在学习过染色体标本的制备与人类非显带染色体核型分析两次实验课的基础上来开展的。通过此次课的学习，使医学生能够充分掌握系谱及系谱分析的理论知识，掌握系谱分析的过程及系谱的绘制方法，熟悉遗传咨询的一般步骤和原则，并能推测系谱中各成员的基因型，计算再发风险，了解系谱分析和遗传咨询的临床意义。在此过程中，培养学生独立思考分析问题解决问题的能力，表达能力，促进高素质医学生的培养。
2.教学内容。情景模拟教学法的主要内容是模拟遗传咨询过程、讲授和熟悉遗传咨询的概念、对象、时机、步骤等。作为医学生首先要让他们明确知道什么是遗传咨询。遗传咨询是由医学遗传学专业人员或遗传咨询医师（或称咨询医师、医学遗传学医师），应用医学和遗传学基本原理，对咨询者提出的家庭中遗传病的发病原因、遗传方式、诊断、治疗和预后、一级患者同胞和子女再患此病风险等问题进行交谈和讨论，并就咨询者提出的婚育等问题提出可供咨询者选择的建议或具体指导措施的过程[2]。遗传咨询的时机和对象是一个人在婚姻或生育方面遇到问题，意识到可能面临患遗传病的风险，或者本人或子女已患有遗传病等情况下的人群。其次，传授和强调进行遗传咨询的一般步骤包括遗传病的明确诊断、绘制系谱并确定遗传方式、估计再发风险、提出对策和措施。遗传病的诊断是一个复杂的过程，包括临床层次、细胞水平、蛋白质水平、基因水平（基因诊断）等四个水平层次的诊断；绘制系谱并确定遗传方式以及估计再发风险需要遗传学理论知识做基础，要求学生在本科医学遗传学中作为掌握的内容加以理解和熟悉后计算再发风险；提出的对策和措施更进一步要求在学生掌握各层次的分子生物学和分子遗传学的系统的理论知识后，给咨询者提出合适的意见和措施。最后，重点强调医生给咨询者提出意见和措施时，要遵循非指令性遗传咨询的原则。作为医生只提出可供咨询者选择的若干方案，并陈述各种方案的利弊提供咨询者选择，咨询医师不应代替咨询者做决定。
3.教学案例的准备。教学案例的好坏直接影响教学效果。任课教师需要注意从多渠道深入开展病案搜寻工作，从病案中挑选诊断明确、典型的遗传病案例，除了教材中给出的常见多发遗传病病例外，也需经常浏览omim（onLinemendelianinheritence）及等互联网址，了解重要的有关临床遗传学最新诊断技术及进展情况。案例挑选出来后，需要进行加工提炼、细心分析、集体讨论，按临床思维进行教学方案的设计。案例设计原则既要传授理论知识，又与临床需要结合，既有利于学生分析，于利于学生演练。
对于案例的教学准备，不但要求任课教师要熟悉案例遗传病的临床表现、发病机理，特别要熟悉遗传病的传递规律、传递方式、诊断方法、治疗方法和预后等方面的相关进展资料，还要要求教师对这些资料的深刻理解和透彻分析，以便针对学生演练过程中出现的各种不准确的表达或者错误的理解进行有效的指导。根据遗传咨询的复杂性，则需要教师具有深厚的理论知识基础，才能提高在模拟遗传咨询教学中的指导能力。因此，在案例准备时，要求任课教师要做好充足的教学准备，以应变课堂中随时出现的问题。
4.教学组织。做好充分的准备后，就进入了模拟遗传咨询情景课阶段，即开始遗传咨询情景模拟教学。由于课堂教学组织难度较大，需要教师在做好充分的案例准备基础上随机应变、深入浅出、因材施教。
教师组织教学的基本过程包括：第一步，教师详细讲解遗传咨询的定义、步骤、方法、意义；第二步，学生选择教师准备好的案例分组讨论，编写案例遗传咨询的对话，并要求学生在课结束后将所编写的对话上交作为课堂作业；第三步，学生两人一组，在45分钟左右的时间内讨论并编写对话，根据临床可能的情景，模拟演练遗传咨询的过程；第四步，当学生模拟演练完成遗传咨询的整个过程后，教师针对学生存在的问题一一进行分析和讲解。在肯定学生正确的理解和表达的基础上指出不当的或者不准确的或者错误的表达。
随着学生不同组别的模拟演练的进行，教师要注意始终引导学生围绕遗传咨询进行交谈，其询问和交谈的内容包括对遗传病的临床表现、发病原因、遗传方式、诊断等情况的了解，询问内容还包括病史、发育史、婚姻史和生育史、家族史，查阅和比对资料进行系谱分析，对咨询者提出的治疗和预后等问题一一作答，并且对患者同胞、子女再患此病的风险提出参考意见。教师始终在一旁提醒、引导和辅佐，并注意把控住整个课堂纪律，使每位学生积极参与到课堂中来，制造出学生在临床实践的气氛，提高学生课堂活跃度。
5.课堂总结。教师根据学生在课堂中的讨论、模拟遗传咨询的情况进行小结，联系理论知识肯定学生在讨论过程中表现好的地方，指出错误或忽视的地方，加深对理论知识的理解和记忆，加深学生对遗传咨询在临床工作的重要性和必要性的理解。最后根据学生在课堂中的表现进行评价，包括学生对案例的分析能力、理论知识的掌握、表达能力、临床综合分析能力、团队合作能力、创新能力等等方面。
二、教学思考与讨论
1.遗传咨询情景模拟教学法的优点和意义。经过多年的教学发现，大多数学生对于应用情景模拟方法进行遗传咨询都非常感兴趣，整个课堂气氛活跃，学生参与度高。整个教学活动中，一直围绕只有真实生活中才存在的病例来进行，组织学生分组开展讨论，教师从旁指导，真正做到以学生为中心，最大限度的激发学生的学习兴趣，取得了较好的教学效果。此教学法解决了以往医学遗传学理论教学与临床脱节，理论教学内容的枯燥难懂，教学手段落后等问题，有效地提高了学生对医学遗传学的学习效果及兴趣，是一种积极有效的教学方法。学生普遍认为通过情景模拟教学，对遗传性疾病的认识更加深刻和形象，他们所学习的内容不再是枯燥乏味的知识，而是在实际临床工作中切切实实需要解决的问题，极大的激发了学生对于学习《医学遗传学》的兴趣。
传统的遗传咨询教学主要以灌输式为主，要求学生大量记忆枯燥无味的基础知识，在这种模式下的教学不利于学生综合能力的提高。相反，经过实践证明，利用情景模拟教学进行遗传咨询，将所学理论知识与实际运用紧密结合，将理论课知识运用于实际临床当中，极大的激发了学生对于学习医学遗传学的兴趣，使学生整堂课都能够融入到课堂教学过程中，使学生将讲台变为他们自由发挥的舞台，而教师课堂中仅仅起到引导作用。在此过程中，学生从被动的接受知识向主动学习转变，既加深了对理论知识的记忆，又培养了学生独立思考分析问题的能力，训练了学生独立思考分析问题的能力。
近年来医患关系逐渐紧张，患者的维权意识也越来越强，如何缓解医患关系也是医学院校在培养学生时需要解决的一大难题。通过临床情景模拟教学的方法，让学生扮演患者有助于建立和谐的医患关系。学生通过扮演患者，能够充分的体会患者的心理和情绪上的变化，站在患者的角度看待就医过程，起到了换位思考的作用。另一方面，学生站在医生的角度学会处理医生和患者之间的矛盾，可以缩短学校与社会实践的差距，帮助学生建立医生角色，为学生将来走向社会处理医患关系奠定基础。
值得一提的是，遗传咨询师在我国医学领域缺乏大量的人才，是一个有待新增的职业。而在美国，绝大多数的医疗用人单位都要求他们的医生通过全美医学遗传学会的考试和资格认证[3]。所以，教师可借此课程向学生宣讲国际国内外医学遗传学理论、临床遗传学的发展的趋势和中国医学发展的所面临机遇和挑战。向学生说明遗传咨询是一项极具挑战的医疗活动，希望有更多的医学志愿者加入这项医疗事业中来。
2.遗传咨询情景模拟教学法的欠缺之处。首先，情景模拟与实际临床有一定的差别，学生由于缺少临床经验，在进行扮演患者的过程中，很容易用到所学的专业术语，与真正临床中所遇到的实际病例有较大的差别，没有达到角色交换的目的。其次，在提出对策和措施时，由于缺乏各层次的分子细胞生物学和分子遗传学的系统的理论知识，并且对所学医学遗传学知识不能灵活运用，只能提出供咨询者选择一到两种方案，没有真正提供可供咨询者选择的若干方案，且无法做到非指令性原则。最后，在教学实施的过程中，由于每位学生学习水平参差不齐，不愿意作为学习的主体，导致过分依赖老师，影响教学效果。目前看来，要使学生都能积极参与到教学活动中，最好的方法是让学生参与真正的临床实践，使学生体会到遗传咨询过程的复杂性。
通过7年的教学效果来看，情景模拟教学极大地调动了学生学习的积极性，真正实现了对医学生综合素质能力的培养，是一个值得推荐的好方法。
参考文献：
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基金项目：遵义医学院教学改革计划项目2013（j-2-7）。
医学遗传学系谱分析篇2
关键词：医学遗传学课程设置助产专业
中图分类号：G71文献标识码：a文章编号：1674-098X（2017）04（a）-0237-02
医学遗传学是一门横跨基础医学和临床医学的桥梁课程，涵盖内容较广泛，不仅涉及经典遗传学的基本原理、分子生物学的基本研究方法，同时还涉及五大遗传病的产生机制、遗传规律等知识。因此，如何针对当前医学生的特点，培养面向21世纪的具有综合素质的医学人才，使医学遗传学课程更贴近临床，使学生更具独立解决临床实际问题的能力，已成为医学遗传与优生学教学的重要任务，而课程标准的实施能够使师生在教与学的过程中更加明确学习的目的和任务，为后续课程的学习奠定坚实的基础。自2014年以来，为了能更好地适应高职院校人才培养的要求，学院在课程标准下针对助产专业医学遗传与优生学的教学进行了改革，并制定出了一套新的课程标准，新课程标准实施以来，既有成效，也有不足。
1开设学期认定
高中毕业生有一定的生物学基础知识，对于高招专业，该课程开设在第一学期，与解剖学、组胚学同步进行，能起到承前启后相辅相成的效果。随着职业院校近10年来对教学课程的改革，生物学早已停设，没有高中的生物学知识的基础，对于以初中生为起点五年制的助产专业学生来说，医学遗传学中的如分子生物学、基因病的产生机制等知识对他们来说，理解起来有一定的难度。所以综合五年制学生特点以及课程开设特点与要求，把医学遗传学设置为解剖学、生理学、病理学等医学课程的后续课程，开设在第四个学期。
2主要教学内容
理论课以课堂讲授为主，要求学生按掌握、熟悉和了解三个层次认真学习，重点是遗传的细胞和分子基础、遗传学的理论与方法在临床医学实践中的应用。通过对一些医院的医生、护士以及助产士的调研结合人才培养方案对不同专业的要求以及该课程内容、课时特点，选取了医学遗传学的教学内容。
3理实比与实验实训项目
医学遗传与优生学在助产专业中开设总学时为32学时，其中理论26学时，实验6学时，理实比为4.3∶1。
医学遗传与优生学有2间独立的实验室，约共80m2，实训仪器仅有易耗品如染色体照片、印油等。一般开设3个实训项目：染色体核型分析、系谱分析、优生咨询。
学院在助产专业去掉了一项传统的医学生物学教学模式里的显微镜实验项目，增加了2项以动手为主实训项目，如优生咨询项目，教师在助产专业学生开课时先以小组为单位模拟一个遗传咨询场景，学生根据患者提供的信息来描绘系谱，然后对系谱进行判断与分析，确定它的遗传方式。如皮纹分析项目，通过提取自己的指纹掌纹再进行统计对比，大大地增强了学生的学习兴趣以及对知识的消化力度。也更好地体现了理实一体化的课程建设目标。
4课程考核方案
以往的教学考查多采用期末结业考试来衡量学生的学业成绩，往往使大多数学生把应付考试作为学习的目的，失去了学习的主动性和兴趣。新课程标准设置后，教师采取了“平时考核（占50%）+期末结业考试（50%）”模式，平时考核形式多样，如课堂提问、课后撰写小论文、实验报告抽查、平r小考等等。
5教学效果
该课程组共完成了助产专业医学遗传与优生学128课时，严格按照新课程标准执行各项教学活动，收到了较好的教学效果，学生普遍反映较好，对医学遗传与优生学的实训项目也产生了较浓厚的兴趣，学生对教师教学的综合测评平均分为96.5，学生的满意度测评优秀率达97.6%。
6采取多样化的教学方法
在医学遗传与优生学的教学过程中，常用的教学方法有案例导入、遗传病例分析导入、讲授、讨论、自学、情景模拟等。值得推介的是助产专业中沿袭的情景模拟与角色扮演教学方法，首先学生以小组为单位，经过自己申请或抽签拟定医生、护士、患者、患者家属等角色，给每一组一个案例，学生在课前要去图书馆或者网上查询所给病例的研究现状及发病情况等，在实训课时通过角色扮演来熟悉临床上遗传与优生咨询的流程，绘制出家系谱图后加以分析，学以致用，很好地把遗传学理论知识跟临床紧密结合，对遗传病的诊断分析乃至治疗产生了浓厚的兴趣，变被动学习为主动学习，改变了学生的学习态度，无形中也树立了医务工作者的使命感。
在医学遗传学新课程标准的制定与实施过程中，老师既感受到了教学改革对职业教育的重要性与可行性，也看到了存在的不足，如课程师资力量欠缺，分配的授课课时也不足，无法适应课程开发与科研的发展；从知识层面来说，书本上的医学遗传学知识也需要不断更新，来适应医学日新月异的变化，目前国际公认的罕见病近7000种，主要涉及儿科、内分泌科、神经内科、骨科等专业，罕见病涉及的科门广，其他常见病如高血压、糖尿病等都与遗传基因有关，因此医学遗传与优生学的知识对于医学生特别是临床、口腔专业（口腔遗传病以及到达100余种、眼科遗传病达20余种）学生来说，应该从分子机制、细胞机制掌握，但是目前设置的医学遗传学课程开设的课时数远远不够，该院学生高考分数并不高，而且文科生所占比例大，学习基础较弱，课时不足可能会达不到理想的掌握知识的效果，当然专科生只有3年的学习时间，还要包括进行临床实习1年，在课堂上学习的时间就只有2年，这也是老师正在研究和考虑的一个问题，在以后的教学过程中，如何在有限的课时里让学生有兴趣和积极地掌握更多的医学基础知识，为临床知识和临床实习与工作驾好桥梁打下夯实的基础。
参考文献
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医学遗传学系谱分析篇3
[关键词]串联质谱；新生儿筛查；氨基酸；酰基肉碱；室间质评
[中图分类号]R446.1[文献标识码]a[文章编号]1673-7210（2014）07（b）-0024-05
自1963年利用枯草杆菌抑制试验进行新生儿苯丙酮尿症的筛查以来[1]，经过40多年的发展，新生儿筛查的概念被普遍认可；筛查技术越来越先进，筛查的方法也越来越灵敏、可靠。我国新生儿筛查工作起步较晚，自1980年代起开始进行遗传代谢病的新生儿筛查，1995年将新生儿筛查工作纳入母婴保健法，使开展新生儿筛查工作有了根本保障。但是筛查的病种有限，主要为苯丙酮尿症和先天性甲状腺功能减退症，纳入遗传代谢病较多依赖生化与分子生物学方法，对技术和设备的要求较高，往往是临床诊治难点。随着人类疾病谱的改变和对出生缺陷的重视，近年国际上开展的串联质谱技术检测病种多，可在2min内检测出45种遗传代谢病，适合大规模遗传代谢病筛查和临床疑似患儿的诊断性检测[2-4]。目前我国越来越多的实验室使用串联质谱开展新生儿筛查工作。鉴于此，卫生部临床检验中心选取了部分开展新生儿筛查的实验室对新生儿遗传代谢病串联质谱检测氨基酸和酰基肉碱项目进行室间质量评价调查。
1对象与方法
1.1室间质量调查对象
2013年选取开展新生儿筛查的实验室19家，为三甲综合医院医院和三甲专科医院临床实验室。
1.2室间质控品的递送和批号
通过特快专递方式向19家实验室邮寄5个不同批号血斑质控品。质控品由杭州宝荣公司提供，批号分别为201311、201312、201313、201314、201315。
1.3样本处理方法及回报结果注意事项
质评物需在2～8℃条件下保存，将质评物当作患者标本进行测定，结果填入对应批号回报表中。回报结果的同时填报使用的测定方法、仪器和试剂名称。
1.4评价项目
氨基酸包括瓜氨酸（Cit）、亮氨酸（Leu）、甲硫氨酸（met）、苯丙氨酸（phe）、酪氨酸（tyr）和缬氨酸（Val）；酰基肉碱包括游离肉碱（C0）、丙酰肉碱（C3）、异戊酰肉碱（C5）、辛酰肉碱（C8）、月桂酰肉碱（C12）、棕榈酰肉碱（C16）、十八碳酰肉碱（C18）。
1.5评价标准
2013年参加新生儿遗传代谢病串联质谱氨基酸和酰基肉碱检测项目调查的实验室共19家，实际回报结果的单位为18家，有1家实验室因质控品丢失未回报结果，回报率为94.7%。回报结果按方法学原理（衍生方法和非衍生方法）同时考虑是否是配套试剂分组，以分组后除外x±3s后的中位数作为靶值[5-6]。氨基酸项目评价标准：靶值±25%；酰基肉碱项目评价标准：靶值±30%。
2结果
2.1氨基酸和酰基肉碱结果
选取高、中、低浓度的3个批号（201311、201313、201315）分别按照方法学原理同时考虑是否配套试剂分组统计见表1、2。
氨基酸项目按方法分组的统计结果，18家回报结果的实验室有14家实验室采用衍生方法不配套的试剂盒，有3家采用衍生方法配套的试剂盒，只有1家实验室采用非衍生的方法。其中，瓜氨基酸项目的变异系数分布在1.52%～25.01%；亮氨酸项目的变异系数分布在2.93%～24.66%；甲硫氨酸项目的变异系数分布在7.83%～43.00%；苯丙氨酸项目的变异系数分布在1.68%～29.67%；酪氨酸项目的变异系数分布在1.60%～35.09%；缬氨酸项目的变异系数分布在6.62%～52.18%。数据显示实验室检测氨基酸一致性好变异系数基本在40%内。
酰基肉碱的统计结果可以看出，18家实验室中有14家实验室采用衍生非配套的试剂检测酰基肉碱，有3家实验室采用衍生配套的试剂检测酰基肉碱，有1家实验室采用非衍生的方法检测酰基肉碱。其中，游离肉碱项目变异系数分布在4.31%～61.40%；丙酰肉碱项目变异系数分布在5.31%～78.69%；异戊酰肉碱项目变异系数分布在16.29%～64.29%；辛酰肉碱项目变异系数分布在4.81%～80.00%；月桂酰肉碱项目变异系数分布在8.12%～55.56%；棕榈酰肉碱项目变异系数分布在5.75%～34.78%；十八碳酰肉碱项目变异系数分布在3.64%～19.17%。数据显示实验室检测酰基肉碱的一致性不好。
2.2按方法学分组计算各组及格率
以项目的中位数为靶值，测定值在靶值±30%内判定为及格。氨基酸项目及格率统计结果中瓜氨酸项目及格率为71.4%～100.0%，亮氨酸项目的及格率为71.4%～100.0%，甲硫氨酸项目的及格率为42.5%～100.0%，苯丙氨酸项目及格率为71.4%～100.0%，酪氨酸项目及格率为71.4%～100.0%，缬氨酸项目的及格率为66.7%～100.0%。酰基肉碱及格率统计结果中游离肉碱项目的及格率为42.9%～100.0%，丙酰肉碱项目的及格率为28.6%～100.0%，异戊酰肉碱项目的及格率为33.3%～92.9%，辛酰肉碱项目的及格率为28.6%～100.0%，月桂酰肉碱项目的及格率为46.2%～100.0%，棕榈酰肉碱项目的及格率为64.3%～100.0%，十八碳酰肉碱项目的及格率为71.4%～100.0%。结果表明，各氨基酸项目成绩好于酰基肉碱结果的成绩。
3讨论
从调查结果看出，串联质谱检测氨基酸和酰基肉碱大都采用衍生的方法，同时大部分的实验室都没有使用配套的试剂，从本次调查结果看使用配套试剂的3家实验室变异系数较小，但是由于配套试剂的实验室数较少，所以不能说明配套试剂比非配套试剂检测结果更具有一致性。结果还能看出，氨基酸检测结果的一致性比酰基肉碱好，及格率较高，这可能与建立的方法有关。mS/mS与以前大多数筛查实验室所采用的系统是完全不同的技术。它具有多种用途、较复杂的系统，基于疾病筛查的特殊性建立方法时应该注意3个方面[7-9]：①方法的确认，主要是对本室建立的方法进行特异性、重复性、精密度和准确性、线性、干扰实验、基质效应考核。②性能验证，建立方法并确认后，可取一定数量已知含量的样本进行分析，验证方法的准确性，或者通过比对实验来考核。③建立并确认截断值。通过分析正常患者的干血斑标本建立分析物的截断值，同时必须考虑方法和仪器的参数以及可接受的假阳性结果的数量。
串联质谱检测在遗传代谢病筛查的应用具有很重要的社会效益和经济效益，一次性检测30～50种氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢病等多种疾病，其科学性、临床价值和社会意义有目共睹，而质量控制方面还有待提高。为了保证检验结果一致性，实验室需要做好室内质量控制[10-13]：使用前需优化串联质谱仪自身参数，使其具有较高的分辨率和灵敏度；长时间的关机开机，离子源的喷雾针及进样孔容易堵塞，需要定期检测调试；样品的处理过程也会对检验结果产生很大的影响，比如内标试剂的配制及每次样品吹干时的气流，氨基酸较难溶于甲醇，配制时需超声足够的时间，衍生化的过程可能会导致某些代谢物或内标的降解（如谷氨酰胺脱氨基转化为谷氨酸）；另外，良好的实验环境、严格的实验室管理制度保证工作人员各司其职、重视预防性质控（如优选试验方法、建立操作规程、仪器的调式和校正、试剂的标定、标本的正确处理、遵章操作、准确计算、做好实验记录等）、重视工作人员的业务培训和考核等也有利于保证结果的准确。
我国疆域辽阔，地域发展不平衡，实验室的质量控制水平也参差不齐，目前部分发达地区的实验室参加美国CDC的室间质评，并且加强对实验室管理，而一些实验室则只关注新技术新方法却缺乏相关质量控制知识并且未开展实验室间的比对。另一方面，卫生部临床检验中心计划增加串联质谱检测氨基酸和酰基肉碱的室间质评项目，此举无疑会提高我国遗传代谢病的研究领域整体水平。
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医学遗传学系谱分析篇4
以单核苷酸多态性（Snp）为核心的Dna分子标记：Snp是基因组中单个碱基缺失和插入，单个核苷酸的颠换产生的差异。Snp位点几乎遍布于整个基因组；其遗传稳定性高，易于进行自动化分析。
Snp在种群中是二等位基因性的，部分Snp可能会直接影响蛋白质的结构或基因表达水平。对于Snp的检测可以通过经典的凝胶电泳法以及高通量的检测方法如，Dna测序法、Dna芯片检测、飞行质谱仪检测、变性高效液相色谱法等。westen等和mead等的实验结果均表明，对于腐败降解的检材，Snp的Dna分析结果较StR的分析结果好。
用于法医学的Dna分子标记技术
1常染色体分析：随着复合荧光标记技术以及自动分型仪器的使用，使得工作者能从少量的Dna检材中获得遗传信息，StR－pCR分析已经成为法医Dna检验中的主要技术手段。人体基因组中含有高变区，这些高变区是一些串联重复序列。StR广泛存在于真核生物基因组中，其核心序列为2～6bp，重复次数通常在5～40之间。StR具有多态性高，操作简单、检测灵敏度高等优点。自20世纪末StRs商业试剂盒投入生产并广泛使用以来，大批商业试剂盒，都包含有15～16个高多样性的StR基因座，例如powerplexReSX、eSi系统、ampFlStRRnGm，这些试剂盒在引物设计，缓冲液成分、扩增条件，提高痕量样本的分析等方面进行了改进。同时商业试剂也在处理降解Dna和痕量Dna方面进行改进，例如减少旁侧区的扩增长度，增加核心位点，如miniStR，以适合更多痕量检材的检测。
2性染色体分析：对于常染色分析受限的检材，性染色体StR为法医个体识别和亲权鉴定提供了新途径。Y染色体由父亲直接遗传给儿子，大部分Y染色体不发生重组，后代遗传变异小，在男性组织成分的个体识别和父系家族的亲权鉴定中具有独特的应用价值。thomas等利用电离飞行时间质谱分析了来自不同种族的16个Y－StR基因座，结果可行。由于Y－StR的局限性，在应用Y－StR进行家系调查时应注意应用的范围，排查前要收集族谱，明确家庭间的遗传关系。X－StR对于双亲缺乏的同父异母姐妹亲缘关系认定、涉及父女关系的单亲亲权鉴定等方面案件有特殊作用。X染色体在遗传过程中为性连锁遗传，在X－StR的应用中应注意连锁不平衡和单倍体等问题。单个StR基因座能提供的信息量有限，主要依靠X－StR复合扩增体系。畅晶晶等通过中国华东地区汉族人群200个无关个体的调查建立遗传学资料，筛选出了48个位点分型结果稳定、重复性好的X－Snp位点。
医学遗传学系谱分析篇5
【关键词】电泳
电泳（electrophoresis）是利用带电粒子在电场中发生移动的一种分离方法。近年来随着基因组学、蛋白质组学的发展，许多新的电泳技术也随之孕育而生。单细胞凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳、双向电泳、毛细管电泳技术的产生，使得Dna及蛋白质在分离和测量方法上有了更精确的提高。另外高效毛细管电泳技术被认为是当今分离生物分子的最重要工具，已被列为人类基因组计划首选分离Dna片段的方法。同时这些先进的电泳技术在现代生物医学研究中也起到了非常重要的作用，本文即对以上几种新的电泳技术的发展与应用加以综述。
1单细胞凝胶电泳
单细胞凝胶电泳（SingleCellGelelectrophoresisassay，SCGe）又称彗星试验（Cometassay）。它的分离原理是根据当各种内源性或外源性Dna损伤因子诱发Dna链断裂时，Dna的超螺旋结构被破坏，在细菌裂解液作用下，细胞内的蛋白质、Rna等扩散到细胞裂解液中，而核Dna由于分子量过大停留在原位。在中性条件时，残留的Dna片段可进入凝胶发生迁移，这时用碱处理或在碱性电解质条件下，Dna会发生解螺旋，释放出Dna断裂片段，由于这些Dna片段的分子量很小，在电泳过程中会离开核Dna向阳极移动，形成彗星状的图像；而未损伤的Dna部分保持球形。在一定条件下，Dna的迁移距离（彗星尾长）和Dna的含量（荧光强度）与Dna损伤呈线性相关，通过测定Dna迁移部分的光密度或迁移距离可以推测出Dna的损伤程度[1]。
由于SCGe具有敏感、简便、快速、低耗等优点，因此被广泛应用在Dna的损伤与修复、遗传毒理、环境监测以及氧化应激和细胞凋亡等研究中[2]。例如在检测外界因素对细胞核Dna的损伤中，SCGe有其独特之处，主要体现在它可以将各种类型的细胞的不同反应有效地反映出来[3]。利用单细胞凝胶电泳法测定镍化物对人血细胞Dna的损伤，检测冰冻保存对外周血细胞Dna的损伤及检测人精子Dna链断裂等在文献中均有报道[4-6]。同时SCGe在Dna切除修复的研究中也具有重要作用[7]。切除修复是人类Dna损伤修复的主要形式，利用SCGe可进行从损伤到切除修复、合成、连接等每个步骤各个时点的观察，可用于Dna修复的分子机理探讨，所以SCGe在检测Dna损伤及修复中有其他电泳不可替代的作用。
外来理化因素对细胞Dna的损伤是引起基因突变及癌症发生的重要因素，并且诱变Dna损伤和致癌效应也是遗传毒理学研究的重要内容。建立快速灵敏的Dna损伤检测方法，对于毒性因素的检测、细胞Dna的保护都是非常有益的。SCGe不仅能提供Dna损伤信息，还可提供环境物质改变修复过程的信息；运用SCGe在活体进行遗传毒理学研究，可了解药物的毒理作用在不同组织和细胞中的分布。pool-Zobel[8]通过口服或吸入亚硝胺的方法，采用SCGe研究药物的动物器官特异性作用，认为器官特异性基因毒性作用与器官特异性癌症密切相关。另外环境中的遗传毒物浓度一般很低，用经典的细胞学方法，如用染色体畸变实验（Ca）、微核实验（mn）和姐妹染色体交换实验（SCe）进行生物监测时，很难得到明确的阳性结果，但利用SCGe检测低浓度遗传毒物具有高灵敏度，并且适用范围广，可检测各种类型组织细胞，特别是来自于直接与环境遗传毒物接触的人体细胞（如口腔黏膜细胞、鼻腔黏膜细胞、食道黏膜细胞），对t淋巴细胞与B淋巴细胞均敏感，因此SCGe这些年广泛用于环境监测[9]。如Rojas等［10］用SCGe检测墨西哥城居民脱落的泪管上皮细胞中Dna，发现由于空气中的臭氧与碳氢化合物超标，通过观察泪管上皮细胞Dna受到损伤的程度，确定北部空气中的臭氧浓度偏高于南部地区。
细胞凋亡是细胞增殖、分化和死亡过程的重要调节机制，该机制发生紊乱与肿瘤发生密切相关。凋亡细胞在核碎裂早期出现大量Dna链缺口，在SCGe中大量Dna进入尾部，且迁移距离延长，甚至与“头部”分离，形成不同于一般损伤的特有形态。根据此形态可计算出细胞凋亡的比例，研究细胞凋亡的机理。由于SCGe的高度敏感性而且能够直接观测单个细胞Dna片段迁移，所以该技术在细胞凋亡检测中发挥着日益重要的作用[11]。另外SCGe在肿瘤学、放射生物学、人群监测、临床诊断与治疗等方面有也具有广泛的应用前景。
2变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelelectrophresis，DGGe）是一种实用价值较高研究Dna突变的分析方法。DGGe主要是利用梯度变性胶来分离Dna片段。当电泳开始时，Dna在胶中的迁移率仅与分子大小有关，一旦Dna移动到某一点，达到该Dna变性浓度位置时，Dna双链开始分开，从而降低了Dna的迁移速率。由于不同的Dna片段具有的碱基组成不同，使得变性条件产生差异，在凝胶上形成不同的条带，从而可以区分Dna突变型和野生型，可以进一步进行基因突变的分析。
另外DGGe还可与pCR联合使用，利用此项技术可以准确鉴定出单碱基替换、移框突变和少于10个碱基的缺失突变。通常先用病人的基因组Dna或者是有突变个体的Dna进行pCR扩增，然后用DGGe进行分析。最早由DGGe筛查的人类基因是珠蛋白位点，以后又有很多位点被筛查，如生长因子Ⅷ基因、生长因子Ⅸ基因等。并且该法适用于大样本的筛查，对一些罕见突变型的筛查也十分有用。
pCR-DGGe的另一个作用是可分析突变组成即突变谱。主要是利用诱变剂体外诱变人类原始淋巴细胞株，使之生成大量的HpRt-突变体，然后进行pCR扩增，用DGGe分析。用定量pCR-DGGe方法还可以确定标本中某特异Dna序列的拷贝数。其原理是将已知拷贝数的内参照与标本中的靶基因共同扩增，然后DGGe分离两者的扩增产物，根据其比率可以确定标本中靶基因的拷贝数。
DGGe经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳（ConstantDenaturantGelelectrophresis，CDGe），瞬时温度梯度电泳（temporaltemperaturegradientelectrophoresis，ttGe）和温度梯度凝胶电泳（temperaturegradientgelelectrophoresis，tGGe）等三种类型。现在上述方法广泛应用于突变分析、遗传病的诊断和肿瘤相关基因的筛查等方面[12]。
其中CDGe是由DGGe改变而来，二者的主要化学物质和基本方法相似，只是凝胶浓度由垂直DGGe来确定，用均一的变性浓度凝胶代替梯度凝胶，使得整个电泳变得更加简单快速。ttGe检测突变的能力和DGGe相接近，但却不需要变性梯度胶。基本方法是：在含有一定浓度尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，使外界的温度不断增加，这样在跑胶的过程中形成一个温度梯度。变性环境是由恒定浓度的尿素和瞬时温度梯度共同形成，这样使得全过程更加简单迅速，分辨率极高。在tGGe中，变性剂形成的梯度被温度梯度所代替，温度梯度由微处理器控制。它与DGGe相比，更加稳定可靠，使得它的应用最为广泛。我国赵永忠等[13]应用tGGe成功地分析了非缺失型地中海贫血突变。Horn等[14]采用tGGe方法对Ⅰ-型神经纤维瘤（nFⅠ）患者进行普查，发现了nFⅠ基因3个新突变。随着对各种遗传病和肿瘤分子病理研究的深入，人们发现的遗传病和肿瘤相关基因也会日益增多，tGGe技术也会得到更多的应用。
3双向电泳
双向电泳（two-Dimensionalelectrophoresis，2-De）作为蛋白质组研究的核心技术之一，目前是分析蛋白质中分辨率最高的工具，因此日益受到人们的关注[15]。近些年双向电泳技术得到了不断的发展和改进，成为分析复杂蛋白质混合物的有效工具，应用于分析当环境变化时细胞增殖、分化、遗传变异、肿瘤发生等过程中的基因表达产物[16]。双向电泳是将两个独立参数（等电点和分子量）结合起来的电泳技术。首先根据蛋白质等电点的不同在pH梯度胶中进行等电聚焦电泳（isoelectricFocusing，iF）将蛋白分离，然后按照它们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-paGe），完成第二次分离。根据第一向等电聚焦电泳条件的不同，可将2-De分为三种系统：第一种系统是在聚丙烯酰胺凝胶中进行，两性电解质在外加电场作用下形成梯度，该系统称为iSo-DaLt。这类电泳的主要缺点是pH梯度不稳定，重复性差，上样量低，不利于不同实验室间进行图谱分较；如果第一向电泳使用丙烯酰胺和immobilines共聚，形成具有pH梯度的凝胶，这种系统称为ipG-DaLt系统，该系统pH梯度稳定，不依赖于外加电场，基本上克服了iSo-DaLt的主要缺点，无论是重复性和上样量等方面均优于iSo-DaLt。第三种是非平衡pH梯度电泳，主要用于分离碱性蛋白质。
蛋白质双向电泳图谱中可显示众多的蛋白质斑点，用图像扫描仪等采集到原始图像后，经背景和污点的校正，可滤掉一部分背景及去除部分水平和垂直条纹，把凝胶上的蛋白质数字化，可获得斑点面积、每点相对黑度等参数。根据标准蛋白（也可用内标，即蛋白质组内的成员），把得到每个蛋白斑点的等电点和相对分子量集中建立数据库。通过此数据库可以提取和发现已知和未知的蛋白质。
与经典的生物化学方法不同，双向电泳的最大优势在于它可对一系列复杂的蛋白质进行分析，而不仅只局限在某一个蛋白质的变化。通过将疾病和对照组相关部位的蛋白组进行双向电泳，然后扫描双向电泳图谱中分离的蛋白斑点，在蛋白图形工作站中，应用melanieⅡ软件，对不同蛋白斑点的分布部位、斑点面积及灰阶、背景过滤，进行2-De匹配及比较，建立参考图谱，最后对比找到斑点的变化，如附加斑点、丢失斑点以及强度上的差异等，这样往往能够发现疾病相关蛋白。
双向凝胶电泳蛋白斑点的矢量图（vectormapofthe2-Dgel）亦被经常使用。如翻译后的修饰和加工对于蛋白质的正常生理功能是必需的，其变化与疾病的发生相关。如果将双向电泳位置与理论预测位置连一直线，即为该蛋白的矢量，如果一个蛋白有多个矢量，表明该蛋白可能有多个翻译后修饰[17]。
4高效毛细管电泳技术
高效毛细管电泳（HighperformanceCapillaryelectrophoresis，HpCe）是80年代后期迅速发展起来的一项新技术，由于它具有高分辨率、高灵敏度、重复性好、可进行定量分析和自动化高等诸多优点，在短短几年时间里就已经成为蛋白质、多肽、核酸及其他生物分子分离和分析的一项重要技术。可以认为，HpCe技术的产生使电泳技术进入一个全新发展阶段[18]。HpCe采用硅烷类石英毛细管柱作为分离部件，毛细管柱内径小、表面积大、散热较好、能够在高电压下进行电泳，这种与色谱过程类似的分离模式可使HpCe的最高柱效能达到106理论塔板数，为分离提供了高的分辨率。同时，由于采用了相应的进样系统和检测系统，使HpCe具备了分离、鉴定和定量分析的能力。
HpCe在生物医学中的应用十分广泛，尤其在蛋白质、多肽、核酸组成的分析方面已取得显著成效。如HpGe可用于蛋白质分子经胰蛋白酶酶解后产生的肽段的分离，并由此得到蛋白质的指纹图谱。HpCe还用于生物技术产品指纹图的研究。重组Dna技术生产的蛋白质类药物经特定酶或化学法水解后，用色谱分离可得到不同的多肽片段的指纹图，不同蛋白质的指纹图具有特征性，这对于蛋白质结构研究和特征性鉴别具有重要的意义。同时HpCe还为蛋白质和多肽的纯度鉴定提供了一种快速、准确的方法[19]。另外HpCe的高分离效能和所需样品量少的特点，也为药物分析及药物体内代谢研究提供了切实可行的分析方法[20]。HpCe的另一重要作用是对低分子量核酸的分离，有报道利用HpCe在30min内完成40～1700个碱基对的Dna片段分离，这使HpCe在Dna序列分析上发挥重要作用[21]。此外，HpCe在环境分析、临床分析以及细菌或病毒颗粒表面研究、细菌代谢产物测定等方面的应用也日渐增多。
电泳技术的发展已有近80年的历史，在早期电泳技术得到了迅猛发展，许多新的电泳技术不断涌现，尽管最近几年电泳发展的脚步缓慢了，但在某些领域仍取得了突破，如空间电泳技术的出现。如今电泳技术正向着全面化、综合化、简便化及实用化方向发展，同时电泳芯片的发展也必然会给电泳技术带来一场新的技术革命。
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医学遗传学系谱分析篇6
关键词半夏;植株形态变异;遗传多样性;有效成分;驯化栽培
半夏(pinelliaternata(thunb.)breit.)又名麻芋头、麻芋子、天落星和野芋头等,为天南星科半夏属多年生草本植物,广泛分布于我国长江流域以及东北、华北等地区[1]。半夏是我国重要的传统中药材,也是重要的出口产品。随着半夏利用范围的不断扩展和市场价格的攀升,有关研究也较为活跃,同时也存在很多亟需解决的问题。
1半夏植株形态变异研究
具有丰富的形态变异是半夏属植物的一个重要特点。生长于不同环境或同一生态环境的不同居群甚至同一居群的不同个体间,各种器官(包括根、球茎、珠芽、叶片、叶柄等)在形态上都存在着丰富的变异类型。其中以叶、球茎和珠芽的变异更明显。对叶和球茎的变异,较早的文献中已有较多报道。近年来,半夏珠芽变异引起研究者的重视。
半夏珠芽变异主要表现在珠芽数量、珠芽着生位置和芽眼数量等方面。据赵忠堂等[2]研究,不同类型半夏形成的珠芽数量差异较大,以线形叶型半夏的珠芽数量最多,芍药叶型半夏的珠芽数量最少。半夏珠芽的多少与种茎大小呈正相关,即同一类型的半夏,种茎越大,形成的珠芽数越多,珠芽在产量中所占比例也越大。还有一类无论是叶柄还是叶端均不结珠芽的“新居群”,经移栽试验和原分布地考证,该类半夏遗传性状稳定。
半夏珠芽正常着生位置在叶柄下部内侧,但有的半夏在叶端也可着生1枚珠芽。据彭延弟等[3]观察,叶端着生珠芽的多为野生的芍药型半夏;在椭圆至披针型和竹叶型半夏偶尔也有,但这类半夏遗传性状不稳定。正常情况下,1枚半夏珠芽上只有1个芽眼,但有时也可见到双芽眼或多芽眼,是由于在珠芽一侧出现疣状突起所致。
对半夏珠芽形态变异的研究不仅有助于揭示半夏种内各类型间的演化关系,也有助于弄清半夏属各种间的系统关系。郭巧生等[4]曾将珠芽变异与其他性状相结合,对主要引自长江中下游地区的15个半夏居群的16个主要形态性状进行模糊聚类分析,将15个居群分成4个类型,即叶柄上均具双珠芽但叶型和块茎形态变异较小的双珠芽型、叶柄上只着生单珠芽但叶型和块茎形状变异较大的普通型、叶柄上具单珠芽但着生位置较低且块茎呈钜圆形的长茎型和叶柄上具单珠芽但居群内常有双珠芽个体出现的复合型。这对于半夏的生物学特性及遗传种质差异等研究具有借鉴意义。
2半夏遗传多样性研究
半夏是一个广布种,具很大生态幅,遗传差异十分明显。据shoyama等报道,半夏种内各群居普遍存在着染色体的复合多倍现象,不同群居的染色体数目为2n=28、72、96、104、108、115、116、118、128。染色体数目的丰富变异决定了半夏的遗传多样性。开展半夏遗传多样性研究,对于半夏资源的保护和合理开发利用具有十分重要的意义[5],但其研究的难点在于找到有效的分析方法。
近年来,借助同工酶技术进行半夏遗传多样性分析的工作日渐增多。张袖丽等通过分析安徽产半夏属的滴水珠、鹤落坪半夏、虎掌及半夏3个居群共6个分类群植株的叶和球茎的est、mdh、adh、sod同工酶,认为叶和球茎中est、mdh的谱带在几者之间都有相互区别的特征,可以作为鉴定原植物及其产地的生化指标。郭巧生等[6]对栽培在同一生境下的16个半夏居群同一生长期叶片中酯酶(est)和超氧化物歧化酶(sod)同工酶谱进行了比较分析,认为est和sod同工酶谱在各居群间甚至同一居群内,除少数共有的特征谱带外都存在着较明显的差异。choi等利用电泳技术研究了半夏愈伤组织中可溶性蛋白质和est同工酶谱型,结果表明由于外植体(花茎、叶脉间和次微管区组织)的不同,电泳谱型存在着十分明显的差异,同时发现谷草转氨酶(got)和过氧化物酶(per或pod)2种同工酶的谱型随培养时间的变化而变化。共有的特征性谱带可认为是相互之间具有共同起源的基因表现,而不同的谱带说明各自在特定的生长环境或不同的进化过程中已发生了趋异分化。
但以同工酶技术分析也存在较大的局限性。即使在半夏的同一居群内,不同个体间也存在着差异;进行同工酶分析时只能以某一类型或某一居群的部分个体为对象,采用计算相互之间的遗传一致度或相同值,甚至直接比较酶谱,显然都缺乏代表性。因此,有研究者认为,采用计算酶谱频率的方法从群体水平比较居群之间的异同,其结果可能要可靠得多。同时,对于多性状的比较分析如采用传统处理办法常会遇到性状的取舍问题,也会影响分析结果,而运用模糊聚类分析的办法更有利于对种内复合体的分类作出客观评价。
郭巧生等[7]还通过对不同半夏居群化学成分的比较来为半夏遗传多样性研究提供依据。结果表明,栽培在同一生境下的6个半夏居群间β-谷甾醇、缬氨酸及精氨酸含量存在很大差异;他们还采用田间试验的方法对16个半夏居群生长节律进行了连续2年的平行比较观测,认为半夏各居群在出苗、展叶、抽薹及倒苗期等方面存在差异。认为这种生长节律方面的差异也可以作为判断不同居群遗传差异的参考依据[8]。
此外,从遗传多样性研究所用的材料看,有观测认为,半夏种内各居群的性状分化除营养器官有很大变异外,生殖器官的变异也较大,实际上后者比前者更具有分类价值。
3半夏有效成分研究
半夏有效成分比较复杂,主要为生物碱、天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、氨基丁酸、半夏蛋白、β-谷甾醇、葡萄糖苷及尿黑酸等。有效成分含量的高低将直接反应半夏作为中药材的品质优劣。季文兰等[9]对狭叶半夏和竹叶型半夏的氨基酸含量测定表明,狭叶半夏的总氨基酸含量高于竹叶型半夏,而且具有一定镇咳祛痰活性的天门冬氨酸的含量也是狭叶半夏高于竹叶型半夏,这可作为狭叶半夏的品质优于竹叶型半夏的重要依据。魏淑红等[10]采用重量法和酸性染料比色法测定表明,狭叶半夏的总生物碱含量高于普通半夏,这也从一个方面反应了狭叶半夏品质优于普通半夏。白权等对川产半夏的总生物碱、β-谷甾醇和鸟苷3种化学成分的含量进行了分析比较,结果表明栽培半夏和野生半夏总生物碱含量差异较大,即使是同一地区所产半夏,总生物碱含量也有高低之分;栽培半夏与野生半夏β-谷甾醇含量分布较为一致,但不同产地半夏β-谷甾醇含量有差异;栽培半夏鸟苷含量高于野生半夏。于超等研究认为,野生半夏的生物碱含量普遍高于栽培品种。曾建红等还研究半夏不同采收期总生物碱含量的动态变化,认为不同采收期半夏的总生物碱含量差异显著。
半夏蛋白是一种植物凝集素,具有抗肿瘤、抗生育等重要的生理作用,tao等将半夏蛋白结晶后,经x射线衍射得出该蛋白的立体构象,发现这种蛋白富含β-sheet及少量的α-helix结构。shen和王克夷等从三叶半夏分离出的结晶半夏蛋白具有凝集和致有丝分裂的活性,同时也是一种毒素,具种系和细胞类型特异性,能够将细胞穿孔,形成离子通道。kurata等通过凝胶电泳和层析,从天然半夏球茎球蛋白组分离出了一种名为6kdp的糖蛋白,通过定量分析技术(eia)测得其总含量为5.75%~8.30%,是半夏球茎中主要的蛋白质之一,并且认为该糖蛋白含量的高低可作为半夏球茎定量分析的一个标准。
此外,张科卫等还研究半夏药材中的脂肪酸成分,发现半夏药材中含有较多不饱和脂肪酸。但由于半夏有效成分十分复杂,除上述主要成分外,对其他有效成分的研究还有待于进一步深入。
4半夏驯化栽培进展
随着半夏野生资源日趋枯竭,半夏的人工驯化栽培成为必然。但人工栽培的问题是种源缺乏,繁殖系数低,同时易感染病毒病,药材质量不稳定。近年来,利用植物器官(茎、芽、根、胚和毛状根等)培育和生产植物产品技术得到迅速发展,特别是组织培养一步成苗法为半夏无性系快速繁殖体系的建立提供了技术支撑。一步成苗法再生周期短,繁殖系数和再生频率高,并能保持半夏原种特性,可作为半夏快速繁殖的有效途径,直接应用于生产。目前,选用半夏球茎、珠芽、叶片、叶柄等作外植体,都成功实现了组织培养的一步成苗。袁燕东等认为,半夏组培试管苗的生长发育和产量均明显优于珠芽与种子,它可以越过半夏的“幼年期”而直接到达“成年期”,并且它比“成年期”的珠芽还具有优良特性。因此,在半夏紧缺时,采用生物工程技术快速繁育组培试管苗,在生产上有重要意义。
半夏的人工驯化栽培也受到重视。山东、安徽、四川等在半夏的人工栽培方面都有较成熟的经验,有的已形成了较完善的成套栽培技术。如在播种和田间管理,包括除草、控水、追肥、培土、遮荫和摘蕾等方面都有较为规范的技术规程;在主要病虫害识别和防治、倒苗预防和球茎防烂等方面都已取得一些经验。张明等还将栽培半夏和其栽培所用的土壤用原子荧光光谱法进行测定,分析了栽培半夏中的重金属含量与土壤重金属含量的关系,对防止人工栽培半夏的品质劣化有积极意义。何道文等[11]还对种茎质量与半夏生长特性和块茎收获量关系进行了研究。
5半夏炮制技术及真伪辨别研究
半夏作为中药材应用,必须根据不同用途采用不同的炮制方法。半夏炮制的最主要目的是祛毒存性、减毒增效。衡量半夏炮制品质量优劣的依据是药理功效的强弱和毒性、刺激性的大小。常用的半夏炮制品有熟半夏、清半夏、姜半夏和法半夏等。王潮奎等[12]研究了半夏炮制过程中加矾量、加热方式与所炮制饮片质量和毒性的关系,结果表明半夏加热加压30min和经8%白矾溶液浸制均可使半夏的麻辣味消除,且水浸出物量增加。高昌琨等通过小鼠扭体试验和家兔眼结膜致炎反应试验,认为不同半夏炮制品对动物黏膜的刺激性大小为生半夏>清半夏>姜半夏>法半夏。赵典刚等认为半夏解毒的方法多种多样,其中以熟半夏的炮制方法简捷、工艺流程数据化、生产成本低,能较好地适应中药现代化发展要求;同时不需要白矾等传统辅料,能有效地防止al3+对炮制品的污染。邓然兴等认为,采用蒸制法姜半夏,可以克服传统炮制工艺中存在的系列缺点。杨玉琴等还用原子吸收法测定半夏炮制品中的微量元素,结果显示:生半夏、姜半夏、法半夏、清半夏含有较多的微量元素,生半夏炮制后,镁元素的含量剧增。因此,如何将传统的中医临床用药理论和现代科学方法相结合,不断进行工艺革新和制定炮制规范是半夏开发利用中的一项重要任务。
药用半夏正品是天南星科半夏属植物。但由于半夏资源短缺,在医药市场上以其他植物充当半夏的情况时有发生。据报道,全国至少有3属12种植物作为半夏代用品使用,充当半夏的植物主要有水半夏、白附子、山珠半夏、狗爪半夏等;在黑龙江发现以紫茉莉根茎处理后充当半夏片,其形态特征与正品极其相似;还有以幼天南星经过蒸煮伪充半夏食用的情况。因此,人们对半夏的真伪的鉴别也进行一些相关研究。
伪品与正品半夏尽管有一定相似之处,但通过性状鉴别、显微特征、层析法鉴别包括薄层色谱法和纸层色谱法等办法均可区别。如半夏与水半夏除在外观形态上有明显区别,可通过性状鉴别、显微特征鉴别以外,也可以通过层析法等方法鉴别。吴皓等通过试验发现,半夏药材的鉴别成分次黄嘌呤核苷为一核苷类成分,该成分水溶性强,对热稳定,且仅在半夏药材中含有。刘玉萍等采用pcr直接测序技术测定半夏及其伪品的18srrna基因序列并作dna序列变异分析认为,在采用传统生药学手段难以鉴别半夏正品与混淆品的情况下,通过dna测序这一高效准确的dna分析方法可在分子水平上解决半夏真伪鉴别问题。将dna分子技术引进中药质量标准研究是今后中药分析的一个发展新方向。
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医学遗传学系谱分析篇7
“炎黄计划”主要分三步：去年10月完成的“炎黄一号”黄种人基因组序列图谱是第一步。第二步是“炎黄99”计划。旨在进行99个人类个体基因组测序及多态性比较，构建黄种人的医学遗传多态性图谱。第三步是在此基础上开展的疾病研究等医学和健康相关的应用研究。
尴尬的测试结果：2005年，Dna研究的开拓者詹姆斯・沃森同意由美国454生命科学公司为自己绘制完整的基因组图谱。正式测序是在2007年3月。在此之前的两年时间，454生命科学公司提取了沃森血样，逐个识别沃森基因的30亿个碱基对。总共用了67天时间为这些碱基对排序。从而绘制了沃森的基因组图谱。
沃森曾公开表示。非洲人的智力低于白种人。观点一经公布。就遭到世人的质疑。而最为尴尬的还是后来沃森个人基因组所透露的信息。
冰岛的一家解码基因公司对开放于网站的沃森的个人基因组进行分析对比研究后发现，沃森的Dna图谱中含有黑人的基因，其基因组中的黑人基因数量是欧洲白人平均水平的16倍(多数欧洲后裔只携带不到1％的黑人基因)。据此，解码基因公司的研究人员说，沃森的曾祖父母或外曾祖父母中可能有非洲人。
尽管对沃森个人基因组的研究结果会有相当多的解读，但有一点不容置疑，即人类不论种族，其基因是相互渗透的；即使有差异，但从基因层面来说也是比较小的。
看基因的“脸色”生活美国塞莱拉遗传公司的创始人、现年60岁的文特尔的基因组则体现了个人健康与遗传关系的特点。他的父亲59岁时就死于心脏病突发。文特尔的基；因组显示。他患心脏病的概率大于一般人，因此最好选择高纤维、低脂肪的早餐食品。所以，在他的早餐食谱中只有一碗麦片和一杯加了少许红糖的脱脂牛奶，以减小罹患心脏病的风险。
当然，文特尔的基因也给予了他安心享受蔓味的权利，比如他在晚上可以放心享用牛排大餐，因为他所拥有的一个基因大大减少了他感染疯牛痛的风险。Dna分析还为他的蓝眼睛找到了决定性依据，那是一个名为0Ca2的基因。不幸的是，文特尔的CFH基因发生了变异。这让他因老年性黄斑痛变而失明的风险增加了4倍。
医学遗传学系谱分析篇8
1.1经穴效应特异性规律研究
主要采用关联规则与频次分析相结合的数据挖掘方法，关联规则旨在提示处方中存在的两个或两个以上腧穴之间的配伍形式，频次分析能够提供针灸治疗某一疾病选用的腧穴及其频繁程度。罗玲等在全面采集古代针灸治疗中风文献基础上，重点进行了选穴的经络症状关联分析，发现针刺治疗中风半身不遂使用腧穴频次最多的为曲池、肩等手阳明经穴；肩、曲池、足三里、百会、风池配伍是最常用处方；多选用足少阳经和手足阳明经穴位。针刺治疗中风不省人事使用腧穴频次最多的为督脉百会穴、心包经中冲穴；风池、百会、曲池配伍或大椎、百会、风池配伍是最常用处方；经脉多选用督脉和足少阳、手阳明等阳经穴位。以上表明针灸治疗中风遵循了辨证循经取穴的处方规律。何冬凤等在全面采集现代针灸治疗心绞痛临床文献基础上，重点进行了选穴的经络部位关联分析。结果发现，心绞痛选穴分布在心包经、膀胱经、任脉、心经最多；选穴主要分布在上肢部、背部、胸部，上肢部用穴中近90％分布于心包经和心经，背部用穴近95％分布于膀胱经，胸部用穴全分布于任脉和心经。以上表明针灸治疗心绞痛遵循了辨位循经取穴的处方规律。数据挖掘结果证实了古代、现代取穴规律和特点与针灸临床理论的一般规律和特点是基本相符的。经络辨证提示了经穴效应的循经性，特定穴的选用提示了经气会聚状态是腧穴发挥效应特异性的关键。
1.2腧穴运用规律的研究
1）神经系统疾病：赵凌等收录了从先秦至清末的偏头痛针灸专著，采用多层关联规则挖掘算法，计算腧穴项集的支持度和置信度，发现手足少阳经脉的穴位丝竹空、风池、率谷、颔厌、头临泣出现频次最高，偏头痛处方配伍中以合谷一风池出现的频次最高，少阳经的交会穴选用最多。杨洁等发现针灸治疗贝尔面瘫中，手足阳明经穴选用最多，重视局部穴位，配合远端选穴，地仓穴为使用频次最多经穴，交会穴、五输穴、下合穴等特定穴运用广泛。吴粮葶等挖掘针灸治疗中风后遗症的现代文献，表明针灸治疗中风后遗症选穴以循经为基础，首选阳经腧穴，分布主要在四肢，阳明经与少阳经的配伍关系最为常用，特定穴为选穴的主体，特别重视交会穴及肘膝关节以下的特定穴。李旗等挖掘出针刺治疗格林巴利综合征所选腧穴以足三里、合谷、曲池、阳陵泉、外关、三阴交使用频率最高，经络则以手足阳明经最为常用。Congmen等以不同针刺手法刺激小鼠足三里，构筑神经元混沌放电的复杂网络来刻画神经元放电时间序列的时变特性。
2）消化系统疾病：任玉兰等通过多维、多层的关联规则分析针刺治疗功能性消化不良的古文献，发现足三里、中脘、脾俞、胃俞、内关是治疗FD最常用的主要腧穴，足三里与中脘相配是最主要穴位组配方式；取穴以循经为基础，主要集中在任脉、膀胱经、脾胃经上；所选腧穴以特定穴为主体，遵循局部与远端取穴相结合原则。张勇等以古文献中治疗鼓胀的经穴为原始数据，运用频数统计及关联规则算法，统计出古代治疗鼓胀最常用经穴为足三里、水分、气海等，通过2次priori关联结果，最终确认组穴1（复溜，中风）和组穴2（复溜，脾俞）在临床应用中具有强关联性。郑华斌等发现在治疗肠易激综合征中，特定穴的使用广泛，其中以足三里为最，其次为天枢、上巨虚、中脘等，脏腑辨证取穴为针刺治疗肠易激综合征的重要原则，以足阳明胃经的足三里和天枢为主。
3）心血管系统疾病：何冬凤等收集从先秦至清末有关胸痹的文献，挖掘结果为历代针灸治疗胸痹以心包经选用频次最高，阴经使用最为频繁，特定穴的选用占有绝对优势，如五输穴原穴络穴等，体现了循经取穴原则。高丽美通过频次分析及关联规则算法挖掘现代穴位贴敷治疗心绞痛文献，结果表明心俞、膻中、内关、厥阴俞使用频次最多，腧穴选用以特定穴为主，俞募配伍使用最多。腧穴分部以胸腹部、背部腧穴为主；以足太阳膀胱经、任脉、手厥阴心包经选用频次较高。
4）其他系统疾病：王洪彬等借鉴文献计量学及数据挖掘的相关方法，对针灸治疗更年期综合征的常用腧穴及经络进行描述性统计。发现现代治疗女性更年期综合征所选取的穴位中以三阴交、肾俞、关元、足三里使用频率最高，膀胱经、任脉、脾经腧穴应用最为广泛。王静等发现源于149篇文献的186条数据元素组成的阿片类药依赖针灸治疗数据库中，用穴频次居于前五的经穴足三里、三阴交、内关、合谷和神门构成了穴—穴，症—穴，研究对象—穴，—穴和戒毒分期—穴等关联规则中的穴位主体。
1.3刺灸方法的应用规律研究
贾春生等提出建立刺灸法文献数据库并设计文献数据应用平台，在此基础上分析数据资料，建立刺灸法数据挖掘模型。此后，各学者运用数据挖掘方法对穴位注射、火针、穴位敷贴、穴位埋线、刺络放血等刺灸法进行了特异性规律及特点的研究。刺灸法挖掘技术的应用中，频次分析最为常用，能够提供各类刺灸法治疗不同疾病的频繁程度，筛选其治疗的优势病种。张选平等发现穴位埋线疗法主要优势病种是内科的胃脘痛、肥胖病、痫证、哮喘、腹痛、面瘫、便秘；外科的腰腿痛；皮肤科的牛皮癣和五官科的重睑术。刘新等总结出放血针具共涉及9种，以三棱针使用频次最高，将放血量人为分为6个等级，其中放血量为少许（少于0.1mL）的出现频次最高，为401次。许晓康等发现水针疗法在内科疾病治疗中出现频次最高，其次为外科疾病，相对于其他疾病，呃逆出现频次最高。
1.4腧穴疾病谱的研究
吴粮葶等通过规范病症、腧穴名称，统计中风后遗症所属病症的针灸病症谱及总结针灸治疗中风后遗症的腧穴谱，结果显示针灸病症谱分布呈偏向性，腧穴谱遍布十四经脉，首选阳经腧穴，常用腧穴以阳明少阳经穴为主。邢晶晶等通过文献比例、疾病比例对内关及其常见配伍的针刺病谱进行分析，总结出内关针刺病谱主要分布于脾胃系和心系；单穴内关针刺病谱中冠心病文献比例最高；内关配伍足三里针刺病谱中呃逆文献比例最高；内关配伍三阴交针刺病谱中焦虑抑郁文献比例较高。黄宗雄等通过对清代及清以前昆仑穴相关文献的整理，挖掘得出：昆仑单穴主治病证33种，筛选出2种优势病证；配伍主治病证45种，筛选出19种优势病证及其高频配伍处方。陈文修等统计出百会单穴主治病证73种，筛选出22种优势病证；配伍主治病证106种，筛选出21种优势病证及其高频配伍处方。
1.5名老中医经验挖掘
张华等对田从豁教授临床病历资料进行整理，发现田从豁教授临床应用穴方共19个，阴交、肓俞、水分配伍使用频次最多。陈裕收集当代名中医针灸治疗偏头痛医案247篇，总结出临床与肝阳上亢型关联密切的是足少阳胆经，血瘀阻络型是手少阳三焦经，风邪上扰型是足太阳膀胱经，气血不足型是足阳明胃经。并且，根据关联规则挖掘提出的基本配穴规律与中医经络理论相契合。
1.6针灸临床决策支持系统构建
针灸临床决策支持系统对于实现针灸临床决策模式的转变有重大意义，基于数据挖掘方法，各学者在此方向进行了有益的探索。任玉兰等提出建立疾病症状、证候症状关系的样本数据库、概率数学模型；再通过遗传算法进行针灸治疗最优方案的选择，构建具有人工智能特征的针灸临床循证诊疗决策辅助支持平台。王佑林等利用复杂网络的K核心思想并改进来寻找针灸治疗疾病所用穴位的主穴信息，使其更好地适应中医决策系统并提供支持。李云松等发现在决策系统中，使用一元字串和二元字串的特征更适合腧穴处方的自动生成，提出了一种基于K近邻方法的腧穴处方自动生成算法，通过分析病历库中与目标现病史最相似K条病历的穴位配方，来自动给出患者针灸治疗的推荐方案。胡绿慧等提出使用weka平台进行编程，分析穴位的支持度与置信度，找出适用于针灸临床方案决策研究的最好方法，用以指导临床医生的方案决策。
2分析与展望
2.1数据挖掘结果能够与传统的中医学理论相契
合并提供新知《席弘赋》云：“凡欲行针须审穴。”可见临证选穴及配伍的重要性。查阅近几年针灸数据挖掘的结果，不难发现，针灸处方的配伍仍大量选用“原络配穴”“俞募配穴”“八脉交会配穴”“合募配穴”“远近配穴”等传统配穴方法，遵循着“循经取穴”的规则，体现了“经脉所过，主治所及”“腧穴所在，主治所及”的规律。数据挖掘在验证传统的中医学理论的同时，还能在海量的文献中发掘出新知，如赵凌等挖掘偏头痛文献时即发现古代针灸治疗该病多采用同名经的配穴方法，发生疾病时即可在相联系的手足同名经的相应部位针刺；赵华等挖掘田从豁教授治疗痹症经验的结果提示上肢疼痛与寒凝、血瘀相关，风寒痹阻与下肢发凉相关。这些新的治疗方法、不易发现的疾病、证候、症状之间的联系，通过数据挖掘为临床提供了新的思路与治疗模式。
2.2数据挖掘在针灸领域存在的不足及展望
针灸数据挖掘起步较晚，不同于中医药数据挖掘文献量大、方法选用较多，针灸数据挖掘文献量较少，且仍以关联规则及频次分析为主要挖掘方法。对针灸选方用穴的规律进行关联程度的分析，虽然能够提供腧穴的使用频率及处方的关联度，但此方法对针灸核心处方及配伍的深层分析如增效、减效等却无能为力。单一的处方关联分析也制约着针灸数据挖掘的进一步发展，其在生物学机制、脑功能分析等的应用基本为空白。而复杂网络分析却在此方面提供了新的可能性。复杂网络方法是通过穴位、疾病、证型等作为基础节点，构筑复杂网络，通过幂律分析、小团体分析、中心性分析等深入分析针灸处方特色的一种数据挖掘方法。可以提炼出核心处方，通过加权与无权的穴位疾病二分网络从宏观及动态的角度揭示腧穴配伍规律。亦可进一步以生物学中蛋白、基因或脑影像学数据作为节点，通过节点间的拓扑网络，深入分析针灸在生物学及脑影像学领域的作用机制。另外，数据挖掘与仿真工程的结合，可以在针刺手法的测定、针灸临床决策系统中发挥更重要的作用。
医学遗传学系谱分析篇9
关键词：分子标记；药用植物；简单序列重复（SSR）；扩增片段长度多态性（aFLp）；单核苷酸多态性分析技术（Snps）
中图分类号：S567文献标识码：a文章编号：0439-8114（2017）13-2401-05
Doi：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.13.001
progressandapplicationofmolecularmarkertechnologyinmedicinalplants
CHenHong-boa，YUJin-ruib，YanGChun-xianb，QianGanga
（a.DepartmentofCellBiologyandGenetics；b.SchoolofDentistry，ZunyimedicalCollege，Zunyi563003，Guizhou，China）
abstract：Bysummarizingtheprincipleandtechnicalcharacteristicsofthecommonlyusedmolecularmarkertechnologyinrecentyearsanditsapplicationinthefieldofmedicinalplantresearch，thispaperprovidesareferenceforthedevelopmentandevaluationofmedicinalplantresources，andfurtherprovidesideasforthescreeningandverificationoffunctionalgeneofmedicinalplants.
Keywords：molecularmarker；medicinalplants；simplesequencerepeat（SSR）；amplifiedfragmentlengthpolymorphisms（aFLp）；singlenucleotidepolymorphisms（Snps）
中是野生中药材资源最为丰富的国家，目前已识别有11000多种，无论其种类或数量均列世界之首[1]，为中国中药文化产业的国际化创造了丰富的资源条件。但近年来，随着人们对养生、保健等意识的不断提高，导致中药材的市场需求极度扩增，一些以野生种质消耗为主的名贵中药材正面临濒危甚至灭绝。传统的研究利用方法在药用植物识别、开发、利用以及保护等方面都相对落后。然而近些年，以RFLp[2]为代表的Dna分子标记技术的兴起，为实现当代药用植物研究的现代化提供了现实手段与条件。分子标记技术（亦或分子鉴别技术或Dna分子标记技术）[3，4]，是一种基于遗传物质的研究方式，这使其具备了不受生长环境的影响、检验精度高及重现性好等优点。随着Dna分子标记技术的不断运用与革新，以分子杂交为基础的第一代标记技术，由于操作过程复杂、周期长等原因，正逐渐退出分子研究领域。而围绕pCR技术为核心的新型分子标记技术正广为使用，并日臻成熟。
1常用分子标记技术的原理及特点
1.1简单序列重复（Simplesequencerepeat，SSR）
SSR亦称为微卫星Dna，它由2-5个碱基组成，如（Ga）n、（tG）n、（GaC）n等，其中最常见为二核苷酸重复形式。SSR序列的长度在不同基因组间由于重复次数以及程度的不同具有高度的变异性，而展现出较高的多态性。SSR标记原理是根据其两端的保守序列设计特异性引物，经过pCR扩增后，再利用变性或者非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，继而体现不同样本基因组Dna的多态性。
简单重复序列具有较多优点，其共显性可区分纯合型与杂合型，以及还有灵敏度高、稳定性好以及操作简便等优点。但目前SSR获得的方式参差不齐，前提都是要提前知道目的基因的序列信息。
1.1.1简单重复区间序列（inter-simplesequencerepeat，iSSR）iSSR是Zietkiewicz等[5]于1994年发展起来的一种加锚SSR技术。它的原理是在SSR引物的5′或3′端锚定2个或以上的SSR碱基，引起特定位点退火，从而提高扩增专一性，得到的特异性片段再通过变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离，最后根据不同的多态性条带分析多态性。
其优点在于无需提前知道样品基因序列，iSSR可为研究者快速高效地提供基因组信息；引物序列相对较长，通过提高退火温度进而保证了结果的可靠性；样本Dna质量要求不高，且所需量少；引物的通用性广，不具种属特异性。但在实际应用中也存在一定缺陷，如：稳定的实验体系条件需要探索构建，且显性标记亦不能区分纯合型和杂合型。
1.1.2表达序列标签（expressedsequencetags，eSts）表达序列标签是基于eSt数据库或cDna文库的一种标记技术，是一种能快速、高效地揭示基因容量的标记方法，由1989年Venter首次提出。它能特异地展示出基因某一位点的表达情况，能够直接反映出功能基因的生物信息[6]，同时也为地道药用植物的鉴别、开发利用提供了新的候选基因。因此，基于eSts开发的SSR技术（即eSt-SSR）是一种稳定、可靠的分子标记技术[7]，可直接用于基因作图[8]，从而指导功能基因的预测。
eSt-SSR与传统SSR技术相比较，无需构建Dna文库而节约了实验成本。而且，在功能基因研究方面，eSt-SSR更接近功能基因组；表达序列标签直接来源于编码序列，从而为基因组比较学以及同源基因的研究提供更可靠的途径。但也有不足之处：与SSR相比，多态性较低；同时，eSts只代表了基因组Dna的一部分，所包含的信息不够全面，且现行的一些序列拼接软件也存在一定的局限性，分析过程中也可能丢失一些重要的基因组信息。
1.2扩增片段长度多态性（amplifiedfragmentlengthpolymorphisms，aFLp）
aFLp是1992年荷兰科学家Zabeau和Vos发明的一项新专利[9]。其原理是植物基因组Dna经过限制性内切酶酶切后（通常采用双酶切），与特定的接头相结合而得到带有特定接头的特异性片段，这些片段再与pCR引物的3′端识别后进行特异性扩增，最后再将扩增产物通过聚丙烯酰氨凝z电泳筛选，进而分析其多态性。
aFLp是RFLp技术与pCR技术的结合，其具备了高多态性、操作简易、可以同时处理大量样品等优点。近年来，aFLp已广泛应用于药用植物遗传图谱的绘制、物种遗传多样性分析及分类研究、辅助育种、功能基因定位等多方向的研究[10，11]，且aFLp目前已被公认为构建Dna指纹图谱最可靠的分子标记。其缺点主要是对样品Dna的质量要求较高，实验成本也较昂贵，扩增所得结果的分析也相对困难。
1.3Dna条形码技术
2003年Guelph大学的Hebert等首次提出Dna条形码的概念。它是以足够变异且相对较短的Dna序列为标准，建立的一种新的生物身份鉴别系统，从而实现对物种快速、精准地识别和鉴定，其类似于超市使用条形码鉴别不同商品。通过特异Dna的比对，对于新种和隐种的发现也具有现实性的帮助[12]。Lahaye等[13]通过单独使用matK基因对1000多种兰科植物进行系统分析，结果证明单独使用matK基因能够发现兰科隐种并证明了Dna条形码分析的可行性；newmaster等[14]运用Dna条形码技术发现了感应草属的3个隐种以及草沙蚕属的1个新种。在2008年召开的植物无国界会议上提出了“超级条形码”技术[15]，决定将叶绿体全基因组序列作为条形码序列应用在植物物种的鉴别上。Shinozaki等[16]第一次完成了单一物种叶绿体全基因组的测序；2008年Diekmann等[17]又提出了一套较为标准的叶绿体Dna提取方法。parks等[18]通过对松属37个样本进行叶绿体全基因组测序分析，验证了叶绿体基因组可以作为植物物种水平上的条形码。近年来，Dna条形码技术在药用植物研究中的报道也逐渐增多，对于加快中国生物进化研究的步伐具有重要意义[19，20]。
1.4基因芯片技术
基因芯片又称Dna芯片或寡核苷酸阵列，它是将大量已知的探针固定在支持物上[21，22]，通过核酸杂交，再利用激光扫描及分析，来实现对目的基因表达水平或多态性的分析。其高通量、自动化的优势使其广泛用于基因的定位、药物的靶向分析及新药研发中。Schena于1995年第一次在论文中发表了Dnachip相关研究，Fodor又于第二年年底研制出了第一块Dna芯片[23]。
基因芯片技术目前主要应用于一些新药的研发[24，25]、药物靶向研究以及疾病的诊断等方面。watanabe等[26]采用高密度基因芯片技术，对经egb761处理的小鼠的皮层和海马细胞的基因表达进行了研究，分析得出其具有拮抗神经病变的药理作用。李美德[27]应用全基因组表达芯片来检测从黄芩根中分离出的汉黄芩素作用于肝癌细胞后的基因表达情况，结果发现406个差异明显的表达基因，通过差异基因的筛选和分析，从而确定了汉黄芩素抗肝癌的分子机制，对药物靶向基因的确定，以及抗癌药物的开发提供了新的依据。郭旭东[28]通过基因芯片技术对急性心肌梗死（ami）患者和健康者外周血的Rna进行差异分析，发现其中的差异基因CYp4F3和USp25可能为ami诊断的基因标记。张玉金等[29]通过利用从中国2010年版药典中筛选出的基原植物以及从nCBi数据库中下载的相应序列进行分析，得到13814条特异性探针，为中国药典中基原植物检测芯片的建立做出了重要贡献。近年来，不同领域的实用芯片陆续都有报道，且基因芯片技术目前已是高通量药物筛选的主要途径，同时也是中药活性成分筛选的重要手段。
1.5单核苷酸多态性分析技术（Singlenucleotidepolymorphisms，Snps）
Snps是等位基因之间的单个核苷酸差异，如单个核苷酸的缺失、插入或者是突变等[30]。Snps标记技术相比微卫星技术而言，Snps描述的是一种双等位基因的多态性，而SSR则是多位点等位基因之间的多态性，故Snps在数量上远远超过SSR，因此具有更高的多态性。在人的基因组中，大概1000bp就会出现一个Snp，因此可以其作为Dna的一种特异性标记[31]。Xu等[32]通过对水稻亲本9311的Snp检测，得到了768万个多态位点，从而绘制了1张高密度的Bin图谱并成功定位了1个QtL。目前，由于Snp技术主要依靠于基因组Dna的大量测序或者是基因芯片技术，且技术要求高以及实验成本大等原因，导致在药用植物方面的研究也相对匮乏。
2Dna分子标记技术在药用植物中的研究应用
2.1中药材种质资源的鉴定、评价及道地性研究
种质资源是指亲本遗传给子代的遗传物质，其包括“道地性”种质资源、新种及重要培育品系等。徐蕾等[33]通过运用SSR标记技术在铁皮石斛种群遗传多样性的研究，证实了铁皮石斛具有较高的遗传多态性，并顺利将36份铁皮石斛材料分成了3个类别。Shen等[34]利用筛选出的iSSR引物准确地鉴别出了8个野生种石斛药品。李永清等[35]利用iSSR技术成功将36份铁皮石斛材料划分为6个类群。赵香妍等[36]通过iSSR标记技术在北京地区野生柴胡种质资源中的研究，得出北京地区野生柴胡具有一定的地域性分布特征，应加以保护及推广种植。
2.2中药材真伪的鉴别及品种鉴定
随着中药材市场需求的不断扩大，中药材市场鱼目混珠的情况时有发生，同类药材由于道地性等导致药效也相差甚远，而常规的检测方式却很难区别。但现行的Dna分子鉴别技术基于高稳定性、不受环境因素及个体发育影响等优点，可以保证鉴定结果的准确性。马晓冲等[37]通过研究证明基于Snp的分子标记技术能够稳定地鉴别中药材泽泻。滕艳芬等[38]利用matK基因已成功将正品与混淆产品鉴别开来。
2.3遗传多样性及种属亲缘关系的研究
药用植物遗传多样性及亲缘关系的研究，对于认识物种的进化历程、遗传育种及物种改良等均具有重要意义。传统的研究方法均是基于对表达产物的研究探索，但药用植物的化学成分及其含量、外部形态等均会由于生长环境及其他因素影响而有所差别。因此，从传统研究的角度探索药用植物的遗传多样性就存在很大的局限性，而从分子角度出发的分子标记技术能有效地揭示物n进化演变过程中遗传物质流动的真实本质，从而使得分子标记技术能够阐明物种进化、遗传背景以及种内或种间遗传关系，为中国珍贵及濒危中药材的开发、利用和资源保护提供真实依据。
近年来，随着分子标记技术的不断应用与发展，已有多种Dna标记技术成功运用于中药材遗传多样性研究及亲缘性分析中。YanG等[39]运用SSR分子标记技术对吉林省5个不同产地的人参材料进行分析，得出不同产地的人参在遗传物质上呈现出较高的多态性。Li等[40]于2013年利用SSR标记法对洋玉兰叶绿体全基因组进行近缘物种比对分析，结果显示洋玉兰叶绿体基因组的重复序列保守性相对较高。2014年，Galina等[41]又运用SSR标记技术对俄罗斯濒临灭绝的人参进行了种群遗传性状的分析。朱田田等[42]利用iSSR对甘肃不同产地中麻黄的遗传关系进行了分析，得出中麻黄遗传距离跟地理距离有一定的关系。黄颖桢等[43]通过使用iSS标记技术对金线莲遗传多样性进行分析，得出在野生种质资源间金线莲具有丰富的遗传多样性。叶炜等[44]通过利用iSSR对金线兰及其近缘物种的遗传多样性进行研究，得出种群间可能存在基因的交流。唐晓清等[45]利用aFLp技术对不同农家栽培类型的丹参进行分析，结果表明aFLp技术可以作为识别丹参不同栽培类型间遗传差异的手段。李勇等[46]利用aFLp技术通过对金莲花遗传多样性的研究，得出地理位置较近的种质遗传相似度较高。唐美琼等[47]利用aFLp技术对广西草珊瑚遗传性状进行研究分析，结果显示广西草珊瑚遗传多样性偏低，须尽快采取相应措施。沈亮等[48]通过aFLp技术分析梭梭遗传多态性得知该物种种内丰度较高，各地区之间的分化较小。李永清等[49]通过iSSR在37份药用石斛亲缘关系研究中的应用，得出iSSR分子标记技术完全可以应用于石斛物种亲缘关系的分析。朱田田等[50]通过对不同黄芪和党参栽培品种遗传关系的iSSR分析，得出不同品种的黄芪和党参拥有较高的遗传多样性，而且种间差异较大。蒋雨晗等[51]利用iSSR分子技术对14份不同来源的白芍进行研究分析，证明了4个栽培种跟野生种之间有一定的遗传差异性，而且可以从基因水平把外型相似的白芍栽培品种区别开来。
2.4Dna遗传图谱的构建及数量控制基因定位
Dna遗传图谱也称基因遗传图谱或连锁图谱，系指基因在染色体上相对应的位置。自从第一张遗传图谱的构建以来，越来越多关于药用植物Dna图谱的构建也相继报道。周志勇等[52]首次用aFLp技术构建了人参和西洋参的Dna指纹图谱，这对人参的鉴别提供了非常有效的工具。虞泓等[53]利用aFLp对石斛4个内种和1个外群种进行Dna多态性分析，用筛选得到的引物构建了5个种的Dna图谱，并应用bootstrap进行了检验，该研究证明了aFLp标记技术可用于构建石斛基因组指纹图谱。赵红燕[54]则利用eSt-SSR、iSSR、RapD、SRap等4种分子标记技术成功构建了浙江铁皮石斛563个遗传连锁。郑伟耀等[55]运用SSR标记天麻基因组Dna，分析得出扩增位点与天麻素含量有关。巫桂芬等[56]通过黄麻基因Dna分子指纹图谱的构建，得出每一种被识别出的物种均有其特有的分子“身份证”。
3展望
中国药用植物种质资源非常丰富，但是近年来由于气候的变化以及过度的开采，使得一些稀少的野生药材资源更是急剧减少，市场也相对混乱，因此从生物本质出发的Dna分子标记技术对于中国药用植物的鉴定、保护、开采、利用及改造就显得格外重要。目前，分子标记技术在药用植物中的研究主要体现在遗传多样性研究、种质鉴别及评价、Dna指纹图谱构建以及基因定位几个方面。
目前在药用植物研究应用中的Dna分子标记技术尚存在以下几个问题：Dna标记技术在中药材研究中的应用较少，而且存在方向聚集现象，近年关于药用植物亲缘性的研究越来越多，然而在其他一些领域，如药材活性成分分离与提取以及相关成分控制基因定位等方面的研究却少有报道，研究范围不够全面和深入。另外，每一种分子标记技术都有其各自的优缺点，实验结果具有一定片面性，而标记技术的联合应用也处于相对空白状态；技术要求高，技术培训相对缺乏。因此，需要加大分子标记技术的研究应用，以便增加其在药用植物研究中的实用性和可靠性，通过以不同分子技术的研究为基础，可达到明确中药材有效药用成分的基因构成，以及各种药用植物基因的调控原理及产物的靶向作用原理，以便对中国中药品种的保护利用及产业化做出更大的贡献，以此实现中国中药文化的规范化、产业化以及国际化。
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医学遗传学系谱分析篇10
摘 要 单核苷酸多态性(Snp)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种Dna序列多态性。Snp现象在人类基因组中广泛存在，并具有很高的信息含量。目前已发现数万个Snp标记，且有多个生物医学网站开辟了专页对其加以介绍。随着对Snp检测和分析技术的进一步发展，尤其是与Dna芯片等技术的结合，它已成为第三代遗传标记，初步满足对疾病相关基因定位研究的需要，尤其是对多基因遗传病高精度基因定位的要求，并将最终取代目前最常用的微卫星标记技术进入基因应用研究的领域。
Snp 单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,Snp),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的Dna序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。Snp在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。
Snp所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的Snp并不包括后两种情况。
理论上讲，Snp既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的Snp都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(C?t，在其互补链上则为G?a)，也可能是颠换(C?a，G?t，C?G，a?t)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的Snp约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。wang等［1］的研究也证明了这一点。转换的几率之所以高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。
在基因组Dna中，任何碱基均有可能发生变异，因此Snp既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的Snp(codingsnp,cSnp)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5［2，3］。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSnp的研究更受关注。
从对生物的遗传性状的影响上来看，cSnp又可分为2种：一种是同义cSnp(synonymouscSnp),即Snp所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSnp(non-synonymouscSnp),指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSnp中约有一半为非同义cSnp。
先形成的Snp在人群中常有更高的频率，后形成的Snp所占的比率较低。各地各民族人群定Snp并非一定都存在，其所占比率也不尽相同，但大约有85%应是共通的［4］。
Snp检测方法 目前已有多种方法可用于Snp检测，如根据Dna列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、Dna芯片以及taqman系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。
传统的Snp检测方法是采用一些已有的成熟技术，如Dna测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLp)、单链构象多态性(SSCp)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(aSo)等。这些技术虽在某种程度上能完成对Snp的检测，但由于它们必须通过凝胶电泳进行检测，因此，距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。传统的RFLp只能检测到Snp的一部分，测序技术既费时费力，又不易实现自动化，而且Dna链的二级结构还容易造成人工假相，使测序结果出现偏差，不适宜于Snp的检测；SSCp则很难满足自动化的需要，难以大规模开展工作。因此，这些方法均未被广泛采用。
Dna芯片技术是近年来新开发的一种Dna序列变异检测工具。Dna芯片(Dnachip),也称生物芯片(biochip),其大小与计算机上的CpU芯片相似，约1cm2或更大些，以玻璃、硅、聚丙烯等作为载体基片，芯片上铺了一层肉眼看不见的Dna纤维“地毯”，即具有特定碱基序列的探针。待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上。由于Dna和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。
目前已有多家公司开展了对芯片的研究，例如美国的affymetrix公司、nen生命科学公司等。前者曾开发出BRCa1(乳癌基因1号)芯片、p53芯片等，后者则在1张玻璃芯片上集成了多达2400个已知基因。此外，ResearchGenetics公司新近开发了1个集成有1500个Snp的Dna芯片，它涵盖了人类基因组全部24条染色体，所提供的信息量至少等于或优于目前常用的300～400个微卫星标记的图谱，检测时只需0.5μg的Dna样品就可进行1次全基因组的扫描。
Snp研究进展和信息搜寻 Snp研究是目前人类基因组研究的又一个热点，1998年wang等［1］首先报道了根据Snp技术建立的人类遗传图谱，其获得的Snp平均距离为2cm(centimorgan);Cho等［5］则在模式生物拟南芥(arabidopsisthaliana)上作了全基因组的Snp图谱定位，该图谱中Snp平均距离为3.5cm。所有这些Snp数据均可为公众免费获取。目前，不仅在人类染色体上，而且在其它生物的基因组上也已建立了Snp图谱。美国、西欧及日本等国的政府、科研机构及部分私人公司斥巨资研究开发的Snp图谱也将向公众免费提供。
近年来，储存在公共数据库里的Snp数量正在以几何级数迅速增长。1999年4月，总共才分析了7000个Snp，其中cSnp占半数；而到了当年12月16日，仅美国的国立生物技术信息中心(nCBi)的Snp数据库就已存放了21172条Snp至1999年10月10日德国的HGBaSe网站也已存放了6503条Snp。
目前已有许多生物医学网站开辟了专门的Snp网页，人们可以很方便地在这些网站上查阅有关的Snp信息。国际上较重要的网站有：(1)dbSnp():该网站是由美国麻省理工学院建立的。它包括数千条已经定位的Snp，可以通过指定染色体的某一区域查询Snp。
其它的Snp站点还有：华盛顿大学，网址是：;美国人类基因组研究所，网址是：www.nhgri.nih.gov/about-nHGRi/Der/variat.htm。
Snp的优点及其应用 由于Snp在任一特定位点上只有2个等位基因，因此，与简单序列长度多态性(SSLp)相比，其所涵盖的信息量很有限，似乎很难满足疾病易感基因精确定位的要求。但这个不足可通过加大分布密度来弥补，而且，这个目标并不是难以实现的，因为完整的Snp图谱完成之后，可以提供远高于此要求的密度。有研究认为，1个二核苷酸重复多态性标记的信息量大约是Snp的2.25～2.5倍，也就是说，1个有900～1000个均匀分布的Snp的图谱在进行基因组扫描时，其所能提供的信息量就足以和目前最常用的有400个标记位点的多态性图谱的信息量相当［6］。所用Snp数量虽多，但因检测速度快，故它将能最终取代SSLp，用于复杂性状的多基因遗传病研究。
人类的遗传连锁图谱至今已发展到了第三代。第一代是限制性酶切片段长度多态性(RFLp)图谱，第二代是微卫星标记图谱，第三代图谱就是Snp图谱。
Snp用作遗传标记具有以下优点：(1)Snp在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。(2)它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。(3)与串联重复的微卫星位点相比，Snp是高度稳定的，尤其是处于编码区的Snp(cSnp),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。(4)部分位于基因内部的Snp可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。(5)易于进行自动化分析，缩短了研究时间。
由于Snp具有以上优点，所以其应用范围较微卫星标记更加宽广，它对群体遗传学、制药业、法医学、癌症及遗传性疾病甚至进化的研究都将产生不可估量的影响。
预计今后Snp将在下列领域发挥重要作用：(1)进行简单和复杂疾病的遗传连锁分析(linkageanalysis)及关联分析(associationanalysis),用于疾病易感基因定位；而且其定位的精度将比微卫星标记精细得多，可直接用于指导易感基因克隆。(2)在“药物基因组学”(pharmacogenomics)研究中，可通过检测Snp的遗传多态性标记揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异的根本原因。(3)也可用于法医研究的罪犯身份的鉴别、亲子鉴定等，此外在器官移植中供体和受体间的配对选择及物种进化的研究中都将具有重要意义。
为了有效地利用连锁不平衡的效力，一个覆盖全基因组的数量至少为10万个Snp的图谱将是有效发挥其作用的前提。有人甚至认为，1个具有50万个Snp的图谱是不可缺少的［17］。但是，目前距此目标还相差甚远。
总之，Snp研究将是二十一世纪生命科学的热点。它与人类基因组计划一起，必将对人类的生产和生活产生不可估量的影响。
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