微生物研究方法篇1
[关键词]微生物分子生态学RFLpDGGeReal-timepCR
[中图分类号]Q938.1[文献码]B[文章编号]1000-405X（2015）-2-267-1
0引言
微生物分子生态学是利用分子生态技术手段研究微生物与环境之间相互关系及其相互作用规律的科学，主要研究微生物生态学基础理论问题。
1微生物分子生态学常用分析方法
1.1寡核苷酸探针检测
该方法利用目标核酸序列与特异性探针特异性互补的特点，检测荧光标记的特定Dna序列[1]。探针为一段特定方式标记的核酸序列，具有较高灵敏度。做种群鉴定时选用Dna制备探针，利用cDna避免繁琐的克隆程序，确保探针与种内全部菌株杂交。除此之外，cDna探针若具有表型特异性，则可检测某一特定表型是否存在。
1.2Dna-Dna杂交
Dna-Dna杂交针对微生物整体基因组的重组[1]，为检测Dna序列相似性提供可能性。该方法基于高温双链Dna解链、低温复性与碱基配对可转移的特点，通过温度等条件控制形成杂交Dna，检测其杂交率。由于来源不同的两条Dna单键难以配对重组，Dna杂交率可用于估计序列相似度。
1.316SrRna序列分析
该方法在微生物分类学研究中最为常用[2]。微生物16SrRna基因由保守区与可变区构成。可变区具有种属特异性，不同种属微生物间存在较大差异；保守区为所有微生物共有基因序列。微生物进化过程中，基因序列基本不变化，因此可根据保守区基因序列设计通用引物，或根据可变区基因序列设计特定引物，从而分析不同微生物的进化距离及亲缘关系。
1.4编码蛋白质基因
该方法利用基因序列控制合成蛋白质[3]。微生物代谢过程实质为生物酶催化作用下的一系列氧化还原反应，而不同功能微生物的催化反应酶具有一定特异性，因此编码功能蛋白的基因不同，主要用于研究特定功能微生物，尤其在毒理学方面。
2微生物分子生态学常用技术
2.1限制性片段长度多态性分析（RFLp）
在RFLp分析过程中，以所提取的微生物Dna为模版，利用特异性引物进行聚合酶链式反应（pCR）得微生物16SrRna序列，将其连接到载体，转至大肠杆菌感受态细胞，通过挑取克隆子，进而获取质粒Dna来实现克隆文库构建。不同微生物Dna序列不同，进而酶切位点不同，因此利用特异性限制性内切酶消化，可得到长短不一、数目不同的限制性酶切片段，琼脂糖凝胶电泳分离得到呈现多态性的图谱，进而获取环境微生物群落结构信息[4]。
2.2变性梯度凝胶电泳技术（DGGe）
DGGe是一种检测Dna突变的电泳技术，根据Dna在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将碱基组成不同的Dn段分开。该技术具有以下优点：①检测极限低、速度快；②结果准确可靠；③无需微生物的培养；④可同时检测多种微生物。但其存在以下局限性：无法获取样品中全部微生物Dna，而Dna回收率越低，重复性越低；不均等扩增造成结果代表性低；敏感度较低，采样和样品处理会对结果产生影响。
2.3荧光定量pCR技术（Real-timepCR）
Real-timepCR为微生物生态学研究的定量分析方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，标记跟踪pCR产物，实时在线监测反应过程，结合相应的软件分析产物，计算模板浓度。该技术具有以下优点：①利用扩增产物数量与荧光信号强度成对应关系的原理，实时检测pCR反应进程，避免了终点定量重现性差；②自动化程度高，操作安全、简单，可避免产物被污染；③检测特异性强，灵敏度与精确度高；④可实现多重扩增。其缺点在于无法对不确定对象进行分析。
3结论与展望
微生物分子生态学克服了传统培养法的不足，为全面掌握微生物多样性提供了可能。若将各方法结合，以便掌握更为全面的信息，可更好揭示微生物对环境变化的影响，预示环境变化趋势，为从微观方面改善环境提供依据。
参考文献
[1]杨霞，陈陆，王川庆.16SrRna基因序列分析技术在细菌分类中应用的研究进展[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（2）：55-60.
[2]邓小宽，张新宜，田敏.现代生物技术在分子微生物生态学中的应用[J].国外医药（抗生素分册），2006，27（4）：164-170.
微生物研究方法篇2
[关键词]乌芪舒筋通络片；微生物限度；方法学研究；《中国药典》2015年版
[中图分类号]R286[文献标识码]a[文章编号]1674-4721（2017）06（c）-0093-04
[abstract]objectivetoestablishamicrobiallimittestmethodofwuqiShujintongluotablets.methodsmethodologyresearchonmicrobiallimittestofwuqiShujintongluotabletswasconductedaccordingtothe"1105，1106，1107"ofChinesepharmacopoeia2015editionwiththefourthpart.Resultsthetotalnumberofaerobicbacteriacouldbetestedbyplatedilutionmethodandmembranefiltrationmethod，thetotalnumberoffungusandyeastscouldbetestedbytheplateroutinemethod，andtherecoverywasbetween0.5and2，escherichiacoli，Salmonella，BilesaltresistantGram-negativebacteriacouldbedetectedthroughcontrolbacteriabydirectinoculationmethod.Conclusionthetotalnumberofaerobicbacteriacanbetestedbyplatedilutionmethod，thetotalnumberoffungusandyeastscanbetestedbyplateroutinemethod，andthecontrolbacteriacanbetestedbydirectinoculationmethod，themethodsusedarefeasible，andeasiertooperate，whicharesuitableforthemicrobiallimittestofwuqiShujintongluotablets.
[Keywords]wuqiShujintongluotablets；microbiallimit；methodologyresearch；Chinesepharmacopoeia2015edition
踯问娼钔络片是根据我院省名中医验方制成的纯中药制剂，具有补肝肾，通络止痛的作用，由细辛、制川乌、制草乌、桂枝、牛大力、防己、黑老虎、蜈蚣、走马胎、羚羊角骨、牛膝、黄芪、杜仲、续断、甘草等药味组成[1]。该制剂微生物限度检查法原按《中国药典》2010年版进行方法学验证[2]，随着《中国药典》2015年版的实施，新版微生物限度检查方法变化很大，必须重新进行验证。为此，本研究按《中国药典》2015年版四部“1105、1106、1107”项下方法[3]，对该制剂的微生物限度检查方法进行了再次验证研究，制订了新的切实可行的微生物限度检查法，替代了旧标准，并应用于该制剂的日常检验，使该制剂的微生物限度检查法提升到新版《中国药典》的水平。
1仪器与试药
1.1仪器
SZX型超净工作台（上海沪南科学仪器联营厂）；BHC-1300Ⅱa/B3型生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司）；YXQwF32-500卧式榘形压力蒸气消毒器（湖南衡阳医疗器械厂）；LRH-250a生化培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；mJ-160B-Ⅱ霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；CX31生物显微镜（奥林巴斯）；HtYHomo761匀浆仪（浙江泰林生物技术股份有限公司）；Ja2003n电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；JC101型电热鼓风干燥箱（上海成顺仪器仪表有限公司、南通嘉程仪器有限公司合作出品）。
1.2样品
乌芪舒筋通络片（肇庆市中医院，批号：15050401；15051102；15052401）。
1.3菌种
实验所用的菌株传代次数不得超过5代[4]，并采用适宜的保藏方法保存，确保试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CmCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CmCC（B）63501]、铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）[CmCC（B）10104]、白色念珠菌（Candidaalbicans）[CmCC（F）98001]、黑曲霉（aspergillusniger）[CmCC（F）98003]、大肠埃希菌（escherichiacoli）[CmCC（B）44102]、乙型副伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）[CmCC（B）50094]。以上菌种均来自于中国食品药品检定研究院。
1.4培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：3105210）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：3105120）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：3105305）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号：3105054）、麦康凯液体培养基（批号：3105291）、麦康凯琼脂培养基（批号：3105138）、RV沙门增菌液体培养基（批号：3104847）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（批号：3104852）、三铁塘琼脂培养基（批号：3105052）、肠道菌增菌液体培养基（批号：3105093）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号：3104750），均由广东环凯微生物科技有限公司生产，使用前先进行培养基的适用性检查，并且在有效期内使用，培养基的制备按照标示方法进行。
1.5稀释液、冲洗液
pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3105256）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：3105305）、0.9%无菌氯化钠溶液（自制）。
2方法与结果
参照《中国药典》2015年版四部“1105、1106、1107”微生物限度检查法[3]进行验证。
2.1菌液制备
2.1.1金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24h；分别取各培养物1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，按10倍递增稀释级数制成每毫升含菌数为
2.1.2白色念珠菌
取白色念珠菌的新鲜培养物接种至100ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3d，取培养物1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，按10倍递增稀释级数制备成每毫升含菌数
2.1.3黑曲霉
取黑曲霉新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20～25℃培养5～7d，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，洗脱孢子。再选用适宜的方法将孢子悬液吸至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制备成每毫升含菌数
2.2供试液的制备
取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基至100ml，用匀浆仪打碎，混匀，作为1∶10的供试液。量取1∶10的供试液10ml，加胰酪大豆胨液体培养基稀释至100ml，混匀，作1∶100的供试液。
2.3微生物计数方法适用性试验
2.3.1平皿常规法
2.3.1.1试验组需氧菌总数计数：取1∶10的供试液5份，每份100ml，分e加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌液适量，振摇均匀，使每毫升供试液含菌量≤100cfu。取1ml注入平皿中，平行制备2份，立刻倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，凝固，30～35℃中培养≤3d，计数。
霉菌和酵母菌总数计数：取1∶10的供试液2份，每份100ml，分别加入白色念珠菌、黑曲霉试验菌液适量，振摇均匀，使每毫升供试液含菌量≤100cfu。取1ml注入平皿中，平行制备2份，立刻倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，凝固，20～25℃中培养≤5d，计数。
2.3.1.2供试品对照组取1∶10的供试液，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，同试验组操作。
2.3.1.3菌液对照组取胰酪大豆胨液体培养基代替1∶10的供试液，按试验组项下方法操作，加入试验菌液并进行微生物回收试验。
2.3.1.4计算各菌株的回收率（R）=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%[5-6]，依据《中国药典》2015年版四部规定，比值R应为0.5≤R≤2[7-9]（表1）。
2.3.2平皿稀释法
2.3.2.1试验组需氧菌总数计数：取1∶100的供试液5份，每份100ml，按“2.3.1.1”项下方法操作。
霉菌和酵母菌总数计数：采用平皿常规法R为0.5～2，所以不再进行稀释法研究。
2.3.2.2供试品对照组取1∶100的供试液，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作。
2.3.2.3菌液对照组取胰酪大豆胨液体培养基代替1∶100的供试液，按试验组项下操作方法加入试验菌液并进行微生物回收试验。
2.3.2.4计算按“2.3.1.4”项下公式计算，结果见表2。
2.3.3薄膜过滤法
2.3.3.1试验组取1∶10供试液10ml，滤过，取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液200ml，分2次冲洗滤膜，在第2次冲洗中加入相应的菌液适量（含菌量≤100cfu），滤过，取出滤膜，需氧菌检查将膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基中，在30～35℃下培养，≤3d，霉菌和酵母菌检查将膜贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，在20～25℃下培养≤3d。
2.3.3.2供试品对照组取1∶10供试液10ml，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作。
2.3.3.3菌液对照组取胰酪大豆胨液体培养基代替1∶10的供试液，按试验组项下操作方法加入试验菌液，同时进行微生物回收试验。
2.3.3.4计算按“2.3.1.4”项下公式计算，结果见表3。
由表1～3可知，乌芪舒筋通络片需氧菌总数计数检查采用平皿稀释法、薄膜过滤法，霉菌和酵母菌计数检查采用平皿常规法、薄膜过滤法，R均在0.5～2内，符合《中国药典》2015年版四部微生物学限度检查验证的要求。考虑到实际操作中，平皿常规法、平皿稀释法操作简便，优于操作繁琐的薄膜过滤法，故需氧菌总数计数法可选用培养基稀释法，霉菌和酵母菌总数计数检查选用平皿常规法为最佳方法。
2.4控制菌适用性试验
2.4.1耐胆盐革兰阴性菌检查验证试验
取1∶10供试液适量，混匀，20～25℃培养2h，作为预培养供试品。取预培养供试品3份，每份10ml，分别加入10ml肠道菌增菌液体培养基，第1份加入1ml缓冲液作为供试品组，第2份加入1ml大肠埃希菌（含菌量≤100cfu/ml）作大肠埃希菌阳性对照组，第3份加入1ml铜绿假单胞菌（含菌量≤100cfu/ml）作为铜绿假单胞菌阳性对照组。另取胰酪大豆胨液体培养基10ml，加入10ml肠道菌增菌液体培养基及1ml缓冲液，作为阴性对照组。于30～35℃培养24～48h，划线接种到紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板上，30～35℃下培养18～24h，观察菌落形态，结果见表4。
2.4.2大肠埃希菌检查验证试验
取1∶10供试液2份，每份10ml，分别加入到100ml胰酪大豆胨液体培养基中，第1份加入1ml缓冲液，混匀，作为供试品组，第2份加入1ml大肠埃希菌（含菌量≤100cfu/ml），混匀，作阳性对照组；另取胰酪大豆胨液体培养基110ml，加入1ml缓冲液，作为阴性对照组，均于30～35℃中培养18～24h。
取以上培养物1ml加入到100ml麦康凯液体培养基中，在42～44℃下培养24～48h。然后划线接种于麦康凯琼脂平板上，在30～35℃下培养18～72h，观察菌落形态，结果见表5。
2.4.3沙门菌检查验证试验
取1∶10供试液2份，每份100ml，第1份加入1ml缓冲液，混匀，作为供试品组，第2份加入1ml沙门菌（含菌量≤100cfu/ml），混匀，作阳性对照组。另取胰酪大豆胨液体培养基100ml，加入1ml缓冲液，作为阴性对照组，在30～35℃下培B18～24h。然后分别取培养物0.1ml，接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，在30～35℃下培养18～24h，取少量RV沙门增菌液体培养物，划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂的培养基上，在30～35℃下培养18～48h，用接种针挑选疑似菌落，进行斜面和高层穿刺接种于三糖铁琼脂培养基上，于30～35℃中培养18～24h，观察菌落形态，结果见表6。
由表4～6可知，控制菌检查采用直接接种法，即可达到要求。
3讨论
2015年版与2010年版《中国药典》相比[10-11]，微生物计数法适用性试验，从对细菌总数作方法适用性检查，变成对需氧菌总数作方法适用性试验，试验菌株3种变为5种；培养基由胰酪大豆胨琼脂替代营养琼脂，用于检查需氧菌，沙氏葡萄糖琼脂培养基代替玫瑰红钠培养基，用于检查霉菌与酵母菌，虽然增加了试验的工作量，但却具有良好的广谱性，提高检出率，方法更灵敏[12]。对控制菌的检查，新版删除了大肠菌群的检查，新增了耐胆盐革兰阴性菌的检查[13]，对含有药材粉末的固体口服给药制剂都必须检查沙门菌，提高了对致病菌控制的要求。
乌芪舒筋通络片处方药味中多种成分含有抗菌活性[14-15]，由实验可知，对需氧菌具有抑制作用，故需氧菌总数计数检查时采用常规平皿法回收率较低，需选用平皿稀释法或薄膜过滤法。
在实际工作中，匀浆仪打碎样品时，经常出现泡沫，往往对验证结果造成影响，待泡沫消除后再加入菌种，基本能消除由操作引起的影响。
[参考文献]
[1]陈震尧，陈金英，姚伟生，等.乌芪舒筋通络片乌头碱限量检测方法研究[J].中国药房，2015，26（36）：5144-5146.
[2]国家药典委员会.中国药典[m].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：附录79-88.
[3]国家药典委员会.中国药典[m].四部.北京：中国医药科技出版社，2015：140-151.
[4]刘广文，苑艳飞.养肝解毒丸微生物限度检查法的验证实验[J].中国医药科学，2016，6（13）：54-57.
[5]文玉辉，韩珍珍.11种医院制剂微生物限度检查方法验证[J].临床医药实践，2015，24（10）：763-765.
[6]柴海毅.浅析微生物计数方法的回收率[J].医药工程设计，2013，34（1）：30-31.
[7]陈志禹，夏佳，席时东.八珍丸的中国药典2015年版微生物学检查结果分析与评价[J].药物分析杂志，2016，36（3）：418-425.
[8]陈志禹，夏佳，席时东.八珍颗粒《中国药典》2015年版微生物限度检查法的建立及检验结果分析[J].中国卫生检验杂志，2015，25（23）：4051-4055.
[9]陈志禹，席时东.中国药典2015年版八珍胶囊和八珍片微生物限度检查与探讨[J].中国现代应用药学，2016，33（5）：628-634.
[10]李趣嫦，江艳芳.《中国药典》2010版与2015版微生物限度检查法对四种药物检测结果的比较[J].中国药品标准，2015，16（2）：86-90.
[11]景荣先，张国林.2015年版《中国药典》微生物限度检查法洁净环境及计数培养基修订分析探讨[J].中国卫生产业，2015，12（5）：184-185.
[12]王洪家.解毒散结颗粒《中国药典》2015年版微生物限度检查方法学验证[J].天津药学，2016，28（4）：17-19.
[13]杨晓莉，李辉，马英英，等.《中国药典》2015年版非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法解读与对策[J].中国药师，2016，19（4）：748-752.
[14]黄英.清热安宫丸等中成药微生物限度检查方法验证[J].中国药业，2013，22（24）：38-40.
微生物研究方法篇3
[关键词]甲硝唑诺氟沙星栓;匀浆;薄膜过滤;中和剂
[中图分类号]R927.2[文献标识码]a[文章编号]1673-7210(2010)02(a)-042-03
Studyonmethodofmicrobiallimittestformetronidazole-norfloxacinSuppositories
ZHoUXiusen,LiDaoming
(XinyanginstituteforFoodandDrugControl,Xinyang464000,China)
[abstract]objective:toestablishamethodofmicrobiallimittestformetronidazole-norfloxacinSuppositories.methods:1%tween-80sterilesodiumchloride-peptonebuffer(pH=7.0)asthesolvent,thesolutionfortestwerepreparedbyhomogenatetechnique,Bacterialcountandthecontrolledbacteriumwasexaminedbymembranefiltrationmethodandmediumaddedneutralizer,thenumberofmoldsandyeastweredeterminedwithmediadilutionmethod.Results:themethodcaneffectivelyeliminatethebacteriostasiseffectsofmetronidazole-norfloxacinSuppositoriesandrateofrecoveredof5-positivebacteriahaveattained70%,accordwiththestandardofChinesepharmacopeia(2005edition).Conclusion:themethodissuitableformicrobiallimittestformetronidazole-norfloxacinSuppositories.
[Keywords]metronidazole-norfloxacinSuppositories;Homogenate;membranefiltration;neutralizer
甲硝唑诺氟沙星栓是河南信阳职业技术学院附属医院制剂室配制的外用制剂,以甲硝唑和诺氟沙星为主药、硬脂酸聚烃氧(40)酯为基质混合制成的栓剂。其中甲硝唑对大多数厌氧菌具强大抗菌作用,对阿米巴原虫和滴虫也有较强的杀灭作用,诺氟沙星为第三代喹诺酮类抗菌药物,具有抗菌谱广、作用强等特点。临床用于治疗阴道滴虫、阴道炎,各种阿米巴病及术后预防和治疗厌氧菌引起的感染等。本文按照《中国药典》2005年版二部附录ⅪJ微生物限度检查法[1]有关要求,对甲硝唑诺氟沙星栓微生物限度检查方法的建立进行探讨。
1仪器与试药
1.1仪器
HtY-Ⅲ智能集菌仪、HtY反复使用集菌培养器(杭州泰林医疗器械厂);YJa型电动匀浆仪(台州市椒江五星机械仪器有限公司);lRH-150B型生化培养箱(广东省医疗器械厂);电热三用水箱(北京市医疗设备厂);Jm3102电子天平(余姚纪铭称重校验设备公司)。
1.2试药
甲硝唑诺氟沙星栓(规格:3.4g,批号:20090311,河南信阳职业技术学院附属医院制剂室提供);大肠埃希菌[CmCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CmCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CmCC(B)63501]、铜绿假单胞菌[CmCC(B)10104]、白色念珠菌[CmCC(F)98001]、黑曲霉[CmCC(F)98003]均购自河南省食品药品检验所,菌株传代数均为第4代;营养琼脂培养基(批号:070328);玫瑰红钠琼脂培养基(批号:070531);营养肉汤培养基(批号:070508);改良马丁培养基(批号:070302);胆盐乳糖培养基(批号:070419);改良马丁琼脂培养基(批号:070520);甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号:080520);溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号:070620)均为北京三药科技开发有限公司生产;pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号:070523,北京三药科技开发有限公司);吐温-80、硫酸锰为国产分析纯。
2方法与结果
2.1菌液制备
分别取经37℃培养18～24h的大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养物1ml,经25～28℃培养18～24h的白色念珠菌的改良马丁液体培养物1ml,用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释成每毫升含菌数50～100cfu的菌悬液;取经25～28℃培养1周的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物,用5ml0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子,吸孢子悬液1ml,加0.9%无菌氯化钠溶液适量,稀释成与标准比浊管浊度相当的孢子悬液,取1ml孢子悬液,用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释成每毫升含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
2.2供试品溶液制备[2]
取供试品10g,加45℃无菌含1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(以下简称稀释液)100ml,置匀浆仪匀浆,1档2min,制成1∶10的供试品溶液。
2.3细菌、霉菌和酵母菌计数法的验证
2.3.1试验组常规法、培养基稀释法分别取供试品溶液1.0、0.5和0.2ml,注入平皿,分别加50～100cfu的试验菌,立即倾注相应的琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按规定培养及测定其菌落数;薄膜过滤+中和法取供试品溶液1ml,加至100ml45℃无菌含0.1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(以下简称冲洗液)中,滤过,再用冲洗液冲洗3次,每次100ml,在最后一次冲洗液中加入50～100cfu的试验菌,过滤后取出滤膜,将滤膜冲洗面朝上贴至含有5ml中和剂(0.1mol/L的mnSo4)的营养琼脂培养基平板上培养,每种试验菌制备2张膜,置规定温度培养24～48h,计数。
2.3.2菌液组测定加入的试验菌数。
2.3.3供试品对照组取供试品溶液,按试验组的方法,不加入试验菌,按菌落计数法测定供试品本底菌数。
2.3.4稀释剂对照组制备供试品溶液和冲洗时,都加入了吐温-80,选择稀释液代替供试品溶液,按试验组常规法试验。
2.3.5回收率的测定计算公式如下,结果见表1。
试验组的加菌回收率=
■×100%;
稀释剂对照组的加菌回收率=
■×100%。
2.4控制菌检查方法的验证[3]
2.4.1试验组取供试品溶液10ml,加至250ml冲洗液中,滤过,再用冲洗液冲洗3次,每次100ml,在最后一次冲洗液中加入50～100cfu的金黄色葡萄球菌(或铜绿假单胞菌),过滤后,灌注100ml含有5ml中和剂的营养肉汤培养基(或胆盐乳糖培养基),培养18～24h后,划线于甘露醇氯化钠琼脂培养基(或溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基)的平板上,依照金黄色葡萄球菌(或铜绿假单胞菌)的检查方法进行检查。
2.4.2阴性菌对照组加入菌改为大肠埃希菌,其余操作同试验组。
2.4.3阳性对照组取50～100cfu的金黄色葡萄球菌(或铜绿假单胞菌)加至100ml含有5ml中和剂的营养肉汤培养基(或胆盐乳糖培养基)中,依法培养,按试验组同法检查。
2.5结果
2.5.1由表1结果可知,用培养基稀释法白色念珠菌、黑曲霉菌的加菌回收率可达到70%,提示可以用培养基稀释法进行该供试品的霉菌、酵母菌计数测定;用薄膜过滤+中和剂法培养计数,大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的加菌回收率均在70%以上,提示可以用该法对细菌数进行测定。
2.5.2控制菌检查方法验证结果试验组、阳性对照组均呈阳性,阴性菌对照组均未检出阴性菌。试验组呈阳性表明试验菌能够正常生长;阴性菌对照组未检出阴性菌表明试验菌对其相对应的增菌液或琼脂培养基具有专属性。因此,该控制菌检查可采用薄膜过滤冲洗后,在含有中和剂的增菌培养基中培养,依法检查。
2.6微生物限度检查方法的建立
根据上述实验结果,甲硝唑诺氟沙星栓微生物限度检查方法为:照微生物限度检查法(附录ⅪJ),取供试品10g,加45℃无菌含1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,置匀浆仪匀浆,1档2min,制成1∶10的供试品溶液。
细菌数计数测定:取供试品溶液1ml,加至100ml45℃无菌含0.1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中,按薄膜过滤法(冲洗量300ml/膜),将滤膜贴至含有5ml中和剂(0.1mol/L的mnSo4)的营养琼脂培养基平板上,依法测定;霉菌和酵母菌计数测定:取供试品溶液按培养基稀释法依法测定。
控制菌检查:取供试品溶液10ml,加至250ml45℃无菌含0.1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中,按薄膜过滤法(冲洗量300ml/膜),灌注含5ml中和剂的100ml相应培养基,依法检查。
3讨论
该制剂有较强的抗细菌作用,消除抑菌成分的有效方法是薄膜过滤,但所制备的供试品溶液必须能顺利通过滤膜。硬脂酸聚烃氧(40)酯是一种常用的水溶性基质,因其不溶于十四烷酸异丙酯,故不适用十四烷酸异丙酯溶解供试品、pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液萃取分层的《中国药典》方法制备供试品溶液。
吐温-80是一种亲水性的表面活性剂,具有增溶和乳化的作用。用含1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作溶剂制备供试品溶液,能提高供试品的溶解性,降低黏稠度,使供试品溶液分散均匀;用含0.1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作冲洗液,可减小膜压力,增加滤过流畅性,缩短操作时间[5]。
利用硫酸锰能与喹诺酮类药物形成稳定的六元环络合物,掩盖它的活性基团的特征,消除细菌计数中喹诺酮类药物的抑菌性和膜吸附性,可有效减少冲洗液的用量,简化操作[4]。
稀释剂和冲洗剂应保温45℃,可增加供试品溶液的均一性和流动性,保证取样量准确,同时使滤过容易。
细菌测定时,若培养后培养基透明度差而不利计数,可在100ml营养琼脂培养基中加入0.1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(ttC)1ml(含0.001%的ttC),利用细菌的琥珀酸脱氢酶在其生长繁殖过程中的活化作用,使无色的ttC还原为红色物质,使培养基变红,易于辨认计数[6]。
[参考文献]
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京:化学工业出版社,2005:附录93-101.
[2]易大为,陈野,潘强.薄膜过滤法在局部给药制剂微生物限度检查中的应用[J].中国药事,2008,22(4):342-345.
[3]叶兴法,杜燕燕,胡江英.风痛灵微生物限度检查方法的验证[J].西北药学杂志,2009,24(2):140-141.
[4]张光华,余立,刘文杰.硫酸锰在几种喹诺酮类药物无菌检查中的应用[J].中国药品标准,2008,9(1):35-38.
[5]刘文杰,江志杰,余立,等.吡咯类抗真菌药物制剂微生物限度检查方法的研究[J].中国医药导报,2008,5(29):28-30.
[6]叶超,钱维清.2,3,5-三苯基氯化四氮唑浓度对细菌菌落计数影响的验证[J].中国药品标准,2007,8(1):66-69.
微生物研究方法篇4
关键词 茁药肤痔清 微生物限度检查方法
肤痔清软膏是由黄柏、土大黄、金果榄等组成的复方制剂，苗医：旭嘎凯沓痂，样丢象泱安，滁内挡祛卡。陡：嘎久杠工浆店羌，罗欧，岗俺，阴高坳。中医：具有清热解毒，化瘀消肿，除湿止痒功能，常用于湿热蕴结所致手足癣、体癣、痔疮肿痛出血、带下病等在微生物限度常规检验中，微生物的检出率都较低。为保证检验方法的科学性、可行性及结果的准确性，本试验用2005年版《中国药典》规定的3株细菌、2株真菌(大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌)对3批肤痔清软膏进行了微生物限度检查法的验证试验研究，以确认所采用的方法是否适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定和控制菌检验及检查药品本身污染微生物的状况。
1 材料
1．1 仪器YJa-电动匀浆仪(台州市椒江五星试压设备有限公司)，Se2020电子天平(梅特勒－托利多常州衡器有限公司)，二氧化碳培养箱(美国SHeL・LaB)。
1．2 培养基营养琼脂培养基(批号031142)、营养肉汤培养基(批号50121)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号040202)、BL培养基(批号050321)、pH7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液(批号060223)，北京三药科技开发公司；氯化钠(批号041011)，成都五环高欣化学试剂厂；疱肉牛肉粒(批号060314)，北京陆桥技术有限责任公司。
1．3 供试品肤痔清软膏(批号为200603022006040520060601)。
1．4 菌种大肠埃希菌[Cm-cc(B)44102]、枯草芽孢杆菌[cmCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌[CmCC(B)26003]、黑曲霉[CmCC(F)98003]、白色念珠菌[CmCC(F)98001]、生孢梭菌[CmCC(B)64941]均由中国药品生物制品检定所提供。
2 方法与结果
2．1 菌液制备将上述5株菌的新鲜培养物分别接种至规定培养基，细菌培养16h；酵母菌培养24h；霉菌培养5d，按《中国药典》2005年版二部附录方法制备菌(孢子)悬液，备用。
2．2 供试液制备按规定取供试品10g，按《中国药典》2005年版一部附录方法制成1:10供试液，备用。
2．3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2．3．1 试验组供试液1ml和50～100CFU试验菌，分别注入平皿中，每株菌平行制备2个平皿。
2．3．2 菌液组测定所加的试验菌数。
2．3．3 供试品对照组取试验组供试液注皿量，测定供试品本底菌数。
2．3．4 回收率计算回收率％=[(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)÷菌液组平均菌落数]×100％
2．3．5 结果判断 在3次平行试验中，试验组的菌回收率均应在70％以上；若低于70％，应采用适宜的方法消除供试品的抑菌活性，重新进行验证试验。
预试验取供试液1，0.50，0.33，0.2ml分别注1皿为一组，每组加入1种试验菌菌液，共5组。枯草芽孢杆菌1，0.50．0.33ml・皿-1的回收率分别为45.8％，67.6％，84.5％，黑曲霉1，0.50ml・皿-1的回收率分别为69，83.6％，白色念珠菌0.2・皿-1的回收率为96.2％，其余2株菌1ml・皿-1的回收率均达80％以上。
根据预试验结果，白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉分别采用培养基稀释法0.2ml・皿-1(1ml分注5皿)、0.33ml・皿-1(1ml分注3皿)、0.5ml・皿-1(1ml分注2皿)其余2株菌采用常规法1ml・皿-1进行验证试验。
结果见表(表试验组数据除白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉为10皿、6皿、4皿平均值外，其余2株菌及菌液组均为2皿平均值)。
2．4 控制菌检查方法的验证
2．4．1 试验组供试液10ml及10～100CFU铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌加入相应培养基中，按《中国药典》2005年版一部附录铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法检查。
2．4．2 阴性菌对照组 方法同试验组，以大肠埃希菌作为阴性对照菌。
2．4．3 结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌；试验组应检出试验菌，该试验方法成立。
试验结果见表。
2．4．4 采用经验证的方法检查3批肤痔清软膏20060302、20060405、20060601细菌数分别为10，20，小于10个g-1，霉菌及酵母菌数均小于10个g-1，未检出铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌。3讨论
(1)肤痔清软膏对白色念珠菌有较强的抑制生长速度作用，当供试液为1，0.5，0.33．0.25ml・皿-1时，加入的白色念球菌，培养72h菌落细小且与平皿内沉淀物不能区别，培养时间延长至96h，该菌并不随培养时间延长而菌落增大，需室温放置24h后菌落方清晰可见。1，0.5，0.33，0.25ml・皿-1白色念珠菌的回收率分别为12％，84％，84％，96.2％，虽然从0.5m/・皿-1回收率即可达70％以上，但方法的可行性差，不宜用于该供试品的霉菌、酵母菌检查。供试液量降低至0.2ml・皿-1时，培养72h菌落清晰可辨，基本消除肤痔清软膏对白色念珠菌的抑制生长速度作用。
微生物研究方法篇5
关键词：微生物限度检查方法；验证；甲磺酸达氟沙星溶液
中图分类号：R927.12文献标识码：a文章编号：1006-3315（2013）03-178-001
材料：
1.供试品：甲磺酸达氟沙星溶液，规格：100ml，批号：120601
2.培养基及稀释剂：营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，胆盐乳糖培养基，mUG培养基，麦康凯培养基，改良马丁培养基，营养肉汤培养基。pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
3.验证用标准菌株：金黄色葡萄球菌[CmCC（B）26003]，枯草芽孢杆菌[CmCC（B）63501]，大肠埃希菌[CmCC（B）44102]，白色念珠菌[CmCC（F）98001]，黑曲霉菌[CmCC（F）98003]。上述标准菌株均源自中国医药细菌保藏中心，验证试验所用的菌株均为第二代。
实验部分：
1.菌液制备：按照《中国兽药典》2010年版附录要求，采用10倍稀释法稀释，取金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠埃希菌的新鲜培养物接种至营养肉汤中30-35℃，培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml含菌数为50-100cfu的菌悬液备用；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中23-28℃，培养24-48小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml含菌数为50-100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
2.供试液制备：取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1：10的供试液。
3.细菌，霉菌和酵母菌计数方法验证
3.1薄膜过滤法（1）试验组：取1：10供试品溶液10ml，过滤，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次100ml，冲洗5次，在最后一次冲洗液中加入50-100cfu/ml的金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠埃希菌的试验菌，滤干，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基上，置30～35℃培养3天，每株试验菌平行制备2个平皿，分别加入6个平皿中。白色念珠菌，黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基上，置23～28℃培养5天，每株菌平行制备2个平皿，计数。（2）菌液组：分别取上述稀释的菌液1ml注入平皿内，每个菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。（3）供试品对照组：取1：10供试品溶液10ml，过滤，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次100ml，冲洗5次，以测定供试品的本底菌数。（4）稀释剂对照组：用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试品，加入50-100cfu/ml试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落数计数方法测定其菌数。
3.2结果说明：采用薄膜过滤法，试验组金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌，黑曲霉菌各试验菌的回收率均高于70%，可采用薄膜过滤法（冲洗量500ml/膜）对本品进行细菌数，霉菌数和酵母菌数测定。
4.控制菌检查方法验证
4.1大肠埃希菌检查法（1）试验组：取1：10供试品溶液10ml，薄膜过滤，用冲洗液冲洗5次，每次100ml，最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌菌悬液1ml（10-100cfu），薄膜过滤，取出滤膜，放入100ml胆盐乳糖培养基中，35℃培养24小时，取0.2ml上述培养物加入5mlmUG培养基中，24小时后，加靛基质试液5滴，液面呈现玫瑰环。（2）阴性对照：照上述方法操作，最后一次冲洗时冲洗液中加入2ml金黄色葡萄球菌菌液，薄膜过滤，取出滤膜加入50ml胆盐乳糖培养基中，于35℃培养24小时，再取上述培养物划线接种于麦康凯培养基的平板上，于35℃培养24小时，未发现有金黄色葡萄球菌典型菌落。（3）阳性对照组：取大肠埃希菌试验菌液10-100cfu接种至胆盐乳糖增菌培养基，依据大肠埃希菌检查法试验生长良好。
4.2试验结果：可采用薄膜过滤法（取1：10供试品溶液10ml，薄膜过滤，用冲洗液冲洗5次，每次100ml）对本品进行控制菌（大肠埃希菌）检查，试验组，阳性对照组均检出大肠埃希菌，阴性对照组无菌生长。
结论：
本品按照《中国兽药典》2010年版附录“微生物限度检查法”要求进行方法学验证试验。结果金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌，黑曲霉菌各试验菌的回收率均高于70%，按照《中国兽药典》2010年版附录“微生物限度检查法”进行控制菌的方法学验证试验及检查，控制菌检查阳性菌生长良好，说明本品对大肠埃希菌没有抑菌作用，阴性菌均未检出，说明该控制菌检查方法的专属性好，可用于控制菌检查。
参考文献：
微生物研究方法篇6
生物修复主要依靠微生物、植物和土壤动物吸收、代谢、降解污染物,最终使其无害化,具有对环境扰动小、不产生二次污染、运行成本低等特点.该技术主要分为两类,即植物修复和微生物修复.由于pCBs疏水性强、生物可利用性低,因此会阻碍植物对它的吸收与转化,从而影响植物修复效果.而优良的pCBs耐受或降解植物的缺乏也在一定程度上限制了该技术的推广应用.微生物修复常采用2种方式[21]:一是生物激励,通过向土壤中添加有机物如葡萄糖或者其他营养元素如n、p等,以促进土著微生物生长,达到降解污染物的目的;二是生物强化,即向土壤中添加外源的高效降解菌(或含有高效降解菌的载体),以促进土壤中污染物的降解.在实际应用过程中,通常都是将这两种技术相结合,以期达到最佳的修复效果.pCBs是人工合成的难降解化合物,其所污染的环境必须经历一个相当漫长的时期才能自然驯化出一些具有降解pCBs能力的微生物,进而转化分解pCBs,其效率较为低下.因此,通过人工筛选获得高效的pCBs降解菌,将其扩大培养后投入污染土壤中加速pCBs的降解,是一种十分可行的技术手段.目前研究工作者已经从环境中分离出了许多能够降解pCBs的微生物,主要分布在假单胞菌属(pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、产碱杆菌属(alcaligenes)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)及鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等多个属,代表种有真养产碱杆菌(alcaligeneseutrophusH850)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.LB400)和假单胞菌(pseudomonassp.KF707)[22-24].在实验室条件下,微生物降解pCBs的效果往往比较理想,但在实际应用中,由于抗毒害能力差、被原生动物吞噬、与土著微生物竞争处于劣势等原因[25],导致外源投加微生物的生物量及代谢活性迅速降低,污染物降解能力也随之下降.因此,如何使外源微生物定殖于原位环境中并稳定发挥其功能,一直是国内外学者关注的焦点,而固定化微生物技术的兴起则为解决这一问题提供了新思路.
2固定化微生物技术及其在土壤修复方面的研究现状
2.1固定化微生物技术固定化微生物技术是指通过物理或化学的方法将游离的微生物与特定的载体相结合,使其固定在某一空间区域内,以提高微生物细胞的浓度、保持较高的生物活性并能反复利用的方法[26].微生物被固定后,载体为微生物提供了一个相对稳定的生存环境[14];载体作为一种屏障,能在一定程度上减轻土著微生物带来的竞争压力、削弱原生动物的吞噬作用[15];成型的固定化颗粒中微生物细胞密度大、代谢活性较强.这些特点使得固定化微生物具备了更好的环境适应能力和应用价值.载体的种类和固定化方式是决定固定化微生物性能的关键因素.良好的载体需具备机械强度高、理化性质稳定、物理性状优良、寿命长、无毒、不溶于水、价格低廉及易制备等特点[27].目前研究与应用中常见的微生物固定化载体材料主要分为4类:无机载体、天然高分子载体、人工合成高分子载体及复合载体[28-29].这4类载体各有优缺点,其中无机载体如蛭石、硅藻土以及天然高分子载体海藻酸钠、琼脂糖等均来源于自然环境,价格低廉且不易造成二次污染,是制备固定化微生物的首选载体,将其应用于环境修复方面的研究报道也较为丰富[17,30-31].此外,固定化方法也会对微生物的生长和活性造成不同程度的影响.因此,必须根据固定化微生物的用途及其应用的环境选择合适的固定方法.吸附法、包埋法、共价结合法和交联法为4种最主要的微生物固定化方法,其各自的特点见表1[26,28].交联法和共价结合法制备的固定化微生物细胞活性相对较低,而且传质阻力大、制备成本高,目前仍然处于实验室研究阶段.吸附法与包埋法对细胞活性影响小,而且制备过程比较简单,所以是目前应用较为广泛的微生物固定化方法[32].2.2固定化微生物技术在有机污染土壤修复方面的研究现状固定化微生物技术兴起于20世纪80年代,运用该技术处理含酚废水、含油废水和味精厂废水[33-37]等高浓度有机废水时均取得了良好的效果.但是到目前为止,固定化微生物技术在土壤修复方面的研究仍然处于起步阶段.其中,利用固定化微生物技术降解土壤中的残留农药及多环芳烃方面的研究报道相对较多.Su等[15]以蛭石为载体,吸附固定毛霉(mucorsp.SF06)及芽孢杆菌(Bacillussp.SB02),用于降解土壤中的苯并[a]芘.42d内,苯并[a]芘的降解率高达95.3%,而游离菌组的降解率仅为79.6%.Balfanz等[38]将用粘土吸附固定的产碱杆菌(alcaligenessp.a7-2)投入反应器中,提高了土壤中对氯苯酚的降解速率.吸附固定的过程比较简单,但其缺点在于微生物与载体结合不够紧密,在使用过程中微生物易从载体上流失.而包埋法则能有效克服这一缺点,所以包埋法以及包埋法与吸附法相结合的微生物固定化技术也受到了广泛关注.Lin等[14]把粉末活性炭加入到海藻酸钠凝胶包埋体系中固定黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporiumBKm-F-1767),制得的固定化颗粒对五氯酚的降解能力优于游离菌,而且还具备了污染物吸附性能.范玉超等[17]采用竹炭吸附苍白杆菌(ochrobactrumsp.aHat-3),并辅以海藻酸钠包埋,所得到的固定化颗粒在28d内对砂姜黑土和红壤中阿特拉津的降解率分别为51.9%和52.8%,均比添加游离菌的试验组高出约10%.wang等[19]的研究结果表明,在采用海藻酸钠和聚乙烯醇包埋微生物时,添加活性炭粉末有助于固定化颗粒形成良好的孔隙结构、利于物质传输和微生物生长.固定化微生物技术在降解有机污染物方面的优越性已经引起了越来越多的关注,而开发多样化的固定化技术则会成为研究的重点.2.3固定化微生物技术在pCBs污染物修复方面的研究现状国内外有关应用固定化微生物技术修复pCBs污染土壤的研究报道十分少见.现有研究主要集中于分离pCBs降解微生物、研究微生物对pCBs代谢谱和代谢产物以及分析相关功能基因和酶的结构[39-43].直接投加微生物修复pCBs污染土壤的研究也处于探索阶段[44-46].20世纪末美国通用电子公司尝试通过投加微生物并结合翻耕等技术实地修复pCBs污染土壤,最终发现土壤的温度、湿度及有机质含量是影响微生物降解pCBs的重要因素[47-49].2011年,tu等[50]报道了一株具备pCBs降解能力的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti).室内模拟试验结果表明,该菌不仅能提高土壤中pCBs的降解率,而且能促进土著细菌与真菌生长,预示着该菌株具备较高的应用价值.近十年来开始有研究者关注固定化微生物对pCBs的降解(表2).mukerjee-Dhar等[12]首次采用海藻酸钙包埋的混浊红球菌(RhodococcusopacustSp203)降解水体中的pCBs,发现固定化的菌株具备更持久的pCBs降解能力:半连续降解试验表明,在第一个降解周期结束后,游离菌的pCBs降解活性基本丧失,而固定化菌株的pCBs降解活性可维持至第三个降解周期.聚氨酯泡沫也是一种常用的载体,na等[51]用其包埋假单胞菌(pseudomonassp.SY5)并获得了高活性的固定化颗粒,其对aroclor1242中不同pCBs同系物的降解率要比游离菌高5%~40%.随后有学者尝试运用吸附型载体固定pCBs降解微生物、构建生物膜反应器,用于降解水体中的pCBs.Borja等[53]以水泥颗粒为载体设计的简易生物膜反应器运行5d后,aroclor1260的降解率高达95%左右.Diana等[54]以聚氨酯泡沫和磨砂玻璃珠为填料,通过添加多种微生物所构建的生物膜反应器能有效的降解多种pCBs和氯代苯甲酸(chlorobenziocacids,CBas).该研究结果表明,生物膜结构能有效抵御环境冲击对微生物造成的不利影响,从而保证微生物稳定的发挥其功能。目前,仅有少量研究涉及固定化真菌修复pCBs污染土壤.Fernández-Sánchez等[55]以甘蔗渣为主要基质培养黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporiumH-298),并用其修复pCBs污染土壤.结果表明附着在甘蔗渣上的真菌能定殖在土壤中并加速土壤中pCBs的降解.而且外源真菌和土著微生物间能建立协同关系,使得土壤中的异养生物活性提高,并促进土壤中pCBs的降解.Federici等[56]用玉米秸秆颗粒培养虎皮香菇(LentinustigrinusCBS577.79),使该菌在生长过程中逐渐与秸秆颗粒紧密结合.土壤修复试验结果显示,这种真菌能显著提高aroclor1260的降解率,并能促进土壤微生物多样性的恢复.生物质材料不仅能作为真菌附着生长的载体,而且还能为真菌的生长提供营养,这两种效用确保了真菌稳定地定殖在土壤中,持久发挥其功能.故在探索真菌固定化方法的过程中,扩大生物质载体材料的筛选范围是非常有必要的.而以pCBs降解菌为对象、选择适当的载体材料、结合不同的物化技术制备出高性能的固定化微生物,并应用其修复pCBs污染土壤是值得深入探究的.虽然迄今为止已经发现了大量具备pCBs降解功能的细菌,但尚未出现与固定化细菌降解土壤中pCBs相关的研究报道.本课题组从长期受pCBs污染的土壤中获得了1种微生物混培物和1株飞鱼鞘氨醇菌(SphingobiumfuliginisHC3,GenBank登录号为KC747727).它们均能降解氯取代数小于4的pCBs同系物.研究还发现当微生物吸附在以水稻秸秆为材料制备的生物炭上后,其细胞能维持较高的代谢活性.因此我们尝试以生物炭为主要载体固定pCBs降解菌,以期获得能适用于pCBs污染土壤修复的固定化微生物.
3应用固定化微生物技术修复pCBs污染土壤的可行性
虽然目前有关采用固定化微生物技术修复pCBs污染土壤的研究报道仍然较少,但应用该技术修复多环芳烃、石油及农药等有机物污染土壤方面的研究已经取得了一定的进展.这些有机物和pCBs具有类似的性质,如具有生物毒性、疏水性强、生物可利用性较低.Su等[15,57]以蛭石和玉米芯颗粒为载体、Chen等[58]以生物炭为载体,制备固定化微生物降解土壤中的多环芳烃;Xu等[59]以花生壳粉为载体、Liang等[60]以活性炭和沸石为载体,制备固定化微生物修复石油污染土壤;Lin[14]等采用凝胶包埋法(辅助活性炭)制备固定化微生物降解土壤中的五氯酚;范玉超等[17]用包埋法制备固定化微生物降解土壤中的阿特拉津.这些研究都表明在土壤中添加固定化微生物降解有机污染物的效果优于直接添加游离微生物.其主要原因为微生物被固定后,载体形成的屏障能在一定程度上屏蔽土著微生物带来的竞争压力、抵御环境因素变化对微生物的冲击,而且适当的固定化方法还能改善微生物的代谢活性[12-16].因此,运用固定化微生物技术修复pCBs污染土壤具有一定的可行性.而且在土壤原位修复过程中,固定化微生物技术的实施工艺简单、对土壤生态环境的扰动小,使这项技术具备了较高的推广价值.此外,目前研究工作者已经筛选出了许多能降解pCBs的微生物,其中能有效降解pCBs并且降解途径已经被阐明的代表种有红球菌(Rhodococcussp.RHa1和Rhodococcussp.R04)、伯克霍尔德氏菌LB400、和弯曲无色细菌(achromobactergeorgiopolitanumKKS102)[61-64].这些宝贵的微生物资源将为制备固定化微生物提供物质基础.能用于固定微生物的载体材料十分丰富,如天然载体硅藻土、蛭石、琼脂糖、海藻酸钠、农作物秸秆以及人工合成载体聚乙烯醇、硅胶和聚酯酰胺泡沫等都比较容易获取或制备,为研究与开发不同性能的固定化微生物提供了充足的资源.其中,蛭石和农作物秸秆常被用作吸附载体固定微生物[15,55-56],而海藻酸钠和聚乙烯醇则可作为交联剂包埋微生物[12,14,19].
4今后研究的重点
微生物研究方法篇7
生物医学电子显微学是电镜技术与生物医学相结合的边缘学科，是应用电镜观察研究细胞亚显微结构及其变化，揭示细胞结构与功能的科学技术，对建立现代医学完整形态学知识结构体系及分子生物学的研究至关重要。为生物医学专业研究生开设《生物医学电子显微学》课程，旨在使学员系统地学习超微结构知识，掌握超微结构的研究方法和实用意义，扩大科研思路，为课题设计和研究打下良好的基础。我室在多年教学实践中，经过积极探索，对教学内容、教学方法进行了系统的改革，几年的教学实践证明，这一改革取得了明显的效果。
1构建面向适应能力培养的教学内容
《生物医学电子显微学》的教学对象主要是硕士研究生，其目的是使学员掌握与研究相关的超微结构研究的实验技能，为超微结构研究奠定实验技术基础，拓展课题研究思路。为了使课程具有足够的宽广度和纵深度，并具有前沿性和前瞻性，提高超微结构的研究水平，突出电子显微学在基础医学及临床研究中的应用［1］。首先，将细胞超微结构纳入电镜技术的教学，系统地充实有关新的电镜技术和细胞超微结构的理论知识，把超微结构理论知识与电镜技术整合为生物医学电子显微学，作为一门学科进行建设。通过两部分内容的有机结合，让学员在学习电镜技术时了解细胞超微结构，在学习细胞超微结构的过程中掌握电镜技术。另外注重融合、吸纳本学科前沿的研究成果和实验实例，更新教学内容，将细胞生物学、分子生物学中的新进展、新技术融入教学，增设了培养细胞电子显微学研究技术、特殊组织细胞（如海马）的取材技术、电镜原位杂交技术、硝酸镧示踪技术、钙离子示踪技术等，使课程内容紧密结合基础研究和临床应用，为研究生更好的利用电镜技术为基础医学和临床研究打下基础。为了使研究生更好地进行超微结构研究，我们建立了开放型技术平台［2］，为研究生课题研究提供选题设计、实验技术方法、镜下图像观察、结果分析与论文撰写等技术指导，既保证了研究生课题的顺利进行，也促进了本学科实验技术的发展，充实了教学内容。同时多层次与我校形态学专家建立良好的协作关系，聘请他们协助指导研究生超微结构研究工作。
2实施有利于实验技能培养的教学法
改革教学方法，突出对研究生创新能力、实践能力的培养，增进研究生的科学素质;改进训练方法，解决课程中的重点与难点教学，加强实际工作能力的训练;应用多种辅助教学手段，建立互动教学园地，提高了教学质量。
2.1理论教学
在细胞超微结构的教学中采用大量典型的各系统超微结构照片、模式图和事例充实理论教学内容，使学员了解细胞亚显微结构的异常改变与功能变化、发病机理及疾病的关系，从而认识到电子显微学在疾病病因、病情、分型及鉴别诊断中的重要性。在有关电镜的结构与原理的教学中应用多媒体、视频、动画和实物等多种辅助教学方式，将抽象的理论形象化。在讲解样品制备技术时，强调取材的重要性，通过介绍失败事例使学员认识到样品制备在超微结构研究中的重要性。
2.2实验教学
在实验教学中重点训练学员基本技能，培养动手能力，使其掌握正确规范的实验技能。通过实验教学加强学员对课程的重点、难点的理解和掌握:①突出重点，培养学员的动手能力;②突破难点，使学员掌握电镜操作技能;③强调镜下观察分析的重要性，提高学员的研究能力;④考试、考核并举，重在能力培养。
3新教学法的实施效果
通过教学体系的改革与调整，拓展了教育规模，提高了学员对生物医学电子显微学的认识及科研技能掌握和应用的能力，增加了选课率，增加了研究生在课题研究中的电镜使用率。两年来完成了593人次.2374例的样品测试任务。通过对教学内容、教学方法的改革，以及新技术、新方法在教学中的应用和充实，促进了教员查阅文献的主动性，追踪技术进展的积极性，使教员队伍综合素质整体跃升。通过建立开放型技术平台，促进了电镜实验技术的发展，两年来协助完成科研任务474项，在临床医生和研究生的配合下开展了电镜诊断研究，涉及到肿瘤疑难病例的诊断、肾穿刺活检的电镜诊断、神经.肌肉活检电镜诊断等，开展了对细胞组织起源的鉴定，细胞损伤的早期观察，纳米材料的测定等，既提高了自身的业务水平，又解决了临床疑难，推动了临床科研，提高了电镜的有效使用率，使教学改革成果显著。
［参考文献］
微生物研究方法篇8
【关键词】林业微生物学理论教学
【中图分类号】G64【文献标识码】a【文章编号】2095-3089（2015）10-0176-02
林业微生物学是微生物学的一门分支学科，着重研究微生物与土壤环境、森林病害及森林培育关系的一门科学，具有较强的理论性和实践性。为适应新形势下的教学要求，提高课堂教学效果，笔者在课堂理论教学方面进行思考，形成以下几点想法。
一、将微生物知识生动化、趣味化和可视化，切实提高学生的学习兴趣
微生物学知识点多，听起来枯燥乏味，且不易记忆。针对这一特点教师在教学过程中应采取多元化的教学手段，努力将枯燥乏味的微生物知识生动化、趣味化和可视化，使学生在复杂中有律可寻、在枯燥乏味的学习中获得乐趣。如：在讲绪论部分时，教师应像讲故事般地把微生物研究对象、特点、发展简史及其应用娓娓道来，从而将学生的思维引入新学科的大门，使他们对本学科产生较大的兴趣；再如，在讲病毒时，可运用形象生动的比喻讲解病毒的结构、化学组成及其繁殖特点，并播放相关视频详细介绍噬菌体在发酵工业中的危害及其防治方法。
二、老师走“下台”，学生走“上台”，提高学生的自主学习能力
为激发学生学习热情，提高学习效率，老师应引导学生化被动为主动，将老师的“喂饭吃”转变为学生自己“找食吃”，改变过去“学生围着教师转”的被动局面。在教学过程中，教师要“精讲”，重点突出，画龙点睛，重点讲解关键基础知识，课后教师通过布置任务，让他们统筹安排学习时间，根据学习要求围绕一些小知识点主动搜集资料进行自学并进行归纳、凝练和总结，然后走上台来给同学们讲解，有意识地让学生自己做“小老师”。对一些重点知识点，可在学生讲解完后，再召开小组讨论会，老师跟学生一起相互提问、共同交流。这样做学生的积极性很高。因此，教师要敢于大胆放手让学生独立学习，充分发挥他们的主观能动性。
三、强调理论联系实际
林业微生物是一门内容枯燥、复杂并且难以理解的学科，初学者往往都难学难懂难记。强调理论联系实际可加深学生对微生物知识的记忆。如：为了说明大部分陆生植物都能被菌根真菌侵染，可让同学们从校园中采集各种林木的根系，染色后在显微镜下镜检，观察菌根真菌的菌丝、丛枝、泡囊等结构；为了说明杨树溃疡病是由微生物引起的，可让学生采集发病杨树的病斑，从中分离病原微生物，然后再将分离的病菌接种于健康杨树，观察杨树的发病状况。此外，贯彻理论联系实际的原则可引导学生将微生物理论知识与学生已有的知识基础和生活经验实际、科学上的最新成就实际、前人从事科学研究的实际、学生的思想实际等相联系，使学生在学习过程中不断认识所学课程的重大价值，从而产生巨大的学习动力，使学生兴趣昂然地去学习微生物学。
四、将学科前沿知识贯穿于林业微生物教学过程
博士研究生是工作在科研一线的研究者，经过多年的研究训练，他们掌握着各自研究领域的最新研究方法与进展。据此，在林业微生物教学过程中，教师邀请了与林业微生物相关的博士研究生深入课堂，给同学们做专题报告。博士研究生们就“菌根与植物抗逆性的关系”、“食源性致病菌特性与检测”和“根瘤菌在逆境生态修复中的作用”等专题从不同角度深入浅出地向同学们讲解了微生物学的最新研究方法与成果，并就各自的研究内容与同学们进行了深入交流。专题报告结束后，同学们“现学现用”，自行分组，各小组根据自己的兴趣点收集不同微生物的特点、研究方法及其应用等方面的文献和资料，进行演讲比赛，比赛中再邀请博士研究生担任评委，就同学们ppt制作、资料查询、文献总结等方面进行点评和评比，并对表现优异的小组予以适当的奖励。通过开展“邀请博士研究生进课堂，学生“当家作主””专题活动，一方面让同学们掌握了一些微生物学领域的研究前沿，让他们变被动学习为主动学习，学习如何收集资料并进行总结、凝练和展示，另一方面让博士研究生的“光环”在一定程度上激起本科生对微生物学的学习热情，为切实提高教学效果发挥了一定的作用。
总之，林业微生物课程教学改革对提高教学效果起到了一定的作用。此外，今后还应进一步强化理论与实验并重，建立以学生为主体的教学方式，促进学生自主性学习和个性发展，完善知识背景和提升创新能力，注重学生独立解决问题能力和综合素质的培养。
参考文献：
[1]李延茂，胡江春，汪思龙，王书锦.森林生态系统中土壤微生物的作用与应用[J].应用生态学报，2004，15（10）.
微生物研究方法篇9
关键词：根系研究；方法统计；问题探讨；根系现状分析
根系是植物所有根的总称，具有锚定植株、吸收和运输土壤中的物质的作用[1]。目前对植物根系的研究还处于科学上的“儿童阶段”。所以，根系研究方法的发展潜力很大、对其的了解和熟练运用也非常重要。
1根系研究的现状
人们对根系的研究是一个从自发认识到主动研究的过程。Keitht.ingram等通过对软件RmS的改进，使得对微根系的测量工作时间得到很大的节省。周本智等[2]使用微根管技术、胡秀娟等[3-4]以CCD摄像系统为图像采集系统分别完成了对植物根系的生长动态的监测工作。罗锡文等[5]采用XCt（计算机断层）成像技术成功做到了植物根系原位形态构型的定性观察和定量测量。白文明等[6]阐述了在微根窗使用和操作过程中需要注意的问题。史建伟等[7]介绍了微根管在细根周转过程研究中的使用和应用问题。向子云等[8]借鉴多层螺旋Ct技术，获得了植物根系图像。目前，美国CiD公司的Ci-600根系生长监测系统、Bartz公司开发的微根管观测系统、澳洲生态仪器有限公司开发的win/macRHiZo根系图像分析系统、加拿大的et-100根系生态监测系统等，都能以较低破坏的方法快速、准确地测量根系生长及分布状况。
2根系研究方法的不同分类方式
（1）根据是否直接观察分类。由于根系研究方法间各自特点的异同，其分类就没有统一的标准[9]。最简单的可根据方法的新与旧、直接与间接及田间与容器进行分类。可归结为：a.田间直接取样方法，如土钻法、整段标本法、挖掘法、剖面法等；b.直接观察法，如玻框法、微根管观测、根系室法、分根移位法等；c.间接观测方法，如土壤水含量测定法、非放射性示踪剂法、放射性示踪法、土壤注射法、植株注射法等；d.其他方法，如容器法、钉板法、雾培法、塑料管土柱法、网袋法等。（2）根据实施过程分类。按照不同的实施过程可以分为三种类型：a.挖掘方法：钻土芯法；圆状土柱法；金属框法和塑料网袋法。b.同位素示踪法。c.图像分析法：winHiZo根系扫描法；三维坐标容器法；植物根系X-光扫描分析系统；营养袋纸培系统和分层式培养系统；微根区管法。（3）根据是否需要挖掘分类。可以分为挖掘法和非挖掘法两种，挖掘法主要有钻土芯法、圆状土柱法、金属框法和网袋法、简易根箱法、塑料管土柱法；非挖掘法主要有气培法、同位素示踪法、容器栽培法、沙培法、无土栽培法、球培法等[10]。（4）根际微区根系研究方法分类。根际微区范围微小，取样时又需要及时定位以保持原有养分环境状态，要求在研究技术上高的分辨率和精确度。主要有：a.放射性自显影法；b.微区土壤剥落分离法；c.冰冻切片法；d.微电极法；e.电子探针法。（5）细根根系研究方法分类。细根周转是指细根的生长、衰老、死亡和再生长过程，对树木体内碳和养分循环具有重要的影响，当前还没有公认的有关细根生物量、生产和周转的测定和计算方法[11]。其中一般采用的是直接测定方法，包括挖掘法、整段标本法、根钻法、生长袋法、根系室法、玻璃壁法、土柱法、微根管法等；间接方法包括碳通量法、生态系统碳平衡法、氮平衡法、非生物变量相关法、同位素示踪法、淀粉含量法等。
3根系研究的具体方法
迄今为止，还没有任何一种方法可以快速准确的测定根系的相关指标[12]，现将各种根系研究的方法最大程度的归纳如下：（1）挖掘法。挖掘法又称为脉络法或轮廓法，传统的挖掘法即挖去被研究根系周围的土壤，在被研究部分保存的较为完整的根系位置等情况下，有目的的进行绘图、摄影等处理，然后将其洗净，选择需要的部分，最后进行测量[13]。挖掘法可分为完整挖掘法和分步挖掘法，仪器简单、应用较为广泛、但伤根较大。a.完整挖掘法（整体挖掘法）。适用于植物苗期根系分布范围较小时使用，可分为：直接挖掘法；金属框法；网袋法。和网袋法原理近似有内生长法、金属框法。b.分步挖掘法。全根分层挖掘法，即双向切片法。即将植株全部根系分区分层掘出，捡去新生体、侵入体及非研究植物根物质，用清水冲洗干净后待测；土块法。又称单块法，即用钢板切取土壤单块，并洗掉土壤提取根系待测，与此法类似还有原状土片法、原状土柱法和圆状土柱块法。在此基础上，又提出了几种改良土块法，如根箱法（箱掘法）、根笼法（笼掘法）和钉板法（针板法）。c.几种改进方法。水压法。又称湿法挖掘，即用压力水把根系上的土壤颗粒冲掉。主要有冲洗法，又称洗根法。该法容易损失有活力幼根，且难于分清活根与死根及其他作物的根[14]；空压法。适用于沙性土壤，须根损失少，省时间；水平面法。主要用于研究水平生长的根系，即按树枝水平伸展范围一倍半为最大直径划个圆，逐层出土，与之类似的还有堑壕法、奥斯卡特尔开沟法、幅射沟法。后三种方法都从局部到整体，沿根系生长方向开始挖掘树根并绘图的共同点；扇面法。主要研究树木根系，其程序为在距树干邪厘米处垂直以树干为圆心的半径疙一沟，最后对暴露出根系扇面描图或拍照。（2）土钻法（钻土芯法、根钻法、圈筒形土钻采样分离根系）。土钻法是利用人力或机械的方法驱动根钻从田间采集等体积含根的土壤样品，从而达到对植物地下生物量的测定的一种方法[15]。该法适于在多石的环境下动态观察根系成分的变化，但在研究非均匀分布的根系时，难区分近期枯死的根或相似的其他植物根。（3）气培法（雾培法、喷雾法）。气培法，又称雾培法，是在水培的基础上发展成的能自动连续喷洒雾状营养液的一种新型利用机械研究根系的方法[16]。该方法主要应用在无土栽培技术中解决根系供氧问题。（4）同位素示踪法（核素示踪法，示踪法、示踪原子法、放射性示踪法）。同位素示踪法是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记，对同位素示剂进行追踪得出物质运动及转化规律的方法。其具有灵敏度高、方法简便、定位定量准确、费用低等优点。通常包括：根部标记法。即将示踪剂引入到生长的植株中，通过对植株地上部分任意部位的放射性活度的测定来得出该植株的根系活力[17]；植株地上部标记法；放射自显影法（aRG）。该方法能将根的形态、机能和代谢统一起来研究，具有可在不破坏土体和根细胞结构条件下进行观测等优点；中子照相法。又称中子散射法，主要用来测定土壤水分含量。（5）塑料管土柱法。塑料管土柱法又称塑料管栽植法。主要应用在旱地作物上，具有取样简便、易于操作、工作量小、能保持根系完整，与大田生长相一致的优点，但伤根。（6）三维坐标容器法。三维坐标容器法是基于根箱法与计算机应用的结合，而创造出的一种新型的根系研究法。该方法太复杂、价格昂贵，计算根系长度比较费时，适用性低。（7）Rhizotron法。Rhizotron设备建立和操作价格都很昂贵，且在处理观察的数量上有一定的限制，难以量化根的生长量，应用较少。（8）容器法。容器法是在根箱法的基础上，研制的一种根系研究法。该法适于研究禾本科作物，便于控制和操作试验中的生长条件一致的重复试验，能迅速获得相关的特殊研究资料。其缺点是只能做为田间研究的补充。（9）断根法。断根法是一种研究不同根群功能的方法，即通过人为方法切断某一部分根系而了解该部分根系的作用。如果定期处理还可以了解不同生育期根系的作用，其结果可为作物栽培调控技术提供理论依据。（10）根室观察和根系生长系统监测法（根窖法、根系地下观测室、玻璃墙法、剖面墙法）。根室观察法是在自然生长的作物下挖一根室，根室的每边都有透明的窗户可以直接观察到根系的生长情况。根室法主要观察根的分枝、根色、根的生长方向等；玻框法（玻璃墙法、玻璃壁法、玻面剖面墙）。玻框法是一种situ的可连续观察和记录某剖面根系生长的方法；根系地下观测室（根系观察室、根试验室法）。一般由一地下通道和两边的透明观察窗组成，能同时看到根与土壤物理性状的关系；剖面墙法（纵剖面壁方法）。该法要点是在土壤纵剖面上移去3-5厘米左右的土壤，观察根的数量和分布，它比较方便于观察垄作植物根尤其是检查条播作物根的分布情况。（11）水培法（无土栽培、砂培、球培、水稻的自然水域无土种植方法）。无土栽培将植物种植在设置有固体支撑装置（如泡沫板等）内含植物必需营养成分的营养液中，或种植在浸润有植物必需营养液的隋性基质中的栽培方法。其中水培法是目前最常用的研究根系的方法，可用于进行各种元素不同浓度或缺素试验。其优点是可避免繁琐的根、土分离操作，缺点是与田间实际生长状况差异更大。（12）分根移位法。分根移位法是以保证作物地上部分的稳定生长为前提条件，将不同类型根或不同节位根与其它根分开并引到别处再种植在不同条件的介质中，研究不同生育条件对作物根系及作物生长发育的影响或观察局部根与整体植株之间的关系的方法。该法可以准确获得根系的信息，但对水肥等条件依赖较大、操作费时费力。（13）微根管系统法（玻管法、微根区管法、微速摄影法）。微根管法通过插入土壤中的透明观察管，形成一个小观察窗，利用长筒观察镜或微型数码相机在小观察窗内定期拍摄记录观察管外壁新根生长动态的一项根系观测研究技术。该技术主要应用于农作物、草地、森林生态系统根系的研究，其最大优点是能有效的估计生态系统地下C分配与平衡，根据观察管材质不同可分为玻管法、微速摄影法与微根管系统法。（14）探地雷达。探地雷达是基于电磁波在地下媒质电磁特性的差异性，通过天线将电磁波的能量发射到地下引起不连续性的反射和散射从而实现浅层成像、定位定性、定量地辨识地下电磁特性的变化，最终实现对目标根系的探测。探地雷达可以描述地下目标的几何和物理性状，具有快速、高分辨率、对目标的三维电磁特征敏感等优于其他遥感技术的特点[18]。（15）核磁共振成像法。核磁共振成像法（mRi）利用核磁共振成像技术对植物根系进行无损观测，获取根系长度、根系数量、根系结构以及水分运移动力学等三维影像信息的方法[19]。该法能在保持根系及根际土壤的本来面目的基础上，直接观测植物根系的各部分生理功能，能较好获取根系信息，但设备维护维修昂贵，应用不广泛。（16）X-光扫描分析系统。X-光扫描分析系统是一套新型、高效率、高精度、非破坏性的具有很大应用潜力的原位分析系统，可以对不同阶段植物根系的所有部分进行动态监测与分析，但操作时要使用特制的容器，且成本高，应用并不广泛。（17）营养袋纸培系统。营养袋纸培系统旨在研究水肥对根系二维构型的影响。但由于支撑架的存在，使植物根系构形与自然条件下的构型有一定的差异，不能代表大田苗木的根系结构。（18）winRHiZo根系扫描法。winRHiZo由根系扫描仪和专业的根系分析软件winRHiZo组成，利用扫描仪扫略洗净的根系形成高清图像，再结合winRHiZo对其分析，具有精度高、测量快、方法简便等优点。该方法可以测量无限小的根系的长度、根系体积、根长密度、根系表面积和根系直径等指标。（19）分层式培养系统。分层式培养系统是将培养基质与各种肥料混匀后装入塑料桶中，将基质从底部的接触面开始加土，然后放入一层孔径为2mm的玻璃纤维筛网，根系分层取样，之后利用台式扫描仪图像扫描存入电脑，通过软件winRHiZo分析根长、根面积、根直径等指标。此法较为廉价，简单，但所得到的根系结构同容器苗生长有差异。（20）电容值测根量法。根系电容值与表面积呈正相关，而根系质量又与其表面积呈正相关，由此产生了利用电容值测根系质量的方法。（21）染色法（非放射性示踪剂法）。染色法是将染色液注入植茎，观察颜色在植株内移动情况，其在研究树根系上有局限性。研究自然根按情况多用曙红兰和R红0.1%-0.5%的水溶液。非放射性示踪剂法：放入土壤内的示踪物质被植物吸收后，可在植株上部探测到，目前还不能用于根生态特性的常规研究。（22）微区土壤剥落分离法。此方法是采用剥落根系粘着程度不同的根面土、根际土和非根际土来进行化学分析。其优点是不需特殊的仪器设备、可在田间应用，缺点是比较粗放，距离根轴最近、粘着最紧的一层根面土难以从根系上剥离，结果易产生误差。（23）冰冻切片法。取一定的土壤紧贴在控制条件下植物长成的一层平面排根根系两边，一定时间后将土壤用液氮冰冻，然后切成微薄的土片进行各种测定的方法。其优点是解决了微区土壤的区分问题、定量地在控制条件下研究各种养分在根一土界面上的动态及同位素法难以测定的微量养分变化，缺点是只能进行短期试验。（24）微电极法。它是把微电极直接插入根际微区，原位测定根际微区的养分环境状况的方法，其本身较简便，但干扰因素的影响比较多。（25）电子探针法。此法是利用高速电子束轰击试样表面的微小区域而得到特征信号，通过检测发射出的放射线的波长和强度，确定该微区内所含元素的种类和数量，并直接将测定位置的图象和养分分布显示出来。分辨率高。但此方法的制样、制片过程复杂，误差也会在这些步骤中产生。（26）根置换法。在活着的木质根上诱发“置换根”，让这些根长在盛土壤或其它培养基质的浅盘里，适于研究成龄树根系的方法。（27）色谱法。采用色谱法，可辨认各种关系密切的植物品种的根。同种根的色谱图是一致的。（28）电气法。把探针根里，用测量根导电率的方法分辨活根与死根或用电容桥测量根系的电容来比较根系大小的方法。（29）树根生长轮测定。计算根生长轮的多少和大小可测定根龄和提供根发育的环境情况。（30）调查根毛。根毛研究是主要以谷物和其它草类为对象，多数在非土壤基质例如潮湿的空气、湿滤纸、沙培或水培上进行，测定时借助显微镜或中性红1%溶液染色，来辨认根毛死活的研究方法。（31）测定根瘤。根样冲洗净后，按株或根测定长度和计算根瘤数量。（32）测定菌根。操作方法是把从已知体积的土壤里分离出的根切成若干短段后，先后用氢氧化钾（10%）冲洗和锥虫兰给菌体染色，最后把根段放在油里进行处理，采用交叉法在显微镜下数段数。此法可测定真菌根感染的根长和整个根长及根毛、根尖直径和表皮状况。（33）现代根系分析系统的应用。现代根系分析系统的基本原理是将扫描系统与图形分析软件结合起来，利用图象分析软件对扫描的根系图象进行分析，计算出根系长度、表面积、体积、根系数量等指标[20]。目前主流根系分析系统有英国的Dt-SCan、加拿大的RegentwinRHiZo以及美国Bartz公司的BtC-100X等。
4存在的几点问题
（1）在已有的领域，研究方法的系统性不足、不深入、重复多以及不能很好的满足实际研究需要。例如：在根系研究的陆面过程模式中，准确观测并模拟更深层次根系的技术不精确；对一种植物根系的研究体系不统一，只能参考其它植物的指标测定及研究方法。（2）在现今根系研究方法的选择时对当前实际具体情况和试验目的的结合，不是很好。（3）根系构型是指同一根系中不同级别的根在生长介质中的相互连接情况和空间分布[21]。在容器法的控根技术下根系构型研究重复过多；目前在根系研究的各领域对细根周转的影响因子和机理的研究远远不足。（4）现代技术与传统方法的结合应用不是很好；最大限度的在最接近植物自然生长的环境条件下，研究其生长发育规律，尤其是对容器法的运用时尽可能最大限度的回避这一点；现代化研究设备构造过于复杂、技术也有待提高等。（5）目前，国内对现代根系研究方法的运用还不是很普遍，多数根系研究的方法基本处于最传统和最现代的两极状态。同时，对于一些例如微区土壤剥落分离法、冰冻切片法、微电极法、电子探针法、电气法的应用基本处于零状态等。
参考文献
[1]梁泉，廖红，严小龙.植物根构型的定量分析[J].植物学通报，2007，24（6）：695-702.
[2]周本智，Swordma，ChamberJL，等.利用minirhizotron技术监测火炬松新根系的生长动态[J].林业科学研究，2002，15（3）：276-284.
[3]胡秀娟，汤晓华.植物根系图像监测分析系统的设计[J].林业机械与木工设备，2003，11（2）：24-25，28.
[4]朱衍杰，张秀省，穆红梅，等.植物根系生长与研究方法的进展[J].北方园艺，2012，20：176-179.
[5]罗锡文，周学成，严小龙，等.基于XCt技术的植物根系原位形态可视化研究[J].农业机械学报，2004，35（4）：104-106，133.
[6]白文明，程维信，李凌浩.微根窗技术及其在植物根系研究中的应用[J].生态学报，2005，25（11）：3076-3081.
[7]史建伟，于水强，于立忠，等.微根管在细根研究中的应用[J].应用生态学报，2006，17（4）：715-719.
[8]向子云，罗锡文，周学成，等.多层螺旋Ct三维成像技术观测植物根系的实验研究[J].Ct理论与应用研究，2006，15（3）：1-5.
[9]廖荣伟，刘晶淼.作物根系形态观测方法研究进展讨论[J].气象科技，2008，4：429-435.
[10]施淑斌.水稻根系研究进展[J].吉林农业，2014，10：26.
[11]斯庆毕力格.毛乌素沙地臭柏、油蒿细根分解过程中养分含量及释放速率[D].内蒙古农业大学，2008.
[12]向小亮，宁书菊，魏道智.根系的研究进展[J].中国农学通报，2009，17：105-112.
[13]胡敏.小麦根系研究方法标准化与关键技术改良化[D].河南农业大学，2012.
[14]刘九庆.植物根系图像监测分析系统[D].东北林业大学，2005.
[15]李俊英，傅宝春，马迎春.树木细根生产与周转研究及方法评述[J].山西农业大学学报（自然科学），2006，S1：1-6.
[16]张成良，尹富强，陈大洲，等.水稻根系研究法的现状[J].江西农业学报，2006，2：34-36+40.
[17]黄兆平.六种草地早熟禾品种的冠部特性及根系特征的研究[D].河北农业大学，2011.
[18]赵建诚.欧美杨Ⅰ-107根系特征及盐、旱胁迫对其生理特性的影响[D].山东农业大学，2013.
[19]朱桂林，韦文珊，张淑敏，等.植物地下生物量测定方法概述及新技术介绍[J].中国草地学报，2008，3：94-99.
微生物研究方法篇10
关键词：长叶微孔草；化学成分；开发利用
中图分类号S812.3文献标识码a文章编号1007-7731（2017）04-0080-04
analysisofChemicalConstituentsinovergroundpartandUndergroundpartofmicroulatrichocarpa
tangBingmin1etal.
（1QinghaiGrasslandStation，Sining810008，China）
abstract：inordertothedevelopandutilizemedicinalvalueandfeedingvalueofovergroundpartandundergroundpartofmicroulatricocarpa，wedeterminedandanalyzedcrudeprotein（Kieldahlmethod），crudefiber（methodofdecomposinginboilingacidandalkalisolution），totalpolyphenol（Folin-Ciocalteucolorimetricmethod），solublesugar（methodofextractinginphenol-sulfuricacid），alkaloids（spectrophotometry）inovergroundpartandundergroundpartofmicroulatricocarpa.theresultsshowedthatovergroundpartofmicroulatricocarpacontained9.22%crudeprotein，16.71%crudefiber，9.78%solublesugar，andtheconcentrationoftotalpolyphenolandalkaloidwas60.11mg/gand26.67mg/grespectively；theundergroundpartofmicroulatricocarpacontained16.71%crudeprotein，72.26%crudefiber，7.69%solublesugar，andtheconcentrationoftotalpolyphenolandalkaloidwas64.69mg/gand15.51mg/grespectively.
Keywords：microulatricocarpa；Chemicalcomposition；Developmentandutilization
1实验目的
长叶微孔草资源的开发利用具有重要的科学意义、很高的经济价值及广泛的应用前景。为长叶微孔草人工培育提供技术支持，有必要对微孔草各部的化学成分进行深入了解，分析其化学成分、药用价值及营养功能，为合理开发利用长叶微孔草资源提供依据。
2研究内容
2.1实验地概况本研究主要是针对青藏高原长叶微孔草化学成分的实用价值，因而在样地的选择上，笔者选择黄南州河南县启龙牧场样地采集。黄南州河南县启龙牧场地处青海省东南部，东临甘肃省夏河、碌曲县，南接甘肃省玛曲县，西南与本省玛沁县、同德县毗连，北与泽库县相邻，处于青甘川三省结合部，素有青海省南大门之称。全县总面积6997.45km2，海拔3600m。河南县地势总趋势是|北高、西南低，大部分地区海拔在3600m以上，最高海拔4539m，最低海拔3168m，高差1317m。
2.2实验测定方法与手段
2.2.1取样方法自返青后开始，于7―8月集中采样1次，取样时，在采样地用采集工具挖取长叶微孔草的地上部分和地下部分。
2.2.2粉碎及保存方法（1）在实验室内对长叶微孔草进行阴干。（2）对长叶微孔草的地上和地下部位进行分离，分别装在自封袋中。（3）用粉碎机把长叶微孔草地上和地下部位粉碎成沫状，分别装在自封袋中。（4）把地上和地下部位的粉沫放到冰箱进行冷冻，保持成分。
2.2.3测定方法测定粗蛋白成分采用凯式定氮法。测定粗纤维成分采用酸碱消煮法。测定可溶性糖成分采用苯酚―硫酸法。测定总多酚成分采用Folin-Ciocalteu比色法测定。测定生物碱成分采用分光光度法。
3结果与分析
3.1粗蛋白成分分析由表1可得：长叶微孔草地上部位粗蛋白含量（表1中，1为长叶微孔草地上部位蛋白质含量）均值为0.1671，标准差：0.0054，均值的标准误：0.0032。长叶微孔草地下部位粗蛋白含量（表1中，2为长叶微孔草地上部位蛋白质含量）均值为0.0922，标准差：0.0043，均值的标准误0.0025。由表2可得：方差的齐性检验结果F=0.366，p=0.578>0.05，表明两组样本的粗蛋白含量方差差异是不显著的，也就是符合方差齐性的假设。然后看t检验t=18.506，df=4，p=0.000
3.2粗纤维成分分析由表3可得：长叶微孔草地上部位粗蛋白含量（表3中，1为长叶微孔草地上部位蛋白质含量）均值为0.1763，标准差为0.0152，均值的标准误为0.0087。长叶微孔草地下部位粗蛋白含量（表3中，2为长叶微孔草地上部位蛋白质含量）均值为0.7226，标准差为0.0000，均值的标准误为0.0000。由表4可得：方差的齐性检验结果F=7.316，p=0.054>0.05，表明两组样本的粗纤维含量方差差异是不显著的，也就是符合方差齐性的假设。然后看t检验t=-62.114，df=4，p=0.000
由表3可得：长叶微孔草地上部位粗蛋白含量（表3中，1为长叶微孔草地上部位蛋白质含量）均值为0.1763，标准差为：0.0152，均值的标准误为：0.0087。长叶微孔草地下部位粗蛋白含量（表3中，2为长叶微孔草地上部位蛋白质含量）均值为0.7226，标准差为：0.0000，均值的标准误为0.0000。
由表4可得：方差的齐性检验结果F=7.316，p=0.054>0.05，表明两组样本的粗纤维含量方差差异是不显著的，也就是符合方差齐性的假设。然后看t检验t=-62.114，df=4，p=0.000
3.3可溶性糖成分分析由表5可得：长叶微孔草地上部位粗蛋白含量（表5中，1为长叶微孔草地上部位蛋白质含量）均值为0.0978，标准差为0.0021，均值的标准误为0.0012。长叶微孔草地下部位粗蛋白含量（表5中，2为长叶微孔草地上部位蛋白质含量）均值为0.7696，标准差为0.0054，均值的标准误为0.0031。由表6可得：方差的齐性检验结果F=2.598，p=0.182>0.05，表明两组样本的可溶性糖含量方差差异是不显著的，也就是符合方差齐性的假设。然后看t检验t=6.205，df=4，p=0.003
3.4总多酚成分分析由表7可得：长叶微孔草地上部位粗蛋白含量（表7中，1为长叶微孔草地上部位蛋白质含量）均值为0.0046，标准差为：0.0005，均值的标准误为：0.0003。长叶微孔草地下部位粗蛋白含量（表7中，2为长叶微孔草地上部位蛋白质含量）均值为0.0049，标准差为：0.0001，均值的标准误为0.00005。由表8可得：方差的齐性检验结果F=2.496，p=0.189>0.05，表明两组样本的总多酚含量方差差异是不显著的，也就是符合方差齐性的假设。然后看t检验t=-1.309，df=4，p=0.261>0.05，2个样本的总多酚含量不存在差异。
3.5生物碱成分分析由表9可得：长叶微孔草地上部位粗蛋白含量（表9中，1为长叶微孔草地上部位蛋白质含量）均值为26.6700，标准差为0.3436，均值的标准误为0.1984。长叶微孔草地下部位粗蛋白含量（表9中，2为长叶微孔草地上部位蛋白质含量）均值为15.5081，标准差为1.1473，均值的标准误为0.6624。由表10可得：方差的齐性检验结果F=2.271，p=0.206>0.05，表明两组样本的生物碱含量方差差异是不显著的，也就是符合方差齐性的假设。然后看t检验t=16.141，df=4，p=0.000
4结论
本试验采用了凯式定氮法测定粗蛋白含量、酸碱消煮法测定粗纤维含量、Folin-Ciocalteu比色法测定总多酚含量、苯酚-硫酸法测定可溶性糖含量、分光光度法测定生物碱含量。
试验得出长叶微孔草地上部位和地下部位分别具有粗蛋白、粗纤维、可溶性糖、总多酚、生物碱成分，得到地上部位粗蛋白、粗纤维、可溶性糖、总多酚、生物碱的含量分别为：16.71%、17.62%、9.78%、60.11mg/g、26.67mg/g，地下部位粗蛋白、粗纤维、可溶性糖、总多酚、生物碱的含量分别为：9.22±0.58%、72.26%、7.69%、64.69mg/g、15.51mg/g。
这些研究结果为长叶微孔草的化学成分、开展长叶微孔草的药理药效学研究、饲用保健营养研究、建立长叶微孔草及其制品的质量评价指标体系，进而深入开发利用长叶微孔草资源，提供了重要的科学依据。
参考文献
[1]中国科学院西北高原植物研究所.青海经济植物志[m].西宁：青海人民出版社，1987：480.
[2]王欣，任继周，郭朝霞，等.微孔草的特征及利用价值研究[J].自然资源学报，2003（5）：2472-2451.
[3]张健深.阿坝州草地微孔草资源调查报告[J].四川草原，1995（l）：11-16.
[4]李京民，王静萍，于凤兰.微孔草油中脂肪酸的分离与鉴定[J].植物学报，1989，31（1）：50-53.
[5]李茂言，何利城.微孔草总油对大白鼠血流变学的影响[J].中国中药杂志，1999（增刊）：135.
[6]安承熙.微孔草的开发前景研究[J].青海科技，1998，5（2）：46-30.
[7]阎殿海，马晓岗，谢德庆.野生药用植物微孔草籽粒特性的研究[C]//2003年全国作物遗传育种学术研讨会论文集.2003：118-119.
[8]张健琛，王元富.阿坝州草地微孔草资源调查报告[J].四川草原，1995，11（1）：12-16.
[9]李东，孙健，元珊，等.我国野生微孔草油的研究进展[J].食品与机械，1995，48（4）：9-10.
[10]罗光荣，邓永昌.微孔草秸秆饲喂藏羊试验[J].四川草原，2001（2）：56-5
[11]肖正春，张广伦.微孔草的调查研究[J].中国野生植物，1989（1）：1-4.
[12]张健琛.微孔草生物学特性研究[J].四川草原，1997（1）：14-17.
[13]王钦，任继周，郭朝霞，等.微孔草特征及利用价值研究[J].自然资源学报，2003，18（2）：247-251.
[14]韩发，程大志，师生波，等.我国优质野生植物微孔草资源的研究与开发利用进展[J].中国野生植物资源，2007，26（5）：5-9.
[15]肖正春，张广伦.微孔草的调查研究[J].中国野生植物，1989（1）：1-4.
[16]中国科学院西北高原生物研究所.青海经济植物志[m].西宁：青海人民出版社，1987：480-481.
[17]李元华，张新跃.微孔草开发利用的研究[J].四川草原，2004（9）：25-28.
[18]韩发，程大志，师生波，等.青藏高原优质野生油料植物资源――微孔草的生物学特性及开发利用价值研究[C]//中国植物生理学会全国学术会议论文集.2007.
[19]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国家标准化管理委员会.GB-t5511-2008谷物和豆类氮含量测定和粗蛋白质含量计算凯氏法[S].北京：中国标准出版社，2008.
[20]邹琪.植物生理学试验指导[m].北京：中国农业出版社，1997：76-77.
[21]田树革，魏玉龙，刘宏炳，等.Folin-Ciocalteu比色法测定石榴不同部位总多酚的含量[J].光谱实验室，2009，26（2）：342-344.
[22]田文礼，孙丽萍，董捷，等.中国农业科学院蜜蜂研究所[J].食品科学，2007，28（2）：258-260.
[23]刘清，李玉，姚惠源.大麦提取物的体外抗氧化活性研究[J].食品科技，2007，28（2）：131-133.
[24]刘硕谦，刘仲华，黄建安.紫外分光光度法检测水皂角总多酚的含量[J].食品工业科技，2003，（6）：76-77.
[25]程华，余龙江，胡琼月，等.分光光度法测定岩黄连不同部位总生物碱的含量[J].时珍国医国药，2006，17（3）：364-365.
[26]康爱民，龙瑞军，师尚礼，等.苜蓿的营养与饲用价值[J].草原与草坪，2002（3）：31-32.
[27]李超，等.天麻化学成分研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2007.
[28]杨敏，李隆云，杨水平，等.青蒿生育期可溶性糖和氨基酸含量动态变化[J].时珍国医国药，2009，20（2）：260-261.
[29]宋晓凯，刘谦光，耿征，等.西洋参中可溶性糖的含量测定[J].西北药学杂志，1996，11（6）：247-249.
[30]杨利.萱草属植物营养成分分析及品质评价[D].吉林：吉林农业大学，2014.
[31]周媛，喻玲玲，李新兰，等.苎麻叶中总多酚的含量测定[J].食品科技，2009，34（4）：193-197.
[32]李彩东.珠子草总多酚含量研究[J].中国药物与临床，2013，13（4）：440-442.
[33]陈军，蔡宝昌，沈春云，等.马钱子总生物碱的含量测定[J].中药新药与临床药理，2007，18（6）：468-471.