动物细胞特征篇1
生物力学
摘 要:目的 观察猪主动脉瓣叶去细胞后的组织学和理化性能变化，探讨其作为未来“杂种”瓣膜支架的可能性．方法 新鲜采集的猪主动脉瓣叶经表面活性剂、核酸酶、渗透压变化作用，去除瓣叶组织的细胞成分，在光镜、电镜下观察组织学变化，测定瓣叶组织的含水量、可溶性蛋白含量、热皱缩温度、瓣叶厚度、描计了应力应变曲线．结果 成功地去除了猪主动脉瓣组织中的细胞成分；瓣叶去细胞后组织含水量明显增高［φ(94.6±0.3)％vs(91.2±2.0)%，p＜0.01］，可溶性蛋白含量明显降低［ω(0.041±0.008)％vs(0.056±0.006)%，p＜0.05］；热皱缩温度［(72.0±0.7)℃vs(71.2±0.8)℃，p＞0.05］，瓣叶厚度［(0.8±0.3)mmvs(0.7±0.3)mm，p＞0.05］，断裂强度［(646±133)g・mm-2vs(650±105)g・mm-2，p＞0.05］和断裂伸长率［(57±14)%vs(65±18)%，p＞0.05］均无明显差别．结论 采用表面活性剂、核酸酶结合渗透压变化的方法，能够成功地去除猪主动脉瓣组织的细胞成分，且不影响组织的理化性能，有可能作为纤维支架，用于构建“杂种”生物瓣膜．
引言
大量研究表明，异种生物瓣钙化与瓣膜中的细胞成分关系密切．我们将瓣膜组织中细胞成分去除，研究了其组织学变化，测定了力学强度，探讨其能否作为组织工程瓣膜的异种纤维支架，取得了初步的实验结果．
1 材料和方法
1.1 材料 ①新鲜猪主动脉瓣与4℃hanks液中带回实验室，洗尽血液，轻轻擦去内皮，作为新鲜瓣(F组’n=25)．②去细胞瓣叶的制备［1’2］：瓣叶于10mL・L-1tritonX-1000.01mol・L-1tris缓冲液中(20mL+pmSF100μL/片)，4℃下持续振荡24h；转入10mL・L-1tritonX-1001.5mol・L-1KCl溶液，同样作用24h；0.01mol・L-1trisCl溶液充分洗涤(20mL/片，振荡洗涤10min×6次)；转入100mLDna酶、Rna酶工作液中，加Dna酶2mL，Rna酶100μL，37℃水浴过夜；转入低渗tritonX-100液中，4℃振荡24h，充分洗涤．为去细胞瓣(aF组n=25)．
1.2 方法 新鲜瓣叶去细胞前后分别测定瓣叶可溶性蛋白含量、含水量、热皱缩温度、断裂强度、断裂伸长率．标本经固定后常规制作电镜、光镜标本，观察组织结构．
统计学分析：结果以X±s表示，采用t检验对所有数据进行统计学分析．
2 结果
瓣叶去细胞后组织含水量明显增高［φ(94.6±0.3)％vs(91.2±2.0)%，p＜0.01］，可溶性蛋白含量明显降低［ω(0.041±0.008)％vs(0.056±0.006)%，p＜0.05］；热皱缩温度［(72.0±0.7)℃vs(71.2±0.8)℃，p＞0.05］，瓣叶厚度［(0.8±0.3)mmvs(0.7±0.3)mm，p＞0.05］，断裂强度［(646±133)g・mm-2vs(650±104)g・mm-2，p＞0.05］和断裂伸长率［(57±14)%vs(65±18)%，p＞0.05］均无明显差别．
新鲜瓣(F组)瓣叶组织常规病理切片，He染色，光镜下观察，见瓣叶表面内皮细胞绝大部分已被擦去，纤维层、松质层、室层三层结构完整，纤维细胞无自溶现象，纤维结构无损伤（Fig1a）．扫描电镜下，见表面无细胞成分残留，暴露出粗大的纤维，比较紊乱，深层纤维仍呈波浪状结构（Fig2a）．去细胞(aF组)瓣叶经常规切片染色，光镜下观察，见瓣叶组织中细胞成分完全消失，纤维层、松质层、室层三层结构在失去细胞后，单凭纤维网架亦可清晰辩认，纤维网之间的空白区，应该是原先纤维细胞占据的位置（Fig1b）；扫描电镜下见表面没有任何细胞成分残留，波浪状结构保存完好，排列规则，连极细小的纤维都能保存（Fig2b）；透射电镜下见交错排列的胶原纤维的纵剖面和横断面，纤维横纹清晰，结构无破坏（Fig3a’3b）．
3 讨论
我们采用了表面活性剂、渗透压改变结合核酸酶消化的方法’完全去除了猪主动脉瓣组织中的细胞成分’获得了完整无细胞的纤维网状支架.此无细胞纤维支架与新鲜瓣叶相比在力学强度和稳定性上没有明显差别．经去细胞处理后，与新鲜瓣叶相比，组织含水量增加，可溶性蛋白含量下降，说明此去细胞过程，不但有效地去除了新鲜瓣叶组织中的细胞成分，也去除了大量的可溶性物质.组织含水量的增加，说明瓣叶组织中疏水性的脂质也得到了去除，胶原纤维、弹力纤维构成的网架结构及附着在网状结构上的糖蛋白得到了保留，这些亲水性的物质，使水分在网状结构中聚集，从而引起含水量的明显增加［1］．Courtman等［1］报道采用此方法去除牛心包组织中的细胞成分后，使组织厚度增加20%之多，他认为系含水量增加，组织肿胀所致．我们采用猪主动脉瓣组织，未发现有厚度增加的现象，可能与猪主动脉瓣和牛心包组织结构不完全相同有关．
猪主动脉瓣中含有大约55%的胶原，主要成分为Ⅰ，Ⅲ型胶原，13%的弹力纤维，剩下的为富含粘多糖的基质［2］，而牛心包组织中胶原的含量达90%，主要是Ⅰ型胶原，Ⅲ型胶原含量很少，弹力纤维的含量少于1％［3］.猪主动脉瓣组织在复杂高压血流冲击下长成，其胶原、弹力纤维网状结构可能编织得更致密，更合理，特别是高含量的弹力纤维在猪主动脉瓣中呈蜂窝状结构，使胶原束在其网孔中穿过，有助于保持胶原纤维的形态.疏水性的弹力纤维［1］可能使水分不易在瓣叶组织中大量蓄积，厚度不致显著增加．
动物细胞特征篇2
论文摘要:细胞凋亡又叫细胞程序性死亡，是植物正常发育中必不可少的一部分，目前已成为植物细胞生物学研究的一个热点。本文对植物凋亡的一般特征、植物营养和生殖生长中的细胞凋亡以及植物-病原物互作中的细胞凋亡进行了综合评述，并对植物细胞凋亡研究的现实意义进行了探讨。
细胞凋亡是多细胞生物体在生理或病理条件下部分细胞所采取的一种由内在基因编程调节，通过主动的生化过程而自杀死亡的方式[1]。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以常常又称为细胞编程性死亡。细胞凋亡的现象最早是Kree在1965年观察到的，经过进一步深入研究之后，他于1972年将其重新命名为细胞凋亡。之后近20年，细胞凋亡的研究主要集中在动物，人们越来越认识到细胞调亡在动物生长发育中、尤其在维持动物体内细胞和组织平衡、特化、形态建成和防病、抗病过程中的重要作用。同动物一样，在植物生长发育中也存在着细胞凋亡现象。但由于植物生长发育和细胞结构的特殊性，有关植物细胞凋亡的研究起步较晚。近年来，随着植物细胞凋亡的研究进展，人们逐渐认识到细胞凋亡是高等植物生长发育的必要组成部分，同时也是植物体度过不良环境的重要手段。目前，植物细胞凋亡的研究已成为近年来植物细胞生物学的新兴研究领域和热点之一。本文就植物细胞凋亡的一般特征、检测方法、在植物中的存在及意义作一综合阐述。
1植物细胞凋亡的一般特征
经历细胞凋亡过程的细胞呈现一些典型的形态学变化，光学显微镜或电子显微镜观察可见:细胞体积缩小，染色质凝集、断裂、趋边化，细胞器解体、消失，细胞膜发泡形成凋亡小体(其中包含有凝集的细胞核断片和细胞器)[3.4]。随着研究的深入，分子生物学证据也逐步被阐明:细胞染色质Dna在核小体连接部位断裂，其片段大小为200bp的倍数，经琼脂糖凝胶电泳可见到特征性的Dna梯度(Dnaladder)，此特征还可以通过超速离心、末端标记电泳以及原位缺口翻译技术等进行定性、定量测定。细胞形态学和分子生物学的变化是细胞凋亡的重要诊断依据。
2 细胞凋亡的检测方法
2.1 细胞形态学观察法
苏木素-伊红(He)染色法:石蜡切片的He染色是组织形态学检测的常规方法，光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布，表现在核染色质致密浓缩，核碎裂等。
(1)电子显微镜。电镜观察，凋亡细胞染色质固缩，常聚集于核膜上呈境界分明的块状或新月形小体，初期细胞可见完整的细胞器，细胞膜完整，凋亡小体形成。目前一致认为，电镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判断细胞凋亡的最可靠依据。
(2)荧光显微镜。对体外培养的活细胞经荧光色素处理，可在荧光显微镜下观察细胞形态改变。常用荧光色素有吖啶橙、Hoechst33258或Hoechst33342、碘化丙啶(pi)、溴乙锭(eB)。前两种可分别进入活细胞和死细胞，而后两种荧光素仅能进入死细胞。不同的荧光素使核着染不同颜色的荧光，正常细胞呈均匀荧光染色，而凋亡细胞呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。
2.2 反映凋亡细胞膜改变的方法：染料排斥法。
除了电镜能反映细胞膜完整性外，还可用染料排斥法，如台盼蓝、pi等。坏死细胞膜破损，被染料着染。而凋亡细胞细胞膜完整，不被着染。但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死。因此，此法不能单独用来判断凋亡细胞。另一种方法是判断胞质膜的不对称性。在正常细胞膜上，磷脂酰丝氨酸基团(pS)位于胞内侧，而在细胞凋亡早期膜上此基团则转向胞外侧，以利于被吞噬。因此，磷脂酰丝氨酸基团位置的改变，可作为凋亡细胞的一个标志。
2.3 反映脱氧核糖核酸有规律断裂的方法
细胞凋亡过程中，Dna有规律地断裂可以通过下述几种方法检测出来。
(1)琼脂糖凝胶电泳法。细胞悬液经裂解消化按常规法提取Dna后，于含eB的琼脂糖凝胶中进行电泳，正常细胞Dna呈单一条带。细胞凋亡时呈典型的梯状条带，系180～200bp左右的及多聚核小体的梯状Dna条带。坏死时则呈现模糊的弥散状条带。Dna电泳法是判断细胞凋亡的经典方法.peG6000诱导的小麦叶片[7]、羟自由基诱导的烟草细胞[8]、细胞色素c诱导的胡萝卜和烟草原生质体[9]和乙烯诱导的胡萝卜原生质体[10]发生pCD时均检测到Dna梯状条带。
(2)流式细胞仪检测法。细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用萤光素染色利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞萤光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
(3)原位末端标记法(inSituend2Labeling，iSeL)。通过Dna多聚酶i把已标记的核苷酸结合到Dna的单链断裂处，以寻找有无ap发生。标记的方法有同位素标记、荧光素标记、地高辛或生物素标记等。
(4)原位切口平移法(inSitunicktranslation，iS2nt)。利用Dna多聚酶将核苷酸整合到ap细胞内断裂的Dna3′羟基末端，同时水解5′末端，以修复Dna。若用已标记的核苷酸，即可显示出有断裂Dna的细胞。该法同样也可用于细胞悬液中ap的观察。
(5)末端转移酶介导的缺口末端标记法(tdt2me2diatedX2dUtpnickendlabeling，tUneL)。末端转移酶(tdt)介导的X2dUtp缺口标记法是目标原位检测ap最为敏感、快速、特异的方法，其具有广泛的应用前景。末端转移酶(tdt)可催化在Dna片段的3′羟基末端合成多核苷酸聚合物的反应，即Dna片段加尾。利用末端转移酶(tdt)将标记的脱氧核苷酸转移到Dna缺口或3′羟基末端上，通常所用的核苷酸为dUtp，标记物为地戈辛、生物素、荧光素等。
(6)eLiSa法。对ap细胞内Dna片段的检测还可用eLiSa法。悬浮细胞经裂解，高速离心去除核的成分后，取上清加入已包被有抗组蛋白抗体的反应板，反应后再加酶标抗Dna抗体，若上清中含断裂的Dna片段，则可通过此双抗体夹心法得以检出[11]。
3植物发育过程中的细胞凋亡
萌发的种子中的糊粉层、维管束的木质部、生殖器官的组织(如花药和子房)及根冠等组织中均有细胞凋亡的发生[12]。虽然在细胞水平上，与细胞凋亡相关联的水解酶的激活、一些蛋白的失活以及核Dna的断裂都可以经常观察到，但是这些现象的发生机制到近来才有所了解。
3.1导管的形成
导管是由排列有序的死亡的导管分子(trachearyelements，tes)构成。王雅清和崔克明[13]对杜仲木质部导管分化的研究证明，其分化过程也发生了细胞凋亡。所有这些研究都表明木质部导管分化与细胞凋亡有密切关系。玉米生长过程中在一定条件下根部皮层细胞崩溃死亡形成通气组织，而通气组织与植物的同化、呼吸、蒸腾作用都有密切关系[14].
3.2单性花的形成
许多单性花植物在花原基分化时存在雌蕊和雄蕊原基细胞，在后期发育的特定阶段雌蕊或雄蕊原基细胞出现细胞凋亡，从而最终形成单性花。
3.3大、小孢子的形成和发育
大多数种子植物中，大孢子母细胞减数分裂形成4个大孢子。仅有1个能发育成雌配子体，其余的3个大孢子退化。例如，蕨类植物大孢子母细胞减数分裂产生4个大孢子，这4个大孢子通常呈线型或t型排列，仅有1个能继续发育成雌配子体，其余3个都死亡。对其超微结构的研究表明，其退化解体过程也符合细胞凋亡的基本特征[15]。
3．3雌雄配子体的发育
植物中雌雄配子体的发育有细胞凋亡参与其中。裸子植物雄配子体发育过程中，原叶细胞的退化和雌配子中颈细胞、腹沟细胞的消失及珠心细胞的衰退也是细胞凋亡的结果。在被子植物雌配子体(胚囊)发育过程中，珠心组织被作为营养物质吸收而退化的过程是细胞凋亡[16].
3．4胚的发育
在胚性细胞分化和发育过程中，存在着细胞凋亡[17]。植物的胚由受精卵发育而成，在胚的形成过程中，助细胞、反足细胞和胚柄细胞都因发生细胞凋亡而消失。胚柄由受精卵第一次分裂形成，当胚发育到一定阶段，胚柄发生细胞凋亡，形态上表现为质壁分离，原生质体固缩。单子叶植物的种子中，在胚和胚乳之间有一层或几层排列整齐的糊粉层细胞，含大量糊粉粒。胚胎发育早期由胚柄提供营养形成种子，后期则通过糊粉层细胞形成分泌组织，分泌水解酶，水解胚乳成分，种子萌发后，糊粉层功能完成，便开始凋亡，是典型的细胞凋亡。在种子萌发过程中，其他胚乳和无胚乳种子子叶中一些贮藏细胞也会发生类似的细胞凋亡，没有这些细胞凋亡，幼苗就不能正常生长发育，会因饥饿而死亡。
3.5根冠细胞的死亡
根冠位于根尖的顶部，是由许多薄壁细胞组成的冠状结构。在根的发育过程中，根冠细胞不断脱落，并由顶端分生组织不断产生新的细胞，从内侧补充使根冠细胞得以保持定数。对根冠细胞脱落的研究证明，其脱落过程是典型的细胞凋亡。正是这些细胞的主动死亡，才保证了根顶端分生组织在生长过程中避免与土壤磨擦而受伤，进而保证了根的正常发育。对玉米根尖进行低温胁迫或用细胞毒素类药物如放线菌D、秋水仙碱处理后，这些根尖分生组织细胞同样具有Dnaladder、染色质和细胞核浓缩等特征，说明环境因子和药物也可诱导根尖细胞发生凋亡[19.20]。
3.6 叶发育过程中的细胞凋亡
在叶子的发育过程中，叶缘的各种裂、齿和叶片中的空洞(如龟背竹叶片)的形成等都是由于相关部位细胞的凋亡所造成的。此外，对叶片衰老过程的研究发现，衰老起始时，叶绿体首先被自体吞噬，此后水解酶、Rna酶等活性上升，而且以液泡内半胱氨酸蛋白酶活性最为显著[21]，这些都是细胞凋亡的特征。因此，叶子脱落前叶片的衰老过程也是pCD。
4 环境胁迫诱导的植物pCD
4.1 植物超敏反应中的pCD
超敏反应(hypersensitiveresponseHR)是植物被病原物侵染后所引起的适应性反应，其中的细胞死亡被证明是细胞凋亡。在植物超敏反应中，Dna片段化，特征性切割核小体的核酸酶被激活等生理生化特征和凋亡小体等形态特征都被证实。转贴于
4.2 盐胁迫诱导的pCD
无机盐KCn、naCl、CaCl2和一些重金属离子等在一定条件下均可诱导植物细胞出现与动物细胞凋亡类似的特征。宁顺斌[22]等人的实验证明烟草、玉米的根尖在高盐(naCl500mmol/L)处理后，出现明显的Dna梯状电泳图谱。林久生和王根轩[23]用20%peG溶液(-0.63mpa)对小麦根系进行渗透胁迫，在小麦叶片Dna琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到明显的梯状Dna条带，表明peG处理诱发了Dna核小体间的断裂，末端脱氧核糖核酸转移酶介导的3’oH末端标记法(tUneL)检测出现阳性结果。
4.3 活性氧与植物细胞凋亡
活性氧是一类具有强氧化能力的物质，主要包括超氧化物、过氧化氢、羟自由基等，各种逆境条件，包括冷害、渗透胁迫、低氧、臭氧、紫外线等导致的植物细胞凋亡最终都与活性氧的产生有关。当细胞外一些信息如辐射、高温等通过细胞活性氧传入细胞引起其脂质过氧化或与细胞凋亡有关基因的表达时，细胞也会凋亡[24]。陈明等[25]研究发现以一氧化氮(no)供体硝普钠(Snp)处理小麦可以明显提高RoS清除酶，如过氧化物酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶等活性，从而清除因盐胁迫产生的氧自由基或活性氧RoS，或直接清除RoS来保持细胞处于还原状态。
5 研究植物细胞凋亡的意义及展望
导管细胞的退化死亡、筛管细胞原生质的自溶，形成了植物体的输导组织;这些细胞死亡之前，细胞内物质可被其他细胞回收利用，这是植物能够独立营养的一个特性，叶片衰老死亡即是适应营养重新分配的结果，但这个过程却影响了农产品的产量。因此，要搞清植物细胞凋亡的发生程序，对粮食生产及作物储藏技术改良都具有重要的现实意义。在超敏反应中，被病原体感染的宿主细胞采取主动死亡的方式，从而限制感染部位病原菌的生长，阻止病原菌的传播，以达到防病抗病的目的。这种植物自身的主动抗病反应，若在植物抗病育种中加以应用，使植物能够自动、有效地抵抗病原物的侵染，就可以减少农药的使用，避免环境污染，从而提高人类生活质量。
由于植物细胞凋亡的同步性很低、凋亡时间很短，同时由于细胞内各种因子相互作用，调控机制及其复杂，使分子生物学技术应用于细胞水平的研究存在很大困难。近年来，利用非细胞体系来研究细胞凋亡的模式的建立和应用弥补了上述不足。有研究表明[26]，利用非细胞体系研究细胞内复杂的生化活动具有独特的优越性，在细胞周期调控、Dna复制、核小体与染色质构建等研究中发挥了重要作用。非细胞凋亡体系的建立与利用，在很大程度上促进了人们对植物细胞凋亡生化和分子机制的研究，为植物细胞凋亡研究开辟了新途径。
随着植物细胞凋亡的研究的逐步深入，发现植物细胞凋亡需要研究的方面还很多。植物体发生细胞凋亡的机理还不清楚，植物细胞中与细胞凋亡有关的基因研究还远没有动物深入。尽管许多实验表明植物细胞凋亡与动物是相似的，但分子水平共同特征少，目前仅发现少数几个基因参与植物细胞凋亡的过程[27]。研究过程中常局限于某一特定现象，很少有将这些现象和植物发育的具体过程联系起来，加上植物生长周期较长，给研究带来一定困难。植物细胞凋亡的研究如果能与植物的经济利用联系起来，将具有重要实践价值。如能发现诱导果实发育中细胞凋亡发生的因子，通过人为调控，改变生长发育期，提高果品产量和品质，则将会极大地推动果树现代化生产的发展。
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动物细胞特征篇3
在生物教学中注重概念教学情景的创设，简捷地导入教学内容。教师在概念教学中，引导学生自己总结出概念，使生物概念、原理的学习水到渠成。教学实例：冀教版“细胞的分裂与生长”一节中的核心概念是生物体通过细胞的不断分裂，细胞的数目增多，通过细胞的生长，细胞的体积增大，经过一系列的变化，生物体由小长大。这个核心概念对于初一的学生来说过于抽象，如何把生物体是如何由小长大的这个抽象概念具体化、形象化，设计概念教学情境播放动、植物细胞分裂的动画，学生通过观看细胞分裂过程的动画，观察细胞分裂的特点，可以自己总结出细胞分裂的概念，并能总结出细胞分裂最终的结果是细胞数目的增多。实验教学情境引出核心概念，例如，学生分组制作不同部位的洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片，课件展示不同部位的细胞，学生观察找出这些细胞有什么不同。通过学生的观察可以总结出细胞生长的概念、细胞在生长的过程中体积由小长大。
二、画概念图分析概念之间的联系，有助于概念的迁移
在教学过程中，教师可以把讲授的概念内容在黑板上绘制成概念图。概念图的绘制，改变了学生的认知方式，学生对所学的知识体系一目了然，建构了知识的整体框架。概念图的绘制使学生更能清晰地分析出概念之间的联系，以及新旧知识间的联系和区别，这样有利于新旧知识的整合，促进有意义学习，最终达到知识的有效迁移。例如，冀教版七年级下册“神经调节的基本方式———反射”这节课反射的概念、反射弧的组成、反射和反射弧的关系是本节的重要概念。通过概念图的讲解，学生对本节的重要概念形成了系统的知识网络，不再是死记硬背，机械的记忆，概念图还总结了前面章节中学过的神经系统的组成，在复习旧知识的同时又学习了新的知识，达到知识的迁移，促进学生有意义的学习。
三、动手制作生物模型加强感性认识，使知识经验化、直观化，有助于概念的形成
新课程理念认为学习是一个主动建构知识的过程。实物能最直观、最有效地表述生物的特征，能够让学生充分地理解事物；一种好的记忆方法、好的讲解方法都能够让学生根深蒂固地记住事物。教学实例：冀教版七年级上册“细胞的结构”一节，在讲细胞的结构时，我课前先准备好琼脂、培养皿、花生、绿豆、芸豆、小麦、塑料膜等实验材料，让学生自己动手制作细胞模型，制作完成后，再由代表讲解所制作的细胞模型是哪种生物的细胞，其中所选的实验材料代表细胞的哪些结构。学生在亲自动手制作细胞模型的过程中，建构了细胞结构的组成这个核心概念，加深了对动物细胞和植物细胞的区别这个知识的理解。
四、在生物概念教学中利用“归纳”教学模式，注重重要概念的建构
动物细胞特征篇4
细胞免疫
对虾血淋巴细胞分为透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞，主要具有吞噬、包囊和胞吐功能，能够合成和释放多种免疫活性因子参与体液免疫［16］。研究发现，30℃高温组的罗氏沼虾（macrobrachiumrosenbergii）血淋巴细胞的吞噬和清除能力显著高于20℃常温组，说明高温具有促进对虾血淋巴细胞免疫力的作用［17］。而且高温感染组对虾的血淋巴细胞总数显著高于常温感染组［10］，表明在高温下感染对虾白斑综合征病毒能诱导宿主细胞非特异性免疫力升高。
体液免疫
对虾等甲壳类动物体内没有类似t淋巴细胞和免疫球蛋白等特异性抗体，酚氧化酶激活系统在对虾非特异性免疫中起着关键作用。酚氧化酶是合成黑色素的关键酶，能诱导多种血淋巴细胞的体液防御反应［18］。在高温下用美人鱼发光杆菌（photobacteriumdamsel）感染对虾，其酚氧化酶、超氧化物歧化酶、呼吸爆发活性均显著高于常温感染组［19］。高温下感染对虾白斑综合征病毒的日本囊对虾（marsupenaeusjaponicas）诱导出的酚氧化酶活性显著高于常温感染组［10］。表明高温条件下感染对虾白斑综合征病毒，对虾的非特异性免疫力高于常温感染组，能够在一定程度上抵御感染。
细胞凋亡
细胞凋亡是高度调控的细胞程序性死亡，在维持多细胞动物细胞稳态、细胞数量和组织大小等方面具有十分重要的作用。在细胞凋亡过程中，细胞内外凋亡信号依靠着一系列精确调控的半胱氨酸蛋白酶介导的酶促级联反应和能量依赖性，最后由半胱氨酸蛋白酶－3执行关键的凋亡程序［20］。在病毒感染宿主细胞的过程中，病毒会激发宿主细胞内的相关感受器，随即激发细胞内的凋亡反应。当病毒感染细胞诱发凋亡后，感染细胞会通过提前溶解，形成凋亡小体并被周围的细胞吞噬，不引起炎症反应，进而起到消灭病毒的作用，所以细胞凋亡在宿主细胞抵抗病毒感染的过程中起着重要作用［21－22］。另一方面，入侵的病毒为了复制更多的子代病毒，会分泌多种抗凋亡蛋白与凋亡通路中的关键蛋白作用，起到阻断或者延迟细胞凋亡的作用［20］。整个病毒感染过程中，宿主细胞的凋亡和病毒蛋白的抗凋亡作用相互对抗，特别是在病毒感染的初期尤为关键。
高温感染对虾白斑综合征病毒诱发的细胞凋亡
在常温下感染对虾白斑综合征病毒后，随着病毒感染程度的加重，斑节对虾（penaeusmonodon）细胞凋亡指数上升，直至死亡［23］。对人正常皮肤和尖锐湿疣的皮肤局部高温处理后，均检测到了凋亡信号［24］，表明病毒和高温均能诱导宿主细胞凋亡。高温感染组的凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）的平均凋亡指数显著高于常温攻毒组（p＜0．05），在触角腺、甲壳下上皮组织、结缔组织、心脏、肝胰腺、淋巴器官、心包膜、胃上皮中均检测到了不同程度的细胞凋亡，而到感染后期凋亡指数下降［25］。这个趋势与对虾白斑综合征病毒在高温条件下的增殖趋势一致（结果待发表①），表明细胞凋亡对于对虾白斑综合征病毒在宿主体内的增殖具有一定的抑制作用。在凋亡信号通路中，需要活化一系列的半胱氨酸蛋白酶，最后由半胱氨酸蛋白酶－3执行凋亡程序。目前，已在斑节对虾、墨吉明对虾（Fennero－penaeusmerguiensis）、凡纳滨对虾中成功克隆出了半胱氨酸蛋白酶－3，对虾白斑综合征病毒感染会诱导其表达量显著增加（p＜0．05）［26－28］。在日本囊对虾中，用Rnai干扰半胱氨酸蛋白酶后，宿主细胞的凋亡率下降，病毒增殖［29］。进一步表明细胞凋亡对于宿主细胞抵抗对虾白斑综合征病毒感染的重要性。
病毒的抗凋亡作用
研究发现，用非特异性凋亡诱导剂放线菌素D处理细胞后，会诱导细胞出现凋亡，但是用对虾白斑综合征病毒感染后，会抑制细胞凋亡［30］。在细胞凋亡抑制过程中，对虾白斑综合征病毒合成了多个抗凋亡蛋白作用于细胞凋亡途径的不同蛋白。目前发现的对虾白斑综合征病毒抗凋亡基因有oRF390、wSSV222和Vp38等，其产物分别通过切割半胱氨酸蛋白酶－3的DeVD272G和半胱氨酸蛋白酶－9的VetD233G、LeHD303G位点、利用泛素化作用介导肿瘤抑制样蛋白降解、抑制半胱氨酸蛋白酶－3启动子的活性来发挥抗凋亡作用［31－33］。但是关于高温与对虾白斑综合征病毒抗凋亡基因作用之间的关系尚未见报道。
热休克蛋白
热休克蛋白具有高保守序列，在各物种中均有表达。热休克蛋白具有折叠、组装、细胞内定位、分泌、调控和降解其他蛋白的作用。根据热休克蛋白的序列同源性和分子质量，将热休克蛋白分为热休克蛋白110、热休克蛋白100、热休克蛋白90、热休克蛋白70、热休克蛋白60、热休克蛋白40、热休克蛋白10和小热休克蛋白家族［34］。生物体受到应激（如高温、氧化应激、细菌、病毒感染等）都会诱导热休克蛋白的表达，而热休克蛋白70家族的基因序列最保守，研究得也最深入，细胞受到应激后变化最显著［35］。热休克蛋白70家族主要包含有组成型热休克蛋白70和诱导型热休克蛋白70［36－37］。在正常环境条件下，组成型热休克蛋白70在各物种中均保持低水平表达，即使在应激条件下，其表达量变化也不显著［38－39］。但在应激条件下，诱导型热休克蛋白70表达量则会显著升高［40－41］。虽然二者在表达模式上差异极大，但结构相似：在n－末端44ku的atp结合结构域和C－末端30ku的底物结合结构域［42］。目前发现诱导型热休克蛋白70基因缺失内含子，而组成型热休克蛋白70含有内含子［43］，这种基因上的结构正好对应诱导型热休克蛋白70，能够在应激状态下快速表达，有效保护细胞免受应激损害。高温能够诱导诱导型热休克蛋白70的表达，提高宿主细胞的耐热性，帮助细胞度过高温应激状态。
1组成型热休克蛋白
70对高温对虾白斑综合征病毒感染的作用目前，已在斑节对虾、中国明对虾（F．chinen－sis）、凡纳滨对虾、罗氏沼虾等主要对虾中克隆出组成型热休克蛋白70，为研究其作用机制提供了丰富的理论基础［44－47］。研究发现，在瘤病毒、腺病毒、轮状病毒感染宿主细胞时，组成型热休克蛋白70能够协助病毒入侵细胞、病毒蛋白组装、降解、细胞转换、病毒Dna复制等［48－50］，表明组成型热休克蛋白70能够诱导一些病毒感染宿主细胞。在对虾白斑综合征病毒感染对虾过程中，组成型热休克蛋白70依靠其三磷酸腺苷结合结构域和多肽结合结构域，与对虾白斑综合征病毒系统性感染相关蛋白Vp28作用，表现出特异性结合和三磷酸腺苷依耐性，协助其感染宿主细胞［51－52］。在常温下，对虾白斑综合征病毒感染初期，组成型热休克蛋白70的表达量升高，半胱氨酸蛋白酶－3活性很低；但在感染晚期，组成型热休克蛋白70的表达量下降，半胱氨酸蛋白酶－3的活性显著升高；用组成型热休克蛋白70的dsRna作用对虾白斑综合征病毒感染对虾发现，其细胞内的半胱氨酸蛋白酶－3活性显著升高［53］。这种组成型热休克蛋白70的表达水平与宿主细胞凋亡之间的关系表明，对虾白斑综合征病毒的感染能够诱导宿主组成型热休克蛋白70的表达，进而抑制细胞凋亡，最后病毒顺利增殖。而在高温下，组成型热休克蛋白70的mRna表达量仅在高温应激的1h内增加2～3倍，0．5h后即恢复至正常水平［44］。前期研究表明，组成型热休克蛋白70受到高温和病毒刺激后的短暂时间内表达量上升，随即恢复到正常水平，但是组成型热休克蛋白70正常表达量较少，所以在高温抑制对虾白斑综合征病毒感染的过程中并不会起主导作用，不会影响整个感染过程。
2诱导型热休克蛋白
70对高温对虾白斑综合征病毒感染的作用诱导型热休克蛋白70是热应激反应的关键效应蛋白，具有高保守性和分子伴侣作用，在细胞内发挥蛋白折叠、细胞周期调控和抗凋亡作用［54］。在罗氏沼虾（GenBankno：aY466445）、斑节对虾（GenBankno：aF474375）、凡纳滨对虾（GenBankno：aY645906）、克氏原螯虾（procambarusclar－kii）（GenBankno：DQ301506）等主要养殖对虾中成功地克隆出了诱导型热休克蛋白70。基于这些基因信息，针对高温抑制对虾白斑综合征病毒增殖的分子机制展开工作，能够深入研究诱导型热休克蛋白70的作用。在对流感病毒和仙台病毒的高温研究中发现，诱导型热休克蛋白70能够抑制细胞核释放核糖核酸蛋白复合体来阻止流感病毒的增殖［55］；诱导型热休克蛋白70能够破坏Hn蛋白的组装来抑制仙台病毒的复制［56］。伴随高温抑制对虾白斑综合征发病的过程，对虾白斑综合征病毒的增殖受到显著的抑制，诱导型热休克蛋白70的mRna水平和蛋白水平均显著升高；通过特异的Rna干扰作用，诱导型热休克蛋白70的表达水平下降，对虾白斑综合征病毒增殖［57］。这表明诱导型热休克蛋白70的表达升高能够显著抑制对虾白斑综合征病毒的增殖，但是关于二者相互作用的分子机制还有待进一步研究。诱导型热休克蛋白70依赖其atp结合结构域和多肽结合结构域，能够与线粒体途径的上游和下游关键凋亡蛋白相互作用，抑制细胞外和细胞内凋亡途径［58］。虽然诱导型热休克蛋白70具有一定的抗凋亡作用，但是在高温抑制对虾白斑综合征发病的过程中，细胞凋亡率显著高于常温感染组，对虾白斑综合征病毒增殖数量显著低于常温感染组，表明诱导型热休克蛋白70的抗凋亡作用在高温抑制对虾白斑综合征中作用不显著。诱导型热休克蛋白70和组成型热休克蛋白70同属于热休克蛋白70家族，具有相同的蛋白结构域，已发现组成型热休克蛋白70与对虾白斑综合征病毒的Vp28直接作用，那么诱导型热休克蛋白70能否直接与对虾白斑综合征病毒相关蛋白作用，从而抑制其增殖，有待试验进一步证实。
动物细胞特征篇5
在判断优先权要求是否成立时，对于在后申请来说，需要比较的“主题”既不是说明书的整体内容，也不是一项权利要求记载的某个或某些技术特征，而是在后申请的每一项权利要求所要求保护的技术方案。换言之，在后申请的一项权利要求既是判断在后申请的“主题”的最大单位，也就是不能将不同权利要求所要求保护的技术方案组合起来，判断该组合是否能够享受优先权；也是判断在后申请的“主题”的最小单位，也就是不能再将一项权利要求所要求保护的技术方案进一步割裂开来，得出其中某一部分技术特征能够享受优先权，另一部分技术特征不能享受优先权的结论。此外，在判断优先权要求是否成立时，并不要求在后申请的某项权利要求所要求保护的技术方案必须完整地反映在首次申请的某项权利要求中，只要在先申请作为一个整体披露了在后申请的该权利要求的各个技术特征即可2。
笔者通过一个驳回决定实例（发文序号：2014031700898600）进一步说明相同主题的判断在优先权核实中的作用。
在先申请（美国临时专利申请US60/772，588）的说明书第12页的实施方案1记载了一种通过电感耦合等离子质谱（iCp-mS）用于细胞组成分析的方法，包括步骤（a）提供包括来自正常和实体肿瘤组织的液体中的单个颗粒的样品，所述样品通过酶解离和机械方式或通过来自体液的细胞分离获得；（b）……；（c）……；（d）……；（e）……。
在后申请（申请号：200780005269.7）的权利要求1限定了一种通过电感耦合等离子质谱用于细胞组成分析的方法，包括：（a）提供包括动物、植物、细菌或真菌源的全细胞或细胞颗粒的样品，所述细胞颗粒选自由分离的染色体、分离的细胞核、分离的线粒体、分离的叶绿体、以及分离的病毒组成的组；（b）……；（c）……；（d）……；（e）……。
驳回决定认为权利要求1不能享有优先权的理由为：（1）在后申请的权利要求1中没有限定细胞或颗粒的获得方式是“所述样品通过酶解离和机械方式或通过来自体液的细胞分离获得”；（2）在后申请的权利要求1中限定了“动物、植物、细菌或真菌源的全细胞或细胞颗粒的样品，所述细胞颗粒选自由分离的染色体、分离的细胞核、分离的线粒体、分离的叶绿体、以及分离的病毒组成的组”，该特征没有记载于在先申中，在先申请记载的是具体的用于细胞组成分析的方法，其在具体的实施例中涉及特定的样品和特定的细胞类型以及其他具体的实验条件。因此，在后申请的权利要求请求保护的方法与在先申请的上述记载，是存在实质不同的。
针对驳回决定认为权利要求1不能享有优先权的理由（1），在“浅谈优先权中相同主题的判断原则”的文章3中，该文章的作者通过分析审查指南中给出的相同主题的定义，得出了在判断在后申请是否能够享有优先权时应当以“直接和毫无疑义地得出”为判断原则的结论，即修改不超范围的判断原则与优先权中相同主题的判断原则相同。同时，对于业界现有的几种用于判断优先权的方法，作者分别通过具体的实例证明了这几种方法与审查指南中的判断原则存在一定的差距，并且在某些情况下会导致错误的结论。
实际上，欧洲审查指南4在第F部分第6章明确指出了相同主题的判断原则与修改不超范围的判断原则相同：“thebasictesttodeterminewhetheraclaimisentitledtothedateofaprioritydocumentis，asfarastherequirementof"thesameinvention"isconcerned（seeF-Vi，1.3（iv）），thesameasthetestfordeterminingwhetherornotanamendmenttoanapplicationsatisfiestherequirementofart.123（2）”。
针对本实例，笔者认为，在后申请的权利要求1中虽然没有限定在先申请中记载的“所述样品通过酶解离和机械方式或通过来自体液的细胞分离获得”，但在后申请的权利要求1的整体技术方案在在先申请中已有清楚的记载。本领域技术人员根据在先申请的整体记载内容能够直接毫无疑义地得出在后申请的权利要求1的技术方案。对于申请人而言，如果要求在在后申请的权利要求中限定在先申请中记载的所有特征或内容，这显然是不合适的。尽管在先申请中记载了“所述样品通过酶解离和机械方式或通过来自体液的细胞分离获得”，但该特征属于本领域的公知常识，即使在后申请的权利要求中不限定该特征，本领域技术人员也能够直接毫无疑义地确定全细胞或细胞颗粒样品的获得方式。因此，在后申请中省却该公知常识性特征而获得的技术方案，应是本领域技术人员能够直接毫无疑义地确定的。
在笔者看来，问题的一个关键似乎在于：在后申请中缺少的技术特征是否属于公知常识。
如果缺少的该技术特征“不属于”公知常识、熟知技术（例如，在先申请中记载了用于细胞组成分析的方法的细胞是需要通过特殊的方法才能够获得的而采用其他方法无法获得），那么在后申请的权利要求的技术方案中没有限定该技术特征将会导致该技术方案的保护范围扩大，同时“缺少该技术特征也能实现在先申请的技术效果”无法从在先申请中直接和毫无疑义地得出。因此，在后申请的权利要求不享有优先权。
如果缺少的该技术特征“属于”公知常识、熟知技术，即使该技术特征在在后申请中没有记载，我们也可以认为在后申请的技术方案也通常包括该技术特征。在本实例中，权利要求1所缺少的技术特征“所述样品通过酶解离和机械方式或通过来自体液的细胞分离获得”是本领域的公知常识。虽然在后申请的权利要求1中并未限定在先申请中记载的“所述样品通过酶解离和机械方式或通过来自体液的细胞分离获得”，但是细胞或颗粒的获得方式对于本发明请求保护的方法而言不是关键的，并且请求保护的分析方法不需要基于细胞或颗粒的获得方式而发生改变。因此，即使在后申请未限定此技术特征，该技术特征也可以从在先申请中直接和毫无疑义地得出。因此，在后申请的权利要求享有优先权。
针对驳回决定认为权利要求1不能享有优先权的理由（2），笔者认为，在判断优先权要求是否成立时，应当把在先申请作为一个整体进行考虑。即使在叙述方式上并不完全一致，只要在先申请作为一个整体已经阐明了在后申请的权利要求所述的技术方案，则在先申请文件就清楚地记载了在后申请权利要求所述的技术方案，在后申请可以享有在先申请的优先权。虽然在先申请记载的是具体的用于细胞组成分析的方法，其涉及的是多种特定的样品和特定的细胞类型，但是在后申请的权利要求1描述的全细胞在在先申请的权利要求11（所述细胞是动物、植物、细菌或真菌的全细胞）中有明确的记载，而细胞颗粒在在先申请的权利要求12-16和说明书的实施例11-16（所述颗粒是动物、植物、细菌或真菌来源的全细胞；所述颗粒是分离的染色体；所述颗粒是分离的细胞核；所述颗粒是分离的线粒体；所述颗粒是分离的叶绿体；和所述颗粒是分离的病毒）中有明确的记载。因此，在后申请的权利要求的各个技术特征记载在在先申请的说明书和权利要求书中，在后申请的权利要求可以享有优先权。
基于上述解释，申请人提出了复审请求。复审委发出了复审决定书（第104808号），其中指出（1）细胞获得方式为本领域的常规方法，即使在后申请未限定此特征，其整体技术方案在在先申请中已有清楚记载；（2）在先申请作为一个整体清楚地记载了在后申请的权利要求1中的技术特征“动物、植物、细菌...”。因此，复审委撤销了国家知识产权局所做出的关于在后申请的权利要求无法享有优先权的驳回决定。
“相同主题”的含义是什么？是否意味着在先申请和在后申请的内部必须完全相同？答案必然是否定的。申请人在提出在后申请时，应当允许申请人基于在先申请的记载内容，对技术方案进行重新整理和撰写。在后申请中要求保护的技术方案在语言表述上不同于在先申请的记载内容，这在涉及专利领域，特别是涉及复杂技术的专利领域是十分常见而又合乎情理的。
动物细胞特征篇6
1西医治疗肾病综合征
西医认为，该病主要的病理机制为免疫复合物沉积，以膜性肾病、系膜增生性肾炎及局灶性节段性肾小球硬化较为常见。而激素类、细胞毒药物及抗凝等药物具有抗炎、抑制抗体及免疫反应等作用，能够改善患者病症。
1.1激素冲击治疗:糖皮质激素等激素能够抑制巨噬细胞和其他抗原呈递细胞的功能、溶解敏感动物淋巴细胞、能够强烈抑制多种致炎因子如前列腺素、白细胞介素、白三烯、粒巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子等，降低补体，对组胺及黏附分子进行抑制，从而起到一定的治疗效果[2]。然而，该类激素的一般使用方法对该病的治疗效果并不显著。此外，该类激素的大剂量使用也会导致很多的副作用。
1.2细胞毒类治疗:环磷酰胺等细胞毒类免疫抑制剂，可以使细胞的Dna发生双链断裂，可以与细胞内的Rna及蛋白质相结合，阻碍Rna和蛋白的合成，同时还能够对B细胞及t细胞的功能进行抑制。当细胞毒类免疫抑制剂大剂量使用时可以对免疫耐受进行诱导，使动物在很长时间内对各种特异抗原不发生反应，以此来达到治疗效果[3]。
1.3抗凝治疗:临床上通过使用血小板解聚药抑制血小板磷脂酶（a2），抑制血小板释放血管活性物质及生长因子，从而抑制肾小球的局部炎症。血液黏度的降低，加快了血液循环，从而对缓解了患者的病情[4]。临床上常用低分子肝素来治疗患者血液凝滞的状况，该药可以促使血管内皮细胞释放纤溶酶原活化因子，从而提高血管内皮表面的抗血栓活性。
1.4环孢素a疗法:环孢素a是一种选择性较强的免疫抑制剂，它能选择性地抑制t细胞增殖和B淋巴细胞增殖，从而抑制肾小球系膜细胞的增殖。有研究显示激素型难治性肾病综合征患者在使用了环孢素a治疗以后，病情明显得到了好转。环孢素a在治疗难治性肾病综合症方面虽然是一种有效药物，临床发现该类患者在药物停用后容易反复发作，有的患者会出现肾功能损害及高血压等不良反应，临床上使用该药的患者需要医护人员密切观察。
1.5霉酚酯酸疗法:霉酚酯酸是一种新型的免疫抑制剂。其可以明显的抑制患者t细胞的产生及t、B淋巴细胞的增殖。该药物通过抑制细胞表面黏附因子的合成，来抑制内皮细胞、纤维母细胞及平滑肌细胞的增殖，通过减少炎细胞浸润来静滴活动性病变率，从而降低对肾实质的损害，改善患者的肾脏功能。
1.6大剂量静滴丙种球蛋白疗法:临床上根据患者情况使用丙种球蛋白，该蛋白可以提高人体免疫系统的功能，改善肾上腺皮质激素对患者的治疗效果。
2中医及中西医结合治疗肾病综合症
中医将肾病综合症分为实证和虚证两种类型。马鸿斌等[6]对100例肾病综合症患者进行回顾性分析，结果显示邪实诸证的总出现率中水湿证最低，湿热证所占比例最高；正虚诸证的总出现率中肝肾阴虚及气阴两虚最低，脏腑辨证涉及肝脾肺肾，以肾虚为主；肺肾气虚所占比例最高。有学者[7]对80例难治性肾病综合症进行研究，本病辨证分为标证5型：水湿证、外感证、瘀血证、湿热证、湿浊证；本证4型：脾肾阳虚证、肝肾阴虚证、肺肾气虚证、气阴两虚证。
针对不同的辩证分型，中医辨证治疗、配合激素分阶段辨证治疗以及以基础方为主的辨证加减或配合激素治疗等治疗方法都获得了一定的应用，且部分方法的治疗效果显著。
3讨论
难治性肾病综合征由于容易反复复发，对药物不敏感等问题使得该病成为目前临床治疗比较困难的一种疾病。西药在治疗该病的过程中常规疗法疗效甚微，而非常规疗法具有一定的疗效，但由于大剂量的使用，导致副作用加大，损害了身体的其他机能。中药在治疗方面根据辨证医治疗效显著且副作用小，对机体损害较小，但治疗时间过长。为了获得更佳的治疗效果，将中西医结合起来将是其未来的发展趋势。
参考文献
[1]alexopoulose,Stanqoum,papaqiannia,etal.Factorsinfluencingthecourseandtheresponsetotreatmentinprimaryfocalsegmentalglomerulosclerosis[J].nephrolDialtransplant,2009,15(9):1348-1356
[2]唐珊珊.甲基强的松龙、环磷酰胺冲击治疗难治性肾病综合征疗效观察[J].河北医药,2010,32(21):2997-2998
[3]王创国,王智杰,代鲜鸽.大剂量地塞米松与环磷酰胺双冲击治疗难治性肾病综合征34例临床分析[J].陕西医学杂志,2010,39(5):609-611
[4]LouisCU,morgensternBZ,ButaniL.thromboticcomplicationsinchildhoodonsetidiopathicmembranousnephropathy[J].prediatrnephrol,2008,18(12):1298-1300
[5]Hayashit,Saiton,Shojit,etal.Cyclosporinamonotherapyinnephroticsyndromewithcontratindicationofsteroidtherapy[J].internmed,2009,38(3):272-275
动物细胞特征篇7
[关键词]脂蛋白(α);急性冠脉综合征;循环复合物
[中图分类号]R541[文献标识码]a[文章编号]1673-7210(2010)01(a)-009-03
theeffectandmechanismoflipoprotein(α)anditsimmunecomplexesinacutecoronarysyndrome
LUoGenyan,Laiweiguo,LinJia,QiUYinbing
(DepartmentofGeriatrics,Ganzhoupeople'sHospitalofJiangxiprovince,Ganzhou341000,China)
[abstract]acutecoronarysyndromeisacomplicatedandacuteischemicsyndrome.thispapermakesasummaryonthestructureoflipoprotein(α),thecorrelationwithcoronaryheartdisease,theeffectandmechanismoflipoprotein(α)anditsimmunecomplexesinacutecoronarysyndrome,inordertoproducesomelogicalproofsfortheclinicalpreventionandtreatmentofacutecoronarysyndrome.
[Keywords]Lipoprotein(α);acutecoronarysyndrome;immunecomplexes
急性冠脉综合征(aCS)包括不稳定型心绞痛、非St段抬高性心肌梗死及St段抬高性心肌梗死[1]。不稳定斑块破裂和随之发生的血小板聚集、血栓形成是导致aCS的最主要机制[2-3]。最近,越来越多的研究表明脂蛋白(α)[lipoprotein(α),Lp(α)]在aCS不稳定斑块的发生、演变及破裂过程中起着重要的作用,并已有研究证实了Lp(α)循环复合物的存在。因此,深入了解Lp(α)及其循环复合物对急性冠脉综合征的危险评估和作用机制将具有很大的临床意义。
Lp(α)由挪威遗传学家Berg[4]于1963年首先发现并命名。2000年,Gambhir等[5]研究认为Lp(α)是动脉粥样硬化(aS)的危险因素。1987年,mclean等[6]报道Lp(α)中的载脂蛋白(α)[apo(α)]与纤溶酶原(plasminogen,pLg)具有高度同源性,从而认为Lp(α)还可能与纤溶系统有关。这引起了医学界的极大关注,促使人们更深入地研究和认识这一特殊的脂蛋白分子。
1Lp(α)的结构特征及分布
Lp(α)由脂质和蛋白质两部分组成,其脂质成分与低密度脂蛋白(LDL)极其相似,但Lp(α)含有独特的apo(α)。由于apo(α)基因位于6号染色体长臂2区7带(6q27)的邻近区,含有Kringle环状样结构,与pLg基因中第4个环状样结构氨基酸序列有75%～85%的相同,这就决定了apo(α)与纤维蛋白溶酶原有高度同源性及交叉免疫反应性。
2Lp(α)在急性冠脉综合征中的作用及机制
病理资料结果显示,不稳定型心绞痛患者破裂斑块中Lp(α)含量明显高于稳定型心绞痛患者[7-8]。越来越多的临床研究也支持Lp(α)与急性冠脉综合征之间的明确相关性[9-10]。
2.1Lp(α)对血管壁的作用
Lp(α)在血管内皮下定位与停留并作用于内皮细胞,促进平滑肌细胞增生,参与急性冠脉综合征的形成。
2.1.1Lp(α)在血管内皮下定位与停留Lp(α)在血管内皮下定位与停留是其引起单核细胞移行、脂蛋白氧化、泡沫细胞形成、平滑肌细胞增殖的前提条件[11]。Lp(α)易沉积于血管壁,因为其有与细胞外基质成分结合的能力。apo(α)与血浆纤溶酶原结构相似,当动脉壁损伤后,Lp(α)即潜入动脉壁,其apo(α)可结合纤维蛋白,但因apo(α)的蛋白酶区域无活性,故它不能像纤溶酶那样水解纤维蛋白,结果使Lp(α)纤维蛋白复合物沉积在动脉中。总之,大量Lp(α)停留并聚集于血管壁造成一种抗纤溶环境,促进泡沫细胞形成、脂肪斑块形成及平滑肌细胞增殖。
2.1.2Lp(α)作用于内皮细胞现在研究认为内皮功能不全是aS的早期特征。allen等[12]研究表明,Lp(α)诱导细胞内游离钙离子浓度升高,从而刺激血管细胞黏附分子-1(VCam-1)、e-选择素(e-selectin)在培养的人冠状动脉细胞中的表达。当血管内皮细胞受损后,Lp(α)可促进白细胞对血管内皮的黏附性及向血管内皮的转移,在动脉粥样硬化早期阶段发挥作用。Galle等[13]研究发现,Lp(α)可以诱导内皮细胞的凋亡。近来研究表明,Lp(α)可以诱导内皮细胞的肌动蛋白应力纤维形成,从而导致内皮细胞的渗透性增加[14]。
2.1.3Lp(α)促进平滑肌细胞增殖平滑肌细胞增殖是aS斑块的重要病理特征,研究证实天然Lp(α)有明显促平滑肌细胞增殖的效果[15]。Lp(α)可降低转化生长因子-β(tGF-β)的活性,刺激平滑肌细胞迁移并增殖[16]。有报道称在不稳定型心绞痛患者中,Lp(α)在斑块中的沉积区域与平滑肌细胞在血管内膜中的增殖程度有关[17]。
2.2Lp(α)对凝血纤溶系统的作用
2.2.1Lp(α)干扰纤溶系统apo(α)结构与pLg有高度同源性,Lp(α)就可以通过apo(α)与pLg竞争性地结合位于内皮细胞、单核细胞和血小板等表面的pLg受体,干扰纤溶酶原转变为纤溶酶。血中Lp(α)呈高浓度时,与pLg竞争性地结合pLg受体的几率增大,使pLg丧失功能的数量增多,使纤溶酶形成减少,从而减少血栓溶解。同时Lp(α)还竞争或抑制纤维蛋白原、纤维蛋白及其分解产物上的pLg受体,导致高凝状态和血栓形成前状态,促进血栓形成。Lp(α)也可以与组织纤溶酶原激活抑制物-1(pai-1)竞争性地结合组织纤溶酶原激活剂(t-pa)。Lp(α)是t-pa的抑制因子[15],增加pai-1的活性[16],干扰纤溶系统的平衡。Lp(α)还能上调内皮细胞表达pai-1[17]。
2.2.2Lp(α)干扰血小板功能血小板在急性冠脉综合征的病理形成中发挥着重要作用,血小板聚集血栓形成及随后的冠脉狭窄是aCS的主要特点。研究表明,高浓度的Lp(α)可与数量增多的血小板相结合,Lp(α)对血小板的活化起促进作用;Lp(α)能使血小板蛋白激酶C底物47kD蛋白磷酸化反应增强,是其活化血小板的标志[18-19]。
2.3Lp(α)自身氧化[oX-Lp(α)]及其循环免疫复合物[Lp(α)-iC]
Lp(α)含有多种不饱和脂肪酸,在机体抗氧化能力降低、抗氧化剂减少时,Lp(α)与低密度脂蛋白一样可发生氧化修饰。研究发现,Lp(α)虽以同样的方式被氧化,但oX-Lp(α)被氧化的程度明显大于oX-LDL。这可能由于Lp(α)含有较少的抗氧化物质如维生素e、β-胡萝卜素而含较高量的游离脂肪酸或Lp(α)而易被氧化敏感性更高有关。Lp(α)氧化修饰后,结构和特性都发生了改变。一方面,oX-Lp(α)增强了与巨噬细胞-清道夫受体的结合,从而更加促进了泡沫细胞的形成;另一方面,oX-Lp(α)与pLg同源性增大,更具有致病性,oX-Lp(α)能更有效地与pLg竞争特有细胞表面的pLg受体,干扰纤溶系统,促进血栓形成。
oX-Lp(α)也作用于内皮细胞,一方面诱导内皮细胞的凋亡。实验表明,oX-Lp(α)诱导人脐静脉内皮细胞凋亡作用远强于n-Lp(α),但其如何传递刺激信息而调控凋亡有待进一步研究。另一方面促进内皮细胞活化,分泌细胞因子及黏附分子等。oX-Lp(α)能促进人脐静脉内皮细胞活化,使p-选择素(p-selectin)和血小板衍生生长因子(pDGF)表达增加[20]。赵水平等[21]还对LDL、n-Lp(α)、oX-LDL、oX-Lp(α)四种脂蛋白的作用进行比较,结果显示oX-Lp(α)的作用最强,支持oX-Lp(α)比oX-LDL具有更强的致动脉粥样硬化作用的观点。
oX-Lp(α)同oX-LDL一样可以启动免疫应答,产生自身抗体,进而与之结合,形成iC。Romero等[22]报道某些患者体内存在抗oX-Lp(α)自身抗体,提示体内可能存在Lp(α)-iC,那么针对氧化型脂蛋白(α)中氧化部分的免疫炎症反应可能参与动脉粥样硬化的发生及发展。wang等[23]发现冠心病患者血浆Lp(α)-iC水平明显升高,并且与LDL-C、apoB、tC、tG和Lp(α)水平呈正相关,与HDL-C和apoa1水平呈负相关;LDL-iC、Lp(α)-iC均明显增加细胞胆固醇酯含量,导致泡沫细胞的形成,且效果强于oX-LDL和oX-Lp(α)。
3结语和展望
aCS已经成为全球关注的临床综合征。研究表明,Lp(α)及其循环免疫复合物在aCS的发生及发展过程中起着重要的作用,Lp(α)-iC有望成为新的aCS的预测指标,但Lp(α)及其循环免疫复合物在aCS中的具体机制尚不明确,有待进一步研究。另外,由于Lp(α)在常用的实验动物中缺乏表达,导致动物模型在探索Lp(α)功能中的使用受到阻碍。然而,表达人类Lp(α)的转基因鼠和兔[24]将会弥补这一遗憾,必将发挥重要作用。
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(下转第26页)
(上接第页)
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动物细胞特征篇8
关键字：pCD，植物凋亡，程序化，研究展望
【分类号】Q942
细胞程序死亡（programmedcelldeath，pCD）也常常被称为细胞凋亡，是生物体发育过程中普遍存在的，是一个由基因决定的细胞主主动的有序的死亡方式。具体指细胞遇到内、外环境因子刺激时，受基因调控启动的自杀保护措施，包括一些分子机制的诱导激活和基因编程，通过这种方式去除体内非必需细胞或即将发生特化的细胞。而细胞发生程序性死亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，凋亡的细胞散在于正常组织细胞中，无炎症反应，不遗留瘢痕。死亡的细胞碎片很快被巨噬细胞或邻近细胞清除，不影响其他细胞的正常功能。
1、pCD的概念
1972年，Kerr等提出了细胞凋亡（apoptosis）的概念，用来描述多细胞有机体在发育过程中出现的细胞自然死亡现象。由于pCD和凋亡时细胞表现相同的形态特征，因此人们认为细胞凋亡就是pCD。其实凋亡是pCD过程中伴随着出现的特定的形态、生化特征，也有一些细胞在pCD过程中并不表现凋亡的特征，这一类细胞死亡被称为非程序化细胞死亡。由此可见，凋亡是pCD在形态学上的表现，两者不完全等同。
pCD是细胞正常发育过程中采取的一种自身基因调控的主动死亡方式，它与一般意义上的衰老、坏死不同，有其固有的特点。pCD发生时细胞和染色质浓缩，细胞膜突出，有pCD小体形成；同时核酸内切酶失活，Dna非随机性断裂成180-200bp的片段，在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶上电泳出现典型的“梯状”条带。而坏死则表现为细胞肿胀，质膜丧失完整性，细胞器损伤等特点。
2、pCD的检测方法
2.1细胞形态学观察法
（1）电子显微镜。电镜观察，凋亡细胞染色质固缩，常聚集于核膜上呈境界分明的块状或新月形小体，初期细胞可见完整的细胞器，细胞膜完整，凋亡小体形成。
（2）荧光显微镜。对体外培养的活细胞经荧光色素处理，可在荧光显微镜下观察细胞形态改变。常用荧光色素有吖啶橙、碘化丙啶（pi）、溴乙锭（eB）。
2.2染料排斥法
除了电镜能反映细胞膜完整性外，还可用染料排斥法，如台盼蓝、pi等。坏死细胞膜破损，被染料着染。在正常细胞膜上，磷脂酰丝氨酸基团（pS）位于胞内侧，而在细胞凋亡早期膜上此基团则转向胞外侧，以利于被吞噬。因此，磷脂酰丝氨酸基团位置的改变，可作为凋亡细胞的一个标志。
2.3反映脱氧核糖核酸有规律断裂的方法
（1）琼脂糖凝胶电泳法。细胞悬液经裂解消化按常规法提取Dna后，于含eB的琼脂糖凝胶中进行电泳，正常细胞Dna呈单一条带。
（2）原位末端标记法。通过Dna多聚酶i把已标记的核苷酸结合到Dna的单链断裂处，以寻找有无ap发生。标记的方法有同位素标记、荧光素标记、地高辛或生物素标记等。
（3）原位切口平移法。利用Dna多聚酶将核苷酸整合到ap细胞内断裂的Dna3′羟基末端，同时水解5′末端，以修复Dna。若用已标记的核苷酸，即可显示出有断裂Dna的细胞。该法同样也可用于细胞悬液中ap的观察。
3.植物pCD的研究进展
在植物细胞学研究中，尤瑞麟首次报道了正常小麦珠心细胞衰退过程的超微结构变化，并引入了pCD的概念。随后eleftherion研究了小麦原生韧皮部细胞核解体过程中的超微结构变化，但没有提及pCD。王雅清、崔克明用原位末端标记法检测了杜仲次生木质部导管分子的pCD，并对其过程中的超微结构变化进行了系统的电子显微观察。李大辉等人在银杏胚珠贮粉室的早期发育中发现参与形成贮粉室的珠心细胞死亡是pCD过程.有资料表明，植物体内导管分子的发育形成过程也是典型的pCD反应。
在生理条件下，生物体内细胞存活与死亡由植物自身发育阶段提供的遗传信息，或由临近细胞和其微环境提供的信号决定的。其中包括细胞相互接触提供的信号以及周围环境中的活性物质、激素等。orzaez和Granell发现乙烯处理豌豆可促使其心皮衰老及Dna降解，morgan等发现乙烯介入玉米根中缺氧和机械障碍诱导的通气组织形成过程中的细胞程序化死亡。尽管乙烯在控制植物生长发育过程中的巨大作用早为人知，但乙烯信号传导途径与细胞凋亡的关系还不清楚。
尽管pCD参与植物发育的许多过程，但植物体中发生pCD的细胞比率小，相对过程短，不利于pCD的检测和机制的深入研究，因此进展缓慢。许多实验表明，植物细胞pCD可以被一定的外界条件诱导产生。wang等用真菌毒素三羧酸丙烯酸单酯（aaL）诱导番茄原生质体及小叶凋亡，观察到典型的Dna梯状条带和类似pCD小体的结构。周军等研究表明，在适当浓度的乙烯利处理下，胡萝卜原生质体产生了典型的凋亡特征，包括Dna梯状条带，核Dna的断裂，以及类凋亡小体的形成等，因而可以确定，乙烯能诱导胡萝卜原生质体凋亡。另外的研究也表明，乙烯能在不同类型的植物中（豌豆、玉米和胡萝卜）诱导细胞凋亡。孙英丽等也发现细胞色素C可以诱导植物细胞产生典型的pCD。
过敏反应（theHypersensitiveResponse，HR）也是一种pCD。植物被病原菌侵染后，感染点周围细胞快速死亡以防止病原菌的传播。通过分离突变体，调节过敏性细胞死亡反应的相关组成已被检测到，但具体是哪些执行了细胞的程序性死亡，还没有结论，且植物中这种形式的pCD是否和其他方式的pCD以及动物中的细胞凋亡相同，还需要进一步的遗传和生化分析。
植物细胞中与pCD有关的基因研究还远没有动物深入，尽管许多实验表明植物pCD与动物是相似的，但分子水平共同特征少。目前仅发现少数几个基因参与植物pCD。
在植物pCD方面已开展了不少研究，但目前的工作远没有弄清楚植物pCD较详细的细胞学特征，而与其相关的分子机制信息则更缺乏，这方面的工作将是今后的主攻方向。
4.pCD研究的意义
植物pCD是一种通过细胞的主动死亡来调节机体的生理活动。pCD不但是保证细胞正常发育所必须，而且是植物的一种重要防卫反应。细胞死亡后被其它细胞吸收利用或构成利于自身发展的特殊结构，对植物的生长发育及新陈代谢起重要作用。皮层细胞死亡形成的通气组织；筛管细胞死后形成的输导组织；植物表面覆盖的一层死亡细胞，具有保护机体，减少水分蒸发的作用，还有器官老化后其养分的回收再利用等，这些都是细胞自身调控的结果。了解pCD发生的机制，通过调节其过程，对控制植物病害的发生，农作物品种选优、粮食生产及贮藏技术的改良都有重要意义。
参考文献：
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动物细胞特征篇9
中学生物学竞赛，是以普及生命科学为原则，以培养21世纪生命科学的后备人才为目的，以提高青少年认识生命科学、保护物种的科学素质为目标，而进行的较高层次的选拔赛。因此，要求试卷编制应规范化，命题应科学严谨，克服随意性。
竞赛命题的主要依据
1.国际生物学竞赛(iBo)的理论纲要（《生物学通报》，1994.10）。
2.《中学生奥林匹克竞赛·生物学》（高信曾主编，中央民族大学出版社）和《中学生物学奥林匹克竞赛辅导》（吴相钰、刘恩山等编译，湖南教育出版社）《高中生物学大纲》供试验用（国家教委基础教育司编订，人民教育出版）。
范围和要求
理论部分
第一部分
植物解剖、生理（重点是种子植物）和分类(20%)
一、种子植物形态解剖
（一）植物组织1.植物组织的概念和类型2.分生组织3.成熟组织4.组织系统5.维管组织和维管束
（二）种子和幼苗1.种子的结构和类型2.种子的萌发和幼苗的形成
（三）种子植物的营养器官1.根的结构（内皮层）2.茎的结构（维管束）3.叶的结构与气孔功能4.根、茎、叶的变态
（四）种子植物的繁殖器官1.花的结构2.种子和果实的形成
二、植物生理
（一）植物的水分代谢1.植物吸水的部位及方式2.植物细胞渗透吸水原理（水势）3.植物体内水分的散失4.外界条件对蒸腾作用的影响5.蒸腾作用原理在生产上的应用
（二）植物的矿质代谢1.植物必需的矿质元素及其主要生理作用2.根吸收矿质元素的过程3.植物根系吸收矿质元素的特点4.植物体内无机养料的同化5.矿质元素在植物体内的运输和利用
（三）植物的光合作用1.光合作用的概念及其重大意义2.光合作用的场所和光合色素3.光合作用的全过程（光系统Ⅰ和光系统Ⅱ）4.C[,3]和C[,4]植物的比较（光呼吸）5.绿色植物与光合细菌的光合作用的比较6.外界条件对光合作用的影响（饱和点、补偿点）7.光合作用的原理在农业生产中的应用
（四）植物体内物质的运输
（五）抗逆生理（抗旱、抗寒等）
（六）植物的呼吸作用1.呼吸作用的类型和过程2.植物体各部分的呼吸强度比较3.外界条件对呼吸作用的影响4.呼吸作用的生理意义5.呼吸作用的原理在农业生产中的应用6.呼吸作用与光合作用的关系
（七）植物生命活动的调节1.生长素类2.赤霉素类3.细胞分裂素类4.脱落酸5.乙烯
（八）植物开花的机理及其应用1.植物的花前成熟2.低温和花诱导3.光周期和花诱导4.春化和光周期理论在生产中的应用5.其他条件对植物开花的影响
（九）植物的生长、发育和生殖1.顶端分生组织和形成层2.无性生殖、有性生殖3.双受精作用、胚的发育和胚乳的发育4.种子植物、蕨类植物和苔藓的世代交替（生活史）
三、植物系统分类（了解到科、目、纲、亚门和门）
（一）藻类植物1.蓝藻门2.绿藻门3.红藻门4.褐藻门
（二）菌类植物1.细菌门2.粘菌门3.真菌门
（三）地衣植物
（四）苔藓植物1.概述2.苔纲3.藓纲
（五）蕨类植物1.概述2.石松亚门3.木贼亚门4.真蕨亚门5.蕨类植物的起源与演化6.蕨类植物的经济价值
（六）种子植物——裸子植物1.概述2.裸子植物分类3.苏铁纲4.银杏纲5.松柏纲6.裸子植物的起源与演化
（七）种子植物——被子植物1.概述2.双子叶植物纲和单子叶植物纲的10个重点科（十字花科、豆料、菊科、蔷薇科、锦葵科、茄科、葫芦科、芸香科、禾本科、百合科等的特征及花程式、花图式）3.被子植物的起源与系统发育
第二部分
动物分类、形态、解剖和生理(20%)
一、动物分类、形态与解剖（重点是无脊椎动物）
（一）原生动物门1.主要特征2.草履虫3.分类（鞭毛纲、肉足纲、孢子纲、纤毛纲）
（二）多孔动物门1.主要特征2.海绵
（三）腔肠动物门1.主要特征2.水螅3.分类（水螅纲、钵水母纲、珊瑚纲）
（四）扁形动物门1.主要特征2.分类（涡虫纲、吸虫纲、绦虫纲）
（五）线形动物门1.主要特征2.分类（线虫纲、轮虫纲）
（六）环节动物门1.主要特征2.环毛蚓3.分类（多毛纲、寡毛纲、蛭纲）
（七）软体动物门1.主要特征2.无齿蚌3.分类（双神经纲、腹足纲、瓣鳃纲、头足纲）
（八）节肢动物门1.主要特征2.甲壳纲3.蛛形纲4.多足纲5.昆虫纲（纲的主要特征：直翅目、半翅目、同翅目、鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目等重要目的特征，触角、口器、翅、足的类型）
（九）棘皮动物门1.主要特征2.分类（海星纲、海胆纲、海参纲）
（十）脊索动物门1.主要特征2.分类概述（尾索动物亚门、头索动物亚门、脊椎动物亚门）3.起源和演化
（十一）圆口纲
（十二）鱼纲1.主要特征2.躯体结构概述3.分类4.洄游
（十三）两栖纲1.主要特征2.躯体结构概述3.分类4.休眠
（十四）爬行纲1.羊膜卵的特点及其在进化上的意义2.主要特征3.躯体结构概述4.分类5.起源和适应辐射
（十五）鸟纲1.主要特征2.躯体结构概述3.分类（主要目）4.繁殖及迁徙
（十六）哺乳纲1.主要特征2.躯体结构概述3.分类（主要目）
（十七）脊椎动物结构的比较（重要器官）和动物胚胎发育过程的比较
（十八）动物体制的基本类型
二、人体及动物（重点是脊椎动物）生理
（一）基本组织
（二）消化系统1.食物的成分2.消化系统的组成3.食物的消化4.营养物质的吸收
（三）循环系统1.血液循环系统的结构和功能2.淋巴系统的结构和功能3.体液平衡（内稳定）
（四）呼吸系统1.系统的结构特点2.呼吸机制3.气体交换
（五）泌尿系统1.系统组成2.肾脏的结构3.尿的产生
（六）生殖系统1.男、女生殖器官的结构和功能2.排卵和经期3.受精4.外胚层、内胚层、中胚层的形成5.胚胎的膜
（七）神经系统1.中枢神经系统（脑和脊髓）、外周神经系统、自主神经系统（交感和付交感系统）2.反射3.神经系统的高级功能4.神经调节和体液调节
（八）感觉器官（眼和耳）
（九）内分泌系统1.脑下垂体2.甲状腺3.胰岛4.肾上腺和肾上腺皮质5.卵巢和睾丸6.内分泌功能的调节7.昆虫的激素调节
（十）免疫系统1.细胞免疫和体液免疫2.免疫失调引起的疾病
第三部分
细胞生物学部分(20%)
一、细胞的化学成分、亚显微结构及功能
（一）化学成分1.水、无机盐2.糖类3.蛋白质（包括：氨基酸、三字母缩写、蛋白质的四级结构、蛋白质的理化性质、变性实质）4.酶类（概念、特征、分类、作用机理、影响酶活性的因素）5.脂类6.核酸（包括Dna和Rna)7.其他重要化合物（包括aDp和atp、naD[+,]和naDH[+,]、naDp[+,]和naDpH[+,]）
（二）结构及功能1.细胞是生命活动的基本单位2.细胞膜（理化性质、分子结构与物质运输等）3.细胞内膜系统（内质网、高尔基体、溶酶体、液泡的结构与功能）4.线粒体结构、功能5.质体的类型和叶绿体的结构功能6.核糖体7.过氧化氢体、过氧化物酶体的结构功能8.细胞核（核膜、染色体、核仁、核基质）和核功能9.细胞壁成分与结构10.细胞骨架系统（包括：微丝、微管、中等纤维、微梁）的功能11.原核细胞与真核细胞12.动物细胞与植物细胞的比较13.细胞分化和组织形成
二、细胞分裂
（一）细胞分裂的方式、意义
（二）有丝分裂1.细胞周期（间期G[,1]、S、G[,2]的变化）2.有丝分裂过程中染色体的变化规律、特征
（三）减数分裂1.第一次分裂（染色体变化的主要特点）2.第二次分裂（染色体变化的主要特点）
（四）有丝分裂与减数分裂的比较
（五）细胞的分化和衰老：癌变
三、细胞代谢
（一）糖代谢（指异化）1.糖的无氧呼吸（糖酵解）2.糖的有氧呼吸（糖酵解、柠檬酸循环、氧化磷酸化）
（二）脂肪和蛋白质的代谢等（异化）
（三）同化作用1.光合作用的光反应（原初反应等）2.暗反应（卡尔文循环）
（四）蛋白质的生物合成1.转录2.翻译3.遗传密码4.生物合成过程
（五）生物代谢类型中重点是原核细胞（微生物）的代谢等1.光养和化养2.自养和异养3.厌氧和需氧
（六）细胞的全能性
（七）细胞工程和酶工程简介
第四部分
遗传与进化(20%)
一、遗传和变异
（一）遗传1.遗传的分子基础1)Dna是遗传物质的证据2)Dna的结构3)Dna的复制4)基因结构与基因表达的调控5)染色体的结构2.遗传基本规律及应用1)基因的分离规律2)基因的自由组合规律3)基因的连锁与互换规律3.性别决定与伴性遗传4.多等位基因（复等位基因）5.基因定位6.基因之间的相互作用7.卡方检验8.细胞质遗传及其在育种上的应用9.基因工程简介
（二）变异1.基因突变1)概念2)特点3)机理4)类型2.染色体变异1)结构变异2)数目变异
3)基因组、染色体组3.基因重组4.人类遗传病与优生
二、生命起源和生物的进化
（一）生命起源
（二）生物进化机制1.进化证据2.现代的生物进化观点（突变、自然选择、生殖分离、适应、进化的中性学说）3.哈特·温伯格定律及应用
（三）人类的起源和发展
（四）物种的形成（途径和方式）
三、生物界级的分类
（一）病毒和类病毒1.病毒的结构和繁殖2.类病毒
（二）原核生物界1.细菌的结构和繁殖2.蓝藻3.放线菌4.立克次氏体、枝原体、衣原体
（三）原生生物界1.甲藻门2.金藻门3.裸藻门4.粘菌门5.原生动物门
（四）真菌界1.酵母菌2.霉菌3.大型真菌
（五）植物界
（六）动物界
（七）植物界和动物界进化系统（树）
第五部分
生态学部分(20%)
一、生物与环境（自然生态学）
（一）生态因素对生物的影响1.生态因素2.光照、温度、水对生物的影响3.生态因素的综合作用4.种内斗争和种内互助5.种间斗争（竞争、捕食、寄生）6.偏利共生、互利共生
（二）生物对环境的适应和影响1.适应的普遍性（保护色、警戒色、拟态、休眠）2.适应的相对性3.生物对环境的影响
（三）种群1.概念2.特性3.结构和数量动态变化4.影响因素（逻缔斯曲线）
（四）群落1.概念2.结构3.群落演替
（五）生态系统的类型、结构、功能1.生态系统的营养结构和空间结构2.生产者、消费者、分解者3.食物链、食物网、营养级4.生态金字塔5.能量流动（生物量、生产量、能流过程和特点）6.物质循环（类型、过程、碳、氮、二氧化硫在自然界的循环）7.光能利用和生物固氮（光呼吸、固氮生物种类、生物固氮过程简介、生物固氮在农业生产中的应用）8.有害物质的富集9.建立良性循环（生态农业的应用）
10.生态系统的类型11.生态系统的稳定性及其保护（生态平衡的解释、生态平衡的原理、破坏的因素、保护）
二、人与生物圈（社会生态学）
（一）人口增长1.人口问题2.人口增长、自然资源与环境污染的世界模型3.温室效应4.臭氧层的保护
（二）生态环境的保护1.野生生物资源的合理利用和保护2.森林在环保中的作用3.草原的利用、保护与农牧业的发展4.城市生态系统的特点5.农业生态系统与发展生态农业6.海洋生物资源的开发和利用
7.自然保护区8.环境污染对生物的不利影响9.有害化学药品和重金属对生物影响10.环境与人体的健康
11.无公害绿色食品12.生物净化
三、动物的行为
（一）动物行为的概述1.概念2.特点3.研究方法4.研究意义
动物细胞特征篇10
[关键词]骨组织工程；脐带；间充质干细胞
[中图分类号]R329[文献标识码]a[文章编号]1674-0742（2014）10（c）-0195-02
骨折及骨科疾病是临床中较为常见的病症，为患者带来了一定身体痛苦与经济负担。目前临床中针对骨折与骨科疾病的治疗，主要采用自体移植、人工植入及异体移植等，但上述方式均存在一定缺陷。mSCs具强大的多向分化功能，能够诱导分化成骨细胞，帮助提升骨折或骨科疾病的治疗效果。在此背景下，对骨组织工程中脐带间充质干细胞的应用进展进行分析具一定现实意义。
1mSCs的分离与培养
1.1mSCs的分离
吉林大学生物医学工程学院的杨晨[1]对mSCs的分离进行了研究，首先在手术室收集得到足月分娩的、健康的、新鲜的胎儿脐带，将其放于融入了浓度为0.1%双抗的氯化钠溶液中，在实验室内对脐带进行间充质干细胞分离。其次，将脐带取出，浸泡于酒精内约5min，后以碘酒进行充分擦拭消毒，置于氯化钠溶液下反复清洗，直至血块完全冲掉。将脐带剪至2cm/段的大小，以镊子固定住脐带边缘，用剪刀小心剔除脐带外膜，将内含的华氏胶组织分离出来。取胶完成后接着剔除脐带内的血管，再次以氯化钠溶液冲洗，或直接在融入了浓度为0.1%双抗的氯化钠溶液中进行，以保证操作的无菌性。
1.2mSCs的培养
武汉大学中南医院的胡培[2]等人对mSCs的分离、培养进行了研究，其mSCs分离操作与杨晨基本相同，华氏胶组织成功分离后，将其放入α-mem培养液（内涵100U/mL链霉素与青霉素、10%胎牛血清）中，在Co2浓度为5%、箱内温度为37℃的培养箱内进行培养，根据细胞生长情况，以0.25%胰蛋白酶进行传代培养。北京协和医学院的李铎[3]选择将切成管状的脐带继续切片，再将片状脐带组织切割致2～3mm3，利用吸管逐一将碎状脐带组织植入t75培养瓶中，培养瓶已预先由D/F12培养基（内含有浓度为20%的FBS）包被完成，植入密度为每瓶20～25块碎状脐带组织；再将培养瓶置于温度为37℃，Co2浓度为5%的温箱中，定时向箱内补充培养基（1mL/d），每隔3d全量换液。
哈尔滨第五医院手外科分院的聂广辰[4]等人对脐带间充质干细胞生长曲线的绘制进行了研究，在细胞传代培养至第3代时将其分别种植于6孔板的其中4孔中持续培养8d，按mtt法对细胞的增值情况进行测定，当细胞增值密度饱和，细胞进入平顶期时停测。卓峰等人[5]在细胞增殖特定于曲线绘制的研究中提出，现阶段培养mSCs普遍采用的方法包括酶消化法与培养法，对mSCs细胞进行初代培养，该过程消耗约2w，当细胞融合率致80%时开始传代培养，在细胞种植2～4d时增殖趋势最盛，传至第15代时增殖速度开始减慢，至20代时增殖基本结束。早期的细胞增殖的潜伏期在植入后的36h内，之后开始了成对增长（5～6d），增殖密度达到饱和后进入到平顶期，综上可知细胞增殖曲线呈“S”型。
2mSCs的特征
2.1细胞形态与生长特征
第二军医大学的胡凯猛[6]在显微镜下对mSCs的形态进行观察，按贴块法获取初代细胞后对其进行种植，4～5d后即可在贴块下方观察到沿瓶底生长的hUmSCs，种植7d后能够观察到细胞数量不断增多，主要呈小梭形及小三角形，继续培养细胞渐成集落状生长，且生长状态较为均衡，边界清晰，伴有生长晕。酶消化法培养下初代细胞生长速度较培养法快，通常2～3d后即在瓶底出现细胞，7d后由小梭形及小三角形变为多角形、纺锤形，且生长迅速，集落生长呈紧靠型。14～15d后达到约85%的融合。mSCs胞浆较少，小梭形的形态较为显著，细胞核周的颗粒物质较少，消化传代完成后细胞解除集落样生长，且分布均匀。
2.2细胞免疫学特征
吕鹏飞等人[7]在关于细胞免疫学特征的研究中提出，mSCs的免疫学优势显著，主要表现在其可以脱离免疫抑制作用而冲破mHC屏障，将细胞植入远交动物体内。在UCmSC的免疫学特征分析中，证实其对人外周血单核细胞、鼠脾细胞及纯化t细胞等免疫细胞具有抑制作用，从而减缓其增殖速度。毛希宏[8]的相关研究证明mSCs表面的抗原存在非专一性，主要包括细胞因子与生长因子受体类、粘附分子类、整和素家族成员类与其他分子类等四大类，实验结果表明UCmSCs中，CD29、CD73、CD44、CD13、CD105的阳性率超过90%，而CD134、CD45、CD11b则为阴性，在23代内的传代培养中，各类细胞因子无明显差异，证明UCmSCs在经过多代培养之后免疫学性质较为稳定。
2.3细胞的诱导分化特征
hUCmSC的诱导分化能力较强，能够实现多向分化，包括内胚层、中胚层与外胚层。在张亚斌等人[9]的细胞诱导分化体内研究中，证实hUCmSC能够分化成为内皮细胞、心肌细胞、骨骼细胞、多巴胺能神经元细胞、神经细胞等，而在细胞诱导分化体外研究中，还发现hUCmSC可分化为成骨细胞、肝细胞、脂肪细胞、胰岛样细胞、生殖细胞、平滑肌细胞等，在研究hUCmSC分化成为成骨细胞时，发现在诱导过程中hUCmSC的aLp活性提升，且钙结节与钙沉积现象明显，证明其具成骨细胞的诱导潜能。上述研究结果表明，hUCmSC诱导分化功能强大，在临床中的应用价值与应用范围明显优于造血干细胞。
3讨论
骨组织工程是近年来临床新兴的学科，其中胚胎干细胞作为骨组织工程研究的热点与重点，受到了临床医学界的广泛关注。通过上述研究可知，mSCs分化潜能较高，在软骨、成骨、韧带、肌腱、肌肉、神经、心肌、肝等组织中均具诱导分化潜能，临床应用前景广阔。李素萍等人[10]相关研究发现，在标准的细胞培养环境下，mSCs能够沿培养瓶进行增值，可以表达CD44、CD105及CD90，但不能表达HLa-DR、CD34及CD45，在体外培养时表现出成骨细胞的诱导分化潜能。
在此背景下通过改进现有mSCs诱导分化为成骨或软成骨细胞的培养方式，或在已知干细胞的基础上找寻新型干细胞，以提升胚胎细胞在骨组织工程研究中的合适度，成为目前国内外相关研究的探索目标。在现代生物科技快速发展的时代背景下，学者们一定可以寻找到理想的培养途径或干细胞类型，不断推动骨组织工程的发展前进。
[参考文献]
[1]杨晨.脐带间充质干细胞的分离鉴定[D].长春：吉林大学，2013：9-11.
[2]胡培.人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定[J].生物技术通讯，2014，25（1）：87-90.
[3]李铎.人脐带间充质干细胞分离培养方法的研究[D].北京：北京协和医学院，2011：14-22.
[4]聂广辰.人脐带间充质干细胞生物学特性及向成骨细胞分化的研究[J].中国伤残医学，2014，22（6）：48-52.
[5]卓锋.人脐带间充质干细胞应用研究进展[J].中国矫形外科杂志，2012，20（1）：49-51.
[6]胡凯猛.人脐带间充质干细胞向造血细胞方向分化的研究[D].上海：第二军医大学，2012：21-23.
[7]吕鹏飞，张光武.脐带间充质干细胞在骨组织工程中的研究进展[J].中华临床医师杂志：电子版，2013，7（10）：4433-4435.
[8]毛希宏.人脐带间充质干细胞的培养鉴定及其向神经元细胞分化的研究[J].昆明医学院学报，2011，32（1）：41-47.
[9]张亚斌，解莉楠.人脐带间充质干细胞研究进展及应用前景[J].生物技术通讯，2013，24（3）：437-438.